Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kertyvät tutkimusten mukaan vaatimuksen edelleen kerrostuminen potilaiden samassa kasvain vaiheessa mukaan molekyyli tekijöihin. Arvioimme yhdistelmä syövän vaiheen ja DNA: n metylaatio tilan indikaattorina uusiutumisen riskiä ja kuolleisuutta potilailla, joilla peräsuolen syöpä (CRC). Kohortti tutkimuksessa 215 potilaalla on CRC (keski-ikä 64,32 vuotta, 50,5% miehistä) Tri-Service General Hospital Taiwanissa tutkinut yhdistyksen välillä syöpä vaihe ja riski CRC uusiutumisen ja kuolleisuutta. Coxin suhteellisen riskin malliin käytettiin analysoimaan potilaan metylaatiostatuksen ja kliininen tieto tutkimuksen alkaessa, ja niiden yhteenliittymien kanssa CRC toistuminen ja kuolleisuuden seurannan aikana. Kehittynyt vaiheessa potilaalla on

p16

,

hMLH1

, ja

MGMT

metylaatio liittyi suurempi riski CRC toistuminen verrattuna paikallisen vaiheessa potilaalla on unmethylation asema kasvainkudoksissa Direktiivissä säädetään hazard ratio (t) (95% luottamusväli [CI]) 9,64 (2,92-31,81), 8,29 (3,40-20,22), ja 11,83 (3,49-40,12), tässä järjestyksessä. Analysoitaessa normaaleissa kudoksissa, havaitsimme vastaava riski CRC uusiutumisen kanssa tarkistetaan h (95% luottamusväli) 10,85 (4,06-28,96), 9,04 (3,79-21,54), ja 12,61 (4,90-32,44), tässä järjestyksessä. Yhdistettyjen analyysien, uusiutumisen riskiä potilailla pitkälle vaiheessa DNA: n metylaation sekä normaali tuumorikudoksia verrattuna paikallisen vaiheessa unmethylation, korotettiin oikaistun HR (95% CI) 9,37 (3,36-26,09). Vuonna pitkälle potilaat, metylaatiostatus ja kudosten alatyypin liittyi suurentunut riski 5 vuoden kumulatiivinen CRC toistumisen (

p

0,001). Tämä tutkimus osoittaa, että klustereiden DNA metylaatiostatuksen mukaan syövän vaiheessa ja kudos alatyyppi on kriittinen arviointi uusiutumisen riskiä CRC potilaiden ja myös viittasi oleva mekanismi.

Citation: Kuan JC, Wu CC, Sun CA Chu CM, Lin FG, Hsu CH, et al. (2015) DNA Metylointi yhdistämiset Viereisen Normaali Colon Tissue Veikkaa syövän uusiutumiseen: Evidence from kliininen seurantatutkimus. PLoS ONE 10 (3): e0123396. doi: 10,1371 /journal.pone.0123396

Academic Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 07 lokakuu 2014; Hyväksytty: 18 helmikuu 2015; Julkaistu: 27 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Kuan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Data ollut talletetaan Dryadi: doi: 10,5061 /dryad.pg126.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat tutkimusmäärärahat National Science neuvosto, Kiina (NSC 98-2314-B016-001, NSC 99-2314 -B016-020, NSC 100-2314-B016-025, ja NSC 101-2314-B-016-029). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä syövistä, yli 140000 uutta tapausta ja 50830 kuolemantapausta arvioidaan tapahtuneen Yhdysvalloissa vuonna 2013 [1]. Vaikka ilmaantuvuus ja kuolleisuus CRC ovat vähentyneet huomattavasti viime vuosina, koska huomattavia parannuksia seulonnassa ja hoitostrategioita, ennuste CRC potilaiden jälkeen kirurgisen resektion on edelleen heikko [2].

