Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Eturauhassyöpä on bimodaalinen sairaus aggressiivisten ja veltto muotoja. Nykyinen prostataspesifisen antigeenin testaus ja eturauhasen seulonta antaa moniselitteisiä tuloksia, jotka johtavat sekä alle-ja yli-hoitoa. Tarkka, johdonmukainen diagnoosi on tärkeää riskien kerrostuvat potilaiden ja helpottaa kliinistä päätöksentekoa niin hoidon vs. aktiivista seurantaa. Diagnoosi on tällä hetkellä saavutetaan neulabiopsiaan, tuskallinen menettely. Näin ollen on olemassa kliininen tarve vähän invasiivisia testi määrittää eturauhassyövän aggressiivisuus. Verinäyte ennustaa Gleason, jonka tiedetään heijastaa aggressiivisuus syövän, voisi olla tällainen testi.

Materiaalit ja menetelmät

Veri mRNA eristettiin Pohjois-Amerikan ja Malesian eturauhasen syöpäpotilailla /valvontaa. Microarray analyysi tehtiin hyödyntäen Affymetrix U133 plus 2 · 0 alustalla. Expression profiileja 255 potilasta /valvonta syntyy 85 ehdokasta biomarkkereita. Sen jälkeen kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) analyysi, kymmenen sairauteen liittyvän biomarkkerit jäi pariksi tilastolliseen analyysiin ja normalisointi.

Tulokset

Microarray-analyysi suoritettiin tunnistamiseksi 85 geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä aggressiivinen eturauhassyöpä (Gleason ≥8) ja valvontaa. Näiden geenien ilmentymistä oli qRT-PCR todentaa. Tilastollinen analyysi tuotti lopullisen seitsemän geenin paneeli arvioitiin kuusi geeniä-suhde duplexes. Tämä molekyyli allekirjoitus ennustaa aggressiivista (ts Gleason pisteet ≥8) 55% G6 näytteistä, 49% G7 (3 + 4), 79% of G7 (4 + 3) ja 83% on G8-10, mutta hylkää 98 % valvonnan.

Johtopäätös

tässä tutkimuksessa olemme kehittäneet uuden, veripohjaisten biomarkkereiden paneeli, jota voidaan käyttää pohjana yksinkertaisella verikokeella tunnistaa miesten aggressiivinen eturauhassyöpä syöpä ja siten vähentää ylidiagnostiikka ja ylihoito tällä hetkellä johtuu diagnoosi käyttämällä PSA yksin. Keskustelemme mahdollisten kliinisten käytöt paneelin tunnistaa miehiä todennäköisemmin hyötyvät koepala ja välitöntä hoitoa verrattuna niihin paremmin ”aktiivinen valvonta” strategiaa.

Citation: Liong ML, Lim CR, Yang H, Chao S, Bong CW, Leong WS, et al. (2012) Veri-Based biomarkkerit Aggressiivinen Eturauhassyöpä. PLoS ONE 7 (9): e45802. doi: 10,1371 /journal.pone.0045802

Editor: Franky L. Chan, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: toukokuu 24, 2012; Hyväksytty: 24 elokuu 2012; Julkaistu: 28 syyskuu 2012

Copyright: © Liong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: Chun Ren Lim, Hengxuan Yang, Samuel Chao, Chun Wei Bong, Choon Gook Yu, Edie JJ Ooi, Karl Wassmann ja Choong Chin Liew ovat työntekijöitä GeneNews Ltd, joka sponsoroi tätä tutkimusta. Choong Chin Liew on johtava tutkija GeneNews ja pitää varastossa yhtiössä. Mikään muu kirjoittajat on kilpailevia intressejä. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä miehillä Yhdysvalloissa (jälkeen ihosyöpä) [1]. Seulonta sairaus on yleensä eturauhasen (DRE) ja eturauhasen antigeenin (PSA) määritys. Kuitenkin hyödyt PSA /DRE seulonta ovat kiistanalaisia, koska korkea vääriä positiivisia, alhainen positiivinen ennustearvo (PPV) ja raportoitu huono tarkkuus tunnistamaan miehillä vaikuttaa aggressiivinen eturauhassyöpä. Viimeisten vuosien aikana, kaksi suurta mahdollisille tutkimuksissa Yhdysvalloista ja Euroopassa ovat korostaneet epäselvyyttä arvon PSA perustuvia menetelmiä eturauhassyövän seulontaan. The Prostate, Lung, Colon ja munasarjasyöpä seulonta Trial (PLCO) Yhdysvalloissa kirjoilla yli 76000 miestä satunnaistettiin saamaan vuosittain PSA kuusi vuotta ja DRE neljä vuotta verrattuna ”tavanomaisen hoidon” [2]. Tekijät havaitsivat eroa syöpä eturauhasen (CAP) liittyvien kuolleisuus näiden kahden ryhmän välillä. Eurooppalainen satunnaistettu tutkimus seulonta korkki (ERSPC) Trial sisältyy 182000 miehiä vuotiaita 50-74 vuotta [3]. Vaikka kirjoittajat raportoitu 20%: n vähennys CAP kuolleisuus miehillä, joille on tehty PSA testaus vähintään neljän vuoden välein, tämä kuolleisuuteen osoittautunut kalliiksi – jokaista CaP kuolema esti, 1410 miehiä tarvitaan seuloa vuosittain ja 48 miehiä tarvitaan hoitoa. Nämä tutkimukset ovat elvytti keskustelua hyödyllisyyttä ja rajoitukset PSA [4] – [10].

