Krooninen sairaus

tiivistelmä

aistihermoilla antaa tärkeää palautetta kuvio tuottaville moottorin järjestelmiä. Vuonna äyriäinen stomatogastric hermosto (STNS), palaute anterior mahalaukun reseptori (AGR), lihas reseptorin hermosolu, muovaa aktiivisuus moottorin piirien stomatogastric hermosolu (STG) kautta polysynaptic väyliä, joihin anterior hermosolmusta. AGR soma sijaitsee selkäpuolen kammion hermo posteriorisesti STG ja on ajateltu, että sen Axon kulkee STG tekemättä kontakteja. Käyttämällä korkean resoluution konfokaalimikroskopia väriainepohjaisten täytetty neuronit, osoitamme tässä, että AGR päässä rapu

Cancer borealis

myös paikallisia ulokkeita sisällä STG ja että nämä ennusteet muodostavat ehdokkaan kosketuksiin sivustoja STG liikehermosoluiksi tai laskevasti input kuidut muista hermosolmusta. Me kehittää ja hyödyntää uutta peittäminen menetelmä, jonka avulla voimme mahdollisesti erillisten presynaptisiin ja postsynaptisiin värjäytyminen synaptic markkereita. AGR prosessit STG näyttää monimuotoisuuden muoto, haarojen lukumäärä ja haarautuvan rakenteen. Määrä AGR ennusteisiin STG vaihtelee yhdestä kolmeen yksinkertaista kertolaskua haarautunut prosesseihin. Ulokkeet ovat läheisessä kosketuksessa mahalaukun moottori neuronien ja laskeva hermosolut ja sitä voidaan myös sähköisesti kytketty muihin neuronien STNS. Niinpä, lisäksi hyvin kuvattu pitkän silmukka polkuja, on mahdollista, että AGR osallistuu integraation ja kuvio sääntelyn suoraan STG.

Citation: Goeritz ML, Bowers MR, Slepian B, Marder E (2013) Neuropilar Ennusteet Anterior mahalaukun Reseptori Neuron vuonna Stomatogastric Hermosolmu on Joonan Crab,

Syöpä Borealis

. PLoS ONE 8 (12): e79306. doi: 10,1371 /journal.pone.0079306

Toimittaja: Melissa J. Coleman, Claremont Colleges, Yhdysvallat

vastaanotettu 4 maaliskuuta, 2013 Hyväksytty: 20 syyskuu 2013; Julkaistu: 3. joulukuuta 2013

Copyright: © 2013 Goeritz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana National Institutes of Health myöntää NS 17813-32 Eevalle Marder. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sensory palautteen lihasten reseptorit muovaa moottori neuroni toimintaa mono- ja disynaptic ( ”short-loop”) venyttää tai vastus refleksit. Lisäksi useimmissa refleksi väyliä ovat polysynaptic ( ”long-loop”) komponentteja, jotka ovat ratkaisevia sopeutua refleksejä eri käyttäytymistiloja. Itse asiassa vaiheittain aistinvaraisen palautetta selkärankaisten ja selkärangattomien moottori neuronien aikana rytmistä moottori aktiivisuus voi aiheuttaa refleksejä kääntää tai tulla osa rytmi tuottavien verkkojen itse [1-7].

taustalla olevien mekanismien sensorisen integraation aikana reflex muutos ei täysin tunneta. Kuitenkin monet toiminnalliset näkökohdat palautetta integraation, kuten presynaptisen inhibition ja antidromic lisäystasot, voidaan liittää rakenteiden moottori tai sensoristen neuronien [8]. Tutkitaan morfologiaa hermosolun yksityiskohtaisesti avaa oven mielenkiintoisia kysymyksiä. Kuinka muuttuja ovat rakenteet tunnistettu hermosolujen poikki yksittäisiä eläimiä? Mitä parametreja on säilytettävä pysyisivät toiminnon verkon sisällä? Nämä kysymykset ovat erityisen vaikea käsitellä suurissa verkoissa, joissa solutyypissä tunnistaminen on epäselvä ja pahentaa monimutkaisia ​​aluevaltaus rakenteita.

