Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vertasimme kasvua ihmisen keuhkosyövän soluista

ex vivo

kolmiulotteisia (3D) keuhkomallissa ja 2D kulttuurin mitkä paremmin jäljittelee keuhkosyöpää kasvua potilailla . A549-soluja kasvatettiin

ex vivo

3D keuhkomallissa ja 2D kulttuuri 15 päivää. Mittasimme koko ja muodostumista kasvaimen kyhmyjä ja laskettiin solut sen jälkeen, kun 15 päivää. Olemme myös värjätään kudoksen /solujen Ki-67, ja kaspaasi-3. Mittasimme matriisimetalloproteinaasi (MMP) tasoilla elatusaine ja veren plasmassa potilailla, joilla adenokarsinooma keuhkojen. Järjestäytynyt kasvain kyhmyt ehjät vaskulaaritilaa muodostettu

ex vivo

3D keuhkomallissa mutta ei 2D kulttuuriin. Lisääntymistä ja apoptoosin olivat suuremmat

ex vivo

3D keuhkomallissa verrattuna 2D kulttuuriin. 15 päivän jälkeen oli huomattavasti enemmän soluja 2D kulttuuriin kuin 3D-malli. MMP-1, MMP-9, ja MMP-10 tuotanto oli myös merkittävästi suurempi

ex vivo

3D keuhkomallissa. Ei ollut tuotantoa MMP-9 2D kulttuuriin. Potilas näytteet sisälsivät MMP-1, MMP-2, MMP-9 ja MMP-10. Ihmisen keuhkojen syöpäsoluja kasvatetaan

ex vivo

3D mallin perfusable kyhmyjä, jotka kasvavat ajan mittaan. Se tuotti myös MMP että ei ole tuotettu 2D kulttuuri mutta nähdään ihmisen keuhkosyöpäpotilaita.

ex vivo

3D keuhko malli voi paremmin jäljitellä biologia ihmisen keuhkosyöpään kehitystä kuin 2D kulttuuriin.

Citation: Mishra DK, Sakamoto JH, Thrall MJ, Baird BN, Blackmon SH Ferrari M, et al. (2012) Human Lung Cancer Cells Grown käytettäessä

Ex vivo

3D Lung Malli Tuota matriisimetalloproteinaasientsyymien ei valmisteta 2D Culture. PLoS ONE 7 (9): e45308. doi: 10,1371 /journal.pone.0045308

Editor: Effie C. Tsilibary, National Center for Scientific Research Demokritos, Kreikka

vastaanotettu: 08 toukokuu 2012; Hyväksytty: 20 elokuu 2012; Julkaistu: 17 syyskuu 2012

Copyright: © Mishra et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat konflikteja. MPK on jättänyt patenttihakemuksen ex vivo 3D keuhkomallissa. Patentti on otsikoitu ”neoplastisia soluja kasvatetaan decellularized biomatriksin.” Se kattaa luomiseen decellularized matriisin ja kasvava neoplastisten solujen decellularized matriisi bioreaktorissa. Se kattaa myös mahdollisen soveltamisen mallin. Ei ole yrityksen suhdetta patenttia ja kirjoittajat eivät ole saaneet mitään tuloja patentin. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syy syövän liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa [ ,,,0],1]. Tähän mennessä ei ole olemassa tehokasta hoitoa potilaille, joilla on keuhkosyöpä, ja koko 5 vuoden pysyvyys ei ole lisääntynyt merkittävästi vuodesta 1975, 13% vuonna 1975 ja vain 16% vuonna 2005 [1]. Ei ole edistytty löytämisessä tehokkaita hoitoja keuhkosyöpä voi johtua osittain puute tarkan mallin, joka jäljittelee biologisia prosesseja, joita esiintyy potilailla, joilla on keuhkosyöpä. Kaksiulotteinen (2D) petrimaljaan soluviljelmissä ovat antaneet paljon tietoa kyky syöpäsolujen kasvua, mutta ne eivät tarjoa tietoa monimutkaiset vuorovaikutukset syöpäsoluja ja niiden ympäristössä. Eläinmallit tarjoavat lopulliset testit erityisesti prosesseja, mutta on usein puutetta korrelaation odotetaan ja havaitaan tuloksiin, mikä voi johtua siitä, että mallit itse [2]. Lisäksi ihmisen kasvaimen kasvua ja vaste lääkehoidon eläinmalleissa eivät aina vastaa havaintoja ihmisten tutkimuksissa [3] – [5]. Lisäksi eläinmalleissa kestää useita viikkoja antamaan tietoa biologisista prosesseista. Tämän seurauksena

in vitro

3D-malleja on kehitetty vuosien varrella yrityksenä paikataan perinteisen 2D kulttuurien ja eläinmalleissa.