Suurimmat ongelmat PSA testaus aiheutua yli- ja diagnoosin. Noin 15% miehistä, joiden PSA-tasot pidetään normaalina (4 · 0 ng /ml tai vähemmän), tee itse asiassa satamassa eturauhassyövän, mukaan lukien korkea-asteen karsinooma [9]. Kasvattamalla rajan tasolle, jonka katsotaan kliinisesti rajatapaus (4 · 0 -10 · 0 ng /ml), noin 25% miehistä on todettu vaikuttavan eturauhassyövän [2]. Toisaalta korkea PSA-tasot havaitaan monet miehet kanssa veltto syöpiin [11]. On arvioitu, että ylihoito voi esiintyä 40%: sta 50%: ssa tapauksista. Lisäksi monet ei-pahanlaatuisia voivat vaikuttaa PSA, kuten hyvänlaatuista eturauhasen liikakasvua ja eturauhastulehdus. Vahvistus diagnoosi vaatii jonkin verran 12-18 ydin koepaloja, huomattavin kustannuksin ja sairastuvuutta [12]. Näiden tietojen perusteella PSA liittyviä haasteita, on selvää, että on tarvetta enemmän kliinisesti merkittäviä biomarkkerit, jotka pystyvät ennustamaan läsnäolo aggressiivinen eturauhassyöpä.

Tuoreessa retrospektiivinen tutkimus tunnisti kudospohjaisia ​​mRNA ilmaus allekirjoitus Gleason luokan ennustamiseen tappava eturauhassyöpää [13]. Samanlaisia ​​biomarkkerit, mutta veri-pohjainen ja pystyy tunnistamaan korkealaatuisesta eturauhassyövän [Gleason pisteet 7 (4 + 3) -10] varhaisessa vaiheessa (ennen päätöstä biopsia), olisivat kliinisesti hyödyllistä [14], [15 ]. Tällainen tekniikka voisi täydentää nykyistä menetelmiä ja auttaa lisäämään luottamusta eturauhassyövän diagnosoinnissa ja hoidossa.

Aiemmissa työssä, olemme kehittäneet uuden veripohjaisten biomarkkereiden paneeli pystyy riskiin kerrostuvat potilaille paksusuolisyövän [16]. Tulokset Tämän testin avulla kliinikot rohkaista suurempaa luottamusta niille potilaille, joilla on ”korkea nykyinen riski” tulokset edetä kolonoskopia. Täällä tunnistaa uusia veripohjaisten biomarkkereita korkealaatuisesta [Gleason pisteet 7 (4 + 3) -10] eturauhassyöpä, joita voidaan käyttää riskien kerrostuvat PSA-positiivisia miehiä. Tämän testin voisi olla hyödyllistä mainita alaryhmään, miehille, joiden hyväksi biopsia on merkittävämpiä kuin siihen liittyvä riski ja epämukavuutta.

