Krooninen sairaus

tiivistelmä

Koska yksilöllistä hoitoa tulee yhä tärkeämpää hoidossa peräsuolen syöpä, tarkka ja tehokas lähestymistapa olisi siinä hoitopaikassa auttaa lääkäreitä tekemään päätöksiä. Kiertävä kasvainsolujen (CTC), peräisin joko primaarinen tai metastaattinen, voi antaa tärkeää tietoa diagnoosiin ja seurantaan syövän. Kuitenkin vaikutuksia ja kehittämistä CTC on rajoitettu johtuen äärimmäisen harvinaisia ​​näiden tuumorisolujen. Tässä tutkimuksessa valmistettu yksinkertainen ja tehokas mikrofluidilaitetta, joka hyödyntää lukuisia suodatetaan mikro- se rikastuttaa suurikokoisista tavoite syöpäsolujen kokoverestä. Erittäin korkea CTC pyyntitehokkuudesta (keskimääräinen hyötykäyttöaste: 94%) saatiin tämän laitteen optimaalisella virtausnopeudella 0,5 ml /h ja kanavan korkeus 5 pm. Lisäksi käytimme tätä laitetta havaitsemiseksi CTC 60 potilaalla, joilla peräsuolen syöpä. CTC laskennat peräsuolen syövän potilaista olivat merkittävästi korkeammat kuin terveillä koehenkilöillä. Lisäksi CTC laskee havaita tällä laitteella olivat huomattavasti korkeammat kuin by EpCAM helmi-tekniikkaan perustuva menetelmä peräsuolen syövän potilaille, joilla on eri vaiheessa. Erityisesti sillä lokalisoitu peräsuolen syöpäpotilaille, positiiviset hinnat näytteiden yli 3 CTC per 5 ml verta käyttämällä mikrolaitteessa vs. EpCAM liimoja oli 100% vs. 47%, vastaavasti. Siten tämä laite tarjoaa uuden ja tehokkaan työkalun tarkka tunnistaminen ja mittaaminen CTC potilailla, joilla peräsuolen syöpä, ja on laajoja potentiaalisia kliinisessä käytössä.

Citation: Sun W, Jia C, Huang T, Sheng W Li G, Zhang H, et al. (2013) High-Performance Size-Based mikrolaitteessa havaitsemiseksi verenkierrossa olevia kasvainsoluja Ääreisverenkierrosta in peräsuolisyöpä Potilaat. PLoS ONE 8 (9): e75865. doi: 10,1371 /journal.pone.0075865

Editor: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Espanja

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2013. Hyväksytty: 16 elokuu 2013; Julkaistu: 16 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Sun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat joitakin tieteellisen tutkimuksen varoja seuraavasti: 1. National Basic Research Program of China (973 Ohjelmanro 2012CB933303) 2. Key Clinical projekti terveysministeriön (2010-2012) 3. Fudanin yliopiston Radiation Medicine Research kolmas vaihe ”985 projekti” (Grant No. 985III-YPT06) 4. National Natural Science Foundation of China (nro 81101645, 61271162) 5. Shanghai Municipal komission tiede ja teknologia (No.12nm0503702, 11JC1414400). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viime vuosina ilmaantuvuus peräsuolen syöpä on jyrkässä nousussa kaikkialla maailmassa [1]. Huolimatta viime aikoina saavutetut edistysaskeleet diagnostisissa ja käsittelytekniikoita, lopputulos käsittelyn jälkeen edelleen heikko lähinnä ulkonäön etäispesäkkeitä [2] – [4].

Kiertävä kasvainsolujen (CTC), irtoa joko primaarinen tai metastaattinen syöpä, on todettu, että perifeerisen veren potilaiden ja liittyy usein syövän uusiutumista ja etäpesäkkeiden [5] – [6]. Näin ollen, havaitseminen CTC odotettaisiin tehokas väline syövän ennuste, diagnoosi minimaalinen jäljellä taudin arviointiin kasvaimen herkkyys syöpälääkkeet, ja soveltaminen yksilöllinen hoito [7].

Kuitenkin yritetty tutkia CTC rajoittavat niiden harvinaisuus, jossa pitoisuudet niinkin alhainen kuin yksi CTC per miljardi verenkierrossa hematologisia soluja [8]. Näin CTC täytyy täydentää, eristetty ja asianmukaisesti tunnistettu ollakseen kliinisesti käyttökelpoisia. Tällä hetkellä yksi yleisimmin käytetyistä menetelmistä CTC havaitseminen perustuu magneetti- helmi konjugoitu vasta-aineita epiteelituumori liittyviä pinta-antigeenejä, kuten epiteelisolujen adheesiomolekyyli (EpCAM) [9] – [10]. CellSearch (Veridex, NJ, USA) järjestelmä on tyypillinen esimerkki käyttäen anti-EpCAM magneettihelmi perustuva menetelmä havaita CTC ja se on ainoa järjestelmä hyväksynyt Yhdysvaltain FDA kliinisten käyttöaste metastaattisen rintasyövän, peräsuolen ja eturauhasen syöpä toistaiseksi [ ,,,0],11]. Kuitenkin jotkut tiedot osoittivat, että epiteelin antigeeni saattaa menetettäväksi CTC johtuu epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), jonka katsottiin olevan ratkaiseva tapahtuma metastaattisessa prosessissa [12] – [13]. Tämä saattaa olla suurin ongelma, joka rajoittaa laaja soveltaminen EpCAM perustuva menetelmä kliinisessä käytössä.

