Krooninen sairaus

tiivistelmä

Chemoresistance yhä merkittävä este tehokasta hoitoa potilaille, joilla on munasarjasyöpä, ja viime aikoina yhä todisteita mukaan miRNA osallistuvat lääkeresistenssideterminantit. Tässä tutkimuksessa selvitimme roolia miRNA säätelyssä sisplatiinin resistenssin munasarjasyövän solulinjassa ja analysoitiin niiden mahdollisia mekanismeja. Olemme profiloitu miRNA differentiaalisesti ilmaistut sisplatiini kestävä ihmisen munasarjasyövän A2780 /DDP verrattuna vanhempien A2780-soluihin käyttäen mikrosirulla. Neljä poikkeuksellisen ilmaisi miRNA valittiin (miR-146a, -130a, -374a ja miR-182) lisätutkimuksiin. Niiden ilme varmistettiin qRT-PCR. MiRNA jäljittelee tai estäjä transfektoitiin A2780 ja A2780 /DDP soluja ja sitten lääke herkkyyttä analysoitiin MTS array. RT-PCR ja Western blot suoritettiin tutkimaan muuttamista MDR1, PTEN geenin ilmentymistä. Yhteensä 32 miRNA havaittiin ilmentyä erilailla A2780 /DDP soluja. Niistä miR-146a oli alassäädetty ja miR-130a, -374a, -182 ilmentyivät A2780 /DDP soluja, mikä varmistettiin RT-PCR. MiR-130a ja miR-374A jäljittelee vähentynyt herkkyys A2780 solujen sisplatiini, käänteisesti, niiden estäjät voivat resensitize A2780 /DDP soluja. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-130a voisi lisätä MDR1 mRNA ja P-gp tasoilla A2780 ja A2780 /DDP soluja, kun taas pudotus Mir-130a voi estää MDR1 geenien ilmentyminen ja upregulate PTEN-proteiinin ilmentymisen .Vuonna päätökseen, sääntelyn purkamista miR-374A ja miR-130a voi olla mukana ja sääntelyä sisplatiinin resistenssin munasarjasyöpäsoluja. Tämä rooli miR-130a voidaan saavuttaa säätelemällä MDR1 ja PTEN geenin ilmentymistä.

Citation: Li N, Yang L, Wang H, Yi T, Jia X, Chen C, et al. (2015) MiR-130a ja MiR-374A Funktion Novel Regulators Sisplatiinin Resistance Human munasarjasyöpä A2780 Cells. PLoS ONE 10 (6): e0128886. doi: 10,1371 /journal.pone.0128886

Academic Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 15 helmikuu 2015; Hyväksytty: 02 toukokuu 2015; Julkaistu 4. kesäkuuta 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee kaksi varoja. Yksi on paikallinen Foundation (No.2012SZ0022) päässä Science and Technology Department of Sichuanin maakunnassa (https://www.scst.gov.cn/info/), jonka rahoittaja on WHJ tutkimukseen osallistuneiden suunnittelu ja päätöstä julkaista tässä tutkimus. Toinen on ohjelma Changjiangin Tutkijat ja Innovative Research Team yliopiston (NO.IRT0935, https://www.moe.gov.cn/), jonka rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojen keruu ja analysointi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on johtava kuolinsyy gynekologinen maligniteetit [1]. Yli 70% munasarjasyöpäpotilaalle ovat edenneet vaiheeseen (levinneisyysaste III tai IV) taudin aikaan diagnoosi [2]. Sisplatiini on tärkein terapeuttinen lähestymistapa pitkälle munasarjasyöpä, kuitenkin, lääkeresistenssideterminantit minimoi tehokkuutta sisplatiini-base kemoterapiaa suuri määrä potilaita [3]. Useita tekijöitä ja mekanismeja, jotka auttavat sisplatiinipohjaisen vastus on raportoitu, mukaan lukien lisääntynyt huumeiden ulosvirtaus, epämuodostuma huumeiden tavoite, parantaminen DNA korjaus ja muuttaminen apoptoosin polkuja [4-7] .Nonetheless taustalla olevien mekanismien chemoresistance tunnetaan edelleen huonosti ja tehokkaita aineita parantaa vastus on till puuttuessa.