Miesten, joilla on kliinisesti paikallinen huono laatu kasvaimet ovat usein neuvotaan tehtävä valvonnan sijaan aktiivista hoitoa sairauteen, joka ei todennäköisesti edetä. Kuitenkin Borocas ja kollegat ovat osoittaneet, että alle 10% miehistä mieluummin valvonta yli aktiivinen hoito [17]. Yksi ehdotettu selitys tälle on, että jopa matalan riskin miehillä, pelko olemassa että hengenvaarallinen, high grade syöpä voi jättää väliin [18], [19]. Testi, joka voi ennustaa läsnäolo mahdollisten korkealuokkaisesta kasvaimet saattavat lievittää potilaan ahdistusta, mikä johtaa suurempiin toleranssi valvontaan.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja verinäytteet

Sample hankinta biomarkkereiden tunnistamiseen toteutettiin vuosina 2004 ja 2009 urologian klinikoilla ympäri Pohjois-Amerikassa (Toronto, Ontario, Canada ja Boston, MA, USA) ja Aasia (Penang, Malesia). Kirjallinen, tietoon perustuva suostumus saatiin kaikki osallistujat ja hyväksynyt kunkin toimielimen tutkimuseettiseltä [Partners Healthcare Institutional Review Board (Brigham and Women n sairaala, Boston), University Health Network Research Ethics Board (Sunnybrook Hospital, Toronto), ja yhteinen eettinen komitea School of Pharmaceutical Sciences (USM Hospital Lam Wah Ee Kliiniset tutkimukset (Penang)].

Kaikki verinäytteet otettiin ennen mitään hoitoa tai koepaloja. Diagnoosi varmistettiin transrektaalisella ultraäänellä ohjattu tru-Cut® neulabiopsiaan ja /tai histopatologisia havaintoja eturauhasen yksilöt (katso liite S1). Kun näyte oli eturauhasen raportti, lopullinen arvosana perustui eturauhasen raportti. lukumäärä kairausnäytteitä otettu koepala oli 6 + 6 eturauhasen tilavuuden 40 grammaa ja 7 + 7 äänenvoimakkuuden 40 grammaa. Kunkin toimielimen in-house patologeja määritetään diagnoosi ja arviointiin Gleason pisteet. Tapaukset, joissa Gleason = 7 jätettiin koulutus aineisto kontrolloida geenien ilmentymisen eroja puolivälissä tason eturauhassyövän Gleason pisteet 7 (3 + 4), jotka me arveltu, voisi olla merkittävästi erilainen kuin aggressiivisempia Gleason pisteet 7 (4 + 3) [14], [15]. Näytteet ottaa Gleason pisteet ≥ 8 klo biopsia tai ilman eturauhasen varta valittu analysointiin ja kehittämiseen geenin allekirjoituksen kanssa koulutusta aineisto. Mallia kehitettiin Gleason pisteet ≥ 8 sitten myöhemmin sovellettu potilaalla on Gleason pisteet 7 onko molekyyli allekirjoitusta voitaisiin erotella 7 (3 + 4) versus aggressiivisempia 7 (4 + 3) Gleason tulokset.

Kaikkiaan keräsimme 1938 näytettä, myös 739 Eturauhassyöpä (PRCA) tapauksia ja 1199 tarkastukset (G0). Tästä ryhmä, 255 näytettä alaryhmä (n = 91 PRCA kanssa Gleason pisteet ≥ 8 ja n = 164 valvonta) kerätään EDTA-putkiin kumoamiseen alustavan tutkimuksen biomarkkereiden löytö on microarray alustalla. Näytteet kustakin ryhmästä sovitettu iän, rodun, BMI, ja muut sairaudet (taulukko 1).

qRT-PCR todentaminen tutkimukset, testasimme tunnistettu geenien useimmat samat näytteet hybridisoitiin geenien henkilöllisyystodistus. Käytimme 245 näytettä (G8 = 54, G0 = 191) meidän Kohortti I tutkimuksessa 182 näytettä (G8 n = 80 ja hallintalaitteet n = 102) meidän kohortti II -tutkimuksessa ja 121 näytettä (G8 n = 64 ja hallintalaitteet n = 57 ) riippumattomana Koepakettia meidän Cohort III tutkimuksessa (kuvio 1). Kohortin IV ryhmä tapauksia keskiasteen syöpä (G6 n = 33, G7 (3 + 4) n = 35, ja G7 (4 + 3) n = 43) käytettiin arvioimaan syövän aggressiivisuus suorituskykyä.