On olemassa suuri määrä todisteita varten erilliset säännöt, jotka ohjaavat näkökohdat solumorfologian aikana verkoston kehittämiseen. Jakauma houkutinta ja hylkivä molekyylien ja vastaavien reseptorien kehittyvässä selkäytimen voi määrittää paikan soma, Axon kasvun kartio ohjausta, ja keskiviivan ylittäminen Axon [9-13]. Muoto ja sijainti saman hermosolun kuitenkin vaihtelevat usein eläimestä toiseen, kuten nähdään äyriäisten stomatogastric hermosolu (STG), jossa vain muutamia ominaisuuksia hermosolun morfologia on yhteinen koko eläimet [14-16]. Jotta paremmin ymmärtää näitä näkökohtia hermosolun morfologia, tässä tarkastellaan tuntohermosolun siinä STG joka on mukana runsaasti erilaisia ​​refleksi polkuja, mutta on suhteellisen yksinkertainen aluevaltaus rakenne.

rytmisesti aktiivinen verkkojen stomatogastric hermoston (STNS) valvonta liikkeen äyriäisten vatsan lihaksia. Aikana mahalaukun mylly toimintaa, pitkittymiseen ja takaisinveto vatsa hampaiden ohjataan koordinointi mahalaukun tehtaan verkkoon [17]. Kuten hummereita ja rapuja, Anterior Mahalaukun Reseptori (AGR) in

C. borealis

on kaksisuuntainen soma joka sijaitsee selkäpuoli kammion hermo (DVN) tai, harvemmin, taka osassa STG ja hankkeiden selkäpuolen mahalaukun hermo (DGN) [18]. Kahdenvälinen dendrites projekti kahteen mahalaukun mylly 1 (

gm1

) lihakset jossa piikkejä käynnistetään lähelle

gm1

lihakset [19]. AGR Axon projekteja pitkän silmukan reitti läpi STG ja tekee kiihottavien ja estävä yhteydet etummaisessa pariksi commissural hermosolun (myytyjen) projektio neuronien joka syöttää takaisin STG moottoripiirit [17,20-24].

yksittäinen AGR on lihasvoiman reseptorin

gm1

lihaksia. AGR hermosolu yhdistää proprioceptive tietoa molemmilta puolilta eläinten vaan myös toimii samaan tapaan kuin Interneuron vaikuttamalla mahan ja pyloric verkon toimintaa, riippumatta sen reseptorin ominaisuuksia [25]. Useita dendritic ja aksonaalinen piikki aloittamista vyöhykkeitä vastata erilaisiin neuromodulaattoreina [21,24-27]. Lisäksi neuropeptides vaihtaa AGR ampumisen välillä tonic lisäystasot tila tai murtumisesta tilassa, jossa jokainen aktivoimaan toisen mahalaukun moottori kuvio [28]. Viimeaikainen työ on osoittanut, että toimet AGR vaikuttavat muiden aistihermoilla (Barriere et al., 2008) ja että vaikutukset AGR ampumisen riippuu siitä, milloin se on aktiivinen maha- mylly rytmit (Smarandache et al., 2008).

Toistaiseksi kaikki nämä fysiologisia vaikutuksia mahalaukun ja mahaportin verkkotoimintaa on katsottu johtuvan pitkän silmukan polysynaptic refleksi reitti läpi anterior myytyjen. Ei yksityiskohtainen tutkimus AGR morfologia STG olemassa ja toistaiseksi ennusteisiin STG hermosyyhuovastoa ei ole kuvattu. Nyt tarjota anatominen kuvaukset AGR ennusteiden osaksi STG neuropil.

Methods

Eläimet ja dissections

Adult Joona rapuja (

Cancer borealis

) saatiin Commercial Hummeri (Boston, MA). Kaikki eläimet pidettiin keinotekoiseen meriveteen säiliöissä 10-13 ° C: ssa 12 tunnin valo /12 tunnin pimeä jakso ilman ruokaa. Rapujen nukutettiin jään päällä 30 minuuttia. Dissections tehtiin aikaisemmin kuvatulla [29] jäähdytetty fysiologista suolaliuosta, joka koostuu: 440 mM NaCl, 11 mM KCI, 26 mM MgCI

2, 13 mM CaCI

2, 11 mM Trizma’a pohja, 5 mM maleiinihappo, pH 7,45.

Elektrofysiologia

STNS oli kiinnitetty alas Sylgard päällystettyä lautasen. STG oli desheathed ja solunsisäisen tallenteita somata ja hermosyyhuovastoa tehtiin 12-40 MQ lasi mikroelektrodeja täynnä 0,6M KSO

4 ja 20 mM KCI, monistettiin 1x HS headstages ja Axoclamp 2A ja 2B vahvistimet (Molecular Devices) . Solunulkoinen aktiivisuus tallennettiin ruostumattomasta teräksestä pin elektrodit, jotka pantiin vaseliini kuoppiin moottorin hermoja ja vahvistetaan ja suodatetaan differentiaalivahvistimen (AM-järjestelmät). Tunnistamiseksi moottori neuronien, solunsisäiset soma tallennukset sovitettu ekstrasellulaarisen tallenteita sopiva liikehermo. Aikana Tallennuksen STNS jatkuvasti superfuusioidaan jäähdytettynä (9-13 ° C) suolaliuosta.