Toisaalta, toinen yleisesti käytetty lähestymistapa erottaa CTC verinäytteistä perustuu eroihin solun koon ja muovattavuuden välillä CTC ja hematologiset solut. Yleisesti, koot CTC vaihtelevat 15-25 um, suurempi kuin hematologisten solujen (Keskimääräinen koot punasolujen ja perifeerisen veren lymfosyytit ovat 8 um ja 7-10 um, vastaavasti.) [14] – [ ,,,0],15]. ISET (Les Ulis, Ranska), jossa luetellaan CTC veren suodattamalla polykarbonaatti Track-Etch-tyyppinen kalvoja 8 um sylinterimäinen huokosiin, on edustava yksi verrattain korkea talteenottotehokkuus [16]. Kuitenkin huokoset polykarbonaattisuodattimille, jotka valmistettu radan etsaus, sijoitetaan satunnaisesti kanssa epätasainen tiheys [17] – [18]. Äskettäin kehittäminen mikrovalmistuksen tekniikka on mahdollistanut käyttöönoton mikrofluidistiikkaan lähestymistapoja kaappaamiseen näitä harvinaisia ​​soluja, jotka saattavat muodostavat heikkous ISET [19] – [20]. Käyttämällä yhden kerroksen paryleeni-C kalvo mikro-suodattimet, Zheng S et al. [21] talteen 89,5% ± 9,5% ihmisen eturauhasen syöpäsolujen, joita oli lisätty kokoveren terveiden luovuttajien. Lisäksi Tan ja Lim et al. [14] kehitti mikrofluidilaitetta, jossa on useita matriiseja puolikuun muotoinen kuoppiin ja saatu talteenotto hyötysuhde yli 80%, rinta- ja paksusuolen syövän solulinjat. Lisäksi Bhagat et al. [22] käytetään suorakaiteen mikro-kanavat kuvioitu supistus-laajennus array ja hankki hyötykäyttöaste yli 90% ihmisen rintasyövän solujen MCF-7. Kuitenkin nämä menetelmät vain havaittu näytteistä syöpäsolulinjoja piikkeinä terveitä vereen, mutta puuttuvat todentaminen CTC veressä syöpäpotilaiden sekä tarkempaa analyysiä niiden kliinistä soveltamista.

Uusi hoitostrategioiden parantamiseen teho vastaan ​​etäpesäkkeitä ja tarkka biomarkkereita seurantaa peräsuolen syöpä potilaat ovat johtava haasteita yhdessä varhainen havaitseminen ja seulonta korkean riskin populaatiot. Tässä tutkimuksessa olemme suunnitella ja valmistaa mikrofluidinen suodatuslaite kaapata näitä harvinaisia ​​CTC perustuu kokoerot kasvainsolujen ja veren aineosia. Meidän laite, veren virtaus kulkee mikro-kanava-pohjainen järjestelmä, jonka avulla kokoerottelevan eristäminen harvinaisia ​​kasvainsolujen, joilla on erittäin suuri talteenottotehokkuutta ja täysin toistettavuus. Jälkeen Immunofluoresenssivärjäystä CTC, voidaan sitten tunnistaa ja luetella suoraan fluoresenssimikroskoopilla. Meidän laite on erittäin tehokas työkalu kaapata harvinaisia ​​CTC ilman vaatimusta suurten ja kalliiden laitteistojen. Tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: Ensinnäkin mitataan ja optimoitu parametrit meidän mikrofluidilaitetta pisteväkevöimällä peräsuolen syövän soluja verinäytteestä. Toiseksi luetellut ja analysoi CTC talteenottotehokkuus sekä piikki soluissa malli ja verinäytteistä potilailta, joilla peräsuolen syöpä. Lopuksi vertasimme meidän laite anti-EpCAM vasta konjugoitu immunohelmimäärityksessä perustuva menetelmä.