Tällä hetkellä kaksi erilaista

in vitro

3D-malleja. Ensimmäinen tyyppi ottaa

in vivo

kiinnostavia kudoksia ja eksplantaatteja ja kulttuurien niitä

in vitro

, joka tarjoaa tietoa lyhyen aikavälin kasvua kudosten [6], [7]. Toinen tyyppi kasvaa kasvainsoluihin 3D keinotekoinen matriisi rakennustelineet. Tämä

in vitro

3D-malliin käyttäen matrigeelin on osoitettu olevan parempia kuin 2D kulttuuriin käyttäen petrimaljassa opiskeluun kasvaimen kasvu [8] – [10]. Fysiologisia muutoksia syöpäsoluja kasvatetaan Matrigelillä ovat merkittävästi erilaiset kuin kasvainten kasvanut 2D kulttuuriin. On rajoituksia kuitenkin nykyistä

in vitro

3D-malleja. Vaikka ne tarjoavat substraattina kasvainten kasvaa, substraatti on keinotekoinen tuote, joka ei ole kohdannut nämä solut luonnollisessa ympäristössä. Lisäksi nämä

in vitro

3D mallien puute läsnäolo verisuoniston, mikä vaikeuttaa niiden kykyä matkia

in vivo

ympäristössä ja ylläpitää dynaamisia solujen käyttäytymiseen [5].

täällä karakterisoineet

ex vivo

3D keuhkomallissa joka on osoitettu tuottavan kasvavaan perfusable keuhkojen kyhmyt [11]. Toisin kuin

in vitro

3D-malleja, meidän

ex vivo

3D keuhkomallissa käyttää luonnollista matriisi, joka säilyttää homologiaa lajien [12], ja decellularized matriisi muodostaa esteen endoteelisolujen ja epiteelin tilat [13]. Siten ihmisen keuhkosyöpä solulinjat kykenevät muodostamaan keuhkojen kyhmyjä tässä

ex vivo

malli ehjä verisuoniston [11], joka ratkaisee rajoituksia

in vitro

3D-malleja. Lisäksi

ex vivo

3D keuhkomallissa avulla solut voivat kasvaa ajan myötä, mikä voi osoittaa dynaamisen ehto, jota ei ole nähty

in vitro

3D-malleja. Vertasimme kasvua ihmisen keuhkojen syöpäsoluja tässä

ex vivo

3D-mallin kanssa, joka on 2D kulttuuri samoissa viljelyolosuhteissa 15 päivää. Löysimme merkittäviä eroja muodostumiseen kasvaimen kyhmyjä, yhteensä solujen määrä, lisääntymistä hinnat, solukuoleman hinnat, ja matriisi (MMP) tuotanto. Lisäksi ihmisen keuhkosyövän soluja kasvatettiin

ex vivo

3D keuhkomallissa tuotettu MMP joita löytyy ihmisen näytteissä, kun taas solut 2D kulttuuri ei.

