Krooninen sairaus

tiivistelmä

miRNA on ehdotettu olevan keskeinen säätelijöinä etenemisen ja etäpesäkkeiden syövässä. Kuitenkin ymmärtää niiden roolit ja molekyylitason mekanismeja tarvitaan antamaan syvempää oivalluksia parempia terapeuttisia mahdollisuuksia. Tässä tutkimuksessa tutkittiin miten ja mekanismi miR-493 kehittämisessä ja etenemiseen nonsmall keuhkosyöpä (NSCLC). Meidän tuloksemme osoittivat, että ilmentyminen miR-493 on huomattavasti pienempi keuhkojen karsinooma. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-493 heikentynyt solujen kasvua ja invaasiota in vitro ja in vivo. Mekaanisesti, miR-493 yleisesti suunnattu suoraan E2F1, mikä johti vankka vähentäminen mRNA: n ja proteiinin. Tämä vaikutus puolestaan ​​vähensi kasvua, invaasio ja metastaasi keuhkosyövän soluja. Meidän havainnot korostavat miR-493 toimintahäiriö edistää syövän etenemiseen, ja sekaantumaan miR-493 mahdollisena terapeuttisena kohteena keuhkosyöpään.

Citation: Gu Y, Cheng Y, Song Y, Zhang Z, Deng M, Wang C, et ai. (2014) MicroRNA-493 vaimentaa tuumorikasvun, ja metastaasit keuhkosyöpään säätelemällä E2F1. PLoS ONE 9 (8): e102602. doi: 10,1371 /journal.pone.0102602

Editor: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, Intia

vastaanotettu: 28 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 19 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 08 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Gu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tutkimus tukee taloudellisesti avustusta Kiinasta Postdoctoral Science Foundation (Project Code: 2012M521588), https://jj.chinapostdoctor.org .cn /V1 /Program1 /Default.aspx. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin histologinen syövän alatyypin maailmanlaajuisesti [1]. Koska suurin osa potilaista on invasiivisia, etäpesäkkeitä [2], ymmärrystä perusteella keuhkosyöpä etenemistä on elintärkeää. Monet tekijät, kuten tuumorisuppressorien ja onkogeenien ovat mukana keuhkojen kasvaimien syntyyn tai etenemiseen. [3], [4]. Äskettäin klassisen jäsenet koodaavan geenejä on nyt myös tyypin ei-proteiinia koodaavan RNA-molekyylin, joka tunnetaan microRNA (miRNA) [5], [6], [7]. miRNA ovat 19-24 nukleotidin pituisia, ja ne säätelevät geenin ilmentymistä kautta epätäydellinen emäspariutumisvuorovaikutusten täydentäviä sekvenssit, jotka sijaitsevat pääasiassa, mutta ei yksinomaan, 3’alueet (UTR) kohde- mRNA: iden. Siten miRNA ovat yksi tärkeimmistä sääntelyyn perheiden geenien eukaryoottisoluissa, ja ne toimivat aiheuttamalla translaation sorron ja transkripti hajoaminen [8], [9]. Nopeasti kehittyvillä todisteet osoittavat selvästi, että miRNA pelata ratkaiseva rooli kasvainten synnyssä ja etenemisessä [10], [11], [12]. Esimerkiksi miR-34 kuulemma estää syövän aloittamista ja etenemistä keuhkoadenokarsinooma [13]. miRNA-218, uusi säätelijä HMGB1, kuulemma tukahduttaa solujen vaeltamiseen ja invaasiota ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [14]. Tästä huolimatta edelleen tuntemus molekyylitason mekanismeja miRNA tarvitaan antamaan syvyyttä kehittää parempia terapeuttisia mahdollisuuksia potilaille, joilla on keuhkosyöpä.

Meidän äskettäisessä tutkimuksessa (Chen, et al. Julkaisematon paperi), käytimme miRNA microarray todeta, että miR-493-ekspressio vähenee merkittävästi 95D-soluissa, erittäin metastaattinen keuhkosyöpä solulinja, verrattuna HBE, immortalisoitu ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen linja. Niinpä hypoteesi, että miR-493 saattaa olla tärkeä rooli keuhkosyövän kasvainten synnyssä ja etenemisessä.