Gene tunnistaminen käyttäen Affymetrix U133Plus 2,0 GeneChip- oligonukleotidisirujen suoritettiin Torontossa, Kanadassa, ja Penang, Malesia, rinnakkain. Torontossa, analyysi tehtiin 166 näytettä (G8 = 42, G0 = 124). Tällä Malesian sivuston, 89 näytteet profiloitu (49 G8, 40 G0). Vuodesta microarray data-analyysi, 85 geenejä tunnistettu molempien sivustojen testattiin sarjassa kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR tarkastuksen tutkimuksissa. Kaksikymmentä geenit todennettiin kautta kohortti I tutkimuksessa useita kohortteja EDTA näytettä (yhteensä 245). Nämä 20 geenit testattiin edelleen kohortin II sarja kokeita PAXgene näytteistä (yhteensä 182), suoritetaan itsenäisesti Penang, Malesia. 10 geeneistä todennettiin, joista 7 geenien tuli meidän lopullinen biomarkkereita ja vahvistettiin myös toinen riippumaton Näytejoukolla-Cohort III -testi (yhteensä 121).

Näytteet jätettiin analyysin ulkopuolelle, jos yksittäisen oli päättänyt olleen: 1) edellinen PRCA; 2) syövän esiasteita, kuten korkea-asteen eturauhasen intraepiteliaalisia kasvain ja epätyypillinen pienet acinar leviämisen; 3) historia syöpä; ja /tai 4) vakavia sairauksia esteenä hoito eturauhasen syöpä, kuten sydämen tai munuaisten vajaatoiminta.

Potilaat jaettiin alaryhmiin perustuu Gleason tulokset: G6 (Gleason pisteet ≤ 6); G7 (Gleason = 7); G8 (Gleason pisteet ≥ 8); ja valvonta (G0). Pohjoisamerikkalainen kontrolliryhmä koostui urologian klinikan potilaille on kerran negatiivisesti koepala. Malesian kontrolliryhmä koostui vuotiaiden miesten 50-75 vuotta, negatiivinen DRE, ja joiden PSA-pitoisuudet olivat alle 2 · 5 ng /ml viiden peräkkäisen vuoden ajan, enintään päivämäärä rekrytointi. Tämä ylimääräinen ehto tehokkaasti kohdistaa Malesian säätimet Pohjois-Amerikan vuosittain PSA standardia. Tämä myös antoi meille mahdollisuuden varmistaa, että PSA nopeus pysyi alle 0 · 4 ng /ml /v, mikä vähentää todennäköisyyttä jääneiden karsinoomien vähäisessä arvoon.

Verenkeruu ja RNA: n eristys

microarray analyysi ja Kohortti I, näytteet perifeerisen kokoveren (2 x 10 ml) kerättiin EDTA Vacutainer® putkiin (Becton Dickinson) (jotta vältetään korkean globiinin transkriptin ongelma Affymetrix mikrosiruja, jotka liittyvät PAXgene järjestelmä), ja käsitellään kuten aikaisemmin on kuvattu [20].

Näytteet ajettiin Affymetrix U133 Plus 2.0 alustalla. Confirmational analyysi suoritettiin käyttäen qRT-PCR kohortti II ja Kohortin III. Sillä qRT-PCR, veri kerätään PAXgene ™ putkia (PreAnalytiX) prosessoitiin PAXgene ™ Veri RNA Kit-protokollaa. PAXgene järjestelmä soveltuu paremmin RT-PCR tutkimuksia, ja on parempi sovi tosielämän kliinisiä sovelluksia, koska sen kyky välittömästi vakauttaa RNA ja pitää se vakaana pitkällä aikavälillä, mikä tarjoaa enemmän joustavuutta näytteessä keräys ja kuljetus.

RNA eheys arvioitiin käyttäen 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano Chip (Agilent Technologies). Kaikki näytteet täyttivät seuraavat laatukriteerit: RIN≥7 · 0; 28S: 18S rRNA-suhde ≥ 1 · 0; ja validoitu Agilent bioanalysaattorin skannata. RNA määrä määritettiin absorbanssilla 260 nm: ssä DU-640 Spektrofotometri (Beckman Coulter).

Microarray hybridisaatio ja tietojen analysointi

Microarray data mining tunnistamiseksi aggressiivinen eturauhassyöpä biomarkkerit mukana kaksi analyysit samanaikaisesti toteutetaan pohjoisamerikkalaisten (Toronto, Kanada) ja Aasian sivustoja (Penang, Malesia). Pohjois-Amerikan sivustolla, me hybridisoitiin 166 näytettä (G8 n = 42; G0 n = 124). Geenit tunnistettu merkitsevä (p 0,05, kertaluokkamuutos ≥1.0, Benjamini-Hochberg FDR korjattu) valittiin jatkojalostustuotteisiin jossa käytettiin merkintöjä ja sondirakenne, [saatavilla Affymetrix verkkosivuilla (https://www.affymetrix.com)] ja tietoa geenien rakenteen ja toiminnan [saatavissa National Institutes of Health verkkosivuilla (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)]. Samanlaisia ​​profilointi ja tiedonlouhinta prosesseja tehtiin meidän Asian sivuston Malesiassa 89 näytettä (G8 n = 49; G0 n = 40), katso kuva 1.