Tulokset

Solukasvunsäätelijä ja kyhmy Formation

ex vivo

3D keuhkomallissa, 96,3 ± 3,9% A549-soluja tarttunut decellularized keuhkojen matriisi jälkeen 3 kulkee ja inkuboimalla 2 tuntia. A549 keuhkosyövän soluja kasvatetaan decellularized keuhkojen matriisit päässä 4 viikon ikäisten (3D -4 Wk) ja 6 viikkoa vanhoja (3D -6 Wk) rottia muodostunut kasvain kyhmyjä, joka kasvoi yli 15 päivän ajan. Koko 15 päivän aikana, pystyimme perfuusion 3D-mallin kanssa mediaa 6 cc per minuutti. Jakelun kyhmyt matriisi oli satunnainen, mutta ajoitus niiden kehitys oli pääosin yhtenäinen, muutamia kyhmyjä, jotka muodostavat 6. päivän jälkeen keuhko matriisit 4 viikon ikäisiä rottia ja päivä 2 keuhko matricies 6 viikon ikäisiä rotat. Huomattavasti suurempi kyhmyt havaittiin on A549 keuhkosyövän soluja kasvatetaan decellularized keuhkojen matriisit 6 viikon ikäisille rotille verrattuna alkaen 4 viikkoa vanhoja rottia (p = 0,03, kuvio. 1a). Kuitenkin kyhmyt decellularized rotta matriisit 4 viikon ikäisiä rottia tiheämpi (Fig. 1 b) kuin kyhmyt decellularized rotta matriisit 6 viikon ikäisiä rottia (Fig. 1 d). Laskimme tiheys kyhmyt kasvatettu decellularized keuhkojen matriisit 4 viikon ikäisiä rottia ja 6 viikon ikäisiä rottia jakamalla solujen lukumäärä päivänä 15 jaettuna kyhmyn koko päivänä 15. tiheys kyhmyt viljellään decellularized keuhkojen matriisi 4 viikkoa vanhoja rottia (3,24 ± 0240000 solua /cm

2) oli merkittävästi korkeampi tiheys kyhmyt kasvatetaan decellularized keuhkojen matriisi 6-viikko- ikäisille rotille (1,12 ± 0,20 miljoonaa solua /cm

2, p = 0,02). Korkeampi tiheys oli myös selvää on H p = 0,0007, Fig. 2 c).

edustaja hematoksyliinillä ja eosiinilla (H E

ex vivo

3D keuhkomallissa esittää solu-solu- ja solu-matriisi vuorovaikutuksia. (C) oli merkittävästi enemmän soluja 2D kulttuuri (471 ± 70 miljoonaa, n = 3) kuin

ex vivo

3D keuhkomallissa (29 ± 3 miljoonaa, n = 4, p = 0,0007) . Kokonaismäärä solujen 4 viikkoa vanhoja (32 ± 3000000, n = 2), ja 6 viikon ikäisiä (27 ± 5000000, n = 2) rotan matriisit ei eronnut (p = 0,45). Virhepalkin edustaa keskivirhettä keskiarvon.

leviämisen ja solukuolema

A549-soluja kasvatettiin 2D kulttuuri (Fig. 3a) ja

ex vivo

3D keuhkomallissa (Fig. 3b) värjättiin positiivisia Ki-67. Prosenttiosuus solujen Ki-67 värjäytyminen oli paljon suurempi

ex vivo

3D-malli (23,8 ± 2,9%) kuin 2D kulttuuri (6,7 ± 0,9%, p 0,0001). Oli hyvin vähän soluja 2D kulttuuri (Fig. 4a), joka värjätään positiivisia Caspase-3, kun taas oli monia soluja

ex vivo

3D-malli, joka värjätään positiivisia kaspaasi-3 (Fig. 4b ). Huomattavan suuri prosenttiosuus solujen

ex vivo

3D-malli (5,5 ± 0,8%) värjättiin positiivisia kaspaasi-3 verrattuna 2D kulttuuri (0,1 ± 0,1%; p 0,0001, Fig. 4c).

edustaja Ki-67 värjäys A549-solut kasvatetaan (a) 2D kulttuuri ja (b)

ex vivo

3D keuhkomallissa. (C) oli merkitsevästi enemmän Ki-67 värjäys

ex vivo

3D keuhkomallissa (23,8 ± 2,9%, n = 4) verrattuna 2D kulttuuri (6,7 ± 0,9%, n = 3, p 0,0001). Virhepalkin edustaa keskivirhettä keskiarvon.

MMP mRNA Level Mallit

Ei ollut merkittävästi korkeampi MMP-1 (p = 0.003) ja MMP-2 (p = 0,01) A540 soluja viljellään 3D -4 Wk verrattuna 3D -6 Wk on saatu mRNA päivä 15 (Fig. 5a 5b). Huomattavan suuri MMP-1: n tuotannon sekä 3D -4 Wk (p 0,0001) ja 3D -6 Wk (p = 0,0002) havaittiin verrattuna mRNA-tasolla 2D. Tämä näkyi myös MMP-9: n ja MMP-10 lauseke (Fig. 5c 5d). MMP-2, oli merkittävästi korkeampi ilmaisun A549-soluja kasvatetaan 3D -4 Wk (p = 0,006) verrattuna tasoon 2D mutta se oli merkitsevästi pienempi A549-soluja kasvatetaan 3D -6 Wk (p = 0,001) verrattuna tasoon 2D (Fig. 5D).

olivat merkittävästi korkeampia MMP-1, MMP-9: n ja MMP-10, A549-soluja

ex vivo

3D-malleja verrattuna 2D kulttuuriin. Oli merkittävä korkeampaa MMP-2-geenin ilmentymisen 3D -4 Wk verrattuna 2D kulttuuriin kuitenkin on merkittävästi alhaisempi MMP-2-geenin ilmentymisen 3D -6 Wk verrattuna 2D kulttuuriin. Virhepalkin edustaa keskivirhettä keskiarvon.