Voit testata tätä hypoteesia, tutkimme ilmaus miR-493 käyttämällä qRT-PCR 6 keuhkosyövän solulinjat ja 65 keuhkosyövän kudosnäytteiden esillä olevassa tutkimuksessa. Tiedot osoittivat, että ilmentyminen miR-493 on huomattavasti pienempi keuhkosyövän soluja ja kudoksia. Toiminnallinen in vitro ja in vivo tutkimukset osoittivat, että miR-493 inhiboi keuhkosyövän solujen proliferaatiota, invaasiota ja etäpesäkkeiden suoraan kohdistamalla 3′-UTR E2F1 aikaansaamaan spesifisen ja vankka pudotus proteiinin. Meidän havainnot korostavat miR-493 toimintahäiriö edistämisessä kasvainprogression ja kasvaimen kehittymisen; ja sotkea miR-493 mahdollisena terapeuttisena kohteena keuhkosyöpään.

Tulokset

miR-493 on vaimentua keuhkosyövässä ja negatiivisesti yhteydessä selviytymisen

tunnistamiseksi dysregulation miRNA-493 keuhkosyövän, tutkimme ilmaus miR-493 käyttäen reaaliaikaista PCR 6 johdetut solulinjat keuhkosyövän ja yksi keuhko fibroblast rivi (MRC5); sekä kuolemattomaksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (HBE). Tiedot osoittivat, että miR-493 ilmentyminen väheni merkittävästi keuhko- syöpäsoluja, erityisesti 95D, erittäin metastaattinen keuhkosyöpä solulinja (kuvio 1A). Lisäksi vertasimme miRNA-493 ilmentymistason 65 tuoretta keuhkosyöpä kudoksia reaaliaikaisella PCR: llä. Vastaavasti, ilmaus miR-493 oli merkitsevästi pienempi keuhkosyövän kudoksissa kuin vastaavassa normaalissa keuhkojen kudoksiin (kuvio 1B). Sen määrittämiseksi, onko downregulation miR-493 vaikuttaa keuhkosyöpä fenotyyppien tai kliinisiä patologisia piirteitä, käytimme korrelaatio analyysi ja totesi, että miR-493 ilmentymisen taso korreloi käänteisesti kasvaimen etäpesäkkeitä (p = 0,038), mutta ei muita patologisia parametreja, kuten kliinisessä vaiheessa (taulukko 1). Lisäksi Kaplan-Meier eloonjääminen analyysi tehtiin käyttämällä potilaan kokonaiselinaika (OS, kuvio 1 C) ja taudista vapaan eloonjäämisen (DFS; kuvio 1D) analysoida merkitystä miR-493 pitemmälle kliinisen ennusteen. Tulokset osoittivat, että potilailla, joilla on alhainen miR-493 lauseke oli lyhyempi keskimääräinen OS ja DFS kuin potilailla, joilla on korkea miR-493 lauseke (P = 0,006 OS, P = 0,000 DFS, kuvio 1 C ja D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että downregulation miR-493 vaikuttaa keuhkosyöpää syövän synnyn ja ennusteen.

(A) Suhteellinen ekspressiotasot miR-493 6 johdetut solulinjat keuhkosyövän ja yksi keuhko fibroblast rivi (MRC5 ), sekä kuolemattomaksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (HBE) määritettiin qRT-PCR. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM vähintään 3 erillisestä kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01. (B) MIR-493 ilmentymistason 65 pariksi ihmisen NSLCC ja vastaavat normaalit kudokset tutkittiin reaaliaikaisella PCR: llä käyttämällä GAPDH sisäisenä kontrollina. Ilmaisu arvo (ACt (N) – ACt (T)) edustaa ero on miR-493: n välillä normaalin kudoksen ja kasvain. A: n eks- arvo 1 tarkoittaa, että miR-493 tasoa nostetaan kasvaimissa. A: n eks- arvo 1 tarkoittaa, että miR-493 tasot vähenee kasvaimissa. Laitepari t-testi (yhden muuttujan) käytettiin vertaamaan eron välillä normaalin ryhmän ja syövän ryhmä. (C) Alhainen miR-493 korreloi lyhyempi selviytymistä. Käyttöjärjestelmä ja DFS käyriä kaikilla tutkituilla potilailla, joilla on korkea tai lowmiR-493 ilme.

