Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA ovat pieniä ei-koodaavan RNA-molekyylejä, jotka säätelevät mRNA käännös ja vakautta sitoutumalla komplementtijaksoja yleensä sisällä 3 ’ un-käännetty alue (UTR). Olemme aiemmin osoittaneet, että maksan aiheuttamaa toksisuutta villityypin adenovirus 5 (Ad5WT) hiirillä voidaan ehkäistä sisällyttämällä 4 sitoutumiskohdat maksan erityisiä microRNA, mir122, osaksi 3 ’UTR: E1A-mRNA: n. Tämä virus, jota kutsutaan Ad5mir122, on lupaava virotherapy ehdokas ja aiheuttaa mitään selvää maksan sairaus. Tässä osoitamme, että Ad5mir122 ylläpitää villin tyypin lyyttinen aktiivisuus syöpäsoluja ei ilmentävät mir122 ja arvioida mahdolliset vaikutukset mahdollisten mir122 ehtymisen isäntäsoluissa. Toista annostelu on 2 × 10

10 virushiukkasta Admir122 HepG2 kasvain hiirille osoitti merkittäviä syöpälääkkeen tehoa. RT-QPCR osoitti, että E1A mRNA alassäädetty 29-kertaisesti maksassa verrattuna Ad5WT. Western blot for E1A vahvisti, että kaikki proteiini variantteja tippuu alas. RT-QPCR kypsälle mir122 Tartunnan saaneiden maksa osoittivat, että määrä mir122 pysyi ennallaan. Genome laaja mRNA microarray profilointi tartunnan maksa osoitti, että vaikka transkriptio taso 3900 erilaista mRNA: iden muuttunut yli 2-kertainen seuraavat Ad5WT infektio, alle 600 muuttivat Ad5mir122. Nämä suodatettiin sitten valita mRNA: iden, jotka olivat vain muuttunut Ad5mir122 ja loput 21 mRNA: t verrattiin ennustettu mir122 tavoitteita. Ei mir122 kohde-mRNA: vaikutti Ad5 mir122. Nämä tulokset osoittavat, että hyödyntäminen mikroRNA asetuksen valvomiseksi viruksen lisääntymisen ei välttämättä vaikuta tasoon mikroRNA tai endogeenisen mRNA tavoitteet.

Citation: Cawood R, Wong SL, Di Y, Baban DF, Seymour LW (2011) MicroRNA Controlled adenovirus sovittelee Anti-Cancer teho vaikuttamatta Endogeeniset MicroRNA Activity. PLoS ONE 6 (1): e16152. doi: 10,1371 /journal.pone.0016152

Editor: Sebastien Pfeffer, IBMC-CNRS, Ranska

vastaanotettu: 13 elokuu 2010; Hyväksytty: 13 joulukuu 2010; Julkaistu: 10 tammikuu 2011

Copyright: © 2011 Cawood et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: RC ja YD tukevat Cancer Research UK (https://www.cancer.org.uk/), SLW rahoittaa tutkimusta stipendi päässä Medical Research Council (www.mrc.ac.uk). Microarray ydin laitos rahoitetaan Wellcome Trust. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Genetic sääntely virusreplikaation ja ilme on tehokas strategia kehittää turvallisempia virus terapeuttisia rokotuksia, geeniterapiaa ja virotherapy. DNA-virukset ovat usein kudosta tai syövän valikoiva korvaaminen vahvan viruspromoottoreista heikomman ihmisen endogeenisen promoottorit. Sen sijaan mekanismeja valvontaa RNA-viruksen replikaatioon ovat pitkälti keskittyneet tekniikan tai hyödyntämiseen interferoni herkkyys [1], [2] tai käyttämällä heikennetyn rokotteen kantoja [3]. Ei universaali mekanismi säätimiä kaikkien viruksia tai viruksen siirtogeenien on osoittautunut onnistuneeksi. Kuitenkin löytö mikroRNA sääntelyverkon on mahdollistanut suunnittelussa virusvektoreita, joissa olennainen mRNA: t selektiivisesti hajoaa kudoksissa ilmentävät tiettyä microRNA, antaen mahdollisuuden ohjaus kudosselektiivistä inaktivointi olennaisia ​​viruksen toimintoja.

MikroRNA ovat ei-koodaavan RNA-molekyylejä, jotka negatiivisesti säätelevät mRNA käännös sitoutumalla sekvenssit yleensä tavataan 3 ’un-käännetty alue (UTR) [4]. Taso täydentävät toisiaan microRNA ja kohde vaikuttaa onko mRNA hajoaa (täydellinen täydentävät) tai muodostaa stabiilin translatorisesti aktiivinen kompleksi. Sisällyttäminen mikroRNA sitoutumiskohtien osaksi 3’UTR mRNA: iden, jotka koodaavat olennaisia ​​virusproteiineja mahdollistaa valikoivan tuhoutumisen mRNA: ta ja estää proteiinin translaation. Edellytyksenä kaikkien virusten hyödyntää mRNA käännös, jotta jäljitellä sitä, että tämä menetelmä ohjaus voidaan yleisesti soveltaa jokaiseen viruksen tartuttamisesta eukaryoottisolu.