MMP proteiini Level Mallit

MMP-1, MMP-2, MMP-9, ja MMP-10 havaittiin media of A549-soluja kasvatettiin

ex vivo

3D keuhkomallissa, kun taas vain MMP-1, MMP-2, ja MMP-10 havaittiin tiedotusvälineissä A549-soluja kasvatettiin 2D kulttuuriin. MMP-1, MMP-2, MMP-9, ja MMP-10 ei havaittu tiedotusvälineissä

ex vivo

3D keuhkomallissa ilman A549-soluja. Koska on merkittävä ero solujen määrä välillä 2D kulttuurin ja

ex vivo

3D keuhkomallissa päivänä 15, laskimme MMP-proteiinin tason solua kohti. Huomasimme, oli merkittävästi korkeampi MMP-1, MMP -2, MMP -9: n ja MMP-10 solua kohden 3D -4 Wk ja 3D -6 Wk verrattuna 2D kulttuuri (Fig. 6).

(a) oli merkitsevästi korkeampi MMP-1, (b) MMP-2, (c) MMP-9, ja (d) MMP-10: n tuotantoa solua kohden

ex vivo

3D-malleja verrattuna 2D kulttuuriin solua kohti. Virhepalkin edustaa keskivirhettä keskiarvon.

Seuraavaksi arvioimme MMP tason eri päivinä tiedotusvälineissä 2D verrattuna 3D -4 Wk ja 3D -6 Wk. MMP tasot

ex vivo

3D keuhkomallissa kasvoi ensimmäisten 6 päivän kokeen. Vaikka oli enemmän soluja 2D kulttuuri, oli huomattavasti suurempia määriä MMP-1, MMP-9, ja MMP-10

ex vivo

3D keuhkomallissa verrattuna 2D malli kaikkina päivinä paitsi MMP-1 ja MMP-10 tasoa päivänä 3 3D -4 Wk joka oli samanlainen kuin 2D malliin. Ei ollut johdonmukaista suhdetta MMP-2 tasot 2D-malli ja 3D -4 Wk ja 3D -6 Wk malleja eri päiville (Fig. 7).

(a) oli merkitsevästi suurempi taso MMP-1 tuotantoa

ex vivo

3D keuhkojen malleja verrattuna 2D kulttuuriin paitsi 3D -4 Wk päivä 3 MMP-1 tason, joka oli samanlainen kuin 2D tasolle 3. päivänä (b) on ollut johdonmukaista suuntausta välillä

ex vivo

3D keuhko malleja ja 2D kulttuurin MMP-2 tasossa eri päivinä. (C) ei ollut tuotantoa MMP-9 2D kulttuuriin ja huomattavasti korkeampi tuotannon MMP-9

ex vivo

3D keuhkomallissa. (D) oli merkittävästi enemmän MMP-10 tuotettu

ex vivo

3D keuhkojen malleja verrattuna 2D kulttuuriin paitsi 3D -4 Wk päivä 3 MMP-10 tason, joka oli samanlainen taso päivänä 3 2D kulttuuriin. Virhepalkin edustaa keskivirhettä keskiarvon.