yli-ilmentyminen miR-493 heikentää solujen lisääntymistä ja invaasiota

arvioimiseksi biologisista vaikutuksista yli-ilmentämään miR-493 keuhkojen syöpäsoluja, vakaa kohdunulkoinen yliekspressiosolu- alaryhmiä 95D /miR-493 ja H1975 /miR-493 ja niiden pariksi säätökennoja rakennettiin. QRT-PCR-analyysi osoitti, että transfektio onnistui (kuvio 2A). Olemme todenneet, että yli-ilmentyminen miR-493 in 95D ja H1975 solujen merkittävästi alentunut solujen lisääntymistä kontrolleihin verrattuna käyttämällä solun kasvua määrityksessä (kuvio 2B), solusyklin jakautumisen (kuvio 2C) ja pesäkemuodostusta (kuvio 2D) . Lisäksi testasimme miR-493 voisi olla rooli kasvaimen kasvua käyttämällä karvattomia hiiriä ksenograftimalleja (kuusi hiirtä ryhmää kohti). 95D transfektoitu joko miR-493 tai salattu ohjaus istutettiin nude-hiiriin ja kehittynyt kiinteitä kasvaimia 25 päivää. Kuitenkin kasvaimen kasvua merkittävästi vähentää, kun miR-493 ilmentyi stabiilisti 95D-soluissa (kuvio 2 E). Nämä tulokset ymmärtää, että miR-493 voi voimakkaasti estää kasvainsolujen kasvua.

, vakaa kohdunulkoinen yliekspressio miR-493 oli peräisin solualaryhmiä 95D /miR-493 ja H1975 /miR-493. qRT-PCR: ää käytettiin tarkistaa transfektion. ** Tarkoittaa P 0,001 (t-testi). B, kasvukäyrät osoittaneet, että keuhkojen solut kykenivät leviämisen. Solut ympättiin 12-kuoppalevyille halutusta solusta pitoisuudet ja pidettiin elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää. Imeytyminen arvo soluja mitattiin ilmoitettuina ajankohtina kolmena kappaleena ja niiden kasvu kirjattiin. * Tarkoittaa, että P 0,05 (t-testi). C, Solut sykli jakelu- keuhkosyöpään solujen analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä. Leviämisen indeksi (PI) on käytetty kuvaamaan potentiaali soluproliferaation. PI = G2 + S jae) /(G1 + G2 + S) x 100%. Vasen, edustaja kuva solukierron prosenttiyksikön muuttumassa. Oikea, tilastollinen analyysi solusyklin prosenttiyksikköä, tiedot esitetään keskiarvona ± SEM 3 itsenäisen kokeen * tarkoittaa P 0,05 (t-testi). D, pesäkkeiden muodostumisen määritykset käytettiin vaikutuksen määrittämiseksi miR-493 pitkän aikavälin solujen eloonjäämistä. Vasen, kuuluvalla alueella kullakin maljalla Pesäkkeiden mitattiin käyttäen kuvantamisjärjestelmä ja edustettuina prosenttiosuus kokonaisalasta levyn. Oikea, vaikutus miR-493 ilmentymisen vaikutus pesäkkeen muodostumista keuhkosyövän solut: kukin sarake edustaa keskiarvoa rinnakkaisessa kokeessa kussakin ryhmässä. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM. * Tarkoittaa, että P 0,05 (t-testi). E, miR-493 esti keuhkojen kasvaimen kasvua hiiren ksenograftimalleissa (12 eläintä). Vasen, edustaja kasvaimia eristetty hiiristä 25 päivää sen jälkeen, kun ihon alle 95D-soluja, jotka oli stabiilisti transfektoitu miR-493-ilmentävät tai kontrollivektorilla. Oikea, Tiedot ovat keskiarvo ± SEM. * P 0,05, (t-testi).

Lisäksi solukasvuneston, vaikutus miR-493 kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden käsiteltiin myös tässä tutkimuksessa. Haava-paranemista määritys osoitti, että miR-493 voi dramaattisesti tukahduttaa kasvainsolujen liikkuvuuden 95D-soluissa verrattuna tyhjällä vektorilla transfektoiduissa soluissa (kuvio 3A). Lisäksi hyökkäys määritys suoritettiin myös. Tuloksena osoitettiin, että miR-493 voisi estää invasiivisen kyvyn keuhkosyövän soluja (kuvio 3B). Kokeellinen eläinmalli käytettiin edelleen tutkia estävä vaikutus on miR-493 kasvaimen etäpesäkkeitä, 95D /miR-493-soluja injektoitiin häntälaskimoihin nude-hiirten (viisi hiirtä per ryhmä). Tyhjä vektori transfektoitiin (95D /kontrolli) soluja käytettiin kontrolleina. Hiiret tapettiin ja keuhkot irrotettiin, ja etäpesäkeleesioita keuhkojen sitten havaita käyttämällä Bruker Small Animal Imaging System (Saksa) sen jälkeen, kun 28 päivää. Aloilla etäpesäkeleesioita muodostuminen keuhkoissa oli merkittävästi vähentynyt verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 3C). Vaikka näkyvissä etäpesäkenystyröiden ei havaittu pinnalla keuhkojen, etäpesäkeleesioita havaittiin keuhkoissa hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäytymistä (kuvio 4D). Nämä tulokset osoittivat, että miR-493 voi estää tehokkaasti kasvaimen etäpesäke in vitro ja in vivo.