Solun täyttää

Somata tai aksonien täytettiin joko:

a. 2% Lucifer Yellow CH dikaliumsuola (LY; Sigma, luettelonumero L0144) in suodatettua vettä,

b. 4% tetrametyylirodamiini-dekstraania 3 kDa: n, lysiinin fixable (TMR, Molecular Probes, luettelonumero D3308) 0,2% KAc,

c. 4% neurobiotin merkkiaineen (Vector Laboratories) 50 mM Tris-puskuria ja 0,5 M KCI, tai

d. 10 mM Alexa Fluor 568- tai 594-hydratsidia natriumsuola 200 mM KCl (Molecular Probes, luettelonumerot A10441 ja A10442).

Kaikille merkkiaineita, kärjet Pieniresistanssinen Lasielektrodit (3-16 MQ) on jälkitäytetään kapillaarisesti 10 minuuttia. Sillä TMR, takana elektrodien oli täynnä 2M KAc, jättäen pienen väli KAc ja TMR kärjessä. Lucifer Yellow ja Alexa Fluor-hydratsidit ruiskutettiin 20-50 minuuttia negatiivinen pulssin -3–11 nA 0,5 sekunniksi 0,1-1 Hz asti sakon hermosyyhuovastoa prosesseja solun näkyivät fluoresenssimikroskoopilla (Leica MF165 FC). TMR ja Neurobiotin injektoitiin vähintään 50 minuuttia käyttäen 3 nA positiivinen virtapulssien (neurobiotin) tai 4-13 nA positiivinen virtapulssien (TMR) 0,5 sekunniksi 1 Hz. Ellei toisin mainita, valmisteita kiinnitettiin 3,5% paraformaldehydillä fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS; 440 mM NaCl, 11 mM KCI, 10 mM Na

2HPO

4, 2 mM KH

2PO

4 , pH 7,4) 40 90 minuuttia huoneen lämpötilassa 3 tunnin kuluessa täytön LY, neurobiotin ja TMR ja 30 minuutin täytön jälkeen Alexa Fluor-hydratsidit. Valmisteet pestiin 0,01 M PBS-T (0,1-0,3% Triton X-100 PBS: ssa) ja varastoitiin 0-7 päivää 4 ° C: ssa ennen käsittelyä.

Dye vahvistus

LY signaali monistettiin lisäämällä polyklonaalista kanin anti-LY-vasta-ainetta (1: 500; Molecular Probes) ja asianmukaista Alexa Fluor-konjugoidulla sekundaarisella anti-kani-vasta-ainetta ( 1: 500; Molecular Probes) aikana immunohistokemiallisella käsittelyn. Neurobiotin visualisoitiin lisäämällä streptavidiinilla konjugoitujen Alexa Fluor väriaineet (1: 500; Molecular Probes) toissijaiseen vasta-mix (katso seuraava kohta).

immunohistokemia

Käytimme rotan monoklonaalinen vasta-aine vastaan ​​aineen P-vasta merkitä

Cancer borealis

takykiniinin liittyvän peptidin (CabTRP, Accurate Chemical and Scientific, Westbury, NY, # NC1 /34HL, 1: 300 laimennus) [30,31], hiiren monoklonaalinen vasta-aine vastaan ​​Drosophila synapsiini GST-fuusioproteiinin (SYNORF1, [32]; Kehittämisopinnot hybridoomasolulinja Bank (Univ. Iowa), # 5F10, 1: 500 laimennus), ja kaniinin polyklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​Lucifer Yellow (Molecular Probes, luettelonumero A-5750 , 1: 1000 laimennus). Vasta-aine spesifisyys synapsiini kaltainen ja CabTRP kaltaisia ​​immunoleimaus in

C. borealis

aiemmin osoitettiin [30,31,33]. Antiseerumit laimennettiin 0,01 M PBS-T sopivassa pitoisuudessa ja soveltaa yön yli huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen 6×10 minuutin pesulla PBS-T: llä.

sekundääridetektio, Alexa Fluor – konjugoidun, vuohen polyklonaalisen vasta-aineita hiiren tai kani-IgG (H + L-ketjut, erittäin rajat imeytymättä Molecular Probes) käytettiin visualisoida immunoreaktiivisuus. Vasta-aineet käytettiin pitoisuutena 1: 500 PBS-T: 2-3 tuntia huoneen lämpötilassa. Valmisteet pestiin sitten 4×15 minuuttia PBS: ssä. STGs Sitten asennetaan ennalta puhdistettu dioja (25x75x1mm, SuperFrost, VWR) in Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA), jossa on 9 mm halkaisijaltaan, 0,12 mm syvyys silikonitiiviste välilevyt (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) alle # 1.5 peitelaseja (Fisher Scientific).

tilastot

AGR prosessi pituudet analysoitiin Excel (Microsoft). Merkittävyys testattiin t-testit SigmaPlot. Virheet ovat keskihajonta.