MMP potilailla

Analysoimme näytteitä neljästä potilaasta, jolla adenokarsinooma keuhkojen. Yhdelläkään potilaalla ei ollut ennen leikkausta kemoterapiaa tai sädehoitoa. Keskimääräinen kasvaimen koko oli 2,6 ± 1,1 cm, eikä yksikään potilaista oli osallistuminen imusolmukkeisiin. MMP-1, MMP-2, MMP-9 ja MMP-10 havaittiin yläonttolaskimon ja keuhkojen verisuonissa lobectomy näytteitä kaikki neljä potilasta. Oli keskimäärin 11,8 ± 22,3 ng /ml MMP-1, 40,4 ± 23,2 ng /ml MMP-2, 41,6 ± 27,6 ng /ml MMP-9 ja 100,4 ± 128,5 pg /ml MMP-10, plasma veren peräisin yläonttolaskimon. Oli keskimäärin 7,8 ± 13,8 ng /ml MMP-1, 37,8 ± 19,9 ng /ml MMP-2, 134,5 ± 83,3 ng /ml MMP-9, ja 105 ± 90,9 pg /ml MMP-10 plasmassa veren saatu keuhkojen suonet lobectomy yksilöitä. Koska oli suurta vaihtelua potilaiden tason MMP, me normalisoitui tasolle löytyy yläonttolaskimon kullekin potilaalle. Sitten verrataan arvoihin potilailla. Ei ollut mitään merkittävää eroa joukossa MMP-1, MMP-2 ja MMP-10 tasoilla, oli kuitenkin huomattavasti suurempi MMP-9 keuhkolaskimossa verrattuna yläonttolaskimon (p = 0,02, kuvio. 8).

MMP tasot normalisoidaan tasolle löytyy yläonttolaskimon (SVC). Ei ollut merkittävää eroa MMP tasojen SVC ja keuhkolaskimon MMP-1 (p = 0,03), MMP-2 (p = 0,9) ja MMP-10 (p = 0,6). Siellä oli merkittävä kasvu MMP-9 tasojen keuhkolaskimossa verrattuna SVC (p = 0,02).

Keskustelu

A549-soluja kasvatettiin

ex vivo

3D keuhkomallissa olivat samanlaisia ​​kuin keuhkosyövän soluja kasvaa potilailla kuin A549-soluja kasvatettiin 2D kulttuuriin. Kuten olemme osoittaneet aiemmin [11] A549-soluja kasvatettiin

ex vivo

3D keuhkomallissa muodostunut kyhmyjä, mutta soluja kasvatettiin 2D kulttuuriin ei. Tunnusmerkki keuhkosyöpä on muodostumista keuhkojen kyhmy, joka voidaan kliinisesti havaita kuvantamisen kuten keuhkojen röntgenkuvauksessa tai tietokonetomografia [14]. Nämä keuhkosyövässä kasvaa ajan mittaan ja etäpesäkkeitä imusolmukkeisiin ja muihin elimiin.

ex vivo

3D keuhkomallissa osoitti kyhmy muodostumista ja kasvua ajan myötä, mutta 2D kulttuuriin ei. Lisäksi suurempi kyhmyt havaittiin, kun suurempi decellularized keuhkojen matriisi käytettiin kokeessa. Todennäköinen syy tähän eroon on se, että koko kyhmy rajoittaa pinta-ala decellularized keuhkojen matriisi. Lisäksi A549 solut muodostivat tiheämpi kyhmyt pienempi keuhkojen matriisi kuin suuremmissa keuhkojen matriisi, ja kokonaismäärä solujen kuluttua 15 päivän kasvun

ex vivo

3D keuhkomallissa ollut eroa näiden kahden koot decellularlized keuhkojen matriisin. Tämä viittaa siihen, että suurempia ja vähemmän tiheää kyhmyt kasvatetaan decellularized keuhkojen matriisit 6 viikon ikäisille rotille oli samanlainen määrä soluja kuin pienemmät ja tiheä kyhmyt kasvatetaan matriisit 4 viikon ikäisille rotille. Riippumatta koko decellularized keuhkojen matriisin kokeessa käytetty, oli kasvaimen kyhmy muodostumista ja kyhmyt kasvoivat ajan kuluessa.

oli merkittävästi enemmän kasvaimen remodeling ja A549-soluja kasvatettiin

ex vivo

3D keuhkomallissa verrattuna kasvanut 2D kulttuuriin. 15 päivän kuluttua, paljon suurempi määrä soluja havaittiin 2D kulttuuriin kuin

ex vivo

3D keuhkomallissa. Kasvu solujen 2D viljelmä rajoitettu tila, kun taas solujen kasvua

ex vivo

3D keuhkomallissa näyttävät olleen rajoitettu muut tekijät kuin tilaa, sillä käyttämällä suurempaa decellularized keuhko matriisi ei lisätä kokonaismäärä soluille kokeen loppuun.