Nykyisen arvioinnin suuntaviivoista n ennuste CRC potilaiden korostavat luokittelun yksittäisten kasvainten-solmu-etäpesäke elementtejä [3]. Kuitenkin, varaamiseen tutkimusten mukaan vaatimuksen edelleen kerrostuminen potilaiden samassa kasvain vaiheessa mukaan molekyylitason tekijöitä [4]. Lisäksi molekyyli tekijöitä, joita ovat biomarkkerit useiden syöpien, voisi olla mahdolliset kliiniset suuruutta voida tarkasti ennustaa syövän kehittymisessä ja etenemisessä, ja ennustaminen ennuste syöpäpotilaiden [5,6].

CRC on tunnustettu seurauksena kertyminen geneettinen (geenimutaatioita) ja epigeneettiset muutokset (poikkeava DNA: n metylaatio), jotka muuntavat paksusuolen epiteelisolujen koolonadenokarsinooma soluihin [7]. Epigeneettiset muutos, johon liittyy DNA ja histonimodifikaation, on ratkaiseva merkitys syövän synnyn reittejä useisiin syöpiin. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että yleisin poikkeava epigeneettisiä muutoksia syöpä, DNA: n metylaatio, vähentää tehokkuutta RNA transkription tuumorisuppressorigeeneille [8,9]. Tuore tutkimus on todennut, että useat geeni promoottori metylaatioita johtaa transkription hiljentämisen, ja voitaisiin hyödyntää biomarkkereina varhaiseen havaitsemiseen CRC [10]. Syövän etenemisen CRC on aiheuttanut toiminnan menetys solusyklin sääntelyn ja DNA yhteensopimattomien korjaus (MMR), joka liittyy DNA: n metylaatio on transkription aloituskohdasta [11]. Aiemmat tutkimukset ovat tunnistaneet DNA-metylaatio liittyviä geenejä, jotka liittyvät syövän synnyn väyliä käyttäen geenien [12,13]. Nämä tutkimukset eivät analysoi DNA: n metylaation tilan ja kliinisen näyttämön seurantaan potilailla, joilla on CRC.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida yhdistelmä syövän vaiheen ja DNA: n metylaatio tilan indikaattorina esiintymisen riski ja kuolleisuus potilaiden kanssa CRC. Olemme myös tutkineet yhdistyksen välillä riskitekijöitä ja ennusteen CRC, kun kerrostamiselintä mukaan paksusuolikudos alatyyppeihin.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasominaisuudet

mukaan kirjallisen toimintatavat, Good Clinical Practice (GCP) ja viranomaissäännökset, tämä hakemus hyväksyttiin Tri-Service General Hospital Institutional Review Board (IRB) (TSGHIRB hyväksyntänumero: 098-05-292). Hallitus järjestettiin alla, ja toimii kohti kansainvälisen yhdenmukaistamista (ICH) /WHO GCP sekä sovellettavien lakien ja määräysten. Kaikki potilaat allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuksen kirjeen ja oli kliinisesti diagnosoitu CRC oli kyettävä sietämään kirurginen resektio. Potilaan ominaisuudet (sukupuoli, ikä leikkauksen, vaiheessa, toistuminen, ja kuolleisuus) saatiin niiden taustatietoja. Paria näytteet kerättiin 215 CRC potilaat (430 näytettä), jotka täyttivät kriteerit. Näytteiden kerääminen suoritettiin kirurgisen klinikoilla, joissa kasvain ja normaaleissa kudoksissa resekoitiin samanaikaisesti. Viereinen normaali kudosnäytteiden kerättiin viilto 10 cm: n päähän syöpä sivustoja. Kaikki näytteet varastoitiin välittömästi nestemäisessä typessä. Resektio menettely tarkasteli Department of peräsuolen Kirurgian Tri-Service General Hospital.