Esimerkkejä jossa tekniikkaa on käytetty menestyksekkäästi ovat hallita sivulla replikaation polioviruksen [5], herpesvirus [6], rakkulasuutulehdusvirusta [7], [8], influenssavirus [9] ja adenovirus tyyppi 5 (Ad5) [10], [11]. Virusvektoreita, joissa tätä tekniikkaa on käytetty onnistuneesti ohjata ilmentymistä sisältävät Dengue-viruksen replikonit [12], alfavirus replikoneja [13], Lentivirusvektorit [14] ja adenovirusvektoreilla [15]. Perustuvat kirjallisuudessa, on selvää, että virus tyypistä, microRNA valinta ja kudoksen patologian ovat kaikki tärkeitä määriteltäessä tasolla, joka virus on onnistuneesti ohjataan.

Ad5 on laajasti tutkittu yhteydessä virotherapy ja villityypin kannan (Ad5WT) on osoitettu olevan voimakas syövän vastaista aktiivisuutta [16]. Kuitenkin seuraava suonensisäisesti hiirille, Ad5WT aiheuttaa akuuttia maksan toksisuus, annoksilla yli 1×10

9 pfu, on tasaisen kohtalokas [17]. Tämä myrkyllisyys uskotaan johtuvan korkean tason ekspression E1A-proteiinia hepatosyyteissä [18], [19]. Tämä ilmaus seuraa sitten myötävirtaan viruksen geenien ilmentymistä ja maksasolujen solukuoleman.

kumota tämän toksisuuden, vaikuttamatta viruksen replikaation syöpäsoluissa, lisäsimme neljä täysin komplementaarisia sitoutumiskohtia maksasolujen-spesifinen microRNA mir122 osaksi 3 ’UTR E1A transkriptiokasetin (virus kutsutaan Ad5mir122). Täydellinen täydentävät toisiaan mir122 sitoutumiskohdat olemme asetettu ja microRNA mir122 pitäisi aiheuttaa merkittäviä E1A mRNA pilkkominen läpi vastaavan mekanismin RNAi. Olemme osoittaneet aiemmin, että tämä voi vähentää maksan virusreplikaation, ALT vapautuminen ja maksan sairaus [10].

tiedetään vain vähän mahdollisista haitallisiin solujen seuraukset virusten torjunnassa käytetään mikroRNA sitoutumiskohtia. Määrä solujen mikroRNA voitaisiin vähentää lisäämällä virus kohde-mRNA: iden tai virus-mRNA: t voivat kyllästää aktiivisuutta mikroRNA ja mahdollistaa muutosten tasot endogeenisen mRNA tavoitteita. Aiemmat tutkimukset käyttäen microRNA säännelty lentivirusvektorit ovat osoittaneet, että tämä voi tapahtua, kun soluja altistetaan korkealle infektiokertoimella. Tämä viittaa siihen, että sääntelyn vaikutus MikroRNA ovat saturoituvasta suurina annoksina [20]. Tämän alapuolella kynnysarvon microRNA endogeenisen mRNA tavoitteet raportoidaan pysyvän ennallaan [21]. Tässä tutkimuksessa esitetyt onko annoksen Ad5mir122 pystyy näyttämään suonensisäisen tehoa syövän hoidossa vaikuttaisi merkittävästi maksan tasoja mir122 tai sen mRNA tavoitteensa.

Materiaalit ja menetelmät

Adenovirus valmisteiden

Adenovirus kloonaus on kuvattu aiemmin [10]. Kaikki adenoviruksia kasvatettiin A549- soluissa, puhdistettiin kaksinkertainen banding CsCl kaltevuudet Bentsonaasilla hoidon jälkeen ensimmäisen ryhmittelyä. Viruspartikkelin (vp) määrä määritettiin mittaamalla DNA-pitoisuus käyttäen modifioitua versiota PicoGreen määrityksen (Invitrogen, Paisley, UK) [22]. TCID

50 laskettu Karber tilastollisen menetelmän [23] käytettiin arvioimaan adenoviruksen tiitteri (TCID

50 yksikköä /ml) ja korjattuna määrittää plakkia muodostavaa yksikköä /ml (pmy /ml). Adenovirusvalmiste ominaisuudet ovat seuraavat: Ad5WT: 1,13 × 10

12 vp /ml, 1,98 x 10

11 pmy /ml ja hiukkasten: infektiivisyys (P: I) suhde 5,6; Ad5mir122: 1,29 × 10

12 vp /ml, 2,01 x 10

11 pmy /ml ja hiukkasten: infektiivisyys (P: I) suhde on 6,4.

ylläpito solulinjojen

HT29-Luc ja Lovo-Luc peräsuolen solulinjat saatiin Caliper Life Sciences (Runcorn, UK). Ihmisen maksasyövän HepG2 ja Hep3B solulinjojen ja A549 keuhkokarsinooma solut saatiin European Collection of Cell Cultures (Porton Down, UK), ja pidettiin DMEM: ssä, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (PAA Laboratories, Yeovil, UK) mukaan lukien penisilliini (25 U /ml) ja streptomysiiniä (10 mg /ml).