Microarray tiedostoihin yhdistetyt 91 G8 ja 164 G0 näytteet olivat taustakorjattuja kautta GCRMA ja tuodaan GeneSpring (versio 7 · 3 · 1, Agilent, Kalifornia, USA) analysoitavaksi. Epäluotettavia signaaleja, jotka on määritelty rajat geenin virhe malli, hylättiin analyysistä.

Probe asettaa signaalin intensiteettiä verrattiin välillä sairauksien ja kontrolliryhmiin. Geenit määritettiin ekspressoitua eri tapausten ja kontrollien välillä käyttäen varianssianalyysi (ANOVA) testiä sisällytetty GeneSpring. Probesets p-arvot alle 0 · 05 ja taita muutos kertaa suurempi kuin 1 · 2 todettiin tilastollisesti merkitsevä. Näytteen koko määritettiin perustana arviota olimme tehty aikaisemmassa tutkimuksessa, joka on, että 100 näytettä per ryhmä, jotta voidaan saavuttaa riittävä teho (0,80), jossa on tyypin I virhe on alle 0,05 ja kertamuutos kertaluokkaa suurempi kuin 1.2, sillä suuri osa (yli 75%) geenien tutkitaan [20].

Microarray tietoja myös käsitellyt MAS5. Koetinsarjojen merkitty ”poissa” tai ”marginaalinen” missään näytteessä heitettiin pois. Analyysi suoritettiin itsenäisesti käyttäen R-ohjelman tarjoamat Bioconductor.org (Seattle, Washington, USA). Vain geenit ilmestyi tilastollisesti merkitsevä sekä keräyspaikat valittiin.

Quantitative reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

Geenit valittu mikrosirulla analyysit varmennetaan qRT-PCR kohortin I tutkimuksessa. Vain geenit tunnistettu mikrosiruanalyysi että myös edelleen tilastollisesti merkitsevä kohortin I qRT-PCR tutkimuksessa säilytettiin jatkojalostustuotteisiin analyysiä.

cDNA templaattina qRT-PCR käänteistranskriptoituneet RNA käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). 20 ng cDNA käytettiin 25 ui reaktiotilavuudessa on TaqMan® Duplex Reaction (yleiskatsaus menetelmistä, katso kuva 1).

Geenit todennettu kohortti I testattiin sitten kohortti II tutkimuksessa . Kohortti II verinäytteet kerättiin PAXgene ™ putkia (PreAnalytiX), toisin kohortti I ja II tutkimuksen menetelmiä olivat samanlaiset.

Kokeet suoritettiin duplex qRT-PCR testejä. Kukin geeni oli määritettiin sarja kokeita, joissa endogeeninen viitaten geenin (ACTB, beta-aktiini). Lähtötilanteessa ilmaus ACTB pystyimme tunnistamaan merkittävästi eriasteisesti geenitranskriptien välillä eturauhassyövän ja kontrolliryhmiin. Geenit tarkistaa molemmat kohortin analyysit yhdistettiin pareittain; suhdeluvut olevan yli-ilmentynyt geeni ja ali-ilmentynyt geeni suoraan mitattiin duplex reaktioita. Geenien ilmentyminen erot arvioitiin käyttäen vertailevaa syklin kynnys (Ct) menetelmää suhteellisen kvantifioinnin [21], normalisoimalla Ct arvoiltaan viittaus geeniä. Tämä tehtiin laskemalla ACt

näyte = Ct

(kohdegeenin) – Ct

(kumppani geeni). Suhteellinen kertamuutosta (tauti vs. kontrolli) oli edustettuna 2

-ΔΔCt, jossa ΔΔCt = keskimääräinen ACt

Ca – tarkoittaa ACt

valvontaa.