DNA eristys ja natriumbisulfiitin hoito

Perimän DNA uutettiin kudosnäytteistä käyttämällä MagCore Automated Nucleic Acid Extractor (RBC Bioscience, Taipei, Taiwan) ja Perimän DNA Tissue Kit mukaan valmistajan protokollaa. Saatu DNA oli natriumbisulfiitti-modifioitu käyttämällä EZ DNA Metylointi Kit (Zymo Research, Orange, USA). Metyloitua DNA ohjaus metylaatiospesifinen polymeraasiketjureaktio (MS-PCR) määritykset on tuotettu käyttäen SSSI metylaasilla (Zymo Research, Orange, USA).

Metylaatiospesifinen PCR-määritys

Valitut 3 tuumorisuppressorigeeneille (

p16

,

hMLH1

, ja

MGMT

) liittyy riski CRC jotka osallistuvat reitit liittyy syövän vaiheisiin ja ennuste mm MMR ja solusyklin [14]. Ehdot DAN bisulfiitin hoitoa ja metylaatiospesifistä PCR-määritys olisi tarjottu S1 Methods, ja laadunvalvonta määritys tarjota S1 Fig.

Tilastollinen

Patient lähtötilanteesta lukien sukupuoli , ikä leikkauksen (jatkuva), vaiheen (I, II, III, ja IV), toistuminen, kuolleisuus tila, ja geenipromoottorialueen metylaation aseman kandidaattigeeneihin (

p16

,

hMLH1

, ja

MGMT

), verrattiin. Arvioimaan mahdollisia vuorovaikutuksia DNA: n metylaation ja kliiniseen vaiheeseen, ja riski CRC toistuminen ja kuolleisuutta potilailla eri syövän vaiheissa arvioitiin erikseen ja myös jaettu 2 alaryhmään (paikallinen ja kehittyneet). Kasvainkudoksista verrattiin viereisten normaaleissa kudoksissa. Useat tekijät voivat ovat vaikuttaneet eroja tuloksemme ja muiden tutkimusten. Häiritsevien tekijöiden säätö yksityiskohtaisesti S1 Methods. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS ohjelmistoa (IBM SPSS Statistics 21; Asia Analytics Taiwan Ltd., Taipei, Taiwan). Kaikki tilastolliset testit 2-puolinen kanssa α tasolla 0.05.

Tulokset

keski-ikä (± SD) tutkimuksen potilaista oli 64,32 (± 14,48) vuotta, ja miehet muodostivat 50,5 % tutkimuksen näytteen. Kaiken kaikkiaan keskimääräinen kesto (± SD) seuranta-aika oli 24,94 (± 17,90) kuukautta. Aikana 5363 henkilön kuukauden seurannan tunnistimme 85 tapauksia CRC toistuminen ja 43 kuolemantapausta, joiden esiintyvyys tiheys on 15,85 ja 8,02 per 1000 henkilövuotta kuukautta. Yhdistyksen välillä kliinisessä vaiheessa ja riski CRC toistuminen ja kuolleisuus on tarjota S1 tulokset.

Taulukko 1 näyttää lähtötilanteen ominaisuudet potilaista mukaan niiden DNA: n metylaatio tila. Analysoitaessa normaaleissa kudoksissa, havaitsimme, että potilaat, joilla on korkeampi metyloinnin tilan tuumorisuppressorigeeneille merkittävästi liittyä suurempi osuus CRC uusiutumisen kuin potilailla, joilla on alhaisempi metylaatiostatuksen olivat (55,3% vs. 37,7%,

p

= 0,012). Tämä yhdistys oli rajatapaus merkittävä kasvaimen kudoksissa (84,7% vs. 73,1%,

p

= 0,065). Olemme edelleen tutki yhdistyksen välillä syöpä vaihe ja riski CRC toistumisen, ositettiin jonka kohdegeenin metylaatiostatuksen kudoksessa alatyyppeihin jälkeen oikaistu sukupuolen, ikä leikkauksen, ja adjuvanttihoitoa (taulukko 2). Analysoitaessa tuumorikudoksia, havaitsimme, että myöhäisessä vaiheessa potilaalla on