Lusiferaasimäärityksiä

solut ympättiin kolmena rinnakkaisena 48-kuoppaisilla levyillä 2,5 x 10

4 solua /hyvin. Virustartunnat suoritettiin 10 vp /solu. 24 tuntia infektion jälkeen väliaine poistettiin ja 150 ui toimittaja solujen (Promega) lisättiin. Solut pakastettiin -80 ° C: ssa 1 tunnin ajan ennen sulatusta. Lusiferiinin (25 ui) (Promega, Southampton, UK) lisättiin 25 ui solu- lysaattia ja suhteellinen luminesenssi mitattiin luminometrillä (Lumat LB 9507, Berthold Technologies, Redbourn, UK).

MTS määritykset

Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä CellTiter 96 Aqueuos Yksi ratkaisu Cell Proliferation Assay (Promega). Soluja ympättiin 1 x 10

4 /kuoppa 96-kuoppaisille levyille 100 ul: media. 24 tunnin kuluttua, viruksia lisättiin 10 ja 100 vp /solu 100 ui media. Solut jätettiin joko 3 tai 6 päivää. Kunakin ajankohtana väliaine poistettiin ja 20 ui MTS-reagenssia 180 ui media lisättiin ja soluja inkuboitiin 30 minuuttia. Levyt luettiin 490 nm: ssä 0,1 sekunnin ajan. Nollakoekuoppien sisältäviä MTS-reagenssia ja media mutta ei soluja toimi tausta ja ei-infektoituneiden solujen osuus 100% eloonjääneitä jokaisessa solutyypissä. N = 5 kussakin määrityksessä.

Ensisijainen Maksasolukasvute- kulttuuri

Frozen Human maksasoluissa (NHeps, CC-2591), Maksasolukasvute- ruselatusaineeseen HBM

TM (CC-3199), täydentää ja kasvutekijät HCM

TM SingleQuots (CC-4182) ostettiin Lonza. Solut ympättiin ja manipuloitu mukaan Lonzan protokollaa. 96-kuoppainen levy päällystettiin rotan hännän kollageenilla tyyppi 1 (Sigma, C3867), 60 ug /cm

2. Solut sulatettiin 37 ° C: ssa vesihauteessa, sentrifugoitiin 4 ° C: ssa 3 minuutin ajan 50 g ja pestiin sitten kylmällä elatusaineessa. Solut suspendoitiin uudelleen lukumäärä ja elinkelpoisuus varmistettiin käyttämällä trypaanisinisen väriaineen syrjäytymisen menetelmällä. Elinkelpoisuus saatiin 60% kylvämisen. Solut ympättiin 5 x 10

4 /hyvin 120 ul väliaineen jokaiseen kuoppaan. Elatusaine vaihdetaan 3 tuntia ymppäyksen jälkeen. Virustartunnat tehtiin 24 tuntia ymppäyksen jälkeen 100 ul tuoreessa väliaineessa 1 vp /solu, toinen 100 ui väliainetta lisättiin 2 tunnin infektion jälkeen. 100 ui median vaihdettiin joka päivä ja kunnes koe loppuun (72 h). Supernatantti poistettiin imemällä ja solut hajotettiin 100 pl Promega toimittaja lyysipuskuria (E397A) ja jäädytettiin -80 ° C: ssa ennen lusiferaasin kvantitointi.

Western blotit

Proteiini uutettiin hiiren maksan homogenoimalla Promega lyysi liuoksessa 80 mg /ml märkää painoa. Näytteet olivat span nopeudella 2000 rpm 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, solujäänteiden poistamiseksi. 30 ug maksan proteiinia ladattiin 10% polyakryyliamidigeelillä jälkeen kvantitointi käyttäen QuantiPro BCA-määrityksellä (Sigma Aldrich, cat: QPBCA-1KT). Geeli ajettiin 160 V: ssa 1 tunnin ajan ja sitten proteiini blotattiin nitroselluloosamembraanille yön yli 4 ° C: ssa 30V. Nitroselluloosakalvolle värjättiin Ponceau ratkaisu vahvistaa yhtä suuri kuormitus (tuloksia ei ole esitetty), ja sen jälkeen estetty 5% maitojauhetta (Fluka, Sigma Aldrich), 2 tuntia (E1A) tai yön yli (aldolaasi A). Membraani pestiin kahdesti PBS: llä 0,1% Tween 20 ja sitten kerran PBS: llä. Sillä E1A western blot, ensisijainen tunnistavaa vasta-ainetta E1A (Abcam, Cambridge, Iso-Britannia, kissa numero: Ab33183) lisättiin 1:500 laimennus 2,5% maitojauhetta PBS: ssä 1 tunnin ajan. Kalvo pestiin kuten edellä. Toissijainen anti-kani-HRP leimattua vasta-ainetta lisättiin 1:1000 laimennus 2,5% maitojauhetta 1 tunnin ajan. Sillä aldolaasi Western blot, primaarisen vasta-aineen tunnistamaan aldolaasi A (Sigma-Aldrich, kissa numero: AV48130) lisättiin 1:1000 laimennus 2,5% maitojauhetta PBS: ssä 1 tunnin ajan. Kalvo pestiin kuten edellä. Sekundäärinen vasta-aine oli sama kuin mitä käytettiin Adenoviruksen E1A western blot, vaan käytetään yhdellä 1:4000 laimennus 1 tunnin ajan. Kalvot pestiin kuten edellä ja sitten kylpi ECL Western blotting detektointireagenssia (Amersham, GE Healthcare) 0,125 ml /cm