Materiaalit ja menetelmät

Laitteen suunnittelu ja valmistus

Kuten kuviossa 1, mikrofluidinen laite koostuu 80 pääkanavia ja 81 puolella kanavia, jotka on järjestetty interdigitaalisen tavalla minimoida siru jalanjälki. Ryhmä kapea rinnan järjestetty suodinkanaviin suunniteltu yhdistämään kunkin parin pääkanavan ja vierekkäiset kanavan. Sekä tärkeimmät kanavat ja sivukanavat on poikkileikkaukset 50 um leveä ja 50 nm korkea, kun taas suodattimen kanavien leveydet 20 um ja korkeus, joka vaihteli 2 um 8 um. Jokaisen pääkanava, oikealla puolella on suora yhteys näytteen syötössä, ja vasen puoli on sitoutunut suodattimen kautta kanavan jätettä kammioon, jossa joukko mikro-viestejä, jotka on tarkoitettu estämään kammion romahduksen. Kummallakin puolella kanavaa, oikealla puolella on sokea ja vasemmanpuoleinen on suora yhteys poistokammioon. Sen jälkeen, kun verinäyte on lisätty sisääntulon, alipaine kohdistetaan pistorasiaan, joka imee verinäytteen kanavat. Samalla paine-eron vaikutuksesta välillä pääkanava ja puoli kanava, suurin osa pienikokoisten hematologisia soluja kokoverestä kuten erytrosyyttien ja leukosyyttien voidaan suodattaa niiden vierekkäiset kanavia suodattimen kanavat ja sitten poistuu poistokammion. Suurikokoisista soluihin kuten tuumorisoluihin voi kulkea kapeilla suodattimen kanavat ja sitten pysyvät pääkanavia. Tämä on teoria eristämisen CTC tätä laitetta varten.

EN) kaavamaisen mikrofluidilaitteen; B) kaavamaisen työaseman CTC eristämistä; C) rakenne laitteen mikroskoopin alla; D) kaavamainen esitys teorian laitteen pystysuuntaisen kuva; E) kaavamaiset osoittaa teorian laitteen profiilin näkymä.

Laite valmistettiin sitomalla hybridi polydimetyylisiloksaania (PDMS) laatta, joka sisältää kolmiulotteinen mikro-kanavaa lasilevyllä. Mikrofluidistisia Laite valmistettiin läpi vakiintuneiden monikerroksinen pehmeä litografia prosessi [23]. Lyhyesti, kaksitasoinen master valmistettiin negatiivinen fotore-, SU-8 (MICROCHEM, USA). Sen jälkeen poistettiin kaasu PDMS (sekoittaa 10:01 suhde PDMS pohja kovetin, Sylgard 184, Dow Corning Inc., USA) ylle master muottiin ja paistetaan 90 ° C: ssa 1 tunnin ajan uunissa. Kovetuksen jälkeen PDMS laatta huolellisesti kuorittiin pois master muotista. Yksi sisääntulo ja yksi ulostulo lävistettiin PDMS neulalla, jossa litistetty kärki. PDMS laatta sitten sidottu lasilevyllä jälkeen happiplasmakäsittelyllä, ja prosessi on kuvattu seuraavasti: Happi plasma liimaus on tehty käyttäen omistettu plasma puhtaampaa (PDC-32G-2, Harrick Plasma Corp., USA). Lasilevyllä ja PDMS laatta sijoitettiin kammioon plasman puhtaamman 50 sekuntia. Sen jälkeen, PDMS laatta ja lasilevyllä otettiin pois kammiosta ja PDMS sijoitettiin ja painetaan lasin välittömästi.

Soluviljely ja Cell Analyysin

paksu- solulinja HT 29, joka on saatu solun pankin American Type Culture Collection viljeltiin McCoyn 5A-alustassa (Gibco, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, Carlsbad, CA, USA). Soluviljely suoritettiin inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2. Kasvualusta imettiin pois ja solut sen jälkeen kerättiin käyttäen 0,25% trypsiiniä. Välittömästi ennen kokeita, solut huuhdeltiin PBS-puskurilla ja suspendoitiin uudelleen. Seuraamalla valmistajan ohjeita, soluja käsiteltiin Vybrant Dil: cell-etikettiratkaisut (Carlsbad, Invitrogen, CA) 5 minuutin ajan 37 ° C: ssa, sitten huuhdeltiin PBS-puskurilla ja suspendoitiin uudelleen. Solujen pitoisuus määritettiin laskemalla kanssa hemasytometriä. Halutun pitoisuuden solujen valmistettiin laimentamalla solususpensioiden PBS-puskurissa. Merkityt solut, joiden tiedetään numerot terästettiin osaksi verinäytteitä jatkomittauksissa.