Äskettäin tutkimuksesta osoitti, että MikroRNA (miRNA) olivat mukana chemoresistance. MiRNA ovat luokka pieni ei-koodaavan RNA-molekyylejä, ja se voi sitoutua 3′-transloimaton alue (3′-UTR), kohde-mRNA: iden, jolloin RNA: n hajoamisen ja /tai translaation repression [8]. Siten miRNA laajasti osallistua sääntelyn erilaisten biologisten prosessien, kuten alkion kehitys, solujen lisääntymistä, erilaistumista, muuttoliike ja apoptoosin [8,9]. Yhä useammat tutkimukset viittaavat siihen, että poikkeava miRNA ilmaisuja on liittynyt kaikessa tuumoribiologiassa, kuten kestävyyttä erilaisia ​​kemoterapia-aineiden [10-12] .For Esimerkiksi miR-21 yliekspressoitui kolorektaalisyövässä kudoksia, jotka olivat vähemmän herkkiä 5 -FU [13], ja inhibitio miR-21 ilmentyminen kykeni herkistämään soluja 5-FU [14]. Lisäksi edellisessä tutkimuksessa [15] todennut, että miR-130 oli yläreguloituja SKOV3 /DDP verrattuna SKOV3, ja miR-130a esto voisi voittaa sisplatiini vastus säätelemällä MDR1 /P-gp-reitin. Kuitenkin rooli miRNA prensents soluspesifisyys, joten ilmaus miR-130a tai muu miRNA rooleineen muissa munasarjasyövän solulinjoissa tarvitaan lisätutkimuksia.

Nykyisessä tutkimuksessa olemme seulotaan miRNA ilme profiilia A2780 ja A2780 /DDP soluja, ja valitut jotkut ilmentyvät eri miRNA A2780 /DDP jatkotutkimuksiin. Sitten me tarkistaa ilmaus valittujen miRNA by qRT-PCR, ja tutkitaan niiden roolia moduloimaan sisplatiini-vastus, joka voi tarjota uusia Ehdokaskohteiden geeniterapiaan sisplatiini kestävä munasarjasyöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

ihmisen munasarjasyövän A2780 ja sen sisplatiini-resistentti alalinja A2780 /DDP viljeltiin DMEM-alustassa (Gibco, USA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco , USA), kosteutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 37 ° C: ssa. A2780 /DPP oli vuorotellen syötettiin alustalla, joka sisälsi 9 ug /ml sisplatiinia säilyttää lääkeresistenssideterminantit ja viljeltiin edelleen huumeiden väliaineessa viikon ajan ennen jatkokokeilut. Molemmat solulinjat saatiin ja säilytetty Gynecological Oncology of Biotherapy Laboratory, West China Second University Hospital, Sichuanin yliopiston Chengdu, Kiina.

miRNA mikrosiruanalyysi

Yhteensä RNA uutettiin A2780 ja A2780 /DDP-soluissa käyttämällä Trizol (Invitrogen, USA) ja miRNeasy mini -kittiä (QIAGEN, Tanska) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Laatu ja määrä mitattiin spektrofotometrillä (Beckman Coulter, DU730, USA) ja RNA: n eheys varmistettiin geelielektroforeesilla. RNA (1 ug) leimattiin Hy3 loisteputki käyttäen miRCURY Virta -leimauskitillä (Exiqon, Vedbaek, Tanska) ja sitten hybridisoidaan sen miRCURYLNA Array (v.18.0, Exiqon), joka sisälsi 1887 ihmisen miRNA sieppauskoettimien selityksin sisään miRBase 18.0. Hybridisaation jälkeen fluoresoiva signaali kuvat hankittiin käyttäen Genepix 4000B skanneri (Axon Instruments, Union City, CA, USA) ja analysoitiin Genepix Pro 6.0 soft-ware (Axon Instruments), jossa mediaani normalisointi saatiin. Kaksinkertaiseksi tai suurempi muutos oli asetettu kynnys merkittävä ero.

