Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä ja hoidot voivat aiheuttaa kognitiivisia häiriöitä syöpäpotilailla, ja välistä syy kemoterapian ja kognitiivisen toimintahäiriöitä äskettäin validoitu eläinmalleissa. Uusi syövän hoitomuotoja kehitettäessä on tullut laajalti käytetty, ja niiden vaikutus aivotoimintaa ja elämänlaatu on tutkittava. Olemme arvioitiin vaikutusta everolimuusin, syöpälääke kohdistaminen mTOR-reitin, kognitiivisiin toimintoihin, aivojen aineenvaihduntaa, ja hippokampuksen solujen lisääntymistä /verisuonten tiheyden hiirissä. Aikuisten hiiret saivat everolimuusia vuorokaudessa 2 viikon ajan, ja käyttäytymiseen testit suoritettiin 1 viikon kuluttua viimeisestä käsittelystä. Everolimuusin käsiteltyjen hiirten näkyy selvä vähentäminen painonnousu viimeisestä päivästä hoidon aikana.

Ex vivo

analyysi osoitti muuttunut sytokromioksidaasi toiminnan valikoiva aivojen alueilla mukana energiatasapaino, ruokailu, palkita, oppiminen ja muisti modulaatio, uni /sykli sääntelyä, ja kiihottumisen. Kuten kemoterapia, everolimuusi ei muuttanut emotionaalinen reaktiivisuus, oppimisen ja muistin esityksiä, mutta toisin kuin kemoterapiaa, ei vaikuttanut käyttäytymiseen joustavuutta tai reaktiivisuus uutuuden.

In vivo

hippokampuksen hermosolujen lisääntymistä ja verisuonten tiheys oli myös ennallaan jälkeen everolimuusin hoitoja. Lopuksi kahden viikon päivittäisen everolimuusi hoidon kliinisen annostuksen ei herättää muuttamista kognitiivisen esityksiä arvioidaan hippocampal- ja etuaivokuoren riippuvia tehtäviä, jotka jatkuvat tällä yksi-neljäviikko päättymisen jälkeen hoidon päättymisestä. Kuitenkin akuutti everolimuusi hoito aiheutti valikoiva CO muutoksia muuttamatta mTOR efektori P70S6 kinaasia aivojen alueilla mukana ruokinta käyttäytymisen ja /tai uni /sykli, ainakin osittain hallinnassa on yksinäinen tuman ja parasubthalamic alueella hypotalamuksen. Siten tämä alue saattaa olla keskeinen tavoite everolimuusin-välittävä reuna-muunnokset, joka on aiemmin liittynyt oireita, kuten laihtuminen ja väsymys.

Citation: Dubois M, Le JONCOUR V Tonon MC, Anouar Y , Proust F, Morin F, et ai. (2014) arviointi vaikutus Cancer Therapy Everolimuusi Central Nervous System hiirissä. PLoS ONE 9 (12): e113533. doi: 10,1371 /journal.pone.0113533

Editor: David L. McCormick, IIT Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 24 lokakuu 2014; Julkaistu: 01 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Dubois et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat yliopisto Roue, Inserm ja Baclesse keskus avustusta saavien Novartis (Novartis) 071160-001141-05. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja on seuraavat ristiriita: Grant on baclesse Center of Caen, Ranska, Novartis (Novartis- 071160-31 001141-05) oli yleinen koulutus- avustusta ja tuettiin post-doc johtaa tutkimusta everolimuusin. Lisäksi kirjoittajat sai everolimuusi ja mikroemulsio kautta MTA Novartiksen. Pr Florence Joly on jäsenenä konsultointi tieteellinen hallituksen Novartis. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Vaikka syntymistä voimakas syöpälääkkeiden on parantunut potilaan selviytymistä, on yhä enemmän todisteita, että sekä syövän ja sen hoidot voivat aiheuttaa kognitiivisia toimintahäiriöitä, jotka vaikuttavat päivittäiseen elämänlaatuun. Potilaat saavat kemoterapiaa raportti huomiota ja keskittyminen muutoksia, visuaalinen ja sanallinen muistihäiriöitä, ja hidastaa psykomotorisen käsittely (jäljempänä ”chemofog” tai ”chemobrain”), joka voi kestää useita vuosia hoidon jälkeen valmistumisen [1]. Viime vuosina kohdistettu aineita on käytetty yhä syövän hoidossa, ja edellinen tietojen mukaan jotkut niistä voivat läpäistä veri-aivoesteen ja toimivat suoraan aivoihin, jotka vaikuttavat aivojen angiogeneesiä ja toiminta [2]. Tämän mukaisesti hypoteesin, anto Bevasitsumabin metastasoituneen kolorektaalisyövän ja sunitinibia metastasoituneen munuaissyövän johtanut useisiin raportoitu tapauksia posterior leukoenkefalopatia [3], [4]. Lisäksi selittämätön väsymys tai voimattomuus, liittyy kohdennettuja syövän hoitomuotoja, joita ei voida torjua levätä tai nukkua saattavat vakavasti vaikuttaa sekä kognitiivisiin toimintoihin ja elämänlaatua [5].

fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K ) /AKT /nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) signalointiryöpyn on keskeinen molekyylikohteena syövän hoitoon [6]. mTOR signalointi komponentit ilmentyvät korkealla tasolla useilla aivoalueilla [7], [8], ja mTOR polku tiedetään mukana erilaisissa neurobiologisia prosessit, myös neuriitin kasvua [9], Axon uudistaminen [10], myelination [11], ja solujen aineenvaihduntaan [12]. Erityisesti, mTOR: n on osoitettu olevan keskeinen säätelijä solujen kasvua ja ohjataan suuri määrä signaaleja, jotka sisältävät ravintoaineita, kuten glukoosin ja aminohappojen, ja kasvutekijät, kuten insuliinin ja IGF-1. mTOR aktivointi stimuloi myös proteiinisynteesiä ja solujen liikakasvua eri solujen ja elinten. Lisäksi, mTOR aktivointi on mukana hippokampuksen synaptisen plastisuuden ja oppimisen ja muistin prosessit

kautta

proteiinisynteesiä [13]. Esimerkiksi mTOR aktiivisuuden rapamysiinin on osoitettu estävän estävää välttäminen pitkäkestoisen muistin [14] ja heikentää auditiivinen [15], pelko [16], [17], ja paikkatietojen muistia vakauttamista [18]. Lisäksi geenivirheitä Ras /Erk /PI3K /mTOR signalointipolkujen voidaan olekaan yhteydessä useisiin ihmisen geneettisten häiriöiden luokiteltu neuro-sydän- kasvojen ihon alle ja hamartoma oireyhtymät, ja siten voi olla vastuussa kognitiiviset häiriöt [19]. Näin ollen voidaan ehdottaa, että pitkäaikainen anto mTOR-inhibiittorit esiintyy syövän hoito voisi vaikuttaa aivotoimintojen mukana kognition ja /tai aineenvaihduntaan.

Everolimuusi (Afinitor, Novartis, Basel, Sveitsi), suun kautta rapamysiinijohdannainen suoraan estää kinaasiaktiivisuutta raptor /mTOR-kompleksia (mTORC1)

kautta

sitoutumiseen FKBP-12, ja siten se muodostaa inhiboiva kompleksin mTOR [20]. Tämäntyyppinen mTOR-estäjä on hyvin ominaista antineoplastisia ominaisuuksia,

eli

asiakkuutta lasku kasvainsolujen kasvua, lisääntymistä, ja angiogeneesin

in vitro

ja

in vivo

[ ,,,0],21] – [23]. Kuitenkin yleiset sivuvaikutukset kuten väsymys, turvotus, voimattomuus, kuume, limakalvotulehdus, ruokahaluttomuus, painon lasku ja kipua on raportoitu [24] – [27]. Tarkemmin, keskushermosto (CNS) haittavaikutuksia, kuten päänsärky /migreeni tai makuhäiriö, on myös kuvattu [26].

Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida mahdollisia kognitiiviseen toimintakykyyn-vajaatoimintaa todennäköisesti aiheuttama kohdennetut hoitomuotojen kuten everolimuusin käyttämällä validoitua hiiren käyttäytymismalli [28]. Olemme erityisen saaneet huomiota käytetty annos ollakseen niin paljon kuin mahdollista syöpäpotilaan hoidossa olosuhteissa. Todellakin, perustuen farmakokineettiseen /dynaaminen tutkimuksia [29] – [31] eniten mukautettu ja ilmoitettu annos kehittyneen hormonireseptoripositiivinen-positiivisia, HER2-negatiivinen rintasyöpä, kehittyneet neuroendo- kasvaimia haiman alkuperää, pitkälle edennyttä munuaissyöpää, munuaisten angiomyolipoma kanssa tuberous skleroosi kompleksi (TSC) on 10 mg /päivässä, mutta jos myrkyllisyyttä, suositeltu annos on 5 mg /päivässä. Myös useat tutkimukset tehtiin eläinmalleissa tämän 5 mg /vuorokaudessa [22], [32], [33] ja tutkimukset osoittivat, että tämä everolimuusin annos on suun kautta hiirillä ja että vakaan tilan saavutetaan kahden viikon annostelujakson [22]. Tämä 5 mg /kg /vrk aikataulu näyttää olevan vähäinen pitoisuus maksimaalisen tehokkaan annoksen ilman näkyvää toksisuutta.