Veren Näytteen kerääminen ja käsittely

verinäytteistä 60 potilaalla, joilla peräsuolen syöpä saatiin maaliskuusta joulukuuhun 2012. Kaikki potilaat vahvistettiin patologisesti kuten peräsuolen syöpä biopsialla tai leikkaus. Näistä 30, 10 ja 20 potilasta vahvistettiin vasta diagnosoitu vaiheen II-III, paikallisen uusiutumisen ja etäinen etäpesäke, vastaavasti. Kaikki nämä 60 potilasta, 10 ml verinäytteitä saatiin CTC havaitsemiseksi, mukaan lukien 5 ml: ksi mikrofluidilaitetta ja 5 ml: ksi EpCAM perustuva menetelmä.

kontrolliryhmä, verinäytteet myös peräisin 30 tervettä vapaaehtoisille, joilla ei ollut tiedossa sairaus tai kuume aikaan vedon ja ei aikaisempaa pahanlaatuinen sairaus.

Kaikki näytteet vedetään evakuoitiin EDTA sisältävään veriputkea, säilytettiin 4 ° C: ssa ja käsitellään 72 tuntia. Sentrifugoinnin jälkeen perifeerisen veren 1500 rpm: ssä 10 min, plasma näytteet poistettiin huolellisesti yläosasta supernatantin. Punasolujen lyysauspuskuria (0,139 M NH

4CL, 0,02 M Tris, pH 7,2) lisättiin jäljellä verinäytteitä, ja sekoitettiin 45 min ajan huoneenlämpötilassa. Sentrifugoinnin jälkeen 1500 rpm 10 minuuttia, supernatantti poistettiin ja jäljelle jäänyt perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) pelletti suspendoitiin uudelleen PBS-puskuriin.

Instrument Setup

Ennen käsittelyä havaitseminen, pitoisuudet PBMC-näytteitä potilaista, joilla on peräsuolen syöpä (tai näytteitä terveiltä luovuttajilta, jossa piikki HT-29-soluja) mitattiin hemasytometriä ja laimennettiin PBS-puskurissa kuin 5 x 10

7 solua /ml. Sitten 0,5-0,6 ml laimennettua PBMC näytteet vietiin laitteeseen pumppaamalla. Ruiskupumppu (PHD 22/2000, HAVARD laite, Massachusetts, USA), jossa on 5 ml ruiskua jätteiden keräily on kytketty pistorasiaan laitteen. Tuloaukon laite on kytketty verinäytteet kautta polymeerin letku. Ruiskupumppua käynnistettiin ja paine säädettävä vaadittu virtausnopeus. Verinäytteitä pumpataan sisääntulon osaksi mikrofluidilaitetta CTC talteenotto ja suodatettu hematologisia ainesosia kuten leukosyytit kerättiin jätekammioon.

tunnistaminen ja leimaus CTC fluoresenssimikroskopisesti

Kun prosessi CTC kaapata, kasvaimen solut tunnistettiin ja erottaa leukosyyteistä perustuu morfologiaan ja ero antigeeniekspressiota. Kasvain solut ovat epiteelin (sytokeratiini- + /CD45- /DAPI +), kun taas leukosyytit ovat nonepithelial (cytokeratin- /CD45 + /DAPI +). Fluoresoivat reagenssit pumpattiin laitteeseen ja immunofluoresenssilla reaktio tehdään suoraan kanaviin laitteen. Ensinnäkin, vasta-aineita CD45 konjugoitiin FITC: tä (BD Biosciences, USA) vietiin laitteeseen, minkä jälkeen inkuboidaan 30 minuutin ajan 0 ° C: ssa. Sen jälkeen liuos, joka sisälsi 0,2% Triton X-100 ja vasta-aineita sytokeratiinia konjugoitu fykoerytriiniin (C-11, Abcam, UK) pumpattiin laitteeseen ja inkuboitiin 10 min ja 1 h, vastaavasti. Sitten jää-solut sekoitettiin DAPI liuosta 20 minuutin ajan. Lopuksi, jää solut kiinnitettiin liuoksella, jossa oli 1% paraformaldehydiä 20 min ajan. Sen jälkeen, kun nämä reaktiot, laite huuhdeltiin 1 ml: lla PBS: llä ylimääräisten reagenssien poistamiseksi. Captured solut tunnistettiin ja lueteltu käyttäen fluoresenssimikroskopiaa (Olympus America). CTC tunnistettiin mukaan värjätään värin ja morfologiset ominaisuudet, kuten solun koon, muodon ja ydinvoiman koon. Solut, jotka värjätään sytokeratiinia + /CD45- /DAPI + ja täyttänyt fenotyyppiset morfologiset ominaisuudet olivat pisteytettiin CTC. Kokenut patologi, joka oli sokea kliinisiä tuloksia kattavasti arvioinut kunkin verinäytteen CTC tunnistamiseen.

