Krooninen sairaus

tiivistelmä

GAGE ​​proteiinit ovat hyvin samankaltaisia, kädellisen molekyylejä ainutlaatuinen kantavan rakenteen ja määrittelemätön solujen rooleja. Ne rajoittuvat soluihin sukusolujen aikuisten terveillä henkilöillä, mutta ilmentyy laajasti erilaisia ​​syöpiä. Hiivan kaksoishybridiseulonnassa tunnistimme metazoan transkription säädin, Sukusolujen-vähemmän (GCL), koska vuorovaikutus kumppanina GAGE12I. GCL suoraan sitoo LEM-domain proteiineja (LAP2β, emerin, Man1) klo ydin- kirjekuoren, ja huomasimme, että GAGE ​​proteiinit rekrytoitiin ydinaseiden kirjekuoren sisemmän kalvon GCL. Perustuen hiivan kahden hybridin analyysi ja avattavan kokeilut GCL polypeptidien, GCL tähteitä 209-320 (joka sisältää BACK domain) pääteltiin riittää yhdessä GAGE ​​proteiineja. GAGE mRNA: iden ja GCL mRNA osoitettiin ihmisen kiveksissä ja useimpien syöpien, ja proteiinitasolla GAGE ​​jäseniä ja GCL olivat koekspressoidusta syöpäsolulinjoissa. Rakenteelliset tutkimukset GAGE ​​proteiinien havaittu mitään erillisiä toisen tai kolmannen rakenne, ikään kuin he ovat luonnostaan ​​huonokuntoinen. Mielenkiintoista GAGE ​​proteiinit muodostivat stabiileja komplekseja dsDNA

in vitro

fysiologisessa pitoisuuksina, ja GAGE12I sidottu useita eri dsDNA fragmentteja, mikä viittaa sekvenssi-spesifisen sitoutumisen. Dual yhdistys GAGE ​​perheenjäsenten kanssa GCL on ydin- kirjekuori sisäkalvon soluissa, ja dsDNA

in vitro

, sekaantumaan GAGE ​​proteiinit chromatin sääntelyn sukusolujen ja syöpäsoluja.

Citation: Gjerstorff MF, Rösner HI, Pedersen CB, Greve KBV, Schmidt S, Wilson KL, et al. (2012) GAGE ​​Cancer-Ituradan Antigeenit rekrytoidaan Nuclear kirjekuori by sukusolujen-Less (GCL). PLoS ONE 7 (9): e45819. doi: 10,1371 /journal.pone.0045819

Editor: Eugene A. Permyakov, Venäjän tiedeakatemia, Institute for Biological instrumentointi, Venäjä

vastaanotettu: 13 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 22 elokuu 2012; Julkaistu: 20 syyskuu 2012

Copyright: © Gjerstorff et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Tanskan Research Council, Tanskan Cancer Society, National Institutes of Health (RO1 GM48646), Tanskan Cancer Research Foundation, Lundbeck Foundation, LeoPharma Research Foundation, ja Hørslev Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

GAGE ​​perheen erittäin samanlaisia, pieni oligomeerinen proteiineja ilmennetään lokukseen, joka sisältää 13-39 kopiota lähes identtinen geenien X-kromosomin [1], [2]. GAGE geenit ovat läsnä vain korkeampi kädellisten ja ovat läpikäyneet laajentunut nopeasti mahdollisesti vahvan positiivisen valinnan [3]. Terveillä henkilöillä gage lauseke rajoittuu sukusoluissa [4], mutta transkriptio GAGE ​​geenien aktivoidaan kohdistamalla epigeneettiset säätelyhäiriötä syöpäsoluissa [5]. GAGE ilmennetään monenlaisia ​​syöpiä, ja niiden ilmentyminen korreloi huonon ennusteen mahasyöpä, ruokatorven syöpä ja neuroblastooma, osoittaa rooli tuumorigeneesissä [6]. GAGE proteiinien tiedetään kasvavan solujen vastustuskyvyn eri sytostaattien suoraan liittämällä ja määrään vaikuttava, apoptoottisten sääntelyviranomaisten IRF1 ja NPM1 [7], [8], mutta vähän tiedetään niiden molekyyli- tai solutoiminnoille.

Kirjoittajat raportoivat, että GAGE ​​proteiinit vuorovaikutuksessa GCL, joka on metazoan proteiini tärkeä ydinvoiman kirjekuori eheyden ja sukusolujen kehitystä

Drosophila

ja hiirillä [9], [10]. Molemmilla lajeilla GCL paikallistaa sisempi tumakalvoa, ja useat tekijät osoittavat, että GCL estää transkriptio: GCL tarvitaan hiljaisuus transkription

Drosophila

sukusoluista [11], ja nisäkässoluissa, GCL sitoo heterodimeeristä transkriptiotekijän DP ja estää siten DP-E2F-riippuvaisen geenejä, joita tarvitaan tuloa S-vaiheeseen. GCL myös suoraan sitoo vähintään kolme LEM-domain proteiineja (emerin, Man1 ja LAP2β [12] – [14]), joka sijaitsee ydinaseiden sisäkalvon, ja näyttäisi edellyttävän LEM-verkkotunnuksen proteiinit toisena repressorit

in vivo

[13], [15]. LEM-verkkotunnuksen proteiinit sitoutuvat lamins (ydin- väli säikeitä) ja ovat keskeinen ydin ”lamina” rakenne.