Kuva hankinta ja käsittely

Keraamiset kasana konfokaali kuvien kerättiin kanssa SP5 CLEM mikroskoopilla käyttäen Leica Application Suite Advanced Fluoresenssi (LAS AF) ohjelmistoja. Useiden tarroja, juokseva kuvantaminen ja kapea päästöjen asetukset käytettiin estämään rajat puhua. Konfokaaliset kuvat hankittiin kuin laatat 63x glyseroli tavoite (Leica HCX PL APO 63x /1.3 GLYC CORR CS (21 ° C) 2048×2048 tai 1024×1024 resoluution 0,12-1,01 um vaiheet ja myöhemmin kohdistettu ja kiinnitetty GUI-pohjainen MATLAB työkalu , kirjoittanut Ted Brookings. kuvapinot muunnettiin .ims tiedostoja Imaris 7,0-7,4 (Bitplane) suodatettu ja alas-näytteet kolmannekseen resoluutiota korkeus ja leveys. Imaris Slice ja ylittävät moduuleja säätämiseen kontrastia ja kirkkautta ja näyttää pinot kuin maksimi-intensiteetin ennusteet tai sekoitus tilassa ennusteet. osajoukkoja z-pinot näkyivät sekoitus tilassa ennusteissa pienemmällä sameuden parantamiseen visualisointiin solujen täyttää ja proteiinin jakautuminen samanaikaisesti. Kuitujen ja tilavuus rekonstruktiot solujen täyttöjä tehtiin kanssa Imaris Filament moduuli käsikäyttötilassa määrittää haaran pituutta ja haara volyymit.

erottaminen Synapsiini kaltaisia ​​merkintöjä sisällä ja ympärillä on täytetty prosessit

Synapsiini kaltainen immunoreaktiivisia merkinnät sisällä täytetty prosessit eristettiin yleisestä synapsiini kaltainen signaali käyttämällä pinta rekonstruktiot täytetyn solun maskina. Pinta rekonstruktiot tehtiin kanssa Imaris Surface moduulin avulla manuaalisesti kynnystä intensiteetin erottamaan taustan ja solun täyttö. Päällekkäisyys rekonstruoidun solun pinnan maski ja synapsiini kaltainen immunoreaktiivisia signaali tallennetaan uutena signaali kanavan ( ”synapsiini-sisällä”). Kaapata synapsiini kaltaisia ​​merkintöjä vieressä täynnä soluun, tämä prosessi toistettiin uudella pinnalla peite täytetyn solun, tällä kertaa syntyy käyttämällä alarajan intensiteetti, syömällä ”hehku” ympäri solun pintaan. Tämä johti maski, joka yliarvioida solun tilavuuteen ja antoi meille mahdollisuuden eristää synapsiini kaltaisia ​​merkintöjä läheisyydessä täytetyn solun vähentämällä ”synapsiini-sisällä” signaali tästä uudesta signaali kanavan, käyttäen ”Channel Arithmetics ”-toimintoa Imaris.

on tärkeää huomauttaa, että korkean näytetaajuuden kuvan ottamisen, mieluiten kaksi kertaa resoluution käytetyn tavoite (Nyquist rate), on kriittinen välttää tappion myöhempien suodatuksen ja sallimaan riittävän tarkka pinta rekonstruktiot.

Tulokset

AGR työntyy synaptic hermosyyhuovastoa

käytetään väriaineen täyttää jäljittää AGR Axon ja sen ennusteet STG. Asento keskiviivan bipolar AGR että STNS on kuvattu aiemmin (Combes et al., 1995) (kuvio 1). Asento soma eri valmisteissa on hieman vaihteleva, koska soma löytyy niin paljon kuin 500 pm posteriorisesti STG selkäpuoli kammion hermo (DVN) tai se voidaan nähdä ventraalisesti alla solu elinten takaosan alueella STG, melko lähellä STG neuropil.

Löysimme AGR ennusteet päässä Axon osaksi hermosyyhuovastoa jokaisen STG että selvitimme (N = 29) (kuvio 2). Konfokaaliset kuvantaminen paljasti AGR ennusteet eripituisia ja haarautuvia kuviota STG. Määrä AGR ennustukset STG hermosyyhuovastoa vaihteli yhdestä kolmeen ja niiden morfologia oli huomattavan monipuolinen, aina minimaalisesti ja monimutkaisesti haaroittunut (kuva 2). Niistä 29 väriaine täytetty AGR neuronit, 17 oli yksi prosessi haarautuvat tärkein Axon osaksi STG neuropiilissä 10 oli kaksi prosessia, ja kaksi valmisteissa, kolme ennustukset STG nähtiin. Yhteiset ominaisuudet, jotka nähtiin koko monilla AGR solujen täytteet olivat koukun muotoinen oksat etuosaan hermosolu (kuvio 2A) (N = 13 pois 23 AGRs), oksat, jotka päättyivät kynsimäisten prosesseja (kuvio 2B) (N = 8 ulos 23 AGRs), ja sipulimainen turvotus AGR prosesseja (kuvio 2B) (N = 18 pois 23 AGRs).