A, naarmu haava määritykset suoritettiin 95D-soluissa, jotka on transfektoitu miR-493 ja sen pariksi valvontaa. Tulokset 3 erillistä määritykset keskiarvo yhteen ja piirretään. *, P 0,05 (vasemmalla). Edustavat kuvat määritykset näkyvät. Alkuperäinen suurennus: × 200 (oikealla). B, invasiivista ominaisuudet H1975 ja 95D-solut analysoitiin Transwell määritys käyttäen Matrigel-päällystetty kammioon. Siirtyneet solut graafisesti keskimääräinen lukumäärä solua per näkökentän 3 eri kokeissa, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. * P 0,01 (vasemmalla). Edustavat kuvat määritykset näkyvät. Alkuperäinen suurennus: × 200 (oikealla). C, in vivo etäpesäkkeitä määrityksiä käytettiin tutkimaan keuhkojen metastaattinen kyky 95D /miR-493-soluja leimattiin vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) ja sen parina ohjaus solu 95D /ohjaus. Keuhkosyövän solut ruiskutetaan häntälaskimoiden viiden viikon ikäinen hiirillä. Päivänä 28, kaikki eläimet tapettiin ja keuhkot leikattiin. Keuhkojen etäpesäke kuvat saatiin Bruker pieneläinlääketieteen Imaging System. Keuhkokudoksen poistettiin, kiinteä, parafiiniin upotettu sarjaan leikattuna, ja altistettiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 versus ryntäily. D ja E, miR-493 stabiili transfektio vähentää E2F1 proteiini ja mRNA-tasoja. F ja G, taso miR-493 korreloi käänteisesti E2F1 ilme. F, The E2F1 ekspressiotasot mitattiin immunohistokemia tuumorikudoksissa. Nämä parafinoidut kudokset näytteet olivat samasta lähteestä, 65fresh keuhkosyöpää kudosta Yllämainituissa kuvassa 1. edustava kuva ekspressiotasot E2F1 ihmisen keuhkojen kasvain kudosten (200 x) on esitetty. G, tiedot ovat keskiarvoja ± s.e.m. * Tarkoittaa P 0,05.

miR-493 suoraan tavoitteet ja estää E2F1

Perustuen havaintoon, että miR-493 vaikuttaa solujen lisääntymistä, invaasiota ja etäpesäkkeiden etsittiin kohdegeenien Mir-493 liittyvää liikkuvuutta ja muuttoliikettä kahdella tavoite scan algoritmia (TargetScan ja microRNA.org). Suuri määrä eri kohdegeenien ennustettiin. Näistä ehdokas kohdegeenien, E2F1 valittiin edelleen kokeellista validointia, ei vain koska se tunnistettiin kohteena miR-493 sekä tietokantoja (kuvio 4A), mutta myös koska se usein sääntelyn kasvainkudoksissa [15], [16 ], [17]. Dual-lusiferaasireportteri analyysi osoitti, että co-ilmentymisen miR-493 inhiboi merkittävästi toimintaa tulikärpäsen lusiferaasi, joka suorittaa villityypin, mutta ei mutantti-3′-UTR: E2F1 (kuva 4B, C) 95D ja H1975-soluissa, mikä osoittaa, että miR-493 voi estää geeniekspression välityksellä sitovan sekvenssin 3′-UTR E2F1. Lisäksi käyttöön miR-493 vähentynyt ilmentyminen solun E2F1 mRNA: ta ja proteiinia (kuva 4D, E). Kuitenkin, kun estävä oligonukleotideja vastaan ​​miR-493 transfektoitiin keuhkosyöpäsoluissa 95D tai H1975, käänteinen ilmentymiskuvio ei havaittu miR-493 ja E2F1-proteiinia (tuloksia ei ole esitetty). Me olettaa, että tämä miRNA hoito vaikutti vähän endogeeninen ilmentyminen sekä keuhkosyövän soluja. Lisäksi ilmiö edelleen vahvistanut käänteinen korrelaatio tason E2F1 proteiinia, osoitetaan immunohistokemiallisesti värjäys, ja taso miR-493 ilmentymisen arvioitiin Q-PCR: raikasta keuhkosyövän kudoksia käytetään edellä analyysit (kuvio 4F , G ja kuvio 1 B).