Mahdollinen pitkäkestoisia vaikutuksia everolimuusin hoito hiirillä kognitioon ja neurobiologisia prosesseja arvioitiin käyttämällä hippocampal- ja otsalohkon riippuvaisen käyttäytymisen tehtäviä ja hippokampuksen solujen lisääntymistä, tai verisuonten kapealla tiheys vastaavasti. Sen akuutti vaikutus hermosolujen aktiivisuutta tutkittiin

ex vivo

arvioinnin alueellisten aivojen sytokromioksidaasi toimintaa.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet ja etiikkaa lausunnot

Mies C57BL /6J Rj hiiriä (Janvier, Le Genest Saint Isle, Ranska) 7 viikkoa ikäisiä oli pidetty kontrolloiduissa vakio ympäristöolosuhteissa: 22 ± 1 ° C; 5 eläintä per häkki; 12 tuntia /12 tuntia valoisa /pimeä sykli (valoa: 00:00); vettä ja ruokaa saatavilla

halun

. Aikana 2 viikon sopeutumisajan, eläimiä käsiteltiin päivittäin painon seurantaan. Hoito hallinto alkoi, kun hiiret oli 9 viikon iässä. Hiiret punnittiin päivittäin päivästä ensimmäinen käsittely nieleminen on 36. päivä viimeisen annon jälkeen. Eläinten painon ennen 1. injektio (D0) käytettiin perustana arvon laskemiseksi painonnousu koko kokeen ajan. Kaikki menettelyt suoritettiin mukaisesti Ranskan eettisen lautakunnan sekä suuntaviivat Euroopan parlamentin direktiivin 2010/63 /EU ja neuvosto varten käytettävien eläinten suojelua tieteellisiin tarkoituksiin. Hanke hyväksynyt ”Comité d’Ethique Normandie en Matière d’kokeiluja Animale” CENOMEXA National komitean koe-ja sai seuraavan numeron N /11.12.12 /35 /11-17. Eläinten käsittelyt suoritettiin valvonnassa valtuutetun tutkijan (H. Castel; lupaa ei. 76.98 alkaen Ministère de l’Alimentation, de l’Agriculture et de la Pêche).

Lääkkeen anto

Mikroemulsiokopolymeeri everolimuusin muotoiltu 2% (w /v), edellyttäen Novartis (Rueil-Malmaison, Ranska), liuotettiin 0,9% NaCl ja annettiin päivittäin suun kautta letkulla (5 ml /kg)

kautta

ruokintaneulan (Fine Science Tools, Heidelberg, Saksa) 5 mg /kg 14 peräkkäisenä päivänä [34].

sytokromioksidaasientsyymiin toimintaa ja aivojen aineenvaihduntaa

Hiiret, jotka saivat ajoneuvo (

n

= 8) tai everolimuusille (

n

= 9) 2 viikon ajan otettiin heti eutanasia viimeisen päivän jälkeen hoidon tutkia sytokromioksidaasi toimintaa eri aivojen alueilla. Hiiret nukutettiin käyttäen isofluoraanilla, katkaistiin kaula ja niiden aivot poistettiin nopeasti 24 tuntia viimeisen hoitopäivän, pakastettiin 2-metyylibutaania (Sigma-Aldrich, San-Quentin Fallavier, Ranska) -30 ° C: ssa ja säilytettiin -80 ° C käyttöön asti. Kryostaattileikkeitä, kukin 30 um, leikattiin bregmasta 3,20 mm -6,48 mm, ja säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes käsittely. Kullekin eläimelle 8 erissä 41 peräkkäisen viipaleita otettiin, kuten yhden dian 2 osat erotettiin 240 um.

Kaikki Aivoviipaleiden yhden erän eläintä kohti käsiteltiin samanaikaisesti samoissa olosuhteissa. Protokolla oli mukautettu aiemmista julkaisuista [35], [36]. Leikkeitä inkuboitiin pimeässä (37 ° C, 50 minuuttia) 0,1 M fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), joka sisälsi 120 mg hevosen sydämen sytokromi c:, 24 g sakkaroosia, 300 mg DAB-4-HCI: ää, ja 108 mg katalaasia ( Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Ranska) per 540 ml. Viipaleet pestiin (5 min) kylmällä puskurilla (10% sakkaroosia PBS: ssä), upotettiin 30 minuutiksi 10%: formaliinilla /puskuriliuosta, ja pestiin kahdesti (5 min) puskurissa ennen kuivumista. Sitten leikkeitä kansi-liukastui kanssa Eukitt (VWR International, Strasbourg, Ranska) ja mikroskooppisesti.

tuote histokemiallista reaktion (hapettunut DAB) näkyi optisella mikroskoopilla. Kussakin kiinnostava alue, sen värjäyksen intensiteetti mitattiin densitometrisellä analyysin avulla tietokoneavusteisen kuva-analyysin työasema (SAMBA Technologies, Meylan, Ranska) [37]. Kullekin alueelle tutkittu, vähintään 2 viipaletta eläintä kohti käytettiin, riippuen anteroposterior alueen pituus, tehdyillä mittauksilla kahdenvälisesti, mikäli mahdollista. Taustalla vähennettiin kunkin kuvan. Eri aivojen alueet tunnistettiin avulla Franklin ja Paxinos [38] hiiren aivoissa atlas.