Bioinformatics

potentiaalisia käyttöalueita ilmentyvät eri miRNA ennustettiin avulla PicTar tai TargetScan 5.2 ohjelmistoa.

Reaaliaikainen qRT-PCR

todentaa ilmentymistä valit- tuja miRNA A2780 ja A2780 /DDP solujen qRT-PCR. Kokonais-RNA kustakin solulinjan uutettiin ja arvioitiin edellä mainittujen. MiRNA ja U6 cDNA luotiin käyttäen miRNA erityisiä kantasilmukan RT alukkeita mukaan AMV First Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, USA) protokollan. Kaikki alukkeet suunniteltiin ja syntetisoitiin Guangzhou RiboBio (RiboBio, Kiina). Reaaliaikainen qRT-PCR suoritettiin 20 ul reaktiotilavuudessa ABI Stepone plus -laitetta (USA). Suhteellinen miRNA ilmentyminen arvioitiin käyttämällä 2

-ΔΔCt menetelmä ja normalisoidaan ilmaus U6 pieniä RNA. Kaikki qRT-PCR: t suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Solun transfektio

miRNA matkivat, estäjä ja negatiivinen kontrolli suunniteltiin ja kemiallisesti syntetisoitu Guangzhou RiboBio (RiboBio, Kiina). 24 ennen transfektiota solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille 5000 solua /kolo ja niitä viljeltiin alustassa ilman antibiootteja. Sen jälkeen, kun solun kiinnitys, transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) ja Opti-Mem seerumivähennysväliainetta (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Elatusaine korvattiin 4-6h transfektion jälkeen uusi tuoretta väliainetta. Soluja valmistettiin lisäanalyysiä 48 h transfektion jälkeen. Tämä tehokas liposomivälitteistä transfektiota järjestelmä dectected avulla Cy3-siRNA. Cy3-siRNA on eräänlainen 21-25nt pieniä RNA-molekyylin, joka on samanlainen miRNA estäjää tai jäljittelee, ja voi kiihottaa fluoresenssi aallonpituudella 555 nm. Tärkeimmät vaiheet ovat seuraavat: solut ympättiin 24-kuoppaisille levyille, joissa 10000 solua /kuoppa ja transfektoitiin Cy3-siRNA käyttäen Lipofectamine 2000 ja Opti-MEM-elatusainetta. 24 tuntia transfektion jälkeen solut tarkkailtiin fluoresenssimikroskoopilla. Transfektiotehokkuus esitettiin suhteena solujen tarkkailtiin fluoresenssia soluihin havaittiin alle nomal ligtht. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa.

Solujen elinkelpoisuus array

Transfektion jälkeen soluja 96-kuoppaisille levyille altistettiin eri pitoisuutta sisplatiinia. Solujen proliferaatio määritettiin kolorimetrisellä määrityksellä käyttämällä CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay -kittiä (Promega, Madison, WI, USA). 48 h jälkeen hoidon, 20 ui Yksi ratkaisu Reagent lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 3 tuntia 37 ° C: ssa. Absorbanssi 490 nm: n aallonpituudella mitattiin käyttäen mikrolevyn lukijaa (malli 680, Bio-Rad, USA). Kukin koe suoritettiin rinnakkaisnäytettä kuusi kuoppaa ja toistettiin kolme kertaa.

Puolikvantitatiivinen RT-PCR-

Kokonais-RNA käsittelemättömien solujen tai transfektoitujen solujen eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia. RT-PCR suoritettiin käyttäen PrimeScript RT reagenssipakkauksen ja Multiplex PCR Assay Kit mukaan valmistajan ohjeiden (TaKaRa Biotechnology, Dalian, Kiina). PCR-tuotteet tunnistettiin elektroforeesilla 1,5% agaroosigeeleillä ja kirjataan käyttämällä Gel kuvantamisjärjestelmä (Bio-Rad, CA, USA). GAPDH RNA toimi tulon ohjaus.