E2F1 osaltaan vaikutusta tukahduttaa leviämisen ja invaasion aiheuttama miR-493

lisäksi rakensimme siRNA fragmentteja kohdistaminen E2F1 kaataa ilmaus E2F1 tutkia osuus E2F1 vaikutuksesta miR-493 näistä fenotyyppejä. Huomasimme, että knockdown E2F1 voisi osittain simulointi solujen kasvuun (kuvio 5 B) ja solujen invaasiota (kuvio 5C ja D) fenotyyppi aiheuttama yli-ilmentyminen miR-493. Sen jälkeen, pelastus Kokeet suoritettiin yli-ilmentävät E2F1-Δ3′- UTR vektori (ilman endogeenisen 3′-UTR: n) soluun ilmentävät miR-493. MIR-493 aiheuttama downregulation E2F1 oli pelastettu tuotaessa E2F1. Lisäksi yli-ilmentyminen E2F1 lievensi solujen kasvun inhibitio (kuvio 5A) ja invaasiota (kuvio 5C ja E) aiheuttama miR-493. Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-493 kohdistuu erityisesti E2F1 spesifisyys edistää vaikutus solujen kasvuun ja invaasiota.

The knock-down of E2F1 osittain simuloitu tukahduttaminen keuhkosyövän solujen kasvua aiheuttama yli-ilmentyminen miR-493 in 95D ja H1975 soluja. Kasvukäyrät osoitti kykyä keuhkojen solujen lisääntymistä. Imeytyminen arvo soluja mitattiin ilmoitettuina ajankohtina kolmena kappaleena ja niiden kasvu kirjattiin. B, yli-ilmentyminen eksogeenisen E2F1 (ilman 3′-UTR E2F1) pelastettu kun leviäminen tukahduttaminen aiheuttama miR-493 in 95D ja H1975 soluja. C, T invasiivisia ominaisuuksia H1975 ja 95D-solut, jotka olivat joko knock-down tai yliekspressio E2F1were analysoitiin siirtokuoppaan määritys käyttäen Matrigel päällystettyä kammioon. Siirrettyjä soluja piirrettiin keskimäärin solua näkökentän 3 eri kokeissa, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tiedot ovat keskiarvo ± SD. * Tarkoittaa p 0,05. D ja E, Kuvat ovat määrityksistä on esitetty. Alkuperäinen suurennus: × 200.

E2F1 asetusten ERK ja PI3K-AKT väylän 95D ja H1975 solujen

E2F1 on kriittinen rooli solusyklin etenemisen, mikä puolestaan ​​edistää solujen leviämisen ja etäpesäke. Kuitenkin tarkka mekanismi E2F1 toiminto on monimutkainen ja riippuu solujen yhteydessä [18]. Tuore tutkimus osoitti, että E2F1 riippuvaisen syövän etenemiseen laukaisi aktivointi sytoplasmisen Ras /Raf signa-, kuten PI3K-AKT [16] ja MEK-ERK reittejä [19], joista useimmat säätelevät solujen proliferaatiota, eloonjäämistä ja hyökkäys [20], [21]. Siten tutkimme t onko miR-493 säätelee näitä reittejä kohdistamalla E2F1. Ylössäätelyyn miR-493, kautta transfektio miR-493, ja 95D ja H1975-solujen vähentynyt fosforylaation tasoja AKT ja sen alavirrassa oleva kohde GSK3p (kuvio 6A). Samoin, miR-493 tukahdutti myös tasot fosforyloitua ERK (kuvio 6A). Havaitsimme myös, että knockdovvn miR-493 transfektoimalla anti-miR-493 HBE, A549 ja H1299 soluja, joissa suhteellisen ilmentymistason miR-493 oli suurempi, nostivat fosforyloidun AKT, GSK3b ja ERK ( kuva 6B). Nämä western blotting tulokset osoittivat, että miR-493 on negatiivinen säätelijä AKT ja ERK polkuja. Sen jälkeen, pelastus Kokeet suoritettiin yli-ilmentävät E2F1-Δ3′- UTR vektori (ilman endogeenisen 3′-UTR: n) in miR-493-käsitellyt solut. MIR-493 aiheuttama downregulation E2F1 oli pelastettu tuotaessa E2F1 (kuvio 6C), ja fosforylaatio tasot AKT ja ERK muutettiin samalla tavalla. Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-493 estää AKT ja ERK reitit kohdistamalla E2F1.