Valitsimme SAMSN1, joka on yli-ilmentynyt geeni kuten kumppani-geenin kunkin kuuden vaimentua kohdegeenien. Tämä muoto voidaan laskea ”ylös /alas” geenien ilmentymisen suhde kunkin ali-ilmentynyt PRCA biomarkkereiden geenin ja sen duplex kumppani, SAMSN1, erosta niiden Ct-arvoja kuten aiemmin on kuvattu [16]. Parametristä Mann-Whitneyn testi arvioidaan tilastollisen merkityksen eroja valvonnan ja punasoluaplasian mRNA-tasoja.

Tulokset

Vuodesta Cohort I (ja Pohjois-Amerikassa Malesian Tutkimuspaikat) 85 geenit tunnistettiin olevan huomattavasti ilmentyvät eri välillä Gleason pisteet ≥8 eturauhassyöpä ja valvonta sekä valittiin jatkotutkimuksiin kautta qRT-PCR (kuva 1).

Quantitative real-time PCR todentaminen

Nämä 85 geenit testattiin 245 Kohortti I kerätyistä näytteistä EDTA-putkiin (G8 n = 54; G0 n = 191). Kaksikymmentä Geenien todennettu jäljellä merkittävää on qRT-PCR-määritys ja säilytettävä Kohortin II -tutkimuksessa.

Niistä 20 kandidaattigeeneihin, kymmenen pysynyt merkittävänä sekä kohortti II kerätyistä näytteistä Paxgene putkiin (p-arvo 0,001, kertamuutoksia 1 · 31-1 · 58 yliekspressoidaan geenien ja -1 · +28–1 · 48 ali-ilmentynyt geenejä).

ilmaisu arvot kymmenen geenien analysoitiin käyttämällä monimuuttuja logistinen regressiomalli. AUC ROC Jokaisen yksittäisen geenin vaihteli 0 · 60-0 · 69; parivertailu johti seitsemän-, kahdeksan- tai yhdeksän geeniyhdistelmiä että kaikki saavuttanut AUC noin 0 · 82. Kiinnostaa, paras seitsemän geenin yhdistelmä koostui yhdestä ilmentynyt geeni ja kuusi ali-ilmentynyt geenit (AUC = 0 · 82). Niinpä valitsimme tämän seitsemän geeniä biomarkkereiden paneeli havaitsemiseksi korkealaatuisesta eturauhassyöpä (taulukko 2).

Käytimme yhden yliekspressoitu geeni, SAMSN1, yhteiseksi kumppani geenin kullekin kuudelle ali-ilmentynyt geenit: CRTAM, CXCR3, FCRL3, KIAA1143, KLF12 ja TMEM204. Kuusi duplexes edustavat kuusi geenien ilmentymisen suhde arvioitiin saman kohortin II näytteistä (G8, n = 80; Ctrl, n = 102). Ilmentymistasojen kuuden dupleksien havaittiin eroavat huomattavasti taudin ja kontrolliryhmiin (p 0,0001 ja kertamuutoksia 1 · 44-1 · 66; taulukko 2). Erotteleva suorituskyky arvioitiin myös käyttäen AUC ROC erotteluärsykeominaisuuksiin kyky kuudesta duplex paneeli (combinative suorituskyky kuudesta duplexes) saavutti AUC 0 · 74 (95% CI: 0 · 67-0 · 80), spesifisyys 84%, herkkyys 63% ja tarkkuuden 75%.

arvioida mahdollisuus, että tulokset johtuivat ainoastaan ​​sattumasta, suoritimme kaksinkertainen cross-vahvistukset, jossa puolet näytteistä on käytetty määrittämään kertoimien ja kynnysarvot mallia, jota sitten käytetään ennustamaan jäljellä puolet näytteistä. Tämä prosessi iteroidaan 1000 kertaa käyttämällä todelliset tiedot, ensin aggressiivinen syöpä tilan ja toisen kerran tilan satunnaisesti uudelleen osoitettu. Jakauma AUC ROC kustakin analyysi johti kahden hyvin erottaa käyrät, joissa on alle 5% päällekkäisyys, josta voimme päätellä, että havaitun suorituskyky tuskin on vain seurausta sattumaa (kuva 2).

histogrammit AUC piirrettiin ja verrata; Tulokset osoittivat AUC PCR tiedot olivat hyvin erillään null sarjaa, jossa päällekkäisyyttä alle 5%.

From data, rakensimme logistiikkaregressiomallin yhdistyvät PSA ja geeniekspression suhteet käyttäen G8 näytteitä vastaan ​​valvonta parantaa entisestään syrjivä kykyä paneelin. Tämä saavutettiin AUC ROC 0,99 69 G8 versus 101 valvontaa Cohort II (herkkyys = 96%, spesifisyys = 100%).