CTC Detection by EpCAM perustuva menetelmä

talteenottotehokkuutta CTC mitattiin myös EpCAM-pohjainen menetelmä. Yksityiskohtaiset menetelmä kuvataan seuraavasti: erotus CTC suoritettiin käyttämällä immunomagneettisia päällystettyjen helmien epiteelisolujen-spesifisten EpCAM-vasta-aineita (magneettinen helmi: 4,5 um halkaisijaltaan, DYNAL, Invitrogen, USA) valmistajan ohjeita. PBMC-pelletti suspendoitiin uudelleen PBS-puskuriin ja sekoitettiin immunomagneettisten helmiä. Solu-helmiä Seosta inkuboitiin 40 minuutin ajan 2-8 ° C: ssa kevyesti vaaka- ja kierto. Seos laitettiin magneettinen 5 min, ja supernatantti poistettiin varovasti. Sen jälkeen, vasta-aineita CD45 konjugoitiin FITC: tä (BD Biosciences, USA) lisättiin ja sekoitettiin jää-soluja 30 minuutin ajan 0 ° C: ssa. Sitten solut pestiin liuoksella, jossa oli 0,2% Triton X-100: ssa 10 minuuttia ja sekoitetaan vasta sytokeratiini konjugoitu fykoerytriiniin (C-11, Abcam, UK) 1 h. Sen jälkeen, jää solut sekoitettiin DAPI liuosta 20 minuutin ajan. Lopuksi solut kiinnitettiin liuoksella, jossa oli 1% paraformaldehydiä 20 min ajan. Jokaisen käsittelyn vaiheessa, jää solut pestiin PBS-puskurilla ylimääräisten reagenssien poistamiseksi on magneettinen. Tunnistamismenetelmä ja luetellaan CTC oli samanlainen kuin mikrofluidilaitetta, mukaan värjätään värin ja morfologiset ominaisuudet, kuten solun koon, muodon ja ydinvoiman koon. Solut, jotka värjätään sytokeratiinia + /CD45- /DAPI + ja täyttänyt fenotyyppiset morfologiset ominaisuudet olivat pisteytettiin CTC. Kokenut patologi, joka oli sokea kliinisiä tuloksia kattavasti arvioinut kunkin verinäytteen CTC tunnistamiseen.

Ethics lausunto

Kaikki toimenpiteet ilmoittautuminen tehtiin soveltuvien lakien ja institutionaalisten suuntaviivojen ja institutionaalisten komitea (eettinen komitea Fudanin yliopiston Shanghai Cancer Center) hyväksyi tutkimuksemme. Kaikki potilaat ja terveillä vapaaehtoisilla allekirjoittama suostumus ennen tutkimusta.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS ohjelmistoa (versio 16.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Kaikki tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± standardipoikkeamat (SD). Capture tehokkuus laskettiin jakamalla lukumäärä jää kohdesolujen useissa koko kohdesolujen syötetään laitteeseen. Puhtaus soluja jää määritettiin jakamalla lukumäärä jää kohdesolujen useissa koko jää soluihin. Regressioanalyysi suoritettiin tarkkuuden arvioimiseksi tuumorisolujen havaitsemiseksi. U-testi ja Kruskal-Wallisin H testiä käytetään tapauksissa 2 itsenäistä näytteitä ja yli 2 näytettä, vastaavasti, kun taas vertailut niihin liittyvät mittaukset tehtiin käyttämällä Wilcoxonin testi. Spearmanin listalla korrelaatio käytettiin analysoimaan korrelaation sieppausnopeuden välillä mikrofluidilaitetta ja EpCAM perustuva menetelmä. Kaikki testit olivat kaksipuolisia ja suoritettiin 5% merkitsevyystaso.

Tulokset ja keskustelu

Vaikutus Channel korkeus ja virtausnopeus CTC pyyntitehokkuudesta

jotta voidaan optimoida kokeellinen parametrit tämän laitteen, me piikki HT-29-solujen, joiden tiedetään numeroita verinäytteitä terveiltä luovuttajilta mitata talteenottotehokkuutta ja solujen puhtautta.

Ensinnäkin tutkimme vaikutuksia suodatinkanavaa korkeus pyyntitehokkuudesta ja solujen puhtautta. Kuten kuviossa 2a on esitetty, talteenottotehokkuutta CTC 8 um kanavan korkeus oli ilmeisesti pienempi kuin 2 um ja 5 pm korkeus, kun taas vastaavia korkeampia talteenotto hyötysuhde on 98%, voitiin havaita 2 um ja 5 pm. Lisäksi, solun puhtaus parani vähitellen kasvaessa kanavan korkeus, kuten on osoitettu kuviossa 2b. Siten perusteella tietojen kuvassa 2a ja 2b, me valitsi korkeus 5 um paras kompromissi talteenottotehokkuutta ja solujen puhtautta. Nämä tulokset osoittivat, että oli olemassa läheinen suhde koon suodatinontelo ja talteenottotehokkuutta CTC, ja jotkut muut tutkimukset esitti samanlaisia ​​johtopäätöksiä: Hosokawa M. et al. [24] käytetään kokoerottelevan microcavity array eristää CTC ja sen talteenottotehokkuus esitti laskusuunnassa lisäämisen kanssa microcavity koon. Sheng W. et ai. [25] valmistettu aptameeristä-käytössä mikrolaitteessa ja totesi myös, että talteenottotehokkuutta CTC olisi laskeutua asteittain mutta puhtaus oli nousussa, kun kanavan syvyys kasvoi.