p16

,

hMLH1

, ja

MGMT

metylaatio liittyi suurempi riski CRC toistuminen verrattuna paikallisiin vaiheen potilaalla on unmethylation asema, jossa on oikaistu h (95% luottamusväli) 9,64 (2,92-31,81), 8,29 (3,40-20,22), ja 11,83 (3,49-40,12), tässä järjestyksessä. Analysoitaessa normaaleissa kudoksissa, havaitsimme vastaava riski CRC uusiutumisen pitkälle edennyt potilaalla on

p16

,

hMLH1

, ja

MGMT

metylaatio verrattuna paikallisen vaihetta sairastavilla potilailla unmethylation tila, jossa on oikaistu h (95% luottamusväli) 10,85 (4,06-28,96), 9,04 (3,79-21,54), ja 12,61 (4,90-32,44), tässä järjestyksessä. Lisäksi Kaplan-Meier-analyysi log-rank testi osoitti merkitystä yhdistyksen välillä syöpä vaiheen ja DNA metylaatiostatuksen viereisissä normaaleissa kudoksissa, ja 5-vuoden kumulatiivinen toistumisen CRC (

p

0,001 , Fig. 1); Coxin regressiomallin vahvistanut johdonmukaista riski jälkeen säätää mahdollisten sekoittavien tekijöiden, kuten sukupuoli, ikä, kasvaimen sijainti, adjuvanttihoitoa, ja kliinisessä vaiheessa (

p

0,001).

Kumulatiivinen uusiutuminen oli merkitsevästi erilainen 4 alaryhmiin aikana 5-vuoden seurannan jälkeen oikaistu sukupuolen, ikä leikkauksen, kasvaimen sijainti, adjuvanttihoitoa, ja kliinisessä vaiheessa.

Kuten taulukosta 3, me analysoitavaa DNA metylaatiostatuksen ja CRC toistuminen tutkimuksessa potilailla, ositettiin mukaan syövän vaiheessa (paikallinen ja kehittyneet) ja kudosten alatyyppi (normaali ja kasvain). Havaitsimme, että riski CRC toistumisen oli merkitsevästi yhteydessä metylaatiostatuksen potilaiden eri syövän vaiheita, ja 2 kudoksen alatyypeistä, säätämisen jälkeen sukupuolen ja iän leikkaus (

p

0,001) . Paikalliset vaihe potilasta nonsignificantly liittyy lisääntynyt riski CRC uusiutumisen riippumatta metylaatiostatus ja kudosten alatyyppi. Vuonna pitkälle potilaat, metylaatiostatus ja kudosten alatyypin liittyi suurentunut CRC uusiutumisen.

Keskustelu

tulokset osoittivat, että DNA: n metylaation tiettyjen geenien ja kliiniseen vaiheeseen olivat liittyvä riski CRC uusiutumisen tutkimuksessamme potilasta. Havaitsimme, että DNA: n metylaation asema 3 kohdegeeneissä ja syövän vaihe liittyi merkittävästi CRC uusiutumisen kasvain ja normaaleissa kudoksissa. Kun me klusteroitu geenin metylaatio tilat mukaan syövän vaiheessa ja kudosten alatyyppi, havaitsimme lisäkorotukset riskiä CRC toistumisen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kliininen syöpä vaihe ja DNA: n metylaatio asema voidaan mahdollisesti arvioida ennustajina riskiä CRC uusiutumisen.