ydinaseiden ”lamina” komponentti nucleoskeleton koostuu verkkojen ydin- väli säikeitä muodostama A-tyypin tai B-tyypin lamins [16] yhdessä este-to-autointegration kerroin (BAF) [17], [18] ja LEM-verkkotunnuksen proteiinit kuten emerin [19], [20]. Lamins vuorovaikutuksessa kromatiinin ja erilaisia ​​rakenteellisia, sääntely- ja signalointi proteiineja tumassa [21], ja vaikutus ydin- rakenne ja monia polkuja kuten kehitys, erilaistuminen, soluproliferaatiota ja apoptoosin [22], [23]. Kokoonpanon muutokset tai eheyttä nucleoskeleton voitaisiin edistää, mekanismeilla, jotka jäävät huonosti, jotta pahanlaatuisiksi tai syövän etenemistä [24]. Esimerkiksi A /T-rich-DNA-sitovan proteiinin SATB1 normaalisti muodostaa erikoistunut chromatin-hiljentäminen nucleoskeletal tarakenteelle tymosyyteissä; rintasyöpäsoluissa korkea SATB1 ilmentyminen osoittavat selvästi misregulated geenin ilmentymistä [25], [26]. Solut, jotka yli-ilmentävät GCL on viallinen ydin- rakenne, syytetään GCL rakenteellisena komponenttina tuman [9], [10].

Raportoimme GAGE ​​proteiineja rekrytoidaan tumalevy kautta GCL soluissa, ja sitovat dsDNA

in vitro

. Nämä tulokset viittaavat siihen, että GAGE ​​proteiinit saattavat myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn mekanismilla, johon liittyy GCL ja chromatin, ja mahdollisesti myös tumalevy organisaatio.

Tulokset

GAGE ​​proteiinit vuorovaikutuksessa Transkription Regulator sukusolujen-vähemmän (GCL) B

Ymmärtääksemme paremmin solun toimintoja GAGE ​​proteiineja, käytimme hiivan kaksoishybridiseulonnassa tunnistaa mahdollisia kumppaneita. TetR-pohjainen seulonta kiveksen cDNA-kirjaston avulla täyspitkää GAGE12I syöttinä tuotti tuloksena yhden kloonin (D2) näytteille kasvu uraa- keskipitkän ja sininen väri X-Gal väliaineessa, mikä osoittaa vuorovaikutuksen syötti ja saalis (Fig. 1A). Saalista plasmidi D2 sisälsi avoimen lukukehyksen, joka koodaa tähteitä 84-320 ihmisen sukusolujen-vähemmän homologin 1 (GCL, alias GMCL1; NM178439.3). GCL yhdessä GAGE12I oli riippumattomasti varmistettiin Luciferase-pohjainen (luminesenssi-pohjainen nisäkkäiden interactome kartoitus; ”Lumier” [27]) pull-down määrityksissä. Luciferase-merkitty GCL ja proteiini A-merkitty GAGE12I (tai vastavuoroista contructs) ilmennettiin tilapäisesti HEK293-soluissa. Sitten eristetty proteiini A fuusiot käyttämällä IgG-päällystettyjä helmiä ja mitataan lusiferaasin aktiivisuuden (Fig. 1 B). Normalisoitu lusiferaasi signaaleja (sidottu /tulo) muunnettiin Z tulokset, jotka edustavat useita standardipoikkeamat keskiarvosta suuri joukko itsenäisesti johdettu, ei-vuorovaikutuksessa Lumier proteiinia paria [27]. GAGE12I-GCL paria näytteille Z tulokset on välillä 3,4-5,3 (Fig. 1 B), mikä osoittaa selvästi vuorovaikutusta näiden proteiinien. Tässä määrityksessä GCL liittyy myös GAGE2B (Z tulokset: 1,8-5,3; Fig. 1 B), joka edustaa GAGE2-tyyppi (GAGE2A-E) perhe, jotka kaikki puuttuu tyrosiini asemassa 11 voidaan fosforyloida muita GAGE proteiinit [28]. Tämä viittasi GCL osakkuus suoraan tai välillisesti kaikkien tunnettu jäsenten GAGE ​​perheen. Koska hiivan kahden hybridin analyysi ja avattavan määritykset ovat molemmat monimutkaisia ​​järjestelmiä, testasimme myös mahdollisia suoran sitoutumisen välillä GAGE ​​proteiinien ja GCL käyttämällä yhdistelmä His-merkitty GAGE12I tuotettu hiiva ja kaupallisesti saatavilla bakteereissa ilmaistu GCL-GST-fuusioproteiinia (Fig. 1 C). Kuitenkin, suora sitoutuminen GAGE12I ja GCL ei havaittu näissä olosuhteissa. Me spekuloida, että suora sitoutumisen GAGE ​​ja GCL voisi: (a) vaativat kofaktorina tai posttranslationaalinen muutos ei säädetty aikana bakteeriekspressiovektoreilla; (B) on steerisesti hankaloittaa His-tag GAGE12I tai GST-tag GCL. Vaihtoehtoisesti GAGE ​​ja GCL mahdollisesti yhdistää epäsuorasti.