ex vivo

3D keuhkomallissa, kasvaimen solut muodostivat kyhmyt tietyissä paikoissa matriisissa, ja kun kyhmyt muodostettu, ne kasvoivat kooltaan, muutamia ylimääräisiä kyhmyjä, jotka muodostavat aikana 15 päivän jakson aikana. Tämä viittaa siihen, solujen lisääntymisen alueilla suotuisasti ja solukuolemaa alueilla epäsuotuisa kasvun. Tämä on osoituksena analyysi Ki-67, joka on merkkiaine leviämisen, ja kaspaasi-3, joka on markkeri solukuoleman. Oli merkittävästi suurempi määrä solujen lisääntymisen ja solukuolemaa

ex vivo

3D keuhkomallissa verrattuna 2D kulttuuriin. Remodeling tapahtui yhteydessä kasvainsolujen järjestetään kanssa solu-solu- ja solu-matriisi vuorovaikutuksia, jotka näkyvät vain käytettäessä

in vivo

asetus [11].

Tekijöitä, jotka voivat myötävaikuttaa muodostumista suotuisat edellytykset kasvaimen kyhmy kasvua sisältävät ravinteita median ja taskuihin hypoksia luoma malli [15]. Syöpäsolut todennäköisesti muodostuu kyhmyjä alueilla, jotka ovat täynnä ravinteita, joka voi mahdollistaa solujen kasvavat paremmin kuin harvaan perfuusion Näin, solut rehevillä alueet lähemmäs verisuonet voivat olla suurempia lisääntymistä kuin alueilla, joilla on vähemmän perfuusio. Kyky

ex vivo

3D keuhkomallissa matkia tämä ehto tekee siitä paremman mallin

in vivo

ympäristössä kuin 2D kulttuuriin.

Lisäksi

ex vivo

3D keuhkomallissa voi jäljitellä

in vivo

ympäristössä parempi kuin

in vitro

3D-malleja (kuten kasvava keuhkosyöpäsoluissa Matrigelillä), koska se säilyttää verisuoni tilaa, on luonnollinen arkkitehtuuri perfusable elimen, ja mikä tärkeintä, koostumuksen matriisin säilyy lajien välillä [12]. Tämä kahden ominaisuudet ovat tärkein näkökohta

ex vivo

3D-malli. Ehjän verisuonen tila on seurausta kasvavan kasvaimen solujen solutonta matriisiin. Koska solutonta matriisi syntyy läpi decellularization prosessi, jossa tyvikalvon säilyy ja pysyy koskemattomana vaskulaaritilaa ja epiteelin tila. Decellularization prosessi poistaa endoteelisolujen vaskulaaritilaa ja epiteeli- ja mesenkymaalisten solujen epiteelin tila. Kasvainsolut sijoitetaan epiteelin tilan kautta henkitorven ja median pumpataan vaskulaaritilaa. Koska kasvain kasvaa ja muodostaa kyhmyjä, se säilyttää vaskulaaritilaa. Jos kasvain tuhoaa vaskulaaritilaa sitten media ei pysty pumppaamaan läpi telineen 6 cc per min. Koko 15-päivää, meillä ei ollut mitään ongelmia perfuusio kasvain kyhmy. Siten malli luo perfusable kasvain kyhmy. Mikään muu malli, joka voidaan toimittaa ravinteita ja poistaa erittyvä tekijät, kuten tässä mallissa. Lisäksi, toisin kuin

in vitro

3D-malleja, jotka ovat riippuvaisia ​​keinotekoinen matriisin koostumus matriisin käytetään

ex vivo

3D keuhkojen malli on koostumus, joka on todennäköisesti nähdään keuhkosyöpä solut

in vivo

ympäristössä. Koska solujen signalointi ja käyttäytyminen ovat riippuvaisia ​​koostumuksesta ja jäykkyys soluväliaineen [9], [16], [17], käyttäytymistä kasvainsolujen voidaan tarkemmin edustaa

ex vivo

3D keuhkojen malli.