Aikaisemmat tutkimukset tutkittiin samalla tavalla yhdistyksen välillä lyhyen uusiutumista elinaika ja DNA: n metylaation CRC potilaille [15 -17]. Zitt ym verrattuna eri seulontatestien CRC, ja ilmoitti, että DNA: n metylaatio tarjoaa kliinisesti hyödyllinen indikaattori varhaiseen toteamiseen taudin etenemistä potilailla, joilla on CRC, jotka saattavat parantaa potilaan selviytymistä ja elämänlaatua [15]. Kim et al raportoitu, että DNA metylaatio useiden promoottorien voisi biomarkkereiden varhaiseksi havaitsemiseksi CRC, ja että DNA metylaation voitaisiin myös käyttää ennustajia metastasoituneen tai aggressiivinen CRC [16]. Tiedot kliinisestä Seurantatutkimus osoitti, että metylaatio spesifisten geenien liittyy huono hengissä kehittyneen CRC potilailla [17]. Suuri seurantatutkimus 61 494 Aasian ja valkoihoinen potilaalla on CRC osoitti, että hinnat olivat merkitsevästi korkeammat potilaiden filippiiniläinen ja Kiinan etnisen kuin muilla potilailla [18]. Siitä huolimatta meidän seurausta Kiinan väestön olivat yhtäpitäviä kuvattujen tutkimusten ja tutkimuksessa oli samanlaisia ​​tuloksia Syövän Genome Atlas [19].

Aberrations että metylaatio makromolekyylien, erityisesti DNA, sekä häiriöitä DNA-synteesin ja korjaus, katsotaan pelata merkittävä rooli syövän synnyssä [20]. DNA: n metylaatio on laajimmin tutkittu epigeneettisiä muutoksia [21], ja se voi tarjota uuden sukupolven syöpiä. Epigeneettiset muutokset, erityisesti DNA-metylaation valitun geenin promoottorit, ovat yhteisiä molekyylitason muutoksia ihmisen kasvaimissa [16]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että metylaatio tiettyjen geenien liittyi merkitsevästi suurentunut riski CRC toistumisen. Brock et al tunnistanut metyloinnin

p16

ja

CDH13

vuonna tumorous ja välikarsinan imusolmukkeiden, arvioimalla kertoimet suhdeluvut (syrjäisimpien alueiden) CRC toistuminen kuin 8,00 (95% CI, 2,50-25,51) ja 4,32 (95% CI, 1,61-185,02), vastaavasti. Kun he arvioivat yleisen metylaatio tumorous ja välikarsinan imusolmukkeiden, OR CRC toistuminen oli 15,5 (1,61-185,02) [22]. Tuloksemme esittänyt samalla tavoin kohonnut CRC toistumisen kun kerrostamiselintä DNA metylaatiostatuksen kliinisen syövän vaiheessa ja kudosten alatyyppi.

geenit arvioitiin tässä tutkimuksessa,

p16

,

hMLH1

, ja

MGMT

, osallistuvat solusyklin sääntelyn ja DNA MMR. Poikkeava promoottori metylaatio tuumorisuppressorigeeneille voi johtaa vaimentua transkription ilmaisun ja proteiinin ilmentyminen epiteelisoluissa [23]. MMR ja solusyklin kontrolli sekä keskeisessä asemassa ovat poistamisen mononukleotidi toistoja, ja menetys korjaus järjestelmä on yksi tärkeimmistä mekanismeista kertyminen toiminnallisen-muutoksen kasvaimia aiheuttavalle vaikutukselle, mukaan lukien CRC kehittäminen [24]. DNA: n metylaatio muutoksia selittää histologista heterogeenisyys ja kliinis monimuotoisuus ihmisen syövissä. Yli-ilmentyminen DNA metyylitransferaasi 1 ei ole toissijainen lisääntyneen solun proliferatiivisen aktiivisuuden, mutta ei korreloi merkitsevästi kertynyt DNA hypermetylaatio, että CpG-saarekkeiden kasvaimeen liittyvien geenien [25]. Välisen assosiaation DNA: n metylaation ja syövän vaiheessa voi olla riippuvainen interleukiini 6, krooninen tulehdus, merkkiaine, joka parantaa hypermetylaatiota tuumorisuppressorigeenin