Behavioral testaus

Kaikkiaan 14 hiiret saivat everolimuusia hoitoa ja 12 hiiret saivat liuotinliuoksiin (ajoneuvon ryhmä) 2 viikon ajan. Behavioral testaus aloitettiin 7 päivää viimeisen hoidon hallintoa ja kesti 23 päivää (Kuva. S3A). Kaikki kokeet suoritettiin välillä 13:00 ja 18:00, aikana alku eläinten aktiivinen vaihe.

kognitiiviset toiminnot arvioitiin käyttäen Morrisin vesilabyrintti, jossa hiiret vaaditaan paeta vesiallas löytämällä alustan sijoitetaan pooliin [39]. Sylinterimäinen säiliö (halkaisija 93 cm, korkeus 45 cm) täytettiin vedellä (pidettiin 23 ± 1 ° C) korkeus 40 cm, tehty peittävä valkoinen, inertti, vesipitoinen akryyli- emulsio (Accusol OP 301, näkökulma, Ranska ). Säiliö pantiin valaistu huoneessa (50 luksia keskeinen altaan pinnalla) extra-sokkelo vihjeet seinillä. Vesilabyrintti jaettiin neljään virtuaalinen neljänneksissä: luoteeseen (NW), Koillis-, kaakkoon, ja lounaaseen, ja eläinten käyttäytymismallia video seurata. Päivänä 1, eläimet perehdytetään allas ja motivaatiota ja visuo-moottori kykyjä arvioidaan. Paeta alusta (halkaisija 9,7 cm) sijoitettiin säiliöön keskellä kehittyvien 1 cm veden pinnan ja jossa on pieni musta pallo kiinnitetty sen helpottamiseksi sen katselu on osa kotieläimistä. Hiiret asetettiin alusta 20 sekuntia. Välittömästi tämän jälkeen, 1 istunto käsittää neljä 60 sekunnin kokeiden (inter-tutkimus väli: 30 minuuttia) suoritettiin. Eläimet sijoitettiin päin seinää, 1 4 lähtösijainnit (pohjoinen, etelä, itä tai länsi) ja annettiin uimaan näkyvä alustan enintään 60 sekuntia. Hiiret eivät löydä alustan pantiin manuaalisesti sille 20 sekuntia. Päivinä 2-5, spatiaalinen oppimiskykyyn arvioitiin koulutus vaiheessa 4 päivittäin tutkimuksissa korkein 60 sekunnin, jossa nousualusta sijoitettiin NW neljänneksessä, upotettiin 1 cm vedenpinnan alapuolella. 2 tuntia viimeisen oikeudenkäynti viimeisen päivän koulutuksen aikana, koetin suoritettiin poistamalla alustan ja jättämään eläimet uida 60 sekunnin ajan vietetty aiemmin oikeassa neljänneksessä (NW) mitattuna. Spatial muisti kyvyt arvioitiin tiedonhakujärjestelmään vaiheessa päivänä 10 käyttämällä yhtä istunto 4 kokeiden samoin edellytyksin kuin Harjoitusvaiheessa. Learning plastisuus arvioitiin siirtovaiheessa yli 4 peräkkäisenä päivänä (4 kokeet /päivä, korkeintaan 60 sekuntia kukin) päivittäin muuttamalla piilotettu taso sijainti. Etäisyys ristissä ja paeta latenssin mitattiin.

aivotursomuodostelmat solujen lisääntymistä, verisuonten tiheyden ja fosforyloituu P70S6 kinaasi immunoleimaus

5-bromi-2-deoksiuridiinia (BrdU) leimattua solujen ulkopuolella subgranular vyöhykkeen hippokampuksessa (SGZ) laskettiin. Leimata aikuisten syntyvän solujen pykäläpoimuilta hippokampuksen, 6 vatsaonteloon injektioita (50 mg /kg) BrdU (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Ranska) annettiin viime päivinä Hoitojakson hiirillä ei käytösterapiaa arviointi (Fig. S3C). Seuraavana päivänä viimeisen letkuruokinnalla, ja 3 tunnin kuluttua BrdU injektion, hiiret nukutettiin käyttäen isofluoraani, katkaistiin kaula ja niiden aivot poistettiin nopeasti, jäädytettiin 2-metyylibutaani (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Ranska) -30 ° C ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Aivot leikattiin kryostaatilla sarja- koronan osiin (paksuus 20 pm) päässä etuosan selkäpuolen hippokampuksen (anteroposterior, 1,20 mm: n päähän bregman -1,44 mm). Joka 12. osassa, joista kukin on erotettu 240 um, kiinnitettiin objektilaseille päällystetty gelatiinilla-kromi aluna ja säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes käsittely.