. GAGE12I käytettiin syöttinä hiivan kahden hybridin näyttö on kiveksen cDNA-kirjastosta. Plasmideja, jotka koodaavat putatiivisia saaliit tunnistettu ensiölajittimen pelastettiin ja retransformed osaksi EGY42 syötti GAGE12I vektorin (B) tai kontrollivektori (C). Klooni D2 näytteillä kasvua uraa- keskipitkän ja sininen väri X-Gal väliaineessa, mikä osoittaa vuorovaikutuksen syötti ja saalista. Koodattu saalista polypeptidi D2 käsitti ihmisen GCL tähteet 84-320, johon kuuluu ehdotettu BTB /POZ ja BACK verkkotunnuksia. B. vuorovaikutus GCL ja GAGE12I varmistettiin Lumier pull-alamäkiä HEK293-solut ko-transfektoitiin proteiini A-fuusioitunut GAGE ​​ja Luciferase-fuusioitunut GCL. Normalisoitu lusiferaasi signaaleja (sidottu /input) esitetään Z tulokset edustava määrä standardipoikkeamat keskiarvosta suuri joukko itsenäisesti johdettu, ei-vuorovaikutuksessa Lumier proteiinia paria (katso materiaalit ja menetelmät lisätietoja). C. Avattava määrityksessä yhdistelmä-His-merkitty GAGE12I ja GST-GCL.

kaksoishybridiseulonnassa nimenomaan talteen GCL tähteitä 84-320, joka sisältää ennustetun BTB /POZ ja BACK verkkotunnuksia (tähteet 109-200 ja 214-282, vastaavasti). Muissa proteiineja, BTB /POZ verkkotunnuksia osallisina DNA: han sitoutumisen tai aktiini [29], [30], kun taas BACK-alueet ovat pääosin alfahelikaalisen mutta eivät ole yleisesti johtuvan toiminto [31]. Sen määrittämiseksi, mitkä GCL domeenit olivat riittäviä GAGE12I yhdistys, olemme toistaneet Lumier määrityksen proteiini A-merkitty GAGE12I ja Luciferase-merkittyjä GCL-fragmentit on esitetty kuviossa 2. Näistä kokeista, meidän päätellä GCL tähteet 209-320 olivat molempia tarvitaan ja riittävä yhdistää GAGE12I soluissa. Tämä alue sisältyy BACK domain (tähteet 214-282) plus 38 viereisen tähteet (tähteet 283-320). Meidän Jpred 3 (University of Dundee, Skotlanti, Iso-Britannia) analyysi ennusti, että GCL jäämät 209-320 on useita kierteiset kuviot ja satunnainen kela segmenteissä (Fig. S1). Erityisesti GCL tähteet 232-285 ovat välttämättömiä sitoa DP alayksikköä heterodimeerinen transkriptiotekijä E2F-DP [29]. Tämä on mielenkiintoista, koska E2F-DP-riippuvaisen geenit edistävät proliferaatiota (tuloa S-vaihe) ja ovat merkittäviä tavoitteita tukahduttamisen tuumorisuppressorigeenin retinoblastooma (pRb), joka sitoo E2F alayksikköä [32] – [34]. GCL tähteet 232-285, jotka ovat välttämättömiä sitoa DP, sisältyvät päätelty GAGE-yhdistyksen alueella (GCL tähteet 209-320) (Fig. 2 ja Fig. S1). Tämä päällekkäisyys ehdotettu ainakin kaksi skenaariota. Ensimmäinen, GAGE ​​ja DP voi kilpailla sitoutumisesta GCL, ja toinen, GAGE-proteiinit saattavat vaikuttaa E2F-DP-riippuvaista geenin ilmentymistä.

sitoutuminen eri GCL deleetiomutanttien on GAGE12I testattiin Lumier määrityksellä (kuten kuva 1). Alueella päätelty olennaisina GAGE ​​sitovia (GCL tähteet 209-320) sisältää tähteitä 232-285, jotka ovat riittäviä sitomaan transkriptioaktivaattorina DP (*) [29].