2 1 minuutti. Blot oli visualisoida Alpha Innotech geeli dokumentointijärjestelmä 1, 5 ja 10 minuuttia käyttäen kemiluminoinnilla tunnistus.

RNA ja Reverse-transkriptio kvantitatiivinen PCR E1A mRNA

kokonais-RNA hiiren maksa uutettiin käyttäen Mirvana miRNA eristyspakkausta (Ambion) ilman miRNA rikastamiseen askel. Suoritettiin käyttäen TaqMan RNA-to-C

T 1-vaiheen Kit (Applied Biosystems) seuraten valmistajan protokollaa. PCR-syklit olivat seuraavat: 95 ° C 10 minuuttia, sitten 40 sykliä 95 ° C: ssa 15 sekuntia, 60 ° C 1 minuutti. Alukesekvenssit kohdistamista E1A 13S olivat: Eteen – ATG TTT GTC TAC AGT CCT GTG TCT GAA, Rev – GAT AGC AGG CGC CAT TTT AGG ja koetin – CCA GAA CCG GAG CCT GCA AGA CCT AC (Sigma-Aldrich), dual leimattu 5′-pään kanssa, 6-karboksifluoreseiini ja 3′-päähän 6-karboksitetrametyylirodamiini. Tulokset analysoitiin StepOne Plus Real-Time PCR Systems ohjelmisto (Applied Biosystems). Standardikäyrät tehtiin sarjalaimennoksia tunnettu määrä E1A DNA käyttäen Ad5 E1A koodaa plasmidi ja oletetaan 100%: n uutto tehokkuutta.

Animal Models

Nu /nu naaraspuolisia CD1-hiiriä saatiin Charles Rivers Laboratories 4-6 viikon iässä. 5 x 10

6 HepG2 solua injektoitiin ihon alle. Hiiret satunnaistettiin ennen hoitoa. Alustava kasvainten koot olivat tyypillisesti 10-20 mm

3. Kaikki olivat esikäsitelty bisfosfonaatti liposomeja (100 ìl /hiiri, saatu tri Nico van Rouijen) 24 tunnin ajan ennen ensimmäistä annosta virus. Tutkimuksessa laskimoon tehoa hiiret saivat bisfosfonaattia liposomeja kahdesti päivinä -1 ja 18. Kaikki ohjaus eläimet saivat tätä hoitoa. 10 eläimet käytettiin kussakin ryhmässä.

Kasvaimen koon ja Kaplan Meier-analyysi

Kasvainten tilavuus mitattiin käyttämällä kädessä pidettävää jarrusatulat ja määritellään koon suurimman kasvaimen kussakin hiiri. Kasvaimen tilavuus lasketaan ellipsoidin [24]. Kaplan Meier-analyysi suoritettiin käyttäen Prism-ohjelmisto ja näytetään prosentteina ryhmän säilymiseen kussakin aikapisteessä.

Imaging

In vivo

virus arvioitiin ei-invasiivisia lusiferaasi kuvantaminen käyttäen IVIS 100 järjestelmä (Xenogen, MA). D-Luciferin (kaliumsuola) (Gold Biotechnology inc) valmistettiin PBS: ssä 15,8 mg /ml. 100 ui Luciferin annettiin kautta vatsaonteloon injektio ja hiiriä kuvattiin 4 minuuttia myöhemmin.

mittaus Seerumin alaniiniaminotransferaasin (ALT) B

50 pl verta otettiin hiirten hännästä verenvuoto ja sallittu hyytymään (15 min, huoneen lämpötila) ja sentrifugoitiin 1200 g: ssä 10 min. Seerumin eristettiin ja pakastettiin välittömästi -20 ° C: ssa. Näytteet sulatettiin seerumia (5 ui) lisättiin ALT-reagenssia (995 pl, Microgenics) 1 ml: n kvartsikyvetissä, inkuboitiin 37 ° C: ssa ja absorbanssin muutos (340 nm) per minuutti mitattiin. Yksikköä ALT litrassa laskettiin valmistajan ohjeiden käyttäen seuraavaa yhtälöä: Aktiivisuus yksikköä /litra = Ä Absorbanssi muutos minuuttia kohden x kerroin (kerroin = kokonaisreaktiotilavuus × 1000 /6,3 x näytteen tilavuus × polun pituus).