Kuusi hippokampuksen osaa kustakin 4 eläintä ryhmää kohti värjättiin samanaikaisesti BrdU visualisointi. Aivoleikkeissä kiinnitettiin (4% paraformaldehydillä PBS: ssä, pestiin 3 x 5 minuuttia PBS: llä, pH 7,4, ja inkuboitiin (2 N HCl; 45 ° C; 45 minuuttia), DNA: n denaturoimiseksi. Sitten leikkeet pestiin (PBS, 3 x 5 minuuttia) , inkuboitiin 1 tunnin ajan esto, joka sisälsi 1:50 normaaliin aasi seerumia, 1% naudan seerumin albumiinia, ja 0,3% Triton X-100 (VWR International, Strasbourg, Ranska) PBS: ssä, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa lammas-anti -BrdU immunoglobuliini G (IgG, Abcam, Pariisi, Ranska) on 1:400 blokkausliuoksessa. Sen jälkeen leikkeet pestiin (PBS, 4 x 5 minuuttia) ja inkuboitiin (2 tuntia, huoneenlämpötila) Alexa 488-konjugoidulla aasin anti- -Lampaat IgG (Invitrogen, Boulogne-Billancourt, Ranska) klo 1:400 PBS. Huuhdeltu leikkeet kansi liukastui kanssa Mowiol. Osiot tutkittiin Nikon Eclipse E600 mikroskooppi (Nikon Instrument, Champigny-sur-Marne, Ranska) liitettynä Mercator ohjelmisto (ExploraNova, La Rochelle, Ranska). modifioitu puolueeton stereologiamenetelmää menetelmää käytettiin laskemaan BrdU-positiivisten solujen SGZ on pykäläpoimuissa ja alueen ulkopuolella SGZ [40], [41]. Lukumäärä värjättyä solujen 6 kohdissa laskettiin kahdenvälisesti, ja, kuten joka 12. jaksossa käytettiin, tämä määrä kerrottiin 12. Kaikki lukumäärät tehnyt tutkijan sokaissut hoitoryhmässä.

tutkimiseksi hippokampuksen verisuonten kapealla tiheys, aivoleikkeet kiinteä, pestiin, ja niitä inkuboitiin edellä kuvatulla tavalla. Ensisijainen vasta-aine oli kanin anti-IQGAP1 (H-109) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Tebu-bio, Le-Perray-en-Yvelines, Ranska) laimennettuna 1:400 blokkausliuoksessa, ja sekundäärinen vasta-aine oli Alexa 488 konjugoitua aasin anti-kani IgG 1:400 PBS. Osiot vastavärjättiin ydin- merkki DAPI (1 ug /ml). Immunofluoresenssikoe havaittiin alle -konfokaalimikroskoopilla ja IQGAP1-leimatun rakenteiden SGZ arvioitiin 3 osaa erotettuna 240 pm (välillä päälakipisteeseen -1,68 mm ja -2,16 mm).

Tutkiakseen aktiivisten muotojen (fosforyloituu) ja P70S6 kinaasi (p-p70S6K), aivojen osat ajoneuvon ja everolimuusin-käsitellyistä hiiristä oli vahvistettu, pestiin, ja p-p70S6K ilmentyminen mitataan primaarisen vasta-aineen anti-p-p70S6K (Abcam ab60948, Pariisi, Ranska) laimennettuna 1:200 blokkausliuoksessa, ja sekundäärinen vasta-aine oli Alexa 488-konjugoidulla aasin anti-kani-IgG 1:400 blokkausliuoksessa. P-p70S6K-leimattua rakenteet arvioitiin 2 tai 3 osaa erotettuna 240 pm (välillä päälakipisteeseen -0,98 mm ja -1,70 mm kaari, Re, Rh, submed, VM, välillä -1,22 mm ja -1,94 mm EP, Ect ja PRH; välillä -2,06 mm ja -2,54 mm PSTh) Nikon Eclipse E600 mikroskooppi (Nikon Instrument, Champigny-sur-Marne, Ranska) rajapinta kuvankäsittelyohjelma NIS-elementit.