A) suhde kanavan korkeus ja pyyntitehokkuudesta : pyydystäminen tehokkuus laskettiin jakamalla kohdesolujen kiinni useissa kohdesolujen syötetään laitteeseen. B) välinen suhde kanavan korkeus ja solujen puhtaus: puhtaus soluja jää määritettiin jakamalla kohdesolujen kiinni useissa solujen kokonaismäärästä kiinni. Virtausnopeus oli 0,5 ml /h A) ja B). C) välinen suhde virtausnopeus ja talteenotto tehokkuus: pyydystäminen tehokkuus laskettiin jakamalla kohdesolujen kiinni useissa kohdesolujen syötetään laitteeseen. Kanavan korkeus oli 0,5 pm. Virhepalkit edustaa yksi keskihajonta 4 toista kokeiluja. D) talteenotto tunnettu lukumäärä piikki HT-29-solujen kokoverestä. Regressioanalyysi havaittujen kasvainsolujen määrä versus odotettavissa kasvainsolujen määrä tuotti kulmakerroin 0,986 ja korrelaatiokerroin (R

2) 1.

Toisaalta, tutkimme myös suhdetta välillä virtausnopeus ja CTC talteenottotehokkuutta. Kuten on esitetty kuviossa 2c, virtausnopeudella välillä 0,2 ja 0,5 ml /h, talteenotto tehokkuus ei muuttunut luonnollisesti. Mutta määrä yli 0,5 ml /h, talteenottotehokkuutta heikkeni voimakkaasti. Talteenottotehokkuutta pelkistetty kasvu virtausnopeus luultavasti siksi suuremman paineen suuremmalla virtausnopeudella. Jotkut muut tutkimukset [24] – [26] myös, että solujen talteenotto tehokkuus oli kääntäen verrannollinen virtausnopeuteen verta. Siksi otetaan huomioon käsittelyaika näytteiden pumpataan laitteen ja talteenottotehokkuus valitsimme 0,5 ml /h parhaana parametri havaitsemiseen, jossa virtausnopeus riittävä läpimeno voitiin havaita.

Siksi käytimme optimaalinen kanavan korkeus on 5 um ja virtausnopeus 0,5 ml /h CTC havaitsemista, ja nämä koeolosuhteissa käytettiin kaikissa seuraavissa kokeissa.

talteenotto kasvainsolun Detection

määrittämiseksi herkkyys tuumorisolujen havaitsemiseksi, HT-29-solujen erilaisia ​​tunnettuja numeroita, jotka oli lisätty 5 ml verinäytettä jokaisen terveen luovuttajan. Numerot piikki soluja 5, 9, 51, 102, 500 ja 998 vastaavasti. Kuva 2d osoitti odotetun määrän HT-29-solujen piikkeinä osaksi terveellistä luovuttajanäytteessä funktiona todellinen määrä HT-29-solujen havaittiin näytteissä. Regressioanalyysi havaittujen kasvainsolujen määrä versus odotettavissa kasvainsolujen määrä tuotti kulmakerroin 0,986 ja korrelaatiokerroin (R

2) 1. keskimääräinen prosenttiosuus HT-29 talteen oli 94% ja hyödyntämiskiintiöitä eri solupitoisuuksilla olivat kaikki yli 80% (taulukko 1, taulukko S1). Meillä on myös validoitu hyödyntämiskiintiöitä kolmen keuhkosyövän solulinjat, mukaan lukien A549, SK-MES-1 ja H446, jotka kaikki olivat suurempia kuin 90% (dataa ei ole esitetty).

CTC Detection of Peräsuolen syöpäpotilaat osuuksilla

CTC laskee 60 peräsuolen syöpä potilailla, joiden eri vaiheiden ja 30 terveillä koehenkilöillä havaittiin ja analysoitiin kussakin 5 ml kokoverta. Kuvio 3 osoitti kiinni CTC yhden tyypillisen potilaan peräsuolen syövän mikrofluidilaitetta.

A /B: CTC värjäys; C /D: normaali verisoluja värjäystä. A) positiivinen CK värjäytymistä CTC; B) positiivinen DAPI-värjäyksen CTC; C) positiivinen CD45 värjäytyminen normaalissa verisoluja; D) positiiviset DAPI värjäytyminen normaalissa verisoluja.