Western blot -määritys

Solut pestiin 1 x PBS: llä ja lyysattiin RIPA-puskurilla. Proteiinipitoisuus mitattiin käyttäen BCA-menetelmää. Seuraavaksi 20 gg proteiinia käytettiin havaitsemiseen P-gp: n ja PTEN-proteiinin, ja GAPDH käytettiin lastaus ohjaus. Hiiren monoklonaalinen anti-Pgp (laimennettu 1: 1000; Calbiochem, San Diego, CA, USA), anti-PTEN (laimennettu 1: 1000, Santa Cruz, CA, USA) ja anti-GAPDH (laimennettu 1: 50000, Kangchen, Shanghai , Kiina) käytettiin ensisijaisena vasta-aineita. Sekundaarinen vasta-aine oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin. Sitoutuneet vasta-aineet havaittiin käyttämällä ECL kit. Määrä-One ohjelmistoa käytettiin määrittämään proteiinin juovien voimakkuudet.

Tilastollinen

Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. Erotus avulla analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 13.0 ohjelmistoa (Chicago, IL, USA). P-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Differential ilmaistu miRNA A2780 /DDP verrattuna sen lähtöaineena solun A2780

miRNA ilmaus profiilia munasarjojen tasyöpäsolulinja A2780s ja A2780 /DDP havaittiin käyttäen miRNA array tässä tutkimuksessa. Kuten taulukosta 1, 32 miRNA (24 säädelty, 8 alassäädetty) havaittiin ilmentyä erilailla A2780 /DDP soluja verrattuna sen vanhempien soluihin. Mahdollinen kohdegeenin näistä miRNA ennustettiin ja lueteltu taulukossa 1.

Reaaliaikainen qRT-PCR 4 ilmentyvät eri miRNA

Niistä 32 ilmentyvät eri miRNA, valitsimme 4 miRNA for enää joutuisi tutkimus. Tulokset qRT-PCR osoitti, että A2780 /DDP soluja, ilmentyminen miR-374A, 130, -182 on vastaavasti kasvanut 2,06, 4,87, 1,28 taittuu ja miR-146a laski 133,56 kertaiseksi verrattuna A2780s solut (

p

0,05), jotka olivat yhdenmukaisia ​​mikrosirulla. (Kuvio 1) B

taso miR-146a A2780 /DDP oli erittäin alhainen, vain osuus 0,75 prosenttiosuuden että A2780s (**

p

0,05). Ilmaisu Mir-130a, -374a ja miR-182 oli 4,8, 2,08 ja 1,28 taittuu korkeampi kuin A2780-soluissa (**

p

0,05, *

p

0.05) .Nämä tulokset osoittivat johdonmukaisesti ilmentyminen muuttuu havaitsemien mikrosirulla.

miR-130a ja miR-374A jäljittelee tai inhibiittorit säädellä sisplatiinin herkkyyttä A2780 ja A2780 /DDP

tässä tutkimuksessa käytimme liposomi välittävän transfektioon miRNA analogit. Joten me ensinnäkin havainneet transfektiotehokkuudelle. A2780 ja A2780 /DDP soluja tarkkailtiin fluoresenssimikroskoopilla 24 tunnin kuluttua Cy3-siRNA transfektiota. laskimme, että A2780s ja A2780 /DDP soluja punaisen fluoresenssin osalta osuus oli 85% ja 93%, mikä indictated että Liposomivälitteinen transfektio voisi saavuttaa korkea hyötysuhde.

kolme miRNA (miR-374A, – 130a, -182) jäljittelee ja miR-146a estäjä transfektoitiin A2780 soluihin, onko transfektoidut solut muuttuvat resistenteiksi sisplatiinia. Tulokset osoittivat, että A2780 transfektoitujen solujen miR-374A ja miR-130a jäljittelee oli merkitsevästi korkeampi selviytymisen kuin verrokkiryhmässä alla hoidossa 0,8, 3,2 ug /ml cispaltin, mutta sama ilmiö ei havaittu miR-182 matkii ja miR-146a estäjä. (P 0,05, kuvio 2A).