Pisteviivat hahmotella hermosyyhuovastoa alueen hermosolu kaikissa osissa kuvassa. A1. Volume-sulatettu näkymä LY väriaine täytetty AGR yhden projektio, aluevaltaus edelleen neljään osa-oksat STG neuropil. AGR soma sijaitsee

STN

ulkopuolella vasemmassa alakulmassa kehyksen. Blend tila projektio 8 fuusioitiin konfokaali kuvapinot, joista kukin koostuu 84 optisten viipaleita (hankittu resoluutio 0.067μm x 0.067μm x 0.378μm). Mittakaava on 30 um. A2 näkyy lähikuva boxed alueen A1, osoittaa levennetty pää AGR ulokkeen sisällä STG. Mittakaava on 5 um. B1. Volume-sulatettu näkymä LY väriaine täytetty AGR yhden projektio, aluevaltaus syvemmälle kaksi lyhyttä osa-oksat STG neuropil. AGR soma sijaitsee

STN

ulkopuolella vasemmassa alakulmassa kehyksen. Blend tila projektio 4 yhdistyivät konfokaali kuvapinot, joista kukin koostuu 226 optisten viipaleita (hankittu resoluutio 0.174μm x 0.174μm x 0.294μm). Mittakaava on 30 um. B2 esittää tilavuuden sulatettu pinta projektio boxed alueen B1 eri näkökulmasta, korostaen iso ilmapallo kaltainen levennys (ei soma) on aksonaalisten AGR projektio. Mittakaava on 10 pm. C. Volume-sulatettu näkymä LY väriaine täytetty AGR yhden projektio, aluevaltaus edelleen kahteen osa-oksat STG neuropil. AGR soma sijaitsee

STN

ulkopuolella vasemmassa alakulmassa kehyksen. Blend tila projektio 5 yhdistyivät konfokaali kuvapinot, joista kukin koostuu 169 optisten viipaleita (hankittu resoluutio 0.068μm x 0.068μm x 0.462μm). Mittakaava on 30 um. D. Volume-sulatettu näkymä LY väriaine täytetty AGR kahdella yksinkertaisella ennusteisiin STG neuropil. AGR soma sijaitsee

STN

ulkopuolella vasempaan alakulmaan runko. Blend tila projektio 18 yhdistettiin konfokaali kuvapinot, joista kukin koostuu 115 optisten viipaleita (hankittu resoluutio 0.183μm x 0.183μm x 0.504μm). Mittakaava on 30 um. E. Volume-sulatettu näkymä LY väriaine täytetty AGR jossa kaksi uloketta, kukin aluevaltaus edelleen kahteen tai kolmeen osa-oksat STG neuropil. AGR soma sijaitsee

STN

ulkopuolella vasemmassa alakulmassa kehyksen. Blend tila projektio 10 yhdistettiin konfokaali kuvapinot, joista kukin koostuu 264 optisten viipaleita (hankittu resoluutio 0.179μm x 0.179μm x 0.38μm), vatsa- näkymä saman valmisteen Kuva 3. Mittakaava on 30 um. F. Volume-sulatettu näkymä LY väriaine täytetty AGR kolme ennusteet, joista yksi aluevaltaus edelleen kahteen osa-konttoria hermosyyhuovastoa. AGR soma sijaitsee

STN

ulkopuolella vasemmassa alakulmassa kehyksen. Blend tila projektio 9 yhdistyivät konfokaali kuvapinot, joista kukin koostuu 229 optisten viipaleita (hankittu resoluutio 0.168μm x 0.168μm x 0.252μm). Mittakaava on 50 um.

mitattiin haarautuvia ominaisuudet 17 AGRs jotka oli kuvattu suurella resoluutiolla (taulukko 1). Valmisteissa vain yksi AGR haara päässä Axon, prosessi haarautunut keskimäärin 3 kertaa. Sen pituus vaihteli valmisteet ja keskimäärin 240 ± 136 um (keskihajonta) (kuvio 2A-C). Määrä terminaalin segmenttien oli 1,7 ± 0,8. AGR prosesseja kaksi uloketta osaksi hermosyyhuovastoa taipumus olla lyhyempi keskimäärin (176 ± 95,4 pm ensimmäistä, p = 0,014, ja 109 ± 94,41 um toisen haaran), jossa on hieman enemmän yksittäisten alahaaroissa (2,5 ± 1,3 terminaali segmentit), mutta koska suuri varianssi haara numeroita, tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,160) (Kuva 2D-F). Myös merkittävää säilyttäminen koko ulokkeen pituudesta, kun normalisoitu neuropiilissä pituus (keskiarvo neuropiilissä pituus = 544 ± 81,1 nm, N = 17) ja verrattiin tiivistää haaran pituus valmisteissa yksi tai kaksi prosessia (p = 0,69) (taulukko 1). Kuitenkin valmisteet kaksi uloketta osaksi neuropiilissä kuvan 2 D ja E, sitä enemmän taka (lähempänä AGR soma) prosessi oli huomattavasti lyhyempi kuin etummaisen ulokkeen (89 ± 73 nm versus 168 ± 99 um, vastaavasti , p = 0,003).