GAGE ​​ja GCL ovat Co -expressed kiveksissä ja Syövät

GAGE ​​perheenjäsenet ilmaistaan ​​havaittavasti vain ituradan soluissa ja lyhyesti erityisissä solutyypeissä aikana kädellisten sikiön kehitykseen (eli solujen varhaisen Ektodermi stroomasolut sukupuolesta johto ja sikiön lisämunuaiskuoren solut), määritettynä immunohistokemiallisella [4], [35] ja RT-PCR-analyysillä (Kuva. 3A) käyttäen vasta-aineita ja PCR-alukkeita odotetaan tunnistamaan kaikki tunnetut jäsenet GAGE ​​perheen. Kuitenkin GAGE ​​ilmennetään 10-40% on monenlaisia ​​ihmisen syövissä [4]. GCL mRNA havaitaan kaikkialle in Drosophila ja hiiren solujen [10], [36] – [38], mutta sen ilmentyminen normaaleissa ja pahanlaatuiset ihmisen soluja ei ollut systemaattisesti tutkittu. Voit selvittää ihmisen kudokset saattavat ilmaista sekä GAGE ​​ja GCL, käytimme kvantitatiivinen RT-PCR mitata GAGE ​​ja GCL mRNA tasoilla 48 eri kudoksissa (Fig. 3A ja 3B, vastaavasti). GAGE mRNA havaittiin matalalla tasolla epididymous ja perna, joilla on korkea kiveksissä (Fig. 3A), kuten odotettua. Yhdenmukainen hiiri ja Drosophila, GCL mRNA havaittiin kaikissa paitsi yhdessä normaalin ihmisen kudosta testattu; korkeimmat tasot havaittiin aivolisäkkeen, ja poikkeus oli lihaksen, jossa GCL mRNA: ta ei havaittu (kuvio. 3B). Koska GCL on erityisesti ilmaistu, ja tarvitaan Drosophila ja hiiren sukusolujen, spekuloida, että GCL ilmentyminen ihmisen kives on todennäköisesti myös paikallistettu sukusolujen, jossa GAGE-proteiinit ovat runsaita [4]. GCL mRNA havaittiin myös kaikissa syöpätyyppien tarkasteltu, kuten rinta-, maksa-, keuhko- ja kilpirauhassyövän jotka on aiemmin osoitettiin myös ilmaista GAGE ​​proteiineja [4], ja ei ollut selvä suuntaus kohti ylä- tai down-regulation GCL mRNA ilmaisumuotoja erityisesti syöpätyypin (Fig. 3C). Me tutkimme seuraavaksi ilmentymisen GCL ja GAGE ​​proteiinien paneelin ihmisen syöpäsoluja riviä eri alkuperää käyttäen Western-blottauksella (kuvio. 4). GCL havaittiin 8 ulos 9 solulinjojen, kuten ihosyövän, rintasyöpiä, keuhkosyöpä ja alkion syöpä, ja koekpsressoitiin kanssa GAGE ​​proteiinien 6 näistä 8 solulinjoista.

A-C. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi suhteellisen ilmentymisen mRNA-molekyylien, jotka koodaavat kaikkia tunnettuja jäseniä GAGE ​​perhe (A) tai GCL (B) normaaleissa kudoksissa, paljastaa co-ekspression kiveksissä. GCL mRNA myös laajalti ilmaistu erityyppisiä ihmisen syövän (C), mukaan lukien rinta-, maksa-, keuhko- ja kilpirauhassyövän jotka on aiemmin osoitettiin myös ilmaista GAGE ​​proteiineja [4].

GCL ja GAGE proteiinin ilmentyminen tutkittiin 9 ihmisen syöpäsoluja linjat johdettu kohdunkaula (HeLa), paksusuoli (HCT116), melanooma (MZ2-MEL), rinta (BRCA-MZ01, SK-BR3, T47D, M4A4, MCF7) ja alkion syöpä (NTERA2 ) käyttäen Western blottauksella. A375-melanoomasoluja eksogeenisellä ilmaus GCL sisällytettiin positiivisena kontrollina. Vasta-aineet: GCL pAb1, Sigma Aldrich; GCL pAb2, klooni A14, Santa Cruz Biotech; GAGE mAb, klooni M3 [4], beeta-aktiini-mAb, Ab6276; Abcam.

Mahdolliset kolokalisaation GCL ja GAGE ​​proteiinien osissa normaalin ihmisen kudosten ja syövistä ei voitu tutkia puuttumisen vuoksi sopivien GCL vasta-aineita. Koska GCL mRNA on lähes poikkeuksetta ihmisen kudoksissa, voisi olettaa sama GCL proteiinia. Mutta tämä ei voi olettaa, koska GCL mRNA tukahdutettu translaatiotutkimukseen tasolla alkioiden mekanismina rajoittaa ilmaisun GCL proteiinin ituradan [39]. Tukee oletusta, että GCL proteiinin ilmentyminen rajoittuu, GCL-null hiiret fenotyypit havaittiin vain kolme solutyypeissä (maksa, haima ja kiveksissä) [10]. Vaikka GCL proteiinin ilmentyminen voidaan rajoittaa ihmisen normaaleissa kudoksissa analyysimme ihmisen syöpäsolujen linjat viittaavat siihen, että GCL proteiini ekspressoituu useiden syöpätyyppien.

Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​mahdollisia yhteyksiä ihmisten GAGE ​​ja GCL uros- sukusoluista ja erityyppisiä syöpäsoluja.

