Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä ei-koodaavat RNA: t, joissa sääntely rooleja, jotka ovat mukana laaja kirjo fysiologisia ja patologisia prosesseja, kuten syövän. Yhteinen strategia tunnistamiseksi miRNA liittyi solun transformaatio on verrata pahanlaatuisten solujen normaaleihin soluihin. Tässä keskitymme tunnistamiseen miRNA jotka säätelevät aggressiivinen fenotyyppi melanoomasolujen. Vältetään erot johtuvat geneettisestä tausta, vertaileva suurikapasiteettisten miRNA profiloinnin suoritettiin kaksi isogeenisiin ihmisen melanoomasolulinjat jotka näyttävät suuria eroja niiden net leviäminen, invaasion ja putken muodostumiseen toimintaa. Tämä seulonta paljasti kaksi suurta kohortteja ilmentyvät eri miRNA. Me arveltu, että miRNA säädellään ylöspäin enemmän aggressiivinen solulinja edistää kasvaimia synnyttävän ominaisuuksia, kun taas alassäädetty miRNA ovat kasvain ehkäisevästä. Tämä oletus testattiin lisäksi kokeellisesti viidellä ehdokas kasvaimen tukahduttava miRNA (miR-31, -34a, -184, -185 ja -204) ja yhden ehdokkaan onkogeeninen miRNA (miR-17-5p), joita kaikkia ei ole koskaan raportoitu aikaisemmin ihomelanooman. Merkillistä, kaikki ehdokas tukahduttava-miRNA esti net lisääntymistä, invaasiota tai putken muodostumiseen, kun taas miR-17-5p solujen lisääntymisen tehostuneen. miR-34a ja miR-185 oli edelleen osoitettu estävän kasvua melanooman ksenograftien asennettuina SCID-NOD-hiiristä. Lopuksi kaikki kuusi ehdokasta miRNA havaittiin 15 eri metastaattinen melanooma yksilöitä, jotka osoittavat, että fysiologinen merkitys havaintomme. Yhdessä nämä havainnot voivat osoittautua instrumentaalinen ymmärtämään mekanismeja taudin sekä kehittää uusia terapeuttisia ja lavastus tekniikoita melanoomaan.

Citation: Greenberg E, Hershkovitz L, Itzhaki O, Hajdu S, Nemlich Y, Ortenberg R, et ai. (2011) asetus Cancer Aggressiivinen ominaisuudet melanoomasoluihin MikroRNA. PLoS ONE 6 (4): e18936. doi: 10,1371 /journal.pone.0018936

Editor: Donald Gullberg, University of Bergen, Norja

vastaanotettu: 06 joulukuu 2010; Hyväksytty: 13 maaliskuu 2011; Julkaistu: 25 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Greenberg et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Gal Markel tukee Recanati Foundation for Medical Research (# 6713). Noam Shomronin tukee Chief Scientist toimisto, Ministry of Health, Israel (# 3-4876); Kurz-Lion Foundation; Tel-Avivin yliopisto, Lääketieteellinen tiedekunta, Schreiber Foundation; ja The Wolfson Family Charitable Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Melanooma, aggressiivinen pahanlaatuisen johtuvat melanosyyttejä, on yksi tärkeimmistä hengenvaarallisia pahanlaatuisten aikakautemme. Vaikka osuus on lähes 4% kaikista ihosyöpiä, se aiheuttaa 75% ihosyöpä liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti ja pidetään yleisin kuolemaan johtava maligniteetti nuorista aikuisista [1]. Transformation ja etäpesäkkeiden kehittymisessä edellyttävät vaiheittaista hankintaa aggressiivisia piirteitä. Näitä ovat, esimerkiksi, hallitsematon kasvu, resistenssin apoptoosia, liikkuvuuteen, proteolyyttinen kapasiteetti ja tarttuvuus (katsaus [2], [3]). Lisäksi, plastisuus melanoomasolujen on ilmeistä niiden kyky muodostaa putkimaisia ​​rakenteita [4]. Nämä toiminnalliset verisuonten kaltaisia ​​rakenteita koostuvat kasvainsolujen [5], ja niiden läsnäolo liittyy huonoon ennusteeseen [6], [7]. Viimeaikainen kehitys täsmähoitoihin melanooman korostaa molekyyli rajauksen taustalla olevien mekanismien synnyssä [8].