Tämä yhdistettynä paneeli PSA ja geeniekspression suhteet (katso taulukko 3) määritellään alkaen kohortti II testattiin kohortin III näytteistä. Kaikki kuusi duplexes jäi merkittävästi ilmentyvät eri välillä G8 ja hallintalaitteet (kaikki p-arvot ovat ≤ 0,01). Yhtälö rakennettu Kohortti II tutkimus – kiinteillä parametrit – sovellettiin uutta Cohort III tietokokonaisuus, antaa riippumattoman arvioinnin ero suorituskykyä biomarkkereiden paneelin. AUC ROC oli 0,88 54 G8 versus 57 tarkastukset (herkkyys = 83%, spesifisyys = 98%).

Kaikki analyyseissä edellä selostetun mukaan kontrollinäyttein tai G8 tapauksissa ja käytettiin mallin validointi. Kuitenkin tavoite Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida aggressiivisuus syövän. Tätä varten käytimme Kohortti IV, joukko sisältää tapauksia väli- syövän laadut (G6 n = 33, G7 (3 + 4) n = 35, ja G7 (4 + 3) n = 43). Tätä analyysiä varten ohjaus, G6 ja G7 (3 + 4) tapauksessa katsottiin ei-aggressiivinen syöpien ja G7 (4 + 3) ja G8 katsottiin aggressiivisia syöpiä. ROC-analyysi (kuten haettu Kohorteissa I, II, III) ei ole tarkoituksenmukaista tässä, koska ROC laskelma on parasta yksinkertainen positiiviset ja negatiiviset mittasuhteet ryhmien sisällä, ja kohortti IV sisälsi monimutkaisempia subgroupings.

Sen sijaan, sillä kohortti IV analyysi, arvioimme positiivisen ennuste taso kunkin alaryhmän, ja havaitsi, että 55% on G6, 49% G7 (3 + 4) ja 79% G7 (4 + 3) havaittiin samalla allekirjoituksella, joka oli tunnistanut G8 aggressiivinen syöpätapausta (kuva 3). Sitä vastoin PSA taso oli yksin pysty erottamaan vähemmän aggressiivisia G6, G7 (3 + 4) ja aggressiivisempia G7 (4 + 3) ryhmää, saadaan positiivinen ennuste hinnat 88%, 89% ja 100%: lla, näytteissä, joissa PSA tasoon 4 ng /ml.

negatiivinen ennuste korko kontrollitapauksista kartoitetaan yhdessä positiivinen ennuste hinnat syöpätapausta. PSA yksin on korkea positiivinen ennustearvo hinnat kaikki syövän laadut ( 87%), mutta yhdistetyn PSA: n ja RNA-paneeli on pienempi positiivinen ennuste hinnat vähemmän aggressiivisia G6 ja G7 (3 + 4) alaryhmää, 55%, ja 49%: lla ) kun taas lähes saman positiivisen ennuste korko aggressiivisempia G7 (4 + 3), kuten G8 ryhmät (79% ja 83% vastaavasti.

keskustelu

Tavoitteemme tässä tutkimuksessa oli tunnistaa veripohjaisten biomarkkereita aggressiivinen eturauhassyöpä. Keräsimme näytteitä useilla paikkakunnilla, sekä Aasian ja ei-Aasian aiheita, minimoimiseksi etnisten ja rotuerojen. Strategiamme keskityttiin pääasiassa tunnistamiseen biomarkkereita parhaiksi grade syöpiä (Gleason pisteet 8-10), ja me sitten soveltaa mallia, jos potilaalla on Gleason pisteet 7 (4 + 3), Gleason pisteet 7 (3 + 4), Gleason pisteet 6 ja valvontaa. malli onnistuttiin erottamaan potilailla joilla on suuri riski Gleason pisteet 7 (4 + 3) Gleason pisteet 10 niiltä, ​​joilla on alhainen tai keskitason riski Gleason pisteet 6 ja Gleason pisteet 7 (3 + 4). Alustavat tulokset seitsemän geenin malli ennustaa aggressiivinen eturauhassyöpä ovat rohkaisevia ja ne on validoitu useassa paikassa validointi kliinisessä tutkimuksessa.