muodostamisen lisäksi perfusable kasvaimen kyhmyjä, A549-soluja kasvatettiin

ex vivo

3D keuhkojen malli tuotetaan MMP-9, joka on tuotettu keuhkosyövän solut potilailla. MMP ovat perheen sinkki riippuvaisten endopeptidaasit että avainasemassa kasvainsolun invaasiota, muuttoliike, ja etäpesäkkeiden hajottamalla soluväliaineen (ECM) ja tyvikalvoista [18]. ECM on monimutkainen verkko makromolekyylit, kuten kollageenia, proteoglykaaneja, laminiini, fibronektiini, ja monia muita glykoproteiineja. MRNA MMP havaittiin myös kasvaimen solut kasvavat

ex vivo

3D-malli päivänä 15. Lisäksi MMP-1, MMP-2, MMP-9 ja MMP-10 havaittiin tiedotusvälineissä

ex vivo

3D keuhkomallissa sekä seerumissa että verinäytteet kerättiin yläonttolaskimon ja keuhkojen suonet lobectomy keuhkosyövän yksilöitä. Keuhkolaskimon on ensimmäinen suuri alus kohtaamista erittyvä proteiini keuhkosyöpä, joka pitää korkein pitoisuus erittämät proteiinit syöpä. Lisäksi yläonttolaskimon sisältää verta, joka kulkee keuhkovaltimon joka menee keuhkojen kasvain. Siten MMP joka on todennäköisesti tuotettu kasvain pitäisi olla korkein pitoisuus keuhkolaskimossa ja alin pitoisuus yläonttolaskimon. Niistä neljä MMP tutkittu, huomasimme, että MMP-9 on ainoa proteiini, joka saavutti tämän kriteerit. MMP-9 löydettiin tiedotusvälineissä

ex vivo

3D keuhkomallissa vaikka sitä ei löydy 2D kulttuuriin. Tutkimuksemme vahvistaa aiempaan toteamukseen A549 solut eivät tuota MMP-9 2D kulttuuri [19]. MMP-9: llä on tärkeä rooli hajoamista tyypin IV kollageenia, joka on merkittävä rakenteellinen proteiini ECM ja tyvikalvoista. Korkea seerumin MMP-9 tasojen on osoitettu korreloivan huonon selviytymisen potilaiden keuhkosyöpä [20], [21]. Siten läsnäolo MMP-9

ex vivo

3D keuhkomallissa viittaa siihen, että se jäljittelee

in vivo

olosuhteissa paremmin kuin 2D kulttuuriin.

Vahvuus nykyinen tutkimus osoittaa, miten ihmisen keuhkosyöpä solut käyttäytyvät 2D verrattuna

ex vivo

3D-malli käyttäen sama määrä kennoja ja käyttämällä samaa elatusaineet. Heikkoutena Nykyisessä tutkimuksessa on, että emme pystyneet vertailemaan

ex vivo

3D mallia

in vitro

3D-malleja. Emme voineet viljellä 25 miljoonaa solua on Matrigel antamaan vertailun vuoksi tekniset rajoitukset

in vitro

3D-malleja. Kuitenkin pystyimme osoittamaan piirteitä

ex vivo

3D-malli, joka ei havaittu

in vitro

3D-malleja, kuten kasvua kasvaimen kyhmyjä ja säilyttämisen vaskulaaritilaa.

Kaiken ihmisen keuhkosyövän soluja kasvatettiin

ex vivo

3D keuhkomallissa ollut ominaisuuksia, jotka jäljittelevät keuhkosyöpää kasvua ja etäpesäkkeiden potilailla, kun taas solut kasvatetaan 2D kulttuuriin ei. Ihmisen keuhkojen syöpäsoluja kasvatetaan

ex vivo

3D keuhkomallissa muodostunut perfusable kasvain kyhmyjä, jossa erittyvää proteiineja, jotka ovat tärkeitä kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden. Siksi

ex vivo

3D keuhkomallissa voi olla parempi malli, jolla voidaan tutkia keuhkosyöpää kasvua ja etäpesäkkeiden kuin 2D kulttuurin ja mahdollisesti muita

in vitro

3D-malleja.

Materiaalit ja menetelmät

Saimme tietoisen kirjallisen suostumuksen potilaista määrittää secretome profiilit veressä. Kokeet, joissa potilaat oli hyväksynyt Institutional Review Board klo Methodist Hospital Research Institute (IRB (2) 0811-0142). Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti kaikkien sovellettavien lakien, asetusten, ohjeiden ja politiikkaa koskevat laboratorioeläinten käyttöä tutkimuksessa. Pöytäkirjojen eläinkokeiden hyväksyttiin Institutional Animal Care ja Käytä komitea on Methodist Hospital Research Institute (AUP-0910-0018).