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, ei-koodaus, 19-22 nukleotidin pitkä RNA-molekyylejä, jotka toimivat erityisinä epigeneettisellä säätelijöinä geenin ilmentymisen estämällä proteiinin translaation, mikä johtaa mRNA hajoaminen, tai molemmat [9], [10]. Kun jalostetut erottavat hiusneula selostukset ja ladataan Argonaute proteiinia hiljentämisen monimutkainen, miRNA parin soluliman mRNA suoraan posttranskriptionaalisella tukahduttaminen. ”Siemen” alue, joka on havaittu nukleotidien 2-8 kypsän miRNA, sitoutuu komplementaarisia alueita, 3 ’un-transloitumaton alue (3’-UTR) ja kohde-mRNA: ta. Tähän mennessä noin 1000 ihmisen miRNA on havaittu [11], joka oletetaan säätelevän yli 50% ihmisen geeneistä [12].

miRNA osallistuvat säätelyyn monien biologisten prosessien, kuten kuten alkion kehitys, solujen erilaistumista, solu- sykli, apoptoosin ja angiogeneesin (tarkistetaan [13]). Ne ovat myös suoraan osallisina syövän kehitykseen, etenemisen ja etäpesäkkeiden

in vitro

,

in vivo

ja raportoitu myös potilailla [10], [14]. Joissakin tapauksissa syöpä on helpottaa menetys tiettyjen miRNA, kuten miR-15/16 klusteri krooninen lymfaattinen leukemia [15], miR-34a uveal melanooma [16] ja miR-31 mesoteliooma [17]. Menetys Näiden miRNA parantaa invasiivisuus, muuttoliike ja syöpäsolujen lisääntymistä. Muissa tapauksissa syöpä on helpottaa yli-ilmentyminen muut miRNA, kuten miR-17-92 klusterin [13], [18], joka edistää muuttoliikkeen ja invaasion useissa syöpäsairauksia.

Tällä hetkellä tietoa roolit miRNA melanooman kehittymisen ja etenemisen on edelleen rajallista. Viime aikoina useat vertailevia miRNA profilointi tutkimuksia normaalien melanosyyttien ja melanoomasoluja paljasti: 1) ryhmät miRNA liittyy pahanlaatuisiksi, etenemisen ja metastaattisen potentiaalia [19]; 2) Erityiset ekspressioprofiileja jotka liittyivät mutaatiostatuksesta riippumatta ja selviytymisen [20]; 3) Differential miRNA malleja melanoomaa nuorten aikuisten ja iäkkäiden [21]; ja 4) ennustaminen jälkeisen uusiutumisen eloonjääminen [22]. Silti mikään näistä tutkimuksista on kuvattu miRNA että suoraan määrittää aggressiivinen piirteitä ihomelanooman, kuten parannettu leviämisen, liikkuvuuteen ja hyökkäystä. Harvat estävä miRNA todettiin melanooma, mukaan lukien miR-34a (uveal melanooma) [16], miR-193B [23], anna-7a [24], ja miR-211 [25], [26], kun taas miR-182 [27] ja miR-221/222 [28] oli osoitettu stimuloivan metastaattisen potentiaalin melanoomasoluja. Koska kriittinen arviointi aggressiivinen versus ei aggressiivinen melanoomaa, ja mahdollisuuksia terapeuttisten pidämme välttämätöntä oppia molekyylitason tapahtumia aggressiivinen melanoomaa.

Tässä keskitymme suurikapasiteettisten tunnistaminen miRNA jotka ovat suoraan osallisina määrityksessä aggressiivinen melanooman solujen fenotyyppiin. Kaksi isogeeninen melanooma solulinjoja eri aggressiivinen kuvio, erittäin aggressiivinen C8161-soluja ja heikosti aggressiivinen C81-61-soluja, oli poikkeavalla tavalla korkean suoritustehon seulonnan miRNA. Oletimme, että koska isogeenisiin taustan Solujen ilmentyvät eri miRNA ryhmiä olisi rikastaa miRNA, joilla on välitön vaikutus aggressiivinen melanoomaa ominaisuuksia. Todellakin, tarjoamme kokeellista näyttöä

in vitro

,

in vivo

ja kliinisissä melanooman yksilöt aiemmin tunnettujen kasvaimeen ehkäisevästä ja kasvaimen edistävät miRNA sopivat tätä hypoteesia. Merkillistä, kuvaamme uusia miRNA vähän tietoa niiden roolia syövän, kuten miR-185. Tieteellinen ja translaation vaikutukset Tässä tutkimuksessa käsitellään.

Tulokset

Differential aggressiivisuus melanooman isogeenisten solulinjojen

erittäin aggressiivinen (HAG) C8161 ja huonosti aggressiivinen (PAG) C81-61 ihomelanooma solulinjat, jotka ovat peräisin eri etäpesäkkeitä samasta potilaasta [29]. Differentiaalinen aggressiivinen fenotyyppiä HAG ja PAG solujen varmistettiin neljä eri toiminnalliset analyysit: leviämisen, invaasio kautta matrigeeliä, putken muodostumista matrigeeliä ja kasvainten muodostumisen in ksenosiirrettyjä hiirillä. Todellakin, HAG soluilla olennaisesti korkeampi lisääntymistä, invaasiota ja putken muodostumiseen ominaisuudet

in vitro

, kuin PAG soluja (kuvio 1, A-C). Lisäksi ihonalaisen 1 x 10

6 HAG solut muodostivat kasvaimia SCID-NOD hiiriin viiden päivän kuluessa injektion, joiden keskimääräinen ksenografti koko 780 mm

3 päivällä 30. Sen sijaan, injektio 1 × 10

6 PAG solut eivät kehittyä mitattavissa kasvaimia 30 päivän sisällä (kuvio 1 D). Pieni PAG kasvaimet (-200 mm

3) havaittiin 90 päivää injektion jälkeen ja PAG-soluja (tietoja ei esitetty).