MicroRNA kvantitointi

RNA uutettiin hiiren maksasta kuten edellä on kuvattu, ja laimennettiin 1 ng /ul nukleaasia vapaata vettä. Aikuinen mir122 kvantitoitiin käyttäen TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems) spesifisiä mir122 (osa numero: 4427975 määritys ID: 002130). Lyhyesti, Käänteinen transkriptio (RT) reaktiot (15 ui) perustettiin mukaisesti valmistajan ohjeita käyttäen Multiscribe käänteiskopioijaentsyymi (50 U /reaktio), dNTP: tä (1 mM lopullinen pitoisuus), 0,188 ui RNaasi-inhibiittoria, 1,5 ui 10X RT-puskuria, 3 ui 5x mir122 TaqMan MicroRNA RT pohjamaali ja 5 ui RNA-näytettä (1 ng /ul). Reaktio-olosuhteet olivat 30 minuuttia 16 ° C: ssa, 30 minuuttia 42 ° C: ssa, 5 minuuttia 4 ° C: ssa. cDNA (1,33 ui RT reaktio) lisättiin 1 ui 20X Mir122 Taqman MicroRNA Pitoisuus, 10 ui TaqMan 2X Universal PCR Master Mix ja täytetään 20 ui käyttäen nukleaasia vapaata vettä. Reaaliaikainen PCR-olosuhteet olivat 10 minuuttia 95 ° C: ssa, mitä seurasi 40 sykliä 15 sekuntia 95 ° C: ssa, sitten 1 minuutti 60 ° C: ssa. Näytteet ajettiin Step One Plus reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems). MicroRNA let7a käytettiin sisäisenä standardina käyttämällä edellä kuvatuissa olosuhteissa ja käyttäen TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems) spesifisiä kypsä let7a RNA (osa numero: 4427975 määritys ID: 000377). Suhteellinen standardikäyrät tuotettiin kymmenkertaisesti sarjalaimennoksia maksan RNA: ta, joka on uutettu hiiren vastaanottavan PBS. Reaktio ominaisuudet olivat seuraavat; mir122 määritys: rinne 3,28, 101,78%, hyötysuhde 2,02 ja Let 7 määritys rinne 3,268, 102,29%, hyötysuhde 2,01. Suhteellinen ilmaisuja laskettiin käyttäen julkaiseman menetelmän Pfaffl, M [25]. Koettimet leimattiin 5’pää 6-karboksifluoreseiinia ja 3’päättyä ei-fluoresoiva sammuttaja kytkettynä pieneen uraan sideaine (KTK).

mRNA mikrosiruanalyysi

RNA uutettiin hiiren maksasta kuten edellä on kuvattu. Kukin ryhmä sisältää 3 hiiret ja riippumatonta siruja käytettiin kullekin näytteelle. Koko genomin geenin ilmentymisen analyysi suoritettiin käyttäen Illumina Yhden Väri Mouse WG-6_V2_0_R0_11278593_A BeadChip suora liuoshybridisaatiomääritysmenetelmä (Illumina, Essex, UK) mukaisesti valmistajan ohjeiden aloittaen 300 ng kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä. Biotinyloitu cRNA valmistettiin käyttäen Illumina TotalPrep-96-RNA: Amplification Kit (# 4393543 Ambion, Inc., Austin, TX). Tämä lyhyt sisältää ensimmäisen ja toisen lohkon käänteinen transkriptio vaihe, jota seuraa yksi

in vitro

transkriptio (IVT) vahvistus, joka sisältää biotiinileimatuilla nukleotidin. Seuraavat vaiheet array hybridisaatio, pesu, esto, ja streptavadiinihelmiä-Cy3 värjäystä. Fluoresenssi päästöjä Cy3 kvantitatiivisesti havaita BeadArray Scanner jatkoanalyysille. GenomeStudio Data Analysis Software käytettiin visualisoida ja analysoida tuottamat tiedot. Tämä ohjelmisto tarjoaa tuloksia standardin tiedostomuotoja, jotka voidaan helposti käsitellään useimpien kaupallisten ilme-analyysi ohjelmia. Tiedot tuotiin GeneSpring GX 11.0.2 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara CA) normalisoitu Shift 75 persentiilin ja lähtötilanteen muuttuu mediaani kaikista näytteistä analysoitavaksi tunnistaa merkittävästi ilmentyvät eri geenit. Tiedot käsitellään tässä julkaista MIAME yhteensopiva ja on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus [26] ja pääsee läpi GEO Sarjan hakunumerolla GSE23854 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc .cgi? acc = GSE23854).

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet suoritettiin ehtojen mukaisesti UK Home Office suuntaviivat ja UKCCCR suuntaviivoja eläinten hyvinvointia koskeva Experimental neoplasia. Koti toimistohanke lisenssinumeron, joilla nämä kokeet toteutettiin on PPL 30/2333. Kaikki kokeet suoritettiin suostumuksella Medical Sciences eläinten eettisen komitean, Oxfordin yliopiston.