GCL Recruits GAGE ​​proteiinit Inner Nuclear kirjekuori

GCL paikallistaa hajanaisesti tumassa sekä lähellä ydinvoiman kirjekuori

Drosophila

[38] ja hiiren solujen [13], mikä vastaa sen suoran sitoutumisen

in vitro

ydinaseiden membraaniproteiineja LAP2β, emerin ja Man1 [12] – [14]. Sen määrittämiseksi, GCL vaikutti lokalisointi GAGE ​​proteiinien, me yli-ilmentynyt Myc-merkityn GCL HeLa-soluissa ja käytetty epäsuora immunofluoresenssivärjäyksen todentaa sekä ydinvoiman lokalisoinnin GCL-Myc ja sen yhteistyössä lokalisointi on endogeeninen A-tyypin lamins lähellä ydinvoiman kirjekuori (Fig. 5A). Kun yli-ilmentää itsensä HeLa-soluissa, GAGE12I lokalisoitu hajanaisesti kirkkain signaaleja tuman sisällä (kuvio. 5B), sopusoinnussa lokalisoinnin endogeenisen GAGE ​​monissa muissa solulinjoissa ja kudoksissa [4]. Myös odotetusti, yli-ilmentynyt GCL-Myc lokalisoitu sekä ydinvoiman kirjekuori (Fig. 5C) ja hajanaisesti on nucleoplasm [10], [13]. Mielenkiintoista, HeLa-soluissa, jotka ohimenevästi ilmaistaan ​​sekä GAGE ​​ja GCL-Myc, useimmat GAGE ​​proteiinit yhdessä lokalisoitu lähellä ydin- kirjekuoressa GCL-Myc, kuten esitetty GAGE12I (Fig. 5D) ja GAGE1 (Fig. 5E). Samat tulokset saatiin transfektoiduissa HCT116-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Samoin kaksi Melanoomasolulinjojen (MZ2-MEL ja SK-MEL-31), ohimenevä ilmentyminen GCL-Myc siirtynyt jakeluun endogeenisten GAGE ​​proteiinien kohti ydinaseiden kirjekuoren (Fig. 5F, G). Solmimme eksogeeninen GCL voidaan palkata eksogeenisia ja endogeenisten GAGE ​​proteiinien ydinvoiman kirjekuori.

. Immunohistokemiallinen kaksinkertainen värjäys Myc-merkityn ihmisen GCL ja endogeenisen A-tyypin lamins (lamins A /C) transfektoiduissa HeLa-soluissa; GCL yhteistyössä paikallistaa lamins A /C ydinvoima kirjekuoressa. OLLA. HeLa-soluja transfektoitiin ohimenevästi GAGE12I (B), GCL-Myc (C), tai GCL-Myc plus joko GAGE12I (D) tai GAGE1 (E). GCL paikallistaa ydin- kirjekuoren ja rekrytoidaan GAGE ​​proteiinien nucleoplasm. F-G. Melanoomasolulinjoja MZ2-MEL (F) ja SK-MEL-31 (G), jotka ilmentävät korkeita endogeenisten GAGE, transfektoitiin ilmaista GCL-Myc; Immunovärjäyksen paljasti GCL välittämää translokaatiota GAGE ​​alkaen nucleoplasm ydinalan kirjekuoren. H-K. Immunohistokemiallinen analyysi endogeenisen GAGE ​​proteiinien ihmisen normaaleissa kudoksissa ja kasvainten paljasti tiheän GAGE ​​signaaleja lähellä ydin- kirjekuoren soluissa sikiön lisämunuaiskuoren (H), vaeltavat alkuitusolut (I), rintasyöpä- solut (J) ja pahanlaatuisten melanoomasolujen (K) näytteitä. (GAGE = DAB /ruskea; Nuclei = Mayers hematoksyliinillä /sininen). Baaria, 5 um (A) ja 10 um (BK).

Vaikka yhteydestä endogeenisen GCL ja GAGE-proteiinit ihmisen soluissa ja kudoksissa ei voitu tutkia, koska ei ole GCL vasta-aineiden sopivia immunocyto – ja immunohistokemia, GAGE ​​proteiinit olisi voinut olettaa paikallistaa klo tumakalvoa syöpäsoluissa linjat osoittivat ilmaista endogeenisen GCL Western blottauksella (esim HeLa, HCT116, MZ2-MEL, Fig. 4). Kuitenkin näissä soluissa GAGE ​​proteiinit havaittiin koko ydin- osastoon. Tämä voi johtua tarvitaan korkean solun tason GCL, vain saavutettavissa yliekspressio, rekrytoida riittävästi ydin- GAGE ​​proteiinit paljastamaan sen lokalisointi on tumakalvoa. Siten GAGE ​​proteiinit voivat paikallistaa sekä tumakalvoa ja nucleoplasm soluissa normaalin GCL tasolle. Erityisesti, immunohistokemiallinen värjäys ihmisen kliinisistä näytteistä, joissa GAGE ​​vasta paljasti ei-diffuusi, tiheä GAGE ​​signaaleja, jotka näyttivät keskittyä lähellä ydin- kehän sikiön lisämunuaiskuoren solut (Fig. 5H), alkuitusolut on mesonefros (Fig. 5I), melanooma-solut (Fig. 5J) ja rintasyöpä soluja (Kuva. 5K), lisäksi perustella mainittua GAGE ​​proteiinit liittävät sisäkalvon ydin- kirjekuoren.