Haarakonttoreita

N

1

st haara pituus

1

st haara pituus, normalisoidaan neuropiilissä koko

2

nd haara pituus

2

nd haara pituus, normalisoidaan neuropiilissä koko

3

rd haara pituus

3

rd haara pituus, normalisoidaan neuropiilissä koko

Yhteensä haara pituus

Yhteensä haara pituus, normalisoidaan neuropiilissä koko

18240 ± 136,2235 ± 118,3 —- 241 ± 136,2235 ± 118,32 7109 ± 94,189 ± 73,3176 ± 95,4168 ± 98,6–286 ± 94,8258 ± 85,93 2175 ± 219,2169 ± 202,372 ± 31,877 ± 18,160 ± 56,660 ± 48,6307 ± 103.306 ± 89.7Table 1. AGR aluevaltaus ominaisuudet.

CSV Lataa CSV

Toinen silmiinpistävä anatominen piirre oli lokalisoinnin AGR oksat osalta hermosolu arkkitehtuuriin. STG somata sijaitsevat klusterin ympärillä hermosyyhuovastoa taka alueella hermosolu. Nämä hermosolut lähettää ensisijainen neuriittien kohti keskustaa hermosolu (karkea neuropil), jossa se haarautuu vähitellen pienempiin prosesseihin ja yhden tai useamman axons jotka jättävät hermosolu kautta kytketty hermoja. Pienin prosesseja STG neuronien sijaitsevat-välillä keskellä ganglion ja solun elinten ulkopuolella, jossa ne muodostavat sakon tai synaptic neuropiilissä kuori-rakenteen ympärille karkea hermosyyhuovastoa joka on sisätilojen hermosolu (kuvio 3) [34]. Sakko neuropiilissä on alue, jossa synaptic vuorovaikutukset tapahtuvat [35]. Se voidaan leimata vasta-aineita presynaptisen proteiinit, kuten synapsiini (synorf) [14,32,33,36]. Huomasimme, että AGR Axon oli joskus off-keskus oikealle tai vasemmalle, mutta aina sai pitkän kaikkein ventral puolella STG (n = 27) (kuvio 3AB). Sieltä AGR ennustetaan dorsaalisesti läpi karkean hermosyyhuovastoa keskellä STG ja osaksi selkä hieno hermosyyhuovastoa (kuvio 3B).

A1. Volume-sulatettu selkäpuolen näkymä LY väriaine täytetty AGR (vihreä), ennustettu pitkin dorso-akselitasoon. A2. Lateral, maksimi-intensiteetin projektio saman hermosolu. B1. Double merkinnät anti-synapsiini vasta-aine (violetti) paljastaa synaptic hermosyyhuovastoa että STG. B2. Sivuprojektion vastaisen synapsiini leimattu hermosolu näyttää ventraalisesti sijaitsee AGR Axon ja sen selkä ulokkeet osaksi synaptic neuropil. Blend tila (A1, B1 ja B2) ja maksimi-intensiteetillä (A2) ennusteet 10 yhdistettiin konfokaali kuvapinot, joista kukin koostuu 264 optisten viipaleita (hankittu resoluutio 0.179μm x 0.179μm x 0.38μm). Mittakaava on 50 um.

lokalisaatio ehdokkaan kosketuksiin sivustojen välillä AGR muiden solujen

Halusimme tietää, onko AGR ulokkeet tuli läheisiä suhteita muihin STG neuronien. Tästä suoritimme kaksinkertainen täytöt AGR ja muiden STG soluja, keskittyen neuronit, jotka ovat osa mahalaukun tehtaan verkkoon, jossa AGR stimulaatio on vahvin vaikutus verkkotoiminnasta

in vivo

ja

in vitro

[24,25,37,38].