p53

perheitä, mutta vähentää metylaatio epidermaalisen kasvutekijän reseptorin [26]. Krooninen tulehdus katsotaan aiheuttama tulehdus välittämän sytosiini vaurioita, ja tuotteet tällaisten vahinkojen voisi tarjota mekanistinen yhteys tulehduksen ja syövän [27], ja edistää poikkeava metylaatio ihmisen syövissä. Tulehdusvasteen välittäjäaineiden, kuten sytokiinien, vapaat radikaalit, ja kasvutekijät, indusoivat epigeneettisiä muutoksia tuumorisuppressorigeeneille. Havainnot tällaisista muutoksista ovat vahvistaneet yhdistyksen välillä tulehdus ja syöpään [28].

Siksi riski huonon ennusteen kasvaa kehittyneen kliinisessä vaiheessa syöpään kun potilaat diagnosoitiin ensimmäisen kerran, jopa sen jälkeen kirurginen resektio. Tuloksemme olivat yhtäpitäviä liittyvistä selvityksistä assosioida imusuonten ja etäispesäkkeitä huonon ennusteen [29,30]. Edennyt pitkälle CRC liittyy suurempi riski huonon ennusteen verrattuna paikallisiin vaiheessa CRC. Lisäksi kliininen katsaus keuhkosyöpään osoitti, että kun strategioita on jouduttamiseksi tarkasteluun epäillyt syöpä, tauti tyypillisesti muuttuu voimakkaasti aikaisemmin ja resektion hinnat kasvu [31]. Aiemmat tutkimukset ovat tunnistaneet, että poikkeava promoottori hypermetylaatiota syöpään liittyvien geenien voi olla potentiaalisesti käyttökelpoisia epigeneettisiin markkereita ennustamaan lopputuloksen syövän hoidossa [32,33]. Toisessa tutkimuksessa 22 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilaiden Esteller et al., 68% potilaista osoittaa hypermetylaation kasvain- DNA osoitettiin myös seerumin DNA poikki vaiheita, joita esiintyi kaikkien vaiheessa I IIIA [ ,,,0],33]. Tutkimuksessa osoitettiin poikkeava DNA: n metylaatio liittyy syöpään ennusteeseen, jopa eri kliinisissä vaiheissa. Toinen tutkimus osoitti geenin promoottori metylaatio liittyy varhaisessa toistumisen vaiheen I NSCLC [22]. Lisäksi, osuudet metylaation olivat enimmäkseen pienempi normaaleissa kudoksissa kuin kasvainkudoksissa taulukossa 1, mutta riskit toistuminen oli samanlainen näiden kahden kudoksiin. Tulokset osoittavat, että kun DNA-metylaatio havaittiin pitkälle potilailla, uusiutumisen riskiä kasvaisi voimakkaasti. Aiempi tutkimus on osoittanut mekanismi Tämän lisääntyneen riskin muutosten molekyylitasolla. Sato et ai. ovat raportoineet DNA: n metylaatio on ei-syöpä kudoksia on saatu potilailla, joilla on keuhkojen adenokarsinoomat oli precancerous vaiheissa poikkeava DNA: n metylaatio yli useita geenejä [34]. DNA: n metylaatio solumuutokset precancerous vaiheissa vahvistuu normaaleissa kudoksissa etenemisen aikana kehittyneiden keuhkojen adenokarsinooma. Joka koostui meidän havaintojen että molekyylimuutokset ei ehkä saapuvat patologiset tutkimukset, mutta DNA metylaatio muutokset ovat tapahtuneet viereisten normaaleissa kudoksissa päässä vaurioita. Siksi DNA: n metylaation muutoksia normaaleissa kudoksissa johtaa huonoon ennusteeseen kuin syövän kudoksissa. Gene metylaatiostatuksen riippumattomalla validointi kohortin suoritettiin huomattavasti korkeammat kerroinsuhde toistumisen keskuudessa tapauksessa potilaita, tyypillisesti lisääntynyt eri sivustoja metyloitua havaitsemisen, kuten kasvain, alueelliset solmut, välikarsinan solmut, ja kasvaimen ja välikarsinan solmuja. Lisätutkimukset potilaan kliinisten tietojen, kuten veren biokemiallisia tai lääkitystausta, jossa ositusta tunnistamaan riskiryhmiin CRC toistuminen, ovat tarpeen.