(EN) A2780 soluissa transfektion jälkeen miR-130a-matkivat ja miR-374A-matkivat osoitti lisääntynyt suhde eloonjääneiden solujen alle hoidossa 0,8, 3,2 ug /ml cispaltin (*

p

0,05). (B) miR-130a-estäjä ja miR-374A-estäjä vähensi suhde eloonjääneiden solujen alle hoitoon 8, 32 ug /ml cispaltin (*

p

0,05).

lisäksi transfektoitu miR-374A ja miR-130a estäjät otetaan A2780 /DDP soluja tutkia, ovatko ne voivat osittain kääntää sisplatiinin vastus. Kuten kuviossa 2B, miR-374A ja miR-130a estäjä tehostaa merkittävästi sytotoksisuutta sisplatiinihoitoon verrattiin ohjaus (p 0,05).

MiR-130a säätelemään MDR1 ja PTEN vuonna A2780s ja A2780 /DDP soluja

tarkasteltiin ilmentymisen MDR1, PTEN mRNA ja proteiini A2780 ja A2780 /DDP solujen RT-PCT ja western blot. Kuten kuviossa 3 MDR1 mRNA: ta ja P-gp taso A2780 /DDP soluja oli 2,33 ja 1,88 kertaa suurempi kuin A2780-soluissa (P 0,05), kun taas ilmentyminen PTEN-proteiinin oli erittäin pieni sekä solun linjat ja ilmaus PTEN mRNA: ta ja proteiinia ei esiintynyt merkittävää eroa (P 0,05).

(A) MDR1 ja PTEN mRNA tasoilla A2780 ja A2780 /DDP soluja. Ilmentyminen MDR1-mRNA yli-ilmentyy A2780 /DDP verrattuna A2780 (P 0,05), ja PTEN mRNA-tasolla ei osoittanut mitään eroa (P 0,05). (B) P-gp: n ja PTEN-proteiinin ekspressiotasot A2780s ja A2780 /DDP soluja. Ilmaisu P-gp A2780 /DDP soluja oli korkeampi kuin A2780 (P 0,05), ja PTEN proteiini oli erittäin alhaisella tasolla A2780 ja A2780 /DDP soluja. (1,2: A2780, A2780 /DDP)

Jotta tutkia miR-130a voisi säädellä PTEN ja MDR1 ilmaisun vastaava matkii ja estäjiä molempien miRNA transfektoitiin A2780 ja A2780 /DDP soluja. PTEN, MDR1 mRNA ja niiden proteiinien ilmentyminen määritettiin 48 tuntia transfektion jälkeen. Kuten kuvassa 4, miR-130a esto kasvoi PTEN-proteiinin tasot ja vaimensi expressio on MDR1 mRNA ja P-gp (P 0,05), kun taas miR-130a yli-ilmentyminen johti säätely ylöspäin MDR1 mRNA ja P-gp ilme A2780 ja A2780 /DDP soluja (P 0,05) kantavassa ilmentymistä PTEN mRNA eivät muuttuneet hoitoon miR-130a estäjä ja jäljittelee molemmissa solulinjoissa (P 0,05).