Tulokset

Ad5mir122 osoittaa vähentynyt E1A ilmentymisen ensisijainen ihmisen hepatosyyttien

Olemme aiemmin osoittaneet että sisällyttäminen mikroRNA sitoutumiskohtien sisällä 3’UTR adenoviruksen E1A mRNA johtaa alhaisempaan E1A-proteiinia sekä hiiren maksassa

in vivo

ja mir122 positiivisen ihmisen hepatoomasolulinjassa Huh7

in vitro

. Kuitenkin, Huh7-solut ilmentävät ainoastaan ​​8%: n mir122 tasojen primaaristen ihmisen hepatosyyttien [27]. Siksi halusimme mittaamiseksi virustautien ilmentymistä, joka voitaisiin saavuttaa ensisijainen ihmisen hepatosyyttien korvikkeena ihmisen maksan. Primaaristen ihmisen hepatosyyttien (1 x 10

4 /kuoppa) inkuboitiin joko Ad5WT lusiferaasia koodaava C-terminaalisesti fuusioitu E1A-proteiinia (Ad5WTLuc) tai vastaava virus, joka sisältää neljä mir122 sitoutumiskohdat E1A-lusiferaasi 3’UTR ( Ad5mir122luc). 72 tunnin jälkeen lusiferaasi-tasot olivat 30-kertaa pienempi infektoiduissa soluissa Ad5mir122luc (9,5 x 10

2 RLU /mg) verrattuna Ad5WTluc (2,7 x 10

4 RLU /mg) (kuvio 1) . Tämä on ensimmäinen osoitus määräysvallan mikroRNA säännellyn viruksen ensisijainen ihmisen soluissa ja korostaa mahdollinen kliininen hyödyllisyys hyödyntää mikroRNA sääntelyn terapeuttinen viruksia.

Ensisijainen ihmisen hepatosyyttien tartutettiin joko Ad5mir122luc tai Ad5WTluc 1 vp /solu. Lusiferaasin tasoja on esitetty 3 päivää infektion jälkeen (n = 3) suhteellisina valoyksiköinä mg proteiinin kokonaismäärää kohti. Virhepylväät edustavat keskihajonta.

Ad5mir122 tappaa mir122 negatiivisia soluja Ad5WT teho

kyky Ad5mir122 tappamaan kasvainsoluja, jotka eivät ekspressoi mir122 verrattiin Ad5WT. Useita solulinjoja inkuboitiin 10 ja 100 vp /solu ja solujen elinkyky määritettiin jälkeen 3 tai 6 päivää MTS-määritys. Tasa-solujen tappaminen havaittiin molemmilla viruksilla molempien MÕIS päivällä 3 (dataa ei esitetty). Lähes täydellinen solukuoleman joissakin solulinjoissa havaittiin korkeampi MOI päivällä 6 (kuvio 2). Mielenkiintoista on, että solulinja kaikkein herkin tappaa molemmat virukset oli HepG2 ihmisen maksasyövän, joka on raportoitu olevan mir122 negatiivinen [27]. Koska pienenee mir122 tasoilla ensisijainen hepatoomat on indikaattorina huonon ennusteen [28], HepG2 solut edusti lupaava kasvain malli, joka olisi maksimoitava terapeuttinen indeksi saavuttaa Ad5mir122 välillä kasvainkudoksen ja ensisijainen maksan.

Comparison of Ad5mir122 ja Ad5WT syöpäsolulinjoissa inkuboitiin infektiokertoimella 100 viruspartikkelia solua kohti. Prosenttiosuus solujen eloonjäänti on esitetty 6 päivää infektion jälkeen (n = 5), käyttäen MTS-solujen eloonjäämistä määrityksessä. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen yksisuuntainen ANOVA (* = p 0,05, NS = ei merkitsevä).

farmakodynamiikka johtama määrittäminen optimaalisen virusannosten

optimaalinen annokset Ad5mir122 ja Ad5WT määritettiin määritelläkseen pöytäkirja, jonka avulla toista toimitus syövän tehoa malli. Vaikka olemme aiemmin määritelleet kertainjektiona suurin siedetty annos normaaleilla hiirillä of Admir122 (6 x 10

10 vp), hoito ksenograftin varustettujen nude-hiirten saattavat vaatia eri protokollaa, ja siksi farmakodynamiikan johtama annoksen suurentaminen Tutkimus suoritettiin .

Ad5WT ja Ad5mir122 annettiin suonensisäisesti CD1 kantavien nude-hiirten HepG2 ksenografteja, joiden seerumin ALT mitattiin kunkin annoksen jälkeen (kuvio 3a). Aloitusannos molempien virusten oli 6 x 10

9 vp /hiiri, mikä vastaa 8,8 x 10

8 pfu Ad5WT, hieman pienempi kuin julkaistu suurin siedetty annos (MTD, 1 x 10

9 pfu ) [17]. Jotta kuvantaminen virus kunkin annoksen sisälsi 10% Ad5mir122luc.