Double täytteet PO hermosolun ja AGR kolmessa valmisteissa paljasti useilla näennäinen läheisessä kosketuksessa tasolla resoluutio saatavana konfokaalimikroskoopilla (kuvio 4A) . Suoritimme pinta rekonstruktiot yhden näistä paria saada parempi otetaan huomioon ilmeisen kontakti sivustoja. Huomiota herättävin ehdokas yhteyspiste ei ollut synaptic (hieno) neuropiilissä mutta karkea hermosyyhuovastoa keskellä on hermosolu, jossa suuri halkaisija prosessi PO nähtiin ilmeisesti kiedottu AGR projektio. Lisäksi toinen ehdokas kosketukseen sivusto AGR erittäin hieno DG prosessi nähtiin synaptic hermosyyhuovastoa (kuvio 4A). Muita soluja, jotka tulivat läheiseen kosketukseen AGR aina kun suoritetaan kaksinkertainen kaatopaikalle oli ainakin yksi neljästä mahalaukun myllyn neuronien (GM) (n = 3) ja yhden sivusuunnassa mahalaukun neuroni (LG) (n = 5). Lähempi tarkastelu kaksinkertaisen täyttöä GM hermosolun ja AGR kahdessa valmisteissa osoitti yhden sijoituspaikalla ilmeisistä kontakti kahden prosesseja (kuva 4B), selvästi nähtävissä pinnan jälleenrakentamiseen kosketus sivuston insertin kuvassa 4B2. Samassa valmistelussa, erittäin hieno prosessit (~ 1 um halkaisija) GM hermosolun myös kiedottu AGR Axon (kuvio 4B3). Kuvio 4C kaksinkertainen täyttöä AGR ja LG ehdokasmaiden kontakti sivustoja suurempi prosessien karkea neuropil. Samanlaisia ​​ehdokas kontakti sivustoja nähtiin hermosyyhuovastoa viiden hermosolmu LG ja AGR kaksinkertainen täyttöjä.

A1. Double täyttö pääosaston neuroni kanssa TMR (keltainen) ja AGR neuroni kanssa LY (sininen) näyttää ehdokas kosketukseen sivustoja hermosyyhuovastoa. Lateral sekoitus tila projektio 18 yhdistettiin konfokaali kuvapinot, joista kukin koostuu 133 optisten viipaleita (hankittu resoluutio 0.177μm x 0.177μm x 1.007μm). Mittakaava on 40 uM. A2. Rekonstruoitu pinta visualisointi PO-AGR ehdokas kosketukseen sivusto karkea neuropiilissä rekonstruoitu samat tiedot asetettu A1. Mittakaava on 10 pm. B1. Double täyttöä GM hermosolun kanssa neurobiotin (vihreä) ja AGR neuroni Alexa Fluor 594-hydratsidi (magenta). Blend tila projektio 18 yhdistettiin konfokaali kuvapinot, joista kukin koostuu 185 optisten viipaleita (hankittu resoluutio 0.088μm x 0.088μm x 0.504μm), tausta vähennetty. Mittakaava on 50 um. B2. Close-up of ehdokas kontakti sivuston karkea neuropil. Mittakaava on 5 um. Rekonstruoitu pinta visualisointi yhteystiedon sivuston (upotettuihin B2) mahdollistaa selkeämmän kuvan. B3. Close-up of ehdokkaan kosketuksiin sivuston välillä hieno neuropiilissä prosessien GM ja AGR Axon. Mittakaava on 10 pm. C. Double täyttää LG neuroni kanssa LY (vihreä) ja AGR neuroni Alexa Fluor 594-hydratsidi (punainen) osoittaa ilmeinen kosketus sivuston LG ensisijaisen neuriittien ja AGR prosessi. Blend tila projektio 8 fuusioitiin konfokaali kuvapinot, joista kukin koostuu 155 optisten viipaleita (hankittu resoluutio 0.177μm x 0.177μm x 0.336μm), tausta vähennetty. Mittakaava on 30 um.

laskevassa projektio kuituja

Noin 25 paria laskeva neuronien työntyvät hampaat ja OG kautta stomatogastric hermo

STN

että STG [39], jossa modulaattorin vapautuminen niiden liittimet muovaa toimintaa mahan ja mahaportin neuronien [40-43]. Neljässä valmisteissa, kun täytimme AGR kanssa Lucifer Yellow pidemmän aikaa (2-3 tuntia), löysimme heikot väriaine levisi AGR prosesseihin, jotka olivat muodoltaan samanlainen kuvatulla projektio neuronien (kuvio 5A). Mielenkiintoista, kun toisti kokeen neurobiotin, molekyyli, joka kulkee aukon risteyksen äyriäinen hermoston, emme nähneet mitään kytkentää muihin soluihin. Halusimme tietää, onko väriaine tuotannosta prosesseja STG olivat projektioita Moduloivat Commissural Neuron 1 (MCN1), pari moduloivaa solujen painopisteen, jotka aktivoituvat ja säätelevät AGR toiminnan kautta pitkän silmukan polkuja

stn

ja hampaat, ja saavat aikaan mahalaukun mylly rytmi [37,42-44]. MCN1 sisältää kolme modu- peptidejä sen ennusteisiin STG; yksi niistä on takykiniinin kaltainen peptidi, CabTRP1a. Koska MCN1 on ainoa takykiniinin kaltaisen peptidi on STG, kaksi MCN1 ennusteisiin STG voi olla erikseen merkitty anti-aine P-vasta, joka tunnistaa takykiniinin kaltaisten peptidien monille eri lajeja [30,31]. Suoritimme immunoleimaus of CabTRP visualisoida MCN1 terminaaleihin kolmessa hermosolun kanssa väriaine-levisi AGR kohteeseen