(A1 , A2): PTEN ja MDR1 mRNA A2780 soluissa transfektion jälkeen. MDR1 mRNA taso voimistuvan MIR-130a matkii ja vaimentua jonka miR-130a estäjä (P 0,01). (B1, B2): P-gp ja PTEN proteiinin A2780 soluissa transfektion jälkeen. Ekspressio PTEN-proteiinin oli merkittävästi kohonnut Kun soluja käsiteltiin miR-130a-I: n ilmentyminen P-gp oli voimistuvan miR-130-M ja vaimentua by miR-130a-I. (C1, C2): PTEN ja MDR1 mRNA A2780 /DDP solujen transfektion jälkeen. Sääntely vaikutus miR-130a päälle A2780 /DDP soluissa oli samanlainen kuin A2780 soluissa. (D1, D2): P-gp ja PTEN proteiinin A2780 /DDP solujen transfektion jälkeen. Vaikutus miR-130 oli samanlainen kuin A2780s soluja. (1,2,3: miR-130a-M, miR-130a-I ja miR-NC; * p 0,05, ** p 0,01)

Yhteenvetona löysimme 32 miRNA ilmentyvät differentiaalisesti A2780 /DDP soluja verrattuna sen vanhempien soluihin miRNA array. Niistä yksi alassäädetty miRNA (miR-146a) ja kolme sääteli miRNA (miR-130a, -374a, -182) valittiin jatkotutkimuksiin, ja niiden ilmentyminen oli validoitu johdonmukaisesti miRNA matriisi qRT-PCR. Vuonna transfektointikokeessa, yliekspressio miR-130a ja miR-374A havaittiin vähentävän herkkyyttä A2780 ja A2780 /DDP soluja sisplatiinin ja alas-säätelemällä miR-130a ja miR-374A ilmaisu kohdistama päinvastainen vaikutus. Tulokset RT-PCR ja western blot osoitti, että miR-130a voisi positiivisesti säädellä mRNA ja proteiini ilmentymä MDR1 ja säädellä negatiivisesti PTEN-proteiinin, joka voi olla yksi mekanismien miR-130a rooli chemoresistance.

keskustelu

Vaikka platinapohjaisen kemoterapian on parantanut ennusteen munasarjasyöpä, lääkeresistenssideterminantit edelleen tärkein este hoidon onnistumisen [3]. Äskettäin miRNA ilmoitettiin ilmentyä erilailla lääkkeille vastustuskykyiset syöpien ja voi säädellä lääkeresistenssi [16,17].

Tässä tutkimuksessa havaittiin, että 32 miRNA oli differentiaalisesti ilmaistu A2780 /DDP verrattuna A2780. Mielenkiintoista on, että jotkut näistä miRNA on vahvistettu olevan osallisena chemoresistance. Esimerkiksi miR-27a oli säädellään ylöspäin A2780 /Taxol soluja ja knockdovvn miR-27a tehosti paklitakseli herkkyys [18]. Takiuchi [19] kertoi, että miR-181 vähentynyt herkkyys haimasyövän solun gemsitabiinin aktivoimalla NF-KB mukaan CYLD esto. Aikaisemmat Tutkimuksessa todettiin myös miR-130a liittyi sisplatiinilla resistenssin SKOV3- soluissa. Tiedot microarray paljasti, että A2780 /DDP ilmentymistä miR-146a oli erittäin alhainen, ja miR-130a, -374a, -182 oli sääteli. Lisäksi miR-130a rooli sisplatiinin vastus A2780 solujen ja onko miR-146a, -374a, -182 voisi säädellä lääkeaineen vastus ei ole vielä raportoitu, joten me valitsemme nämä neljä miRNA jatkotutkimuksiin. Nämä neljä miRNA ilmaisu varmistettiin qRT-PCR, hieman viittaa siihen, että mikrosiru oli suurella tarkkuudella.

transfektiokokeis-, löysimme muuttamista miR-130a ja miR-374A ilmentyminen voi muuttaa aste sisplatiinin vastus A2780 ja A2780 /DDP. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-130a toimi solunsalpaajaresistentti säädin. Up-regulation miR-130a voi vaikuttaa doksorubisiiniresistenssiä rintasyövässä [20], ja miR-130a aiheuttama vastus maksasyövän solun sisplatiini mukaan downregulation tuumorisuppressorigeenien RUNX3 [21]. Edellisessä tutkimuksessa [15], miR-130a yliekspressoitiin SKOV

3 /DDP soluja, ja esto miR-130a voi osittain palauttaa sisplatiinia herkkyys, mikä oli yhtäpitävä edellä tutkimuksessa.