A) Seerumin alaniinitransaminaasiarvo (ALAT) hiiriltä vastaanottaa Ad5mir122, Ad5WT tai PBS. ALT-arvot kullekin ryhmälle on esitetty päivinä 2, 5 ja 8 (n = 3) ensimmäisen injektion jälkeen. Aineisto esitetään ALT yksikköä litrassa käyttäen yhtälö materiaaleja ja menetelmiä. B) Luciferase kuvantaminen 2 päivää sen jälkeen ensimmäisen injektion Ad5mir122 (vasen paneeli) tai Ad5WT (oikea paneeli). C) Luciferase kuvantamisen kahdeksan päivän kuluttua ensimmäisestä annoksesta. Hiiret, jotka saivat yhden injektion Ad5WT näkyvät oikeanpuoleisessa paneelissa ja hiirtä sai kolme injektiota Ad5mir122 näkyvät vasemmassa paneelissa. Kuvat ovat kaikki esitetty samassa mittakaavassa. D) Annostus ja hoidon aikataulu Ad5mir122 ja Ad5WT. Viral annokset edellä on esitetty kunkin rivin ja sisältävät 10% lusiferaasireporttiterilla virus (Ad5mir122luc). Kaikki hiiret hoidettiin bisfosfonaatilla liposomien päivänä -1.

Kaksi päivää annon jälkeen 6 x 10

9 vp Ad5WT, hiiret osoittivat merkittävästi kohonneet ALAT-arvot ( 1000 yksikköä /l) viittaa merkittävää maksatoksisuutta (kuva 3a). Imaging osoittivat korkeita maksan lusiferaasiekspression, vahvistaa virus maksassa juurikaan mitään kasvaimen signaalia (kuva 3b). Vaikka ALT arvot laskivat tasaisesti päivän 2-8 (kuva 3a), useat eläimet (6 10) osoitti merkittävää laihtuminen ( 5%) ja yksi oli lopetettava (laihtuminen 15%). Niinpä tämä annos Ad5WT otettiin MTD, ja hoito ei suurennettu.

Sen sijaan, kaksi päivää antamisen jälkeen sama annos (6 x 10

9 vp) on Ad5mir122, hiiret osoittivat ALT lukemat samanlainen fosfaattipuskuriliuosta (kuvio 3a). Imaging tulokset vahvistivat tämän tuloksen ilman havaittavaa maksan lusiferaasi (kuva 3b). Juurikaan ole kasvainta infektiota havaittu tällä annoksella.

annosta Ad5mir122 oli siis kasvanut puoli log 2 x 10

10 vp, kolmen päivän kuluttua ensimmäisestä injektiosta. Imaging päivänä viisi osoitti jonkin lusiferaasiaktiivisuutta (osoittaen E1A ilmentymisen) sekä kasvaimen ja maksassa, vaikka absoluuttiset arvot vaihtelivat välillä hiirissä (tuloksia ei ole esitetty). Keskimääräinen ALT-arvot nousivat 222 ALT yksikköä /l verrattuna 42 ALT yksikköä /l kontrolleista (kuvio 3a). Päivänä kuusi annosta lisäsi edelleen puoli log 6 x 10

10 vp. Imaging päivänä kahdeksan osoitti merkittävää lusiferaasin aktiivisuutta kasvaimia, mutta tämä oli liitetty mitattavissa lusiferaasiaktiivisuus myös maksassa (kuvio 3c). ALT lukemat osoittivat vain pientä kasvua edelliseen annoksesta (kuvio 3a). Tutkimus vahvisti, että 6 × 10

10 vp Ad5mir122 oli lähes MTD Admir122 suostumuksella aiempien tietojen normaaleilla hiirillä.

Toista antaminen adenovirus voi aiheuttaa kumulatiivista myrkyllisyys [10]. Tehokkuuden arvioimiseksi oli toivottavaa antaa viruksen useita kertoja, joten toistuvaan hallintojen valitsimme annostasoilla, jotka olivat puoli log alempi kuin arvioitu Mtds of Ad5mir122 (2 x 10

10 vp /hiiri) ja Ad5WT (2 × 10

9 vp /hiiri).

tehokkuus Ad5mir122 ja Ad5WT in hepatoomasta ksenograftimallia

Voit selvittää syövän vastaisen aktiivisuuden Ad5mir122 nude-hiiret, joissa oli muodostuneita HepG2 -ksenografteja annettiin 2 x 10

10 vp intravenöösisti vuorokausina 0, 3, 19 ja 22, kun taas ohjaus eläimet saivat joko 2 x 10

9 vp Ad5WT tai PBS. Hoito aloitettiin kasvainten välillä 10-20 mm

3 kokoisia. Kasvainten kasvua seurattiin tehon ja selviytymisen päätepisteen (varten Kaplan Meierin kuvaaja) otettiin käyttöön yksittäisten kasvaimen tilavuuden saavuttanut 400 mm

3. Eläimet, joilla nopein kasvaimen kasvua annettiin jatkua tässä vaiheessa (1000 mm

3), jotta ryhmän kasvaimen keskikoon päästä 400 mm

3. Hiirillä, joille annettiin Ad5mir122 osoittivat merkittävästi vähentää kasvaimen tilavuus 20. päivänä verrattuna PBS kontrolleihin (kuvio 4a). Kuitenkin hiiret, jotka saivat Ad5WT osoitettiin myös merkittäviä syöpälääkkeen tehoa. Tämä on ehkä yllättävää ottaen huomioon, että Ad5WT on osoitettu olevan voimakas syövän vastaista aktiivisuutta [29]. On tärkeää korostaa, että annokset Ad5mir122 ja Ad5WT ei equitoxic. Kun 4 päivää hoidon Ad5WT yhdellä hiiren tukahdutettiin johtuu laihtuminen ( 15%) ja maksatoksisuutta (kuva 4b). Mitään tällaista haittatapahtumia saaneiden ryhmässä Ad5mir122 klo 10 kertaa suurempi annos.