(A) Lisääntyminen määritettiin standardoitu XTT kolorimetristä määritystä 24 h ymppäyksen jälkeen . Määrä HAG solujen määritettiin 100%. Kuvassa on edustava koe kolmesta suoritetaan; (B) prosenttiosuus tunkeutumaan solujen testattiin 20 h Matrigel invaasiomääritys. Tulokset korjattiin proliferaationopeus. Kuvassa on edustava koe kolmesta suoritetaan; (C) HAG soluja tai PAG solut testattiin putken muodostumisen aktiivisuutta. Edustavia koko kenttä mikrovalokuvia on esitetty edustavasta kokeesta, kolmesta suoritetaan; (D) keskimääräinen kasvainmassoja muodostettu SCID-NOD-hiiristä 30 päivää injektion jälkeen 1 x 10

6 solua HAG tai PAG solulinjoista. Jokainen ryhmä mukana vähintään kuusi hiirtä.

Differential ilmaisun profiilia miRNA keskuudessa HAG ja PAG solujen

Merkittävä fenotyyppiset ero kahden isogeenisten melanooma riviä käsitti alustan opiskeluun epigeneettiset sääntelyn aggressiivinen ominaisuuksia mukaan miRNA. Vertaileva suurikapasiteettisten profilointi miRNA suoritettiin. Tärkeää on, joukko 81 miRNA ilmaistiin korkeammilla tasoilla HAG verrattuna PAG soluihin (HAG

korkea). Toinen joukko 69 miRNA ilmaistiin alemmilla tasoilla HAG verrattuna PAG soluihin (HAG

alhainen). Ryhmä 48 miRNA ulos 81 HAG

korkea miRNA ei ole esittänyt lainkaan PAG soluissa (kuvio 2A), kun taas 56 miRNA ulos 69 HAG

alhainen miRNA ei ole havaittu HAG soluissa (kuvio 2B). Loput differentiaalisesti ilmaisi miRNA havaittiin molemmissa solulinjoissa eri, mitattavissa määrät (kuvio 2C). Oletimme, että nämä miRNA klusterit olisivat rikastaa miRNA, jotka osallistuvat suoraan sääntelyn erillisten fenotyyppisten eroja. Tarkemmin, me arveltu, että HAG

alhainen miRNA olisi rikastunut miRNA osuus tukahduttava vaikutus moniin solun ominaisuuksista esim. leviämisen (tukahduttava miRNA), kun taas HAG

korkea miRNA olisi rikastunut miRNA onkogeenisella tai kasvainta edistävät vaikutukset (onkogeeninen miRNA) (kuva 2).

(A) Luettelo miRNA jotka ovat ilmaistu HAG soluissa, mutta ei PAG soluissa; (B) luettelo miRNA jotka ilmentyvät PAG soluissa, mutta ei HAG soluissa; (C) Suhteellinen ilmentyminen miRNA jotka on ilmaistu sekä HAG ja PAG-soluja. Expression of HAG-to-PAG-suhde (Y-akseli) on esitetty 2∧-ΔΔCt. HAG

alhainen edustaa miRNA alhainen HAG-to-PAG suhde. HAG

korkea edustaa miRNA korkea HAG-to-PAG suhteen.

valinta miRNA tiettyjä funktionaalisia määrityksiä

keskittyi lähinnä HAG

alhainen miRNA, joka ovat oletettavasti kasvaimeen ehkäisevästä ja voisi tarjota perustan uusille riviä terapiaa melanooman. miRNA tuumoriperäisten tukahduttava potentiaali analysoitiin ennustettu tavoitteensa TargetScan algoritmilla [30] sekä vaikuttaa biologisten prosessien kanssa Miranda (miRpath) algoritmi [31]. Kaikki mahdollisesti vaikuttaa biologisten prosessien rankattiin mukaan yleinen P-arvo, jossa on leikkaus, 0,01. Edelleen keskittyä vankan prosesseihin mahdollisti valitsemalla biologisista prosesseista, jotka sisältyvät vähintään 30 ehdokasta kohdegeenien. Merkillistä, nämä laskennallinen vaiheet korostettiin neljää biologisista prosesseista, jotka ovat vahvasti mukana syövän, kuten Wnt-reitin (82 geenit, P = 1,7 x 10

-9), fokaalisen adheesion (100 geenit, P = 8,6 x 10

– 9), MAPK-reitin (120 geenit, P = 2 x 10

-7) ja fosfatidyyli-reitin (35 geenit, P = 7,2 x 10

-3). Kaksikymmentä yhdeksän miRNA ennustettiin kohdistaa kaikki neljä prosessia, jossa vain 12 ne on raportoitu kokeellisesti aikaansaamaan estävä vaikutus tahansa syöpään.