Tällä hetkellä muutamia tutkimuksia keskittynyt roolista miR-374A kasvaimen, joka muistutti, että miR-374A yliekspressoitui vuonna osteosarkooman [22] ja paksusuolen syöpä. [23] Lisäksi miR-374A oli mukana kasvaimen synnyssä ja etäpesäke rintasyövän säätelemällä Wnt /kateniinin reitin [24]. Toistaiseksi ei ole raportoitu roolista miR-374A huumeiden vastarintaa. Täällä, huomasimme, että miR-374A on yläreguloituja sisplatiini-resistentit solut, ja vähentämällä sen ilmentyminen voisi tehdä soluja herkempiä sisplatiiniin, vaikka upregulating ilmaisunsa A2780s oli päinvastainen vaikutus.

Siksi katsottiin että yli-ilmentyminen miR-130a ja miR-374A saattaisi edistää ja sääntelyn sisplatiinin resistenssin munasarjasyöpäsoluja. Ekspression inhiboimiseksi miR-130a ja miR-374A saattaisi olla uusi lähestymistapa voittamiseksi lääkeresistenssin munasarjasyöpä. Tämän seurauksena myös suorittaa RT-PCR ja western blot löytää mekanismi miR-130a sääntelyn vaikutusta lääkeresistenssi.

tutkimuksessa todettiin ilmaus MDR1 mRNA ja sen proteiinituotteen P-glykoproteiinin (P -gp) tasoilla A2780 /DDP oli merkittävästi suurempi kuin, että A2780s, mikä viittaa siihen, että yli-ilmentyminen MDR1 geeni voi olla yksi mekanismi, lääkeresistenssin muodostumiseen A2780 /DDP soluja. P-gp on ATP-riippuvainen kalvopumppu, joka kuljettaa lääkkeen ulos soluista, mikä johtaa monilääkeresistenssin [25]. Runsaasti todisteita osoittivat, että miRNA liittyivät P-gp välittämää lääkeresistenssin monissa syövissä. Esimerkiksi miR-451 voitti doksorubisiiniresistenssiä mukaan vähen- tämisessä P-gp ilmentymisen doksorubisiini rintasyövän MCF-7 /ADR-[26]. Esto miR-27a tehosti paklitakselin herkkyys A2780 /Taxol moduloimalla MDR1 /P-glykoproteiinin ilmentymisen [18]. Olemme päätellä, että estämällä ilmentymistä miR-130a johti alas-säätely MDR1 mRNA ja P-gp. Tämä tulos on sopusoinnussa aiempien kokeiden.