vahvuudet ja rajoitukset Tutkimuksemme optio keskustelua. Tässä tutkimuksessa arvioimme seurantatietoa DNA metylaatio ja syövän vaihe indikaattoreina riski CRC toistuminen mukaan kudokseen alatyyppi. Suoritimme myös arviointeja käyttämällä molekyyli- biomarkkereita ja kliiniset tiedot. Tuloksemme voisi tarjota lääkäreille kliinisen viittaus ennustetta CRC potilaiden leikkauksesta. On kuitenkin mahdollista, että pidemmän ajan seuranta voi olla suurempi eroja tässä tutkimuksessa. Kuitenkin aiemmat tutkimukset osoittivat lyhyen mediaani seurannan jälkeen kirurginen hoito keskuudessa CRC potilaita, alle 2 vuotta seurannassa jaksoja, jotka esitetään merkittäviä eroja ilmaantuvuus toistumisen [35,36]. Toiseksi, emme arvioida tulehdusreaktioita tai tulehdukseen liittyviä biomarkkereiden CRC potilailla. Kanai et ai. havaittiin, että krooninen tulehdus voi vaikuttaa ennustetta CRC potilaista [25]. Emme voineet arvioida tätä yhdistystä. Vaikka puolikvantitatiivinen MSP käytettiin tässä tutkimuksessa, kvantitatiivinen MPS kuten pyro-sekvensointi tulee tehdä jatkotutkimuksia. Lisäksi geenien ilmentyminen ei arvioida tässä tutkimuksessa, koska jäädytetty kudoksia tallennettu kasvain pankki, kokonais-RNA taso näytteessä olivat riittämättömiä kokeilu geenien ilmentymisen. Replikointi ei tehty tässä tutkimuksessa.

Yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa, että klusterointi DNA metylaatiostatuksen mukaan syövän vaiheessa ja kudos alatyyppi on kriittinen arviointi uusiutumisen riskiä CRC potilailla. Tutkimuksen tuloksista osoitti myös taustalla mekanismi lisääntynyt riski uusiutumisen CRC potilailla, erityisesti nontumorous kudoksissa.

tukeminen Information

S1 Methods. Metylaatiospesifinen PCR kunnossa.

Bisulfiittimodifiointi-käsitellyn DNA saatettiin MS-PCR: llä käyttäen alukepareja, joiden tarkoituksena on erityisesti monistamaan kohde- geenejä. Reaktioliuokseen (15 ui) sisälsi HotStart Taq Esiseos (7,5 ui) (RBC Bioscience, Taipei, Taiwan), bisulfiitti-käsitellyn DNA: n (0,6 ui), ja 0,6 ul: n eriä eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita. Aluke sekvenssejä