(A) miR-493 yliekspressio vähensi aktiivisuutta AKT ja ERK reittejä 95D ja H1975 soluja. (B) toinen knockdovvn miR-493 anti-luki- 493 lisäsi aktiivisuutta AKT ja ERK signalointi HBE, A549 ja H1299 soluja. (C) miR-493 (tai ryntäily kontrolli) transfektion seurasi E2F1 (tai mock vektori) transfektiota 24 tuntia myöhemmin 95D-soluissa vaikuttaa AKT ja ERK signalointi. Akt-reitin aktiivisuus mitattiin tarkastelemalla ilmaus fosforyloidun AKT (Pakt), kun taas EKR reitin aktiivisuus mitattiin tarkastelemalla ilmaus fosforyloidun ERK (Perk).

Keskustelu

Vaikka kourallinen tutkimuksissa on todettu erityisiä miRNA osallistuvat ihmisten kasvaimien syntyyn ja etenemiseen [10], [11], [12]. Uskomme myös enemmän pyrittävä löytämään sopivat miRNA sekä erityisiä mekanismeja, joilla ne voisivat toteuttaa tiettyjä toimintoja, erityisesti synnyssä ja etenemisessä erilaisia ​​kasvaimia. Täällä tunnistimme että miR-493, mahdollisesti ehdokas tuumorisuppressoriproteiinia miRNA [22], [23], heikkeni merkittävästi keuhkosyöpää ja että alemman miR-493 ilmentyminen liittyi tuumorimetastaasin ja huono ennuste (kuva 1 C, D ja Pöytä 1). Ektooppinen ilmentyminen miR-493 vaimensi merkittävästi kykyä solujen lisääntyä ja tunkeutua keuhkosyövän solut 95D ja H1975 in vitro ja in vivo.

Tähän mennessä luonnehdinta miR-493-toiminto ei ole ollut laajaa vaikka useat tavoitteet on tunnistettu keskeinen rooli solujen vaeltamiseen ja etäpesäkkeiden polkuja, mukaan lukien FZD4, Rhoc, MKK7 ja IGF1 R [22], [23], [24]. Täällä olemme tunnistaneet uuden tavoite miR-493, E2F1. E2F1 on tärkeä transkriptiotekijä, joka on kriittinen rooli solusyklin etenemiseen ja on tiukasti säännelty retinoblastoomaproteiiniin (Rb) [25]. RB-vapauttaa E2F1 päässä ehkäisevän kompleksin, joka puolestaan ​​indusoi jatkuvaa ilmentymistä kohde- geenejä, joiden tuotteet edistävät solusyklin etenemistä [26]. Ektooppinen ilmentyminen E2F1 johtaa neoplastisten muutos jyrsijän soluja [27], [28], ja havaintoja siirtogeenisten mallien osoittaneet, että lisääntynyt E2F1 aktiivisuus liittyy kasvaimen kehitys eri kudoksissa [29], [30], [31] . Poikkeavuuksia E2F1-geenin ilmentyminen ja /tai E2F1-geenin monistamisen, on kuvattu eri syöpäsolulinjoissa ja kasvaimen tyypit, mukaan lukien keuhkosyöpä, [32], [33]. On huomioitava, että yli-ilmentyminen E2F1 usein liittyy korkea-asteen kasvaimet ja huono potilaan eloonjäämisen ennustetta [29], [31], [34], mikä viittaa siihen, että sen onkogeeniset ominaisuudet ulottuvat kyky stimuloida poikkeavaa kasvua neoplastisten solujen. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, uusin todisteita on paljastanut, että E2F1 on suurin merkitys syövän etäpesäkkeiden ja chemoresistance [18], [19], [35]. Tässä osoitamme, että ilmaus E2F1 on korkea keuhkosyöpä. Samalla olemme päättäneet, että miR-493 suoraan tavoitteet ja estää E2F1protein ilme. Dual-lusiferaasireportteri analyysi osoitti, että miR-493 voi sitoutua sekvenssin 3′-UTR E2F1 (kuva 4B). Lisäksi otetaan käyttöön miR-493 vähentynyt ilmentyminen solun E2F1 mRNA: ta ja proteiinia (kuvio 5C, D) .Whereas, kun estävä oligonukleotideja vastaan ​​miR-493 on transfektoitiin HBE, A549 ja H1277-soluja, käänteinen ilmaisu kuvio oli havaittu miR-493 ja E2F1 proteiinia (kuvio 6 B). Koska E2F1 on merkittävä rooli sääntelyn solujen lisääntymistä, eloonjääntiä ja invaasio, me tutkimme, E2F1 osaltaan vaikutusta miR-493 seuraavilla fenotyyppejä keuhkosyöpään solujen. Rakensimme siRNA fragmentteja kohdistaminen E2F1 kaataa ilmaus E2F1, ja totesi, että knock-alas E2F1 voisi osittain simuloida solujen kasvuun (kuvio 5 A) ja solujen invaasiota (kuva 5 D, E) fenotyyppi aiheuttama yli-ilmentyminen miR-493. Lisäksi yliekspressio E2F1 (ilman endogeenisen 3′-UTR) pelastettu inhibition solujen kasvua ja invaasiota aiheuttamat miR-493 (kuva 5B, D ja E).