STN

prosesseja. Yhdessä näistä valmisteita, väriaine kytketty

STN

prosessi merkitty positiivinen CabTRP ja siksi todennäköisesti MCN1. Kahdessa muussa valmisteita, kaksi MCN1 ennusteet eivät vastanneet väriaine kytketyn prosessin STN (kuvio 5B). Kun kuitenkin suoritetaan kaksinkertainen merkitseminen AGR ja CabTRP in hermosolun ilman väriaine levinnyt, me jatkuvasti löytyy ainakin yksi AGR oksat läheisyydessä tai kiedottu MCN1 Axon ennen dendriitiselle vuonna hermosyyhuovastoa (kuvio 5C-D) ( N = 7 ulos 7).

. Pitkäaikainen (2 tuntia) LY väriaine-täyttöä AGR neuroni (magenta) paljasti väriaine-kytketty laskeva STN kuituja. B. Kahden merkinnät CabTRP samassa valmisteluun osoittaa, että väriaine-kytketyn STN kuidut eivät olleet MCN1 ulokkeita. A ja B ovat sekoitus tila ennusteita 12 yhdistettiin konfokaali kuvapinot, joista kukin koostuu 200 optisten viipaleita (hankittu resoluutio 0.187μm x 0.187μm x 0.504μm). Mittakaava on 50 um. C. AGR prosessit (LY väriaine täytetty, magenta) ovat lähellä kerroskasvua ennusteet MCN1 hermosolujen leimattiin anti-P-aineen vasta-ainetta (vihreä). Blend tila projektio 12 yhdistettiin konfokaali kuvapinot, osoittaa 47μm paksu keskiosa on hermosolu (127 210 optisten viipaleita, hankittu resoluutio 0.187μm x 0.187μm x 0.713μm). Mittakaava on 50 um. D. lähikuva hermosyyhuovastoa osoittaa kynsimäisten päättyminen LY väriaine täytetty AGR projektio (magenta) tiivistä yhteyttä hieno MCN1 prosesseihin (vihreä), ja kaksi erillistä AGR terminaalia ilmeinen kosketuksessa halkaisijaltaan suurempi MCN1 prosessit (nuolet). Blend tila projektio 24μm paksu keskiosan samassa valmisteen 4B, kierretty 180 ° ympäri dorso-akselitasoon (66 210 optisten viipaleita, hankittu resoluutio 0.187μm x 0.187μm x 0.713μm). Mittakaava on 15 um.

Lopuksi suoritimme kaksinkertainen tallenteet AGR ja tunnistamattomia prosessien stomatogastric hermo (STN) (kuva 6). Me tallennettu 1-5

STN

axons per hermosolu. Useimmissa ganglia, kun molemmat solut seurattiin solunsisäisesti, ei havaittu olevan

STN

prosesseja, jotka on sähköisesti kytketty AGR (N = 7). Kuitenkin kerran sähköinen kytkentä nykyhetken injektiona joko AGR tai tunnistamaton STN prosessi nähtiin ja

STN

prosessi oli väriaine täyttämä. Insertti kuvassa 6A esittää pinta jälleenrakentaminen alueen läheinen kosketus AGR ja tämä laskeva tunnistamaton

STN

prosessi sakon neuropil. Valitettavasti emme pystyneet myöhemmin löytää, ennätys, tai täyttää samat

STN

projektio muilla hermosolmusta.

Double täyttöä tunnistamattoman STN prosessi LY (vihreä) ja AGR neuroni Alexa Fluor 594-hydratsidi (magenta) esiintyy tiiviitä varmentamisen prosessien laajalla alueella STG neuropil. Rekonstruoitua pintaa visualisointi 9 yhdistyivät konfokaali kuvapinot, joista kukin koostuu 229 optisten viipaleita (hankittu resoluutio 0.168μm x 0.168μm x 0.252μm). Mittakaava on 50 um. Insert näkyy lähikuva kehystetty alue, paljastaen ilmeinen kosketus sivustojen välillä AGR jektiopäätteitä ja hieno prosessit tunnistamattomien projektio hermosolu.

Oletetut kemiallinen synapsien AGR vuonna STG

Olemme ensi tutkinut tarkasti jakelun mahdollisia synapsien AGR solussa täyttyy. Käytimme pinta rekonstruktiot erottamaan synapsiini kaltainen immunoreaktiivisuus on AGR signaalista muualla synaptisen neuropil (katso menetelmät jakso). Kuvio 7A esittää eristetyn synapsiini signaali peitettiin AGR solun täyttö.