Potilasnäytteet

Potilailla, jotka olivat käynnissä lobectomy varten keuhkosyöpä antoi suostumuksensa saada verta otettu yläonttolaskimon ja keuhkojen laskimoon resektoitua näytteen. Keräsimme myös potilaan demografiset tiedot ja patologian tuloksia näytteen. Kun potilaan oli keskeinen linja paikka, poistimme noin 10 ml keskilinjasta sijaitsee yläonttolaskimon on BD Vacutainer K

2 EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ, USA. Sitten, kun näyte oli poistaa potilaasta, keuhkolaskimosta tunnistettiin. Poistimme noin 10 ml verta suoneen ja asettanut sen BD Vacutainer K

2 EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). näyte laimennettiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) 01:01, sitten näyte laitettiin kerrokseksi 18 ml lymfosyyttien erottaminen median ja sentrifugoitiin 2200

g

sentrifugissa 20 minuuttia. MMP-pitoisuus plasmassa kerros määritettiin käyttämällä Luminex (Luminex, Austin, TX, USA), joka on kuvattu alla.

Cell Culture

ihmisen alveolaarisen pohjapinta epiteelin adenokarsinoomasolulinja A549 saatiin American Type Culture Collection ( Manassas, VA, USA). soluja kasvatettiin 525 cm

2 soluviljelypullot (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) täydellisessä median valmistettu RPMI 1640 -alustaa (Hyclone, South Logan, UT, USA) jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Lonza, Walkersville, MD, USA) ja antibiootteja (100 IU /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 0,25 ug /ml amfoterisiini; MP Biomedicals, Solon, OH, USA) 37 ° C: ssa 5% CO

2. Kun solut olivat 85% konfluentteja, ne pestiin PBS: llä ja saatettiin trypsiinikäsittelyllä käyttämällä 0,25% trypsiiniä (Cellgro, Manassas, VA, USA) solujen keräämiseksi pulloista. Solut pestiin median ja lopuksi suspendoitiin 30 50 ml: aan täyttä kasvatusliuosta.

Ex vivo

3D Lung Model

Loimme

ex vivo

3D keuhkomallissa kuten aikaisemmin on kuvattu [11]. Käytimme decellularized keuhkojen matriisit 4-viikon ikäisiä (n = 2), ja 6 viikon ikäisiä (n = 2) rotilla. Decellularized keuhkojen matriisit 4 viikon ikäisten rottien olivat merkittävästi pienempiä kuin 6 viikon ikäisille rotille. Olemme sijoitettu 25 miljoonaa A549-solut laimennetaan 50 ml täyttä median kautta henkitorveen

ex vivo

3D keuhkomallissa (n = 4). Keräsimme mediaa passiivisesti tuli ulos mallin 500 ml säiliöön, johdetaan uudelleen läpi henkitorvi kolme kertaa, ja inkuboitiin sitä 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan, jotta solujen kiinnittymistä. Sitten lasketaan solujen astiaan ja määritetään prosentuaalinen osuus kasvainsolujen ympätään

ex vivo

3D keuhkojen malli. Olemme sijoitettu vielä 200 ml: lla täydellistä median bioreaktorissa aiemmin kuvattu [11] ja annettiin median läpi pumpun 6 ml minuutissa ja sitten läpi oxygenator ja keuhkovaltimon

ex vivo

3D-keuhko malli. Olemme myös juoksi ohjaus

ex vivo

3D keuhkomallissa jossa muutimme 200 ml täyttä kasvatusliuosta bioreaktorissa päivittäinen asettamatta mitään solujen mallissa. Keräsimme median päivittäin 500 ml astiaan ja pyöritettiin alas käytetään mediaa 400

g

5 minuuttia ja tallennetaan 10 ml supernatanttia varten secretome analyysiä. Olemme korvanneet käyttää mediaa tuoreella media päivittäin 15 päivän ajan. Joka toinen päivä, selvitimme

ex vivo

3D keuhkomallissa läsnäolo kyhmyt. Laskimme alaa kyhmy ja lasketaan yhteen kaikki kyhmy alueiden saamiseksi koko kyhmyn koon mallia kohden. 15 päivän jälkeen noin 5%

ex vivo

3D keuhkomallissa poistettiin ja kiinnitettiin 10% formaliiniin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H sitten solut laskettiin käyttämällä TC10 automatisoitua solulaskijalla (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

2D Culture

sijoittaa 25 miljoonaa A549-soluja on 525-cm