Äskettäinen tutkimus osoitti, että E2F1- riippuvainen kasvaimen etenemistä on välittämän aktivaation sytoplasmisen Ras /Raf signa- [19], kuten MEK-ERK ja PI3K /AKT-reitin, useimmat jotka säätelevät solujen proliferaatiota, eloonjäämistä ja invaasio. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että miR-493 voi estää konstitutiivista aktiivisuutta AKT ja ERK reitit kohdistamalla E2F1. Sen jälkeen, pelastus kokeet osoittivat, että miR-493 aiheuttama downregulation E2F1 oli pelastettu tuotaessa E2F1 (kuvio 3B), ja fosforylaatio tasot AKT ja ERK muutettiin samalla tavalla. Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-493 estää AKT ja ERK reitit kohdistamalla E2F1.

Yhteenvetona tiedot meidän tutkimuksessa todettiin, että miR-493 voi olla mahdollinen kasvain tukahduttava miRNA joka estää solujen invaasiota ja lisääntymistä esto E2F1 keuhkosyövän, ja myöhemmin estää loppupään AKT ja ERK signalointireittejä, hallita solujen lisääntymistä, invaasiota ja kasvaimen kehittymisen. Kuitenkin tulevissa tutkimuksissa on havaita enemmän Ehdokaskohteiden ylimääräisiä syöpätyypeissä kokonaan selkeyttää toimintaa miR-493 kasvainten synnyssä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuuri

ihmisen keuhkosyövän solulinjat (H1975, A549, H1299, H446), MRC5, normaali diploidinen ihmisen solulinja keuhkojen fibroblasteja, ja kuolemattomiksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen HBE saatiin ja ylläpitää suositusten mukaisesti American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA, USA) kantavassa ihmisen keuhkosyövän solulinjassa 95D saatiin Cell Bank of Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). H1975, A549, H1299, H446, HBE ja 95D-solut ylläpidettiin RPMI-1640-alustassa (Hyclone, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone, USA). MRC5-soluja ylläpidettiin DMEM-alustassa (Hyclone, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone, USA) kantavassa soluja inkuboitiin ilmakehässä 5% CO2, 37 ° C: ssa.

Potilasnäytteet

Kaikki kudosnäytteet kerättiin kautta kirurginen resektio potilailta diagnosoitu välillä maaliskuussa 2009 ja vuoden 2012 ensimmäinen Affiliated Kasvain sairaalan Guangzhou Medical University (Guangzhou, Guangdong, Kiina). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta TET. Tutkimuksen protokolla hyväksyi eettisen komitean Guangzhou Medical University.

käänteiskopioijaentsyymin (RT) -PCR ja qRT-PCR

Koko RNA eristettiin soluista tai kudoksista käyttäen Trizol reagenssia ( Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ja RT-reaktiot suoritettiin käyttämällä miR-493 spesifistä aluketta. Erityinen kantasilmukan RT alukkeita miR-493 ja U6 ostettiin Ribobio co., Ltd (Guangzhou, Kiina). Alukkeen sekvenssit E2F1 määriteltiin seuraavasti: Forward-aluke: 5′-CCCATCCCAGGAGGTCACTT-3 ’; Reverse-aluke: 5-CTGCAGGCTCACTGCTCTC-3 ’. Alukkeen sekvenssit GAPDH määriteltiin seuraavasti: Forward-aluke: 5’-CCACATCGCTCAGACACCAT-3 ’; Reverse-aluke: 5’-TGACAAGCTTCCCGTTCTCA-3 ’. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen standardia protokolla SYBR Green PCR Kit (Toyobo, Osaka, Japani). U6 ja GAPDH käytettiin viitteinä miRNA ja mRNA: t, vastaavasti. 2

-ΔΔCt menetelmää käytettiin määrittämään suhteelliset määrät geenin ilmentymisen. Kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena.