Toista anto Ad5mir122 (n = 10 hiirtä) klo hoitoannoksen määritetään kuvassa 2 (2 x 10

10vp ) päivinä 0, 3, 19 ja 22 laskimonsisäisenä injektiona. Ohjaus eläimet saivat toista anto 2 x 10

9 vp Ad5WT tai PBS laskimoinjektiona (n = 10 hiirtä). A) Kasvaimen tilavuus hiirestä, jotka saivat PBS: ää tai Ad5mir122 tai Ad5WT laskettiin määrä ellipsoidin [24]. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen yksisuuntainen ANOVA kanssa Bonferronin kokeen (ns = ei merkitsevä, * = P 0,05, ** = P 0,01) kunakin ajankohtana. Virhe palkit näkyvät keskivirhe. B) Kaplan Meier selviytymisen analyysi osoittaa elonjäämisetua hiirten vastaanottamisesta Ad5mir122 ja Ad5WT vertailuryhmän hiirtä sai PBS. Kun 4 päivää hoidon Ad5WT yhdellä hiiren tukahdutettiin toksisuuden takia. Hoitoon liittyvä toksisuutta ei todettu Ad5mir122 hoidon tai hoidon PBS: llä. Päivää näkyy sekä vaaka-akselilla edustavat useita päiviä, koska ensimmäinen virus injektion.

Kaplan-Meier-analyysi hiirillä, joille annettiin Ad5mir122 osoittivat lisääntynyttä eloonjäämistä kaikki hiiret elossa pidempään kuin kaikki ohjaimet (kuvio 4b). Nämä tiedot osoittavat, että toista antaminen Ad5mir122 annoksilla yli MTD Ad5WT voi olla merkittäviä syöpälääkkeen tehoa ilman myrkyllisyyttä.

Arvio sisäiseen maksan Ad5mir122 E1A aktiviteetti

määrällisesti sekä E1A-mRNA: n ja proteiinin tuottaman Admir122 optimaaliseen hoitoon annos verrattuna Ad5WT, Balb /C-hiiriin injektoitiin 2 x 10

10 vp ja maksat otettiin talteen sen jälkeen, kun 48 tuntia. Kuten edelleen ohjaa hiirille annettiin PBS: ää tai E1A poistaa ei-replikoituva adenovirus tyyppi 5 lusiferaasia koodaava (AdLuc) samalla annostuksella. RNA uutettiin ja tärkeimpien E1A 13S transkripti mitattiin RT-QPCR. Ad5mir122 osoitti 29-kertaisesti alentunut taso 13S E1A transkriptio kappaletta verrattuna Ad5WT. E1A mRNA kopiota nanogrammaa kokonais-RNA oli 4,57 x 10

6 ja 1,54 x 10

5, vastaavasti. Tämä vahvisti, että vakaus mRNA on itse vaikuttaa suoraan microRNA asetuksella, kuten voisi odottaa (kuva 5a).

A) RT QPCR varten 13S E1A mRNA transkriptiona, maksa hiirien 48 tunnin kuluttua laskimoon injektio 2 x 10

10 vp of Ad5mir122, Ad5WT, Ad5Luc tai PBS. Ad5mir122 osoittaa merkittävästi vähentää E1A-mRNA: n aikana maksan infektion verrattuna Ad5WT (N = 3). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen kahta tailed student T-testi (* P = 0,05). B) Western blot vahvistaa, että kaikki E1A proteiinit vaihtoehdot ovat tippuu alas. Kukin kaista vastaa proteiinia, uutetaan yksittäisen hiiren. Ohjaus kaistaa sisältävät maksaa hiirille on joko E1A poistettu Ad5Luc vektori tai PBS osoita mitään E1A signaalia. Ad5WT hoito näyttää 3 selkeästi määritelty vyöhykettä, jotka vastasivat proteiineja tuotetaan 13S (36 kDa), 12S (26 kDa) ja pienemmän himmeämpi bändi, joka voi edustaa 11S tai 10S E1A transkriptio tuote. Hoito Admir122 näkyy merkittävää Knockdown in E1A proteiinin tasoja kaikissa silmukointimuunnokset. Blotti altistettiin 1, 5 ja 10 minuutin ajan 5 minuutin altistus esitetään tässä. Molekyylipainot laskettiin vastaan ​​kaksivärinen molekyylipaino tikapuut (Bio-Rad).

Varmista, että alennetun E1A mRNA alensivat E1A proteiinin tuotantoa, ja vahvistaa, että vaikutus ei ollut E1A 13S erityisiä, maksan proteiinia uutteet analysoitiin western blot E1A-proteiinia.