Tämä vahvistetaan tulosten yllä, PSA omasta on suuri positiivinen ennustus korko. Lisäyksen raportoitu veripohjaisten biomarkkereiden paneeli parantaa PSA tarkkuutta aggressiivinen syöpien. Tähän päästiin korjaamalla yli-diagnoosin aggressiivisia syöpiä G6 ja G7 ikäluokat noin puolet (vähemmän tapauksia tulisi odottaa olevan aggressiivisen syövän molekyylimerkkiaineet alemman luokan syöpää ikäluokat).

Havaitsimme ehdokas biomarkkereiden geenejä ja kehittää geeni dupleksit yhdistämällä ilmentynyt geeni, jossa on ali-ilmentynyt geeni, jotta monistamiseen ero geenien ilmentyminen ja normalisoida yksittäisille vaihtelua (taulukko 2). Tarkastus riippumattomiin kohortti III näytteet osoittivat, että olimme onnistuneet pyrkimyksissämme. Tätä edustaa analyysimme verrokeilla ja vahvistettu Gleason pisteet 8-10 eturauhassyöpäpotilaalla, joiden spesifisyys 80% tai parempi. Geeni-vasta monimuuttuja ennustava malli rakentuu kohortti II -tietoja levitettiin Kohortti III näytteitä, ja spesifisyys pysyi korkeana 83%.

Seitsemän geenit tunnistettiin verestä peräisin mRNA tässä tutkimuksessa ovat pääosin mukana immuunivaste, kemotaksista, ja geenitranskription sääntelyn karsinogeneesis- [22] – [25]. Kiinnostaa, meidän tutkimuksessa havaittiin CRTAM merkittävästi ali-ilmentynyt aggressiiviseen eturauhassyöpään, mikä viittaa mahdolliseen rooliin T-solujen puute eturauhassyövässä. Lisäksi muuttunut KLF ilme on löydetty kasvaimia ja syövän etenemistä [26] – [29], ja useat tutkimukset raportoivat, että aktivaattori proteiini 2 alfa (AP-2a) on keskeinen rooli kasvainten synnyssä [30], [31].

Monet miehet varhaisvaiheen eturauhassyöpä koskaan edetä myöhäisessä vaiheessa syöpään. Osajoukon miesten veltto tauti olisi erinomaisia ​​ehdokkaita aktiivista seurantaa. On kuitenkin puuttuvat selkeät kriteerit erotella suurimpaan riskiryhmään aggressiivinen syöpä ja joiden tauti seurata veltto kurssi [4], [32], [33]. PSA kuin yksinäinen ohjeellinen biomarkkeri on korkea vääriä positiivisia ja merkittäviä väärien negatiivisten tulosten osuus [34]. Se altistaa monet miehet toistuvien tarpeetonta koepaloja, ja tästä aiheutuu kipua, infektio, sepsis, ja mahdollisia CSS loppupään seurauksia, kuten eturauhasen kanssa sivuvaikutuksia impotenssi ja inkontinenssin [35]. Siten tärkeä kliininen haaste eturauhasen onkologian on tunnistaa, populaatiossa PSA-positiivisten miesten, joilla on korkea-asteen tai aggressiivinen syöpä, vaatimatta kaikki potilaat läpikäyvät tuskallinen kudosbiopsiasta.

veren- pohjainen biomarkkereiden allekirjoitus raportoitu tässä tunnistaa eturauhasen syöpiä Gleason tulokset välillä 7 (4 + 3) ja 10. replikoidaan yleisemmän ja edustava väestön, tämä biomarkkereiden allekirjoitus voidaan jalostaa ja käyttää muodostavat perustan yksinkertaisella verikokeella. Käytetään yhdessä PSA riskinä kerrostuneisuus työkalu, raportoidut allekirjoitus voi tunnistaa miesten riski saada korkealaatuisesta eturauhassyöpä. Biopsia, värikylläisyys koepala, vahvistus ja interventio voidaan suositella miehille tämän luokan, koska hoito korkeamman asteen syöpä on osoitettu vaikuttavan myönteisesti 5 vuoden eloonjäämisluvut verrattuna havainto [36]. Käänteisesti miehillä tämä biomarkkereiden allekirjoitus voidaan luottaa enemmän valitsemalla ”aktiivinen valvonta” yli välitöntä hoitoa.

tukeminen Information

Liite S1.

Tiedot koepaloja eturauhassyöpänäytteissä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0045802.s001

(DOC) B

Kiitokset

Haluamme tunnustaa panosta tohtori G Lee ja tohtori WL Chong. Kirjoittajat kiitollisena tunnustavat toimituksellisen apua Isolde Prince ja David J Novak.