Western blot-analyysi

proteiinipitoisuus lysaateissa mitattiin proteiini BCA Assay Kit (Bio-Rad), ja 30 ug proteiinia sekoitetaan 2 × SDS latauspuskuria ladattiin kaistaa kohti. Proteiinit lysaatit erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore). Seuraavaksi membraaneja inkuboitiin 12 tunnin ajan 4 ° C: ssa antiseerumin kanssa, joka sisältää vasta-aineita E2F1, p-ERK, andβ-aktiini ostettu Cell signaloinnin Technology, Akt, p-Akt, GSK3p: n ja p-GSK3p ja ERK hankittiin Sigmalta -Aldrich Technology. Peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen ja ECL Western blotting detektioreagensseja käytettiin visualisethe kohdeproteiinit (ECL New England Biolabs), joka oli määrällisesti Bio Image Älykäs kvantisointi 1-D (versio 2.2.1, Nihon-BioImage Ltd.). Anti-β-aktiini-vasta-ainetta käytettiin proteiinin lastaus ohjaus.

immunohistokemia

kudos liukuu sisältyy 65 ensisijaista keuhkojen näytteitä ja vastaavassa normaalissa keuhkojen epiteelikudosten. Immunohistokemia suoritettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu kudokseen käyttäen anti-E2F1-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology) ja tavallinen streptavidiini-peroksidaasia värjäysmenetelmällä (Biotin-streptavidiini (ABC) IHC detektiovälinepakkaukset, Abcam Inc, USA). Immunohistokemia tulokset pisteytettiin voimakkuuden mukaan (0-4) ja positiivisten solujen prosenttiosuuden pisteet 0: ei värjäytymistä; 1: 10% positiivisia soluja; 2: 11-50% positiivisia soluja; 3: 51-75% positiivisia soluja; 4: 0,75% positiivisia cells.The suhteellinen ekspressio saadaan kertomalla intensiteettiä prosentteina.

lusiferaasireporttiterilla määritys

pmirGLO Dual-Luciferase miRNA tavoite ekspressiovektoria käytettiin 3 ”-UTR Lusiferaasimäärityksiä (Promega). Kohdegeenien miRNA-493 valittiin perustuen kohde scan algoritmeja [microRNA.org (https://www.microrna.org/microrna/home.do) ja TargetScan (https://www.targetscan.org/) ]. Alukesekvenssit käytetään määriteltiin seuraavasti: E2F1 forward-aluke: GCCTCGAGGAGATGCTCACCTTGTCTCTG, käänteinen aluke: CTAGCGGCCGCTGGATCTGCTTTTGAGTT. Mutant E2F1 eteenpäin aluke: GAGGTGAGTGGGG

ACAAGG

CTGATGTGGGCAGGAGGGGTG, Mutant E2F1 vaihtaa pohjamaali: CCTGCCCACATCAGCCTTGTCCCCACTCACCTCTCCCATCTC. Bold ilmaisee XhoI (CTCGAG), ja alleviivaus osoittaa Notl sisäinen sivusto. Italic (villi: GACCTTCA, mutantti: ACAAGG) osoittaa kohdesekvenssin. 3′-UTR lusiferaasianalyysissä, 293T-solut kotransfektoitiin HSA-miR-493 ja pmirGLO Dual-Luciferase miRNA kohdistaa ekspressiovektorit villityypin tai mutantti-kohdesekvenssiin käyttäen Lipofectamine 2000.The Lusiferaasimääritys suoritettiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) 48 tuntia transfektion jälkeen. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD rinnakkaisessa kokeessa ja verrattiin tasoon villityypin sekvenssin vektorit saadaan mutantti-tyypin sekvenssivektori transfektoituja soluja, jotka on normalisoitu 100%: iin.

Lentivirus tuotannon ja infektio

rakentamiseksi ilmentävää vektoria miR-493, esiaste sekvenssi miR-493 (MI0003132) syntetisoitiin, hehkutettu ja insertoitiin sitten BamHI-Hindlll-fragmentti PGCI-L3-vektoriin (GeneCopoeia, Inc., Rockville, MD USA) kantavassa lentivirus plasmidit kotransfektoitiin pLP1, pLP2, ja PLP /VSVG (GeneCopoeia, Inc., Rockville, MD USA) 293T-soluihin (Invitrogen), ja virus-supernatantteja valmistettiin valmistajan ohjeita. Sillä lentivirus infektio, soluja inkuboitiin viruksen kanssa sisältävien supernatanttien läsnä ollessa 6 ug /ml polybreeniä. Tartunta-solut selektoitiin, kun läsnä on 2 ug /ml puromysiiniä tuottaa kaksi pariksi stabiili monoklonaalista solulinjoja (stabiili solulinja, joka ekspressoi miR-493, 95D-miR-493, H1975-miR-493 ja niiden valvontaa vakaa solulinja, 95D -ohjaus tai H1975- kontrolli).