Culture of hermo kantasolujen ja endoteelisolujen

hermostoputken kantasolujen (NSC) kulttuuri, aivot C57BL /6J Rj vastasyntyneet hiiret pestiin trypsiini. Solususpensio sentrifugoitiin nopeudella 100 G: ssa 4 minuutin ajan, ja solut laitettiin tuoretta seerumia. Tämä väliaine koostui Neurobasal (100 ml, Gibco, Saint-Aubin, Ranska) täydennettynä 5 mM HEPES-puskuri (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Ranska), 1 ml B27 ja 1 ml N2 kasvun täydennysosa (Gibco), 20 ui epidermaalinen kasvutekijä (20 ng /ml; Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, Ranska), 10 ui emäksinen fibroblastikasvutekijä (10 ng /ml; Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, Ranska), ja 7,32 ui hepariinia (Sigma- Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Ranska) ja lisättiin 33 mM glukoosia. Solut maljattiin tiheydellä 100 elävää solua per mikrolitra tässä alustassa ja kasvatettiin 25 cm

2 pulloissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2-95% ilman kostutetussa inkubaattorissa. Päivänä 7, hyvin kehittynyt neuropallojen kerättiin ja hajotettiin trypsiinillä 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Toissijainen neuropallojen (P

1) ja myöhemmin kohtia kertyi mekaaniset ja entsymaattisen dissosiaatio ensisijainen neuropalloja. Sitten soluja inkuboitiin ilman tai läsnäollessa ajoneuvon tai everolimuusin 24 tunnista 48 tuntiin. Käyttämällä 4 × tavoite Nikon (Nikon Eclipse TS100, Kingston, Englanti) käännettyä mikroskooppia, mittasimme keskimääräinen halkaisija 20 satunnaisesti valitun neuropallojen kuoppaa kohti ( 40 pm halkaisijaltaan) näkökentässä 4 eri alueilla 3 kuoppiin 24-kuoppaisille viljelylevyille.

endoteelisolujen soluviljelmässä, käytimme polyoomavirus keskikokoinen kasvaimen antigeeni (mT) transformoituja hiiren aivoissa kapillaarisen endoteelisolun linja (bEND.3, saatu tri D. Gorecki , Portsmouth yliopisto, Englanti). Soluja viljeltiin runsaasti glukoosia (4,5 g /l) sisältävä Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, johon oli lisätty 1,5 g /l natriumbikarbonaattia, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C ° C 5% CO

2. Määrittämään solujen eloonjäämistä ja proliferaatiota, solut maljattiin kolmena rinnakkaisena useita sarjaa 12-kuoppaisille viljelylevyille. Inkubointi ± ajoneuvo /everolimuusille 24-48 tuntia oli FBS-alustassa. Solujen lisääntyminen kvantifioitiin elektronisesti laskemalla solujen määrä (Z2, Beckman Coulter, Villepinte, Ranska).

Tilastollinen

painonnousun ja paikkatietojen oppiminen esityksiä analysoitiin 3-tapoja ANOVA toistaen mittaukset seuraa pienin merkitsevä ero (LSD) Jälkikäteisanalyysi kun ne olivat tarpeen. Anturin testi Morrisin vesilabyrintti, aika neljänneksessä, jossa alustan sijaitsi verrattiin ennustettu sattumalta avulla χ

2 testiä. Muut käyttäytymiseen tiedot immunohistokemiallinen ja sytokromioksidaasiposi- toimintotiedot analysoitiin Student

t

testejä. Nämä tiedot analysoitiin Statistica- © 5.1. Tiedot hippokampuksen solujen lisääntymisen ja datan kulttuurin tutkimuksissa analysoitiin nonparametric Mann-Whitneyn U-testi ja ANOVA Kruskal-Wallisin seurasi Dunnin testit GraphPad Prism 5. kaikki tilastolliset testit, kynnys merkitys asetettiin

p

≤.05.

tulokset

Everolimuusi aiheuttama painonnousu muutoksiin

ensin arvioitiin seuraukset krooninen mTOR estoa painokiloa hiirillä. Kun everolimuusia (5 mg /kg) päivittäin nuorille hiirille letkulla aikana 2 viikon ilman näkyvää sairastuvuutta ja /tai kuolleisuutta. Kun taas kontrolli (emulsio) ryhmä jatkoi lihoa aikana kokeen, everolimuusi hoidetuissa hiirissä oli pienempi paino (käsittely x päivä vuorovaikutus: F

23552 = 8,29,

p

. 001) alkaen 17rd päivänä käyttöönoton mTOR-estäjä, ja jatkoi painavat vähemmän koko seuraavan koejakson (LSD jälkikäteen

p

0,01, Fig. 1).

Kehon paino ajoneuvo- ja everolimuusin käsitellyillä hiirillä arvioitiin pitkällä aikavälillä päätyttyä hoidon aikana (harmaa palkki). Hiiret saivat ajoneuvo tai everolimuusin kerran päivässä 14 perättäistä päivää. Pylväät edustavat keskivirhe keskiarvon. ANOVA, hoito x Päivä vuorovaikutus

p

0,001 seurasi LSD jälkikäteen: **

p

0,01, ***

p

. 001.