p16

,

hMLH1

, ja

MGMT

on kuvattu aikaisemmin. [14] Polymeraasiketjureaktio (PCR) pyöräily edellytykset metyloitu ja metyloitumaton alukkeet mukana denaturaatio 95 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 35 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, pariutuminen 62 ° C: ssa, 60 ° C: ssa, ja 53 ° C: ssa 35 sekunnin ajan ja 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 4 minuuttia. PCR-tuotteet sekoitettiin DNA-väriainetta (bioman, Taipei, Taiwan), suoritettiin horisontaalinen geelielektroforeesilla 2% agaroosigeelissä, 25 minuuttia, ja värjättiin etidiumbromidilla 10 minuutin ajan. Tulokset analysoitiin alla ultravioletti (UV)-läpivalaisulla, joka on esitetty S1 kuviossa. Tilastolliset menetelmät. Tässä tutkimuksessa potilaat saivat luokitellaan metylaatio 3 kohdegeenien. Päätulosmuuttuja toimenpiteet olivat CRC toistuminen ja kuolleisuutta. Henkilö-vuoden seurannassa käytettiin laskettaessa CRC uusiutuminen ja kuolleisuus, alkaen siitä päivästä kirurgisen resektion ja jatkuvat siihen asti diagnoosi CRC toistuminen, kuolinpäivästä tai 31. joulukuuta 2012. Kaplan- Meier-analyysi ja Coxin suhteellisen riskin malliin käytettiin analysoimaan potilaan metylaatiostatuksen ja kliininen tieto tutkimuksen alkaessa, ja niiden yhteenliittymien kanssa CRC uusiutuminen tai kuolleisuuden seurannan säätämisen jälkeen mahdollisten sekoittavien kovariantteja. Säädetty hazard ratio (t) ja 95%: n luottamusvälit (CI) laskettiin arvioida metylaatiostatuksen ennustajana riski CRC toistumisen. Mahdollinen sekoittavia muuttujia mallissa olivat sukupuoli, ikä leikkauksen (käsitellään jatkuvana muuttujana), kasvain sijainti, ja adjuvanttihoitoa. Oikaistu HRS laskettiin sitten kullekin. Liitot välinen DNA metylaatiostatuksen ja riski CRC toistumisen ja kuolleisuus arvioitiin edelleen määrityksin ryhmiteltynä perustason kliiniset syöpä vaiheessa (I-IV). Testata lineaarisen trendin poikki kliinisen syövän vaiheissa ja metylaation tilassa alatyyppejä kudoksissa, esiintyvyys CRC toistumisen kussakin luokassa käytettiin jatkuvana muuttujana monimuuttujaisen malli.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0123396 .s001

(DOCX)

S1 Kuva. Agaroosigeeli- edusti

p16

geenin promoottori metyloidut tai metyloimattomat tilan CRC potilaista.

T: kasvainkudoksen; N: normaali kudos; MR: merkkiaine viite PCR-tuotteen koko; U: unmethylation; M: metylaatio. Laadusta metylaatiospesifistä PCR, kokeellinen valvonta esittivät WBC terveistä ihmistä, ja kaksi paksu- adenokarsinooma solulinjoissa (HT29 ja DLD1). Vesi oli negatiivinen kontrolli tätä koetta.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0123396.s002

(TIF) B S1 tulokset. Tuloksemme yhdistysten eri syövän vaiheissa ja CRC toistumisen ja kuolleisuus havaittiin merkittävästi vaiheittaista lisäystä CRC toistuminen ja kuolleisuus vaiheessa I-IV potilaista (

p

0,001).

vaiheen III ja IV potilaat olivat yhteydessä huomattavasti suurempi riski CRC toistuminen verrattuna vaiheen I potilaille, joilla oikaistu h (95% luottamusväli) 19.37 (+2,59-145,05) ja 56.36 (+7,42-428,09), tässä järjestyksessä. Porras IV potilaat olivat yhteydessä huomattavasti suurempi riski kuolla verrattuna vaiheen I potilaille, joiden sovitettu HR (95% CI) 5,76 (1,99-16,61). Olemme mukana vaiheen I ja II potilaat paikallisessa vaiheessa alaryhmä, ja vaihe III ja IV potilaat pitkälle alaryhmä. Potilaat pitkälle edennyt alaryhmä liittyi suurempi riski CRC uusiutumisen ja kuolleisuus verrattuna potilaiden paikallisen vaiheessa alaryhmä, jossa on säädetty h (95% luottamusväli) 6,73 (3,56-12,71) ja 1,75 (0,94-3,28), vastaavasti.

doi: 10,1371 /journal.pone.0123396.s003

(DOCX) B