Kuten on osoitettu kuviossa 4, positiivisten solujen voitiin havaita 3 ulos 30 terveitä ihmisiä, mutta yksikään niistä ei ollut yli 3-positiivisia soluja näytettä kohti . Nämä tulokset olivat samankaltaiset kuin aiempien tutkimusten osoittaa, että jopa kolme CTC havaittiin pieni väestö terveiden luovuttajien tai ei-pahanlaatuisten potilaille [27] – [28]. Syy tällaiseen ”vääriä positiivisia” tuloksia ei tunneta vielä, mutta oletettavasti johtuu useista syistä seuraavasti: (a) saastuminen epiteelisolujen verinäytteistä koska joitakin virheellisestä käsittelystä kuten sopimaton verinäytteiden otto; (B) epätarkkoja asiassa tunnistus CTC tutkijat; (C) esiintyminen poikkeavien hematologisen ilmentävien solujen epiteelin antigeenin verinäytteistä; (D) mahdolliset syöpäpotilailla, jotka eivät voi olla varhainen diagnosoitu rutiini kliinisillä tekniikoilla.

rasiakuvaaja osoittaa mediaani, alempi ja yläkvartiilit (25., 75. prosenttipisteet). Tiedot muistuttaa, että ulkopuolelle 10. ja 90. prosenttipisteet näkyvät poikkeavat havainnot.

Vaikka kasvain markkereita, kuten seerumin CEA käytetään laajalti diagnosointiin ja seurantaan potilailla, joilla on ruoansulatuskanavan syöpiä, niiden puute herkkyys edelleen ratkaisematta. Perinteiset kuvantamislaitteiden ja kasvainmerkkiaineet ovat joskus epätarkkoja syövän diagnosointiin ja hoidon monitoroinnin vastausten johdosta viivästyy päätellen taudin etenemistä aikaisin. Tässä tutkimuksessa CTC voitiin havaita kaikissa 60 peräsuolen syöpäpotilaille, joiden CTC laskee olivat kaikki yli 3 solua näytettä kohti. CTC laskennat peräsuolen syövän potilaista olivat merkittävästi korkeammat kuin terveillä koehenkilöillä (167,33 ± 212,76 vs. 0,17 ± 0,59, P 0,05). Lisäksi potilailla, joilla on etäispesäkkeitä oli merkittävästi korkeammat CTC tasolla kuin potilailla, joilla on vaiheen II-III tai joilla paikallisen uusiutumisen (385,30 ± 245,86 vs. 39,40 ± 19,23 vastaan ​​115,20 ± 69,15, P 0,05). Lisäksi CTC laskee paikallisten toistuvien potilaista oli myös huomattavasti korkeammat kuin ne, joilla on vaiheen II-III (P 0,05). Nämä tulokset osoittivat, että CTC määrä korreloi kohtuullisen hyvin kasvaintaakkaa ja vakavuus potilaita eri vaiheissa. Siksi CTC saattaa olla lupaava biomerkkiaine muodostavat riittämättömyys tavanomaisen kliinisen havaitsemisen säännöt. Sastre et ai. [29] osoitti läheinen suhde CTC laskee ja erilaiset kliiniset vaiheet paksusuolisyövän potilaille, joka oli samanlainen kuin meidän tuloksia. Cohen et ai. [30] osoitti, että CTC laskee ennen hoitoa ja myöhemmissä aikapisteissä olivat riippumattomia ennustavat tekijät ilman taudin etenemistä ja kokonaiselinaika. Allen-Mersh et ai. [31] osoitti, että CTC laskee 24 tunnin kuluttua ensisijainen peräsuolen syöpä resektio oli vahva ennustaja peräsuolen syövän uusiutumiseen. Havaitsemiseksi CTC voidaan myös soveltaa kohdennettuja geeniterapiassa. Yen et al. [32] totesi, että havaitseminen Kras mutaatiostatuksesta tilaansa CTC oli potentiaalia kliiniseen käyttöön valittaessa metastasoitunut kolorektaalisyöpä potilaiden todennäköisimmin hyötyvät setuksimabihoito. Siten havaitseminen CTC voi olla laaja-sovellus kliinisissä asetuksia, kuten diagnoosi syöpäsairauksien, hoidon seurantaa vastausten ennusteen arviointi ja jopa päätöksentekoa yksilöllistetyn hoidon. Edelleen analyyseissä roolin CTC ennustamiseen ja arviointiin syöpäpotilaiden pysyvyyttä käyttämällä mikrofluidilaitetta tehdään lähitulevaisuudessa.