Lyhyen aikavälin vaikutus everolimuusin on aivojen sytokromioksidaasientsyymiin aktiivisuutta ja P70S6 kinaasin phosphotylated muodossa

jotta voitaisiin arvioida vaikutusta mTOR-estäjä on aivojen solujen aineenvaihduntaa, histokemiallista analyysi paljastaa sytokromioksidaasi- toiminta on suoritettu aivojen viipaleita ohjaus ja käsiteltyjen hiirten (taulukko 1). In everolimuusi käsitellyissä hiirissä 4 päivän kuluttua hoidon aikana merkittävä lasku (

p

0,05) on sytokromioksidaasi aktiivisuus oli läsnä kuoren osassa accumbensissa tuman (t

13 = 2,52), The prelimbic cortex (t

15 = 2,20), sivuttainen preoptinen ala (t

14 = 2,33) ja moottorin kolmoishermon nucleus (t

13 = 2,38). Lisäksi everolimuusi hoito lisännyt aineenvaihdunnan aktiivisuus ectorhinal cortex (t

14 = -2,61), The entopeduncular nucleus (t

13 = -2,27), The parasubthalamic ydin hypotalamuksen (t

14 = -2,91), yksinäinen nucleus (t

13 = -2,49) ja thalamic reuniens (t

14 = -2,48), vinoneliösilmäisellä (t

14 = -2,31), submedius (t

14 = -2,30) ja ventromediaalisessa (t

14 = -2,56) ytimet (kaikki

p

0,05) (Fig. 2A ja taulukko 1). Tutkiakseen mahdollisia suoria tai epäsuoria mTOR näillä aivojen alueilla, aktiivisuus alavirtavaikuttajainhibiittorit on mTOR reitin arvioitiin immuno- tasoja fosfo-P70S6 kinaasi (p-p70S6K) eri aivoalueilla näytteille tai ei CO aineenvaihdunnan muutoksia. Hoito ei merkittävästi muuta p70S6K-positiivisten merkintöjen on ectorhinal cortex entopeduncular tuma, reuniens, vinoneliösilmäisellä, ventromediaalisessa ja submedial talamuksen ytimet ja parasubthalamic tumassa näytteille muutettu CO toimintaa, sekä perirhinal cortex ja kaareva hypotalamuksen nucleus osoittaa mitään muutoksia CO toimintaa (Fig. 2B ja C).

(a) CO aktiivisuus valikoiva ajoneuvo- ja everolimuusille-käsiteltyjen hiirten aivojen alueilla. (B) Kuvat ovat fosfo-p70S6K (p-p70S6K) immunoleimaus aivokuoressa, entopeduncular tuma, talamuksen ja hypotalamuksen ajoneuvon tai everolimuusin käsitellyissä hiirissä. (C) keskimääräinen prosenttia P-p70S6K-leimattua pinta (normalisoitu ajoneuvo) (+ SEM) eri aivoalueilla. Arc: kaareutuva ydin; ECT: ectorhinal aivokuori; EP: entopeduncular ydin; PRH: perirhinal aivokuori; PSTh: parasubthalamic ytimen; Re: reuniens thalamic ydin; Rh: vinoneliösilmäisellä thalamic ydin; Submed: submedial thalamic ytimen; VM: ventromediaalisessa thalamic nuleus.

Ei emotionaalista ja kognitiivista muutos jälkeen everolimuusille hoidon

emotionaalinen käyttäytyminen.

Seitsemän päivää päättymisen jälkeen hoitojakson prosenttiosuus avoimen varren merkinnät koholla pluslabyrintti (katso materiaalit ja menetelmät S1) ei ollut merkitsevää eroa näiden 2 hoitoryhmissä, mikä viittaa siihen, että everolimuusi eivät vaikuttaneet ahdistuksen käyttäytymistä (t

24 = 1,66,

p

0,05, Fig. S1A). Vuonna pakkouintitestissä, liikkumattomuus kesto ei ollut tilastollisesti erilainen ryhmien välillä, mikä osoittaa, että everolimuusi ei muuttanut masennuksen kaltaisen käyttäytymisen (t

24 = 0,65,

p

0,05, Fig. S1B ).

Spatial oppiminen ja muisti.

aikana perehdyttäminen vaiheen Morrisin vesisokkelotestissä, uinti nopeus (t

24 = -0,69,

p

0,05; ei esitetty), etäisyys ristissä (t

24 = 0,49,

p

0,05, ei esitetty) ja aika löytää syntynyt alustan (t

24 = 0,93

p

0,05, Fig. 3A) eivät muuttuneet merkittävästi käsittelyllä, mikä osoittaa, että motivaatio ja visuo-motoriikkaa ei vaikuttanut everolimuusin. Aikana hankinta vaiheessa, everolimuusi ei muuttanut paikkatietojen oppimista suorituskykyä 15 päivän kuluttua hoidon päättyessä ajan kuin paon viivästyminen (F