GAGE ​​proteiinit ovat luonnostaan ​​Disordered

Edellinen analyysi natiivin ja rekombinanttisen GAGE ​​proteiinien SDS-PAGE ja kokoekskluusiokromatografialla osoitti näennäinen massa 26 kDa, mikä oli suurempi kuin sen ennustettu ja MALDI MS-vahvistettu massa ~13 kDa [2], [4]. Tämä poikkeava muuttoliike saattaa heijastaa epätavallinen aminohappokoostumus GAGE ​​proteiineja, joilla on muutama hydrofobiset tähteet (15 117) ja monet varautuneet tähteet (36 117). Kuitenkin nämä ominaisuudet ovat tyypillisiä myös luontaisesti epäjärjestyksessä proteiinien (IDP) [40], [41]. Harkitsemaan tätä mahdollisuutta haimme kaksi eri algoritmeja proteiinien rakenteen ennustaminen, FoldIndex ja metaPrDOS, jotta GAGE12I edustaja jäsen GAGE ​​perheen. Molemmat algoritmit ennustivat suuri todennäköisyys häiriön koko proteiinia (Fig. 6A, vasen ja oikea paneeli, vastaavasti). Koska GAGE12I on 98% identtinen lähes kaikki muut tunnetut jäsenet GAGE ​​perheen [6], tämä ehdotti, että GAGE ​​proteiinit yleensä ole toissijainen rakenne. Ainoa poikkeus oli GAGE1; rakenteellisen ennustaminen GAGE1, joka on ainutlaatuinen C-terminaalinen domeeni [6], ehdotti tämä C-terminaalinen alue, on alfa-kierukka (Fig. S1).

. Toissijainen rakenne ja häiriö GAGE-12I ennustama kaksi algoritmit: FoldIndex (vasen paneeli) ja metaPrDOS (oikea paneeli). B. Far-UV-CD-spektri GAGE-12I tallennettu 195-250 nm 4,5 uM GAGE-12I 100 mM NaCl ja 50 mM natriumfosfaattia, pH 5,5 25 ° C: ssa. Pienin noin 200 nm, ja puute muiden erillisten minimit, osoittavat selvästi proteiini on pääasiassa unfolded. C. 1D

1 H-NMR-spektri 4 mg /ml GAGE-12I 100 mM NaCl, 50 mM natriumfosfaattia, pH 5,5, 0,15 mM DSS ja 10% D

2O. Hyvin alhainen hajonta NMR-signaalien, havaittavissa erityisesti alifaattiset alueella, tarjoaa selkeän sormenjäljen avatun proteiinia.

Mahdollinen häiriö GAGE12I testattiin ympyrädikroismilla (CD) ja

1H ydinmagneettisen resonanssin (NMR). Far-UV-CD-spektri kirjattu GAGE-12I osoitti vain yhden vähintään noin 200 nm (Fig. 6B). Tämä minimi, ja puuttuminen selvä negatiivinen elliptisyyttä alueella 210-225 nm (Fig. 6B), osoitti, että GAGE-12I ei ole laajennettu tyyppinen toissijainen rakenne. Vahvistava havainto, 1D

1H-NMR-spektri osoitti kapean hajonta signaaleja (Fig. 6C). Alueella spektrin, jossa on signaalit alifaattisista sivuketjuja, havaitsimme ei negatiivista kemialliset siirtymät. Kapea hajonta oli jälleen selvästi nähtävissä amidin protonisignaaleja alueella noin 7-9 ppm. Olemme päätellä GAGE12I ei ole erillistä sekundäärinen tai tertiäärinen rakenne.

GAGE ​​Proteiinit Bind dsDNA on fysiologiset pitoisuudet

GAGE ​​proteiinien paikallistamiseksi tumassa sekä normaalien solujen (eli sukusolujen ja sikiön lisämunuaiskuoren solut) ja syöpäsolujen [4]. Siksi arveltu GAGE ​​proteiinit mahdollisesti yhdistää DNA: n kanssa. Tämä hypoteesi tukivat avattavasta kokeet osoittavat, että yhdistelmä-GAGE12I (ilmaistuna hiiva ja hyvin puhdistettua) [2]), ja endogeenisten GAGE ​​proteiinien läsnä MZ2-MEL melanooma solulysaatti, pakko natiivi vasikan kateenkorvan DNA: ta (Fig. 7, A ja B tässä järjestyksessä).

A-B. Western blot avattavasta kokeissa testaamalla sitoutumisen rekombinantti GAGE12I (A) tai endogeenisten GAGE ​​proteiineja MZ2-MEL lysaatit (B) selluloosan yksin, tai selluloosa-immobilisoitu natiivi vasikan kateenkorvan dsDNA. C. elektroforeettinen liikkuvuus shift määrityksissä. Kukin osoitettu pitoisuus puhdistettua GAGE12I inkuboitiin

32P-leimattua 90 bp: n EcoRI-PvuII-DNA-fragmentti pUC19: 1 pg /ul; Sitten näytteet erotettiin agaroosigeelielektroforeesilla. D. Sama koe kuin (C), mutta lisäämällä NaCl. E. Prediction oletettujen DNA: n sitoutuminen aminohappoa GAGE12I käyttäen ohjelmaa BindN. +/- = Sitova /ole sitovia; 0-9 = luottamus sitoutumisen ennustaminen.

elektroforeettisen liikkuvuuden shift määrityksiä käytettiin analysoimaan edelleen välillä suoraa yhteyttä GAGE ​​proteiinien ja dsDNA käyttämällä eri restriktiofragmenttien plasmidista pUC10 tai pUC19 (Fig. 7C ja kuvio . S2). Pitoisuutena -10 ng /ul (730 nM), GAGE12I aiheutti osajoukko dsDNA molekyylien siirtyä hitaasti (Fig. 7C). Läsnäollessa 100 ng /ul GAGE12I (7,3 uM) yli 50% dsDNA siirtyneet hitaasti (nukleoproteiinikompleksin ”kompleksi 1) ja myös havaita vieläkin hitaammin muuttavien kompleksi (kuvio. 7C,” monimutkainen 2 ’), mikä viittaa mahdollisten oligomeroinnin. GAGE12I sidottu useita sekvenssi-eivät liity dsDNA fragmenttien, mikä viittaa siihen, DNA-sekvenssi-riippumatonta sitoutumista (tuloksia ei ole esitetty). Molemmat kompleksit olivat stabiileja 75 mM NaCl, ja pieni osa monimutkaista 1 pysynyt vakaana 250 mM NaCl (Fig. 7D).