Olemme myös havainneet, että miR-130a säätelee negatiivisesti ilmentymistä PTEN-proteiinin. PTEN-proteiinin on kaksi spesifisyyttä fosfataasi, joka voi estää sytokiini-välitteisen signaalitransduktion reittien, sitten inhiboivat soluproliferaatiota ja metastaasit ja edistämään apoptoosia [27]. Erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien peräsuolen syöpä, rintasyöpä, leukemia, munasarjasyöpä jne, PTEN-geenin ja -proteiinin on eriasteinen poistamista tai down-regulation [27,28]. On raportoitu, että PTEN-proteiinin voisivat edistää lääkeaineen herkkyys tukahduttamalla PI3K /Akt-reitillä, ja toimia kohdegeenin monien miRNA, kuten miR-21, miR-22 ja miR-222 [29,30]. Tässä kokeessa ekspressio PTEN-proteiinin A2780s ja A2780 /DDP soluja erittäin alhainen ja ei ollut merkittävää eroa näiden kahden solulinjan. Olemme myös päätellä, että palauttaminen PTEN ilmentyminen voi olla yksi mekanismien kemosensitiivisyys kasvu munasarjasyöpä soluja. Kuitenkin, A2780 ja A2780 /DDP transfektoitujen solujen miR-130a-estäjä ei aiheuttanut suurempi solujen aktiivisuuden esto verrattuna kontrolliryhmiin alla käsittelemällä matalassa annoksen sisplatiinia (0.2ug /ml ja 2 ug /ml), laskimme syy tähän ilmiöön on, että PTEN-välitteistä apoptoosia osittain tukeutua soluvaurioita sisplatiinin ja niillä on synergistinen vaikutus. Vain pieni määrä soluja käsitellään apoptoosin tai kuolema tässä matalan Sisplatiinin ja solukasvuneston välittämää PTEN ei ollut tarpeeksi kykyä tehdä merkittävää eroa koe- ja kontrolliryhmissä. Mielenkiintoista, Huomasimme, että miR-130a ei säädellä PTEN mRNA: n ilmentymisen samoin PTEN-proteiinin, mikä viittaa siihen, että miR-130a voi säädellä PTEN geenin transkription jälkeisen translaation tasolla epätäydellinen sitoutuvat 3′-alue (3′-UTR ) PTEN mRNA.

PicTar andTargetScan ohjelmisto ennustaa, että mahdolliset kohdegeenien miR-374A ovat AKT3, ABI1, PDCD6, ABCC5 ja niin edelleen. Niistä ABI1 on osoittautunut liittyvän solujen kasvun esto ja lisääntymistä [31], joka voi olla yksi säätelymekanismien miR-374A sisplatiinilla vastus, mutta se jää edelleen todentaa expriments.

Äskettäin Xiang ym. [32] kertoi, että miR-152 ja miR-185 merkittävästi vaimentua siinä SKOV3 /DDP ja A2780 /DDP soluja, verrattuna niiden herkkä vanhemman linjan SKOV3 ja A2780, ja ajan säätelemällä ilmentyminen miR-152 tai miR-185 lisääntynyt sisplatiini herkkyyttä SKOV3 /DDP ja A2780 /DDP soluja estämällä DNA metyylitransferaasi 1 (DNMT1) suoraan. Ristiriitaisesti, miR-152 ja miR-185 (laski 0,4 ja 0,6 kertaa A2780 /DDP soluja verrattuna A2780 solujen Xiang tutkimus) havaittiin olevan ylä- tai alassäädetty alle kahdessa kertaa A2780 /DDP soluja verrattuna jossa A2780 soluissa, joten nämä miRNA ei lueteltu miRNA kohteisiin. Meidän pitäisi kuitenkin olla tietoisia siitä, että miRNA array on alustava seulonta testi jonka tulokset on lisävalidointia kuten qRT-PCR, ja vähemmän kuin kaksi kertaa ilmentyvät eri miRNA voi myös olla vaikutusta lääkeresistenssin munasarjasyöpä.

Yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa, että ilmennetty eri miRNA sisplatiini- resistenttien munasarjasyöpäsoluja todennäköisesti tärkeä rooli kehitettäessä tai sääntelyä sisplatiinin vastarintaa. Lisäksi transfektio miR-130a ja miR-374A-inhibiittorit parantaa sytotoksista vaikutusta sisplatiinin. Rooli miR-130a in lääkeresistenssin saavutettiin ainakin osittain ekspressiota sääteleviä P-gp ja PTEN-proteiinin. PTEN voi olla kohdegeenin Mir-130a on kuitenkin se tarvitsee validointi dual lusiferaasin raportteja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-130a ja miR-374A voi olla lupaavia uusia terapeuttisia kohteita voittamiseksi lääkeresistenssin.

Kiitokset

Tutkimus tukivat ohjelma Changjiangin Tutkijat ja Innovative Research Team (PCSIRT) in University (IRT0935), ja paikallinen Foundation of Science and Technology Department of Chengdu (nro 11DXYB133SF-027).