1,24 = 0,94,

p

0,05; Fig . 3B) ja etäisyyden ristissä (F

1,24 = 0,32,

p

0,05, Fig. 3C) eivät olleet merkittävästi erilaiset ryhmien välillä. Esitykset parani merkittävästi, kun koe toistettiin (paeta latenssi F

3,72 = 18,38,

p

0,001 ja matkan ristissä F

3,72 = 19,51,

p

0,001). Aikana koetin testiä kaikki hiiret käytetty huomattavasti enemmän aikaa aiemmin oikeassa neljänneksessä ennakoitua sattumalta (ajoneuvo: X

2

11 = 117,67,

p

0,001; Everolimuusi: X

2

13 = 231,80,

p

0,001; Fig. 3d). Aikana haku vaiheen, everolimuusi-hoidetut hiiret eivät osoittaneet paikkatietojen muistia suorituskykyä vajaatoiminta, koska niiden paon viivästyminen (t

24 = 0,49,

p

0,05, Fig. 3B) ja etäisyyden ristissä ( t

24 = 0,40,

p

0,05, Fig. 3C) ei eroa merkittävästi siitä, ajoneuvon hiirillä.

(A) motivaatio ja visuo-motoristen taitojen jälkeen ajoneuvon tai everolimuusi hoitoon (Student

t

testi,

p

0,05). (B ja C) Koulutuksen aikana ja haku (R) vaiheet, latenssi (B) ja etäisyyden ristissä (C) jälkeen ajoneuvon tai everolimuusi hoito (ANOVA, päivä vaikutus ***

p

0,001) . (D) aikana koetin testin aika eläinten molempien ryhmien neljänneksessä, jossa alustan sijaitsi harjoittelujakson aikana (χ

2, ***

p

0,001

vs

mahdollisuus). Siirron aikana vaiheessa, paeta latenssi (E), etäisyys ristissä (F), ja uima-nopeus (G) in ajoneuvo- tai everolimuusin käsitellyissä hiirissä (ANOVA, hoito vaikutus *

p

0,05, Trial vaikutus ***

p

0,001 seurasi LSD jälkikäteen

##

p

0,01). (H) aikana ensimmäinen päivä siirtovaiheessa, aika aiemmin oikea luoteeseen neljänneksessä jälkeen ajoneuvo tai everolimuusi hoitoon (Student

t

testi,

p

0,05). Tiedot ovat keskiarvoja + SEM.

Siirron aikana vaiheen Morrisin vesisokkelotestissä eläimet parani sekä poikki tutkimuksissa (paon viivästyminen: F

3,72 = 9,76,

p

0,001; etäisyys ristissä F

3,72 = 14,99,

p

0,001; kuviot. 3E ja 3F). Oppiminen plastisuus, arvioidaan päivittäin muuttaminen alustan sijainti oli hoito vaikuta; paeta latenssi ennen kuin löytää piilotettu taso oli samanlaista ryhmien välillä (F

1,24 = 3,36,

p

0,05, Fig. 3E). Etäisyys kuitenkin halkoo everolimuusille hoidetuissa hiirissä oli merkittävästi lisääntynyt verrattuna vehikkelillä hiiriin (F

1,24 = 6,08,

p

0,05; Fig. 3F). ANOVA arviointi paljasti huomattavan hoito × tutkimuksessa vuorovaikutuksen kannalta uima nopeus (F

3,72 = 3,69,

p

0,05). LSD Jälkikäteisanalyysi osoitti, että everolimuusi käsiteltyjen hiirten ui nopeammin kuin ajoneuvo hiirillä aikana ensimmäisen ja kolmannen kokeet (

p

0,01; Fig. 3G). Aikana päivä 1 siirtovaiheessa, everolimuusi ei muuttanut vietetty aika neljänneksessä että oli oikein harjoittelujakson aikana (t

24 = -0,39,

p

0,05, Fig. 3H ), mikä viittaa puuttuminen käyttäytymiseen perseveraatio.

spontaania toimintaa ja tunnistamismuistia.

Everolimuusi ei muuttanut spontaani liikuntaelimistön ja pystysuora toimintaa. Matkaa ylitti ja nojaten numero eivät olleet merkittävästi eroa hoitoryhmien välillä (t

24 = 0,63,

p

0,05 ja t

24 = 0,39,

p

0,05, vastaavasti, kuviot. S1C ja S1D). Objektin hyväksynnän jälkeen, eläimet molemmissa ryhmissä havaittiin uutuus, pidemmän etsintä kestot uuden kohteen

vs of the tutut (ajoneuvo: t

11 = -2,90,

p

0,05; everolimuusille: t

13 = -4,51,

p

0,001; Kuva. S1E). Kuten on esitetty kuviossa. Mittakaava, 100 pm. Kuva. Mittakaava, 100 pm.