. Pisteblotit arvioida GAGE ​​proteiinipitoisuus MZ2-MEL ja SK-MEL-31 kokosolulysaateista verrattuna rekombinanttiin GAGE12I. Blotit vasta-aineilla odotetaan tunnustaa kaikki GAGE ​​perheenjäseniä; numero alla jokainen piste osoittaa suhteellinen signaalin voimakkuus. B. suhteellinen kvantitointi GAGE ​​proteiinien ytimet ja sytoplasmaan MZ2-MEL ja SK-MEL-31-solut perustuen immunovärjäyty- intensiivisyys konfokaali kuvien mitataan ImageJ64 ohjelmistoa.

Käytimme BindN nukleiinihappo ennustus ohjelma [42] asetetaan spesifisyys 95% ennustaa mahdollisten DNA sitova jäämien GAGE12I. Tämä ohjelma tunnistaa GAGE12I tähteet 4-17 otaksutuksi DNA: ta sitovan domeenin (Kuva. 7E), mutta tämä on vielä varmistettava kokeellisesti.

Edellä esitetyt tulokset osoittivat GAGE ​​pitoisuus on vähintään 10 ng /ul (730 nM) vaaditaan sitomaan DNA: ta pitoisuutena 1 pg /ul (17 pM), joka vastaa moolisuhdetta 43:1 (GAGE12I: DNA). Sen määrittämiseksi, onko nämä GAGE ​​pitoisuudet olivat fysiologisesti merkityksellisiä, mittasimme GAGE ​​sisällön MZ2-MEL ja SK-MEL-31 melanooma solulysaateista vastaan ​​tunnettuja määriä yhdistelmä-DNA-GAGE12I käyttäen dot blotting. MZ2-MEL ja SK-MEL-31-soluja havaittiin sisältävän 0,53 pg ja 0,29 pg GAGE ​​proteiinia solua kohden, vastaavasti (Fig. 8A). Perustuu arviolta melanooman solujen halkaisija -15 um (olettaen pallomainen muoto), pitoisuudet olivat konservatiivisesti laskettiin olevan 299 ng /ul (23 uM) in MZ2-MEL-solujen ja 164 ng /ul (12 uM) in SK- MEL-31-soluihin. Molemmissa solulinjoissa, konfokaalimikroskopia ehdotti GAGE ​​signaali oli 2-3 kertaa voimakkaampi tumassa kuin sytoplasmassa (Kuva. 8B). Olemme päätellä, että ydin- pitoisuus GAGE ​​proteiinien näissä soluissa on huomattavasti suurempi kuin (7,3 uM) vaaditaan -50% DNA: han sitoutumisen

in vitro

.

Keskustelu

toiminnallinen karakterisointi GAGE ​​proteiinien on tärkeää ymmärtää niiden roolit syöpäsolujen ja sukusolujen biologian ja arvioida niiden terapeuttista potentiaalia syövän tavoitteita. Tutkimus osoitti, että GAGE ​​proteiinit vuorovaikuttavat suoraan tai epäsuorasti GCL, ja että GCL rekrytoi GAGE ​​proteiineja ydinvoiman kirjekuori soluissa. Olemme lisäksi osoittaneet, että GCL ja GAGE ​​jäsentä co-express ihmisen kiveksissä ja syöpäsoluja. GCL on tärkeää ydin- kirjekuori eheyden ja sukusolujen kehitystä sekä

Drosophila

ja hiirillä [9], [10]. GCL keskittyy lähellä ydinaseiden sisäkalvon, mikä saattaa johtua sen suoran sitoutumisen LEM-domain proteiinit [12] – [14]. Vuonna

Drosophila

, GCL tarvitaan hiljaisuus transkriptio sukusolujen [11]. Nisäkässoluissa, GCL sitoo DP suoraan ja vähentää ilmentymistä E2F-DP-aktivoitu geenejä [29]. Pääteltiin GCL negatiivisena säätelijänä DP toimintaa. Tutkimuksen tulokset osoittavat, GCL myös värvää GAGE ​​proteiineja ydinvoiman kirjekuori. Onko tämä rekrytointi hiilinieluna ja köyhdyttää GAGE ​​muiden sivustojen toimintaa (kuten ehdotettu tiettyjä transkriptiotekijöitä; [43]), tai vaaditaan GAGE ​​toimisi, vai GCL on itse säätelee GAGE, eivät ole tiedossa.