Vertailu mikrofluidilaitetta vs. EpCAM perustuva menetelmä

Anti-EpCAM magneettihelmi perustuva menetelmä on tällä hetkellä yksi yleisesti käytetty teknologiaa CTC havaitsemiseksi [9] – [10]. Siksi vertasimme suorituskyky meidän mikrolaitteessa laskentaa varten tuumorisolujen vastaan ​​EpCAM-pohjainen rikastusmenetelmällä. Ensinnäkin, HT-29-solujen, joiden tiedetään numerot terästettiin otetaan verinäytteitä terveiltä luovuttajilta, ja sitten kukin näyte jaettiin kahteen kaksoiskappaleet, yksi meidän laite ja toinen EpCAM perustuva menetelmä. Hyödyntämiskiintiöt näistä menetelmistä vertailtiin ja analysoitiin. Kuten taulukosta 1, hyödyntämiskiintiöt syöpäsolujen käyttämällä tätä mikrolaitteessa olivat kaikki yli 80% kaikilla pitoisuuksilla tuumorisolujen, kun taas elpyminen hinnat EpCAM perustuva menetelmä oli suhteellisesti pienempi, vaihdellen 36%: sta 81% (P 0,05). Lisäksi emme löytäneet merkittävä korrelaatio kierrätysaste mikrofluidilaitetta ja että EpCAM perustuva menetelmä (Correlation tehokas oli 0,07, P 0,05.). Myöhemmin myös verrattu näistä menetelmistä käytetään potilaan verinäytteestä, ja tulokset osoittivat taulukossa 2. Me kerätä ja käsitellä verinäytteet 60 potilasta, joilla peräsuolen syöpä, ja kukin näyte jaettiin kahteen kappaletta kasvainsoluja havaitseminen käyttämällä näitä kahta menetelmää (taulukko S2). Peräsuolisyövässä potilaalla on eri vaiheissa, CTC laskee havaita mikrolaitteessa olivat kaikki merkitsevästi korkeammat kuin by EpCAM perustuva menetelmä (P 0,05). Määrä yksittäisiä CTC vaihteli 0-100 vs. 0-12 (mikrolaitteessa vs. EpCAM-pohjainen) per näyte potilaille, joilla on vaiheen II-III (keskiarvo ± SD, 39 ± 19 vs. 4 ± 3), 4-210 vs . 3-31 toistuvia potilaille (115 ± 69 vs. 12 ± 9) ja 47-980 vs. 5-55 metastasoineeseen potilaille (385 ± 246 vs. 24 ± 15). Sillä EpCAM perustuva menetelmä, CTC laskee 38 (63%) potilaista vaihteli 0-10, kun taas vain yksi potilas (2%) oli yli 50. Sitä vastoin sellaisiin mikrolaitteessa, CTC laskee 3 (5 %) potilaista vaihteli 0-10 kun taas 34 (57%) potilasta oli yli 50. ero näiden kahden menetelmän oli erityisen selvä 30 peräsuolen syövän potilaille, joilla on vaiheen II-III: positiiviset hinnat näytteiden yli 3 CTC per 5 ml verta käyttämällä mikrolaitteessa oli 100% (30/30), kun taas vain 47% (14/30) positiiviset näytteet voitiin havaita EpCAM perustuva menetelmä.

EpCAM- magneettihelmi perustuva menetelmä on tällä hetkellä yksi yleisimpiä lähestymistapoja eristämiseksi CTC. Kuitenkin tämä menetelmä on riippuvainen EpCAM ilmentymisen kohde-kasvainsoluja. Vaikka EpCAM antigeeni löytyy useimpien kasvaimia, heikko tai negatiivinen EpCAM ilmentyminen on esitetty, joka on todennäköisesti liitetty ilmiö EMT [33] – [34]. Monet tekijät kuten kemoterapia voi todennäköisesti aiheuttaa EMT, joka voi vaikuttaa talteenottotehokkuutta syöpäsoluja. Tutkimuksessamme minimoimiseksi vaikutuksen EMT, käytimme koko perustuva menetelmä havaita CTC sijasta EpCAM riippuvaiset yksi. Siksi teoriassa, lisää kasvainsolut mukaan lukien sekä EpCAM-ilmaisun positiivisia ja negatiivisia voisi olla kiinni meidän kokoon perustuva mikrolaitteessa. Tämä hypoteesi on sopusoinnussa tuloksemme yllä: Ei vain näytteissä, joissa kasvainsolujen piikkeinä terveitä veren, enemmän CTC eristettiin meidän mikrolaitteessa, mutta samanlaisia ​​tuloksia on validoitu näytteissä peräsuolen syövän potilaille. Muut aiemmat tutkimukset [35] – [36], jossa verrattiin kokoon perustuva ja EpCAM perustuva menetelmä, raportoitu samanlaisia ​​havaintoja ja osoittivat, että osa soluista eristettiin koko lähestymistapa puuttui epiteelin ominaisuudet.

On