Huomasimme, että GAGE ​​proteiinit ovat luonnostaan-disordered proteiineja, jotka voivat sitoutua dsDNA suoraan. Muut luonnostaan-epäjärjestykseen dsDNA-sitovat proteiinit ovat High Mobility Group (HMG) domain proteiineja ja metyyli-CpG sitova proteiini 2 (MeCP2) [44], [45]. Syöpä-ituradan antigeenin page4, joka on sekä evoluutiossa ja rakenteellisesti sukua GAGE ​​proteiineja (32% identtisyys GAGE12I), on myös luonnostaan ​​epäjärjestyksessä ja niillä DNA-sitovat ominaisuudet [46]. Jäsentymätön polypeptidejä usein hyväksyä taitettu rakenteiden sitoutumisen biologisen tavoitteet [41], [47]. Sekä DNA-sitova alue GAGE, ja rakenteellinen perusta GAGE ​​DNA: han sitoutumisen tai kromatiinin, ovat tärkeitä aiheita tulevaa tutkimusta. Meidän tämänhetkiset tulokset siihen, GAGE ​​proteiinit sitoutuvat dsDNA sekvenssi-riippumattomalla tavalla, joka on samanlainen HMG domain proteiineja. Kuitenkin potentiaali edullisen sitoutumisen (esimerkiksi A /T-rikas DNA-sekvenssit, kuten nähnyt chromatin säädin SATB1; [25]) ei ole poissuljettu. Meidän geeli-shift kokeet paljastivat havaittavaa sitoutumista 90-bp dsDNA fragmenttien (17 pM) kanssa GAGE12I pitoisuutena 0,73 uM, ja noin 50% sitova klo GAGE12I pitoisuutena 7,3 uM. Nämä pitoisuudet olivat selvästi alle arvioidun GAGE ​​proteiinin pitoisuudet ytimet melanoomasolujen, ja ehdottivat

in vitro

sitoutumisen stoikiometria 43-to-1 (GAGE12I-to-DNA) 50% sitova. Koska GAGE ​​proteiinit muodostavat stabiileja dimeerejä ja korkeampia oligomeereja [2], oletamme tämä korkea moolisuhde heijastaa pitoisuudesta riippuva oligomeroinnissa GAGE ​​proteiineja.

Emme vielä ymmärrä merkitystä GAGE ​​sitoutumisen DNA

in vivo

, vai onko tämä vaikuttaa GCL. Kuitenkin me spekuloida GAGE ​​proteiinit saattavat silta kromatiinin että GCL liittynyt proteiini komplekseja ydin- kirjekuoren ja siten säädellä chromatin organisaatio ja toiminta [22], [48]. Ihmisen sukusolujen linjaa, GAGE ​​proteiinit ovat läsnä alkuitusolujen (PGC) ja katoavat juuri ennen ensimmäistä meioottista jako [35], [49]. PGC lisääntyvät ja vaeltavat selkäpuolen ruskuaispussista kautta selkä suoliliepeen hyökätä ja asuttaa gonadaalinen harjanteet [50]. Tähän prosessiin kuuluu jono epigenetic tapahtumia, jotka uudelleen ja ohjelmoida chromatin, ja lopulta siirtää solun somaattisen on sukusolujen tilassa [51]. Nämä epigeneettiset muutokset ovat vielä huonosti tunnettu, mutta sisältää genominlaajuisten menetys DNA: n metylaatio, vähitellen menettää H3K9me2 ja maailmanlaajuinen voitto H3K27me3 [52]. Erityisesti epigeneettiset muutokset ovat myös keskeinen kasvaimien syntyyn, ja fenotyyppinen yhtäläisyyksiä itusolujen ja syöpäsolujen perusteella on mahdollista aktivointia sukusolujen liittyvän erilaistumisprosessia syöpäsoluissa [5]. Siksi spekuloida, että GAGE ​​perheenjäsenillä on uusi rooli korkeamman asteen chromatin uudelleenjärjestely ja uudelleenohjelmointi sukusolujen ja syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Immunoanalyysit

käytetyt vasta-aineet tässä tutkimuksessa olivat: hiiren anti-GAGE (M3 [4]; immunosolukemialliset [ICC], 1/100 laimennus; western blot [WB], 1/5000 laimennus), kanin anti-Myc (A14; Santa Cruz Biotech, Heidelberg, Saksa ; ICC, 1/100), kanin anti-GCL (Santa Cruz Biotech, WB, 1/1000), kanin anti-GCL (Sigma Aldrich, Brondby, Tanska, WB, 1/1000), hiiren anti-beeta-Actin ( Ab6276; Abcam, Cambridge, UK, WB, 1 /200,000); FITC-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG: tä (Dako, Glostrup, Tanska, ICC, 1/400), Cy3-konjugoitu vuohen anti-kani-lgG: tä (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA, ICC, 1/400).

Länsi pyyhkii ja solujen värjäytymisen kuvattiin aiemmin [4]. Sillä pisteblotit, me täplikäs rekombinantti GAGE12I tai solulysaateista (valmistettu PBS käyttäen kuulamyllyssä homogenointi) päälle aktivoitu PVDF kalvo; ilmakuivattu kalvot käsiteltiin kuten kuvattiin Western pyyhkii ja kvantitoitiin käyttäen Fusion Fx7 Imager (Vilber Lourmat Deutschland GmbH, Eberhardzell, Deutschland).

Hiiva kaksoishybridiseulonnassa

Hiiva kaksi- Kaksoishybridiseulonta tehtiin ProteinLinks (Pasadena, CA, USA).