Kaikkiaan viisi ehdokasta tukahduttava miRNA, joita ei ole koskaan tutkittu melanooman, valittiin kloonaukseen ja kokeellisia testejä. Kolme miRNA olivat sisällä ilmaisun välillä (miR-34a, miR-185 ja miR-204, kuvio 2C) ja kaksi jotka hiljennettiin (miR-31 ja miR-184, kuvio 2B) kun HAG soluissa. miR-17 valittiin esimerkkinä ehdokasta onkogeeninen miRNA (kuvio 2C). Ero ilmentyminen kukin näistä miRNA validoitiin kaksi erillistä RNA-valmisteita (tuloksia ei ole esitetty). Erilaiset roolit miR-17, miR-31 ja miR-34a syövässä on raportoitu aikaisemmin, vaikka ei koskaan ihomelanooman. Sen sijaan on olemassa niukasti näyttöä roolit miRNA -184, -185 ja -204 syövässä. Exemplar ennustettu rooleja biologisiin ja molekyylitason toimintojen kyseisiä miRNA esitetty yhteenvetona Täydentävä taulukossa S1 [32].

Expression profiilia valittujen miRNA kliinisissä melanooman yksilöiden

Viisitoista potilaasta johdettujen primääriviljelmien melanooman analysoitiin ilmentymistason valitun miRNA. Kaikki melanooma perustettiin viljelmät kaukaisista etäpesäkkeitä. Muita tietoja potilaista annetaan Täydentävä taulukossa S2. Kuten odotettua, huomattava vaihtelu miRNA-ekspressiota havaittiin joukossa yksilöä, pääasiassa miR-31 (kuvio 3). Keskimääräinen ekspressiotaso useimmat ehdokas tukahduttava miRNA että kliinisissä näytteissä oli välillä vastaavien miRNA arvot PAG ja HAG soluja, lukuun ottamatta miR-185 ja miR-31. Vaikka keskimääräinen taso miR-185 oli erittäin lähellä PAG soluihin, miR-31-tasot olivat selvästi korkeampia kuin jopa PAG soluja (kuva 3). Sen sijaan, keskimääräinen ekspressio ehdokas onkogeeninen miR-17 joukossa kliinisissä näytteissä oli jopa korkeampi kuin HAG-soluissa (kuvio 3). Mirna ekspressiokuvioita kliinisistä näytteistä suoraan osoittaa, että useimmat ehdokas tukahduttava miRNA, paitsi miR-31, ilmennetään huomattavasti pienemmässä määrin kuin ehdokas onkogeeninen miR-17 (kuva 3). Nämä tulokset yhtyä hypoteesia ja viittaavat siihen, että lähestymistapa käyttää tunnistamaan toiminnallisia ehkäisevästä ja onkogeeninen miRNA on fysiologisesti relevantti perustein.

ilmaus ehdokas ehkäisevästä tai onkogeeninen miRNA, kuten, HAG (raidalliset palkit), PAG (harmaat pylväät) ja 15 matalan kulkua primääriviljelmien metastaattisen melanooman (mustat palkit). Vaakasuora viiva kuvaa keskimääräistä ilmaisua. Y-akseli kuvaa ehdoton ilmaus kunkin miRNA jälkeen normalisoinnin U6 endogeeninen kontrollia jokaisessa näytteessä, ja esitetään 1 /ACt.

asetukseen aggressiivinen fenotyypin melanoomasolujen ehdokas tukahduttava miRNA

määritys miRNA jotka estävät aggressiivinen fenotyyppi melanooman voisi tulla perusta uusien alustojen syöpähoitoa varten. Jotta voitaisiin arvioida toiminnallista vaikutusta ehdokas tukahduttava miRNA on aggressiivinen ominaisuuksista melanooman, me kloonattu ja vakaasti yli-ilmentynyt niitä HAG soluissa arvioida niiden vaikutuksia in vitro ja in vivo. Tyhjä vektori toimi kontrollina. Yli-ilmentyminen on vähintään 50-kertainen varmistettiin reaaliaikaista PCR: llä (kuvio 4A). Fenotyyppi transdusoidut solut testattiin

in vitro

varten lisääntymistä, invaasiota ja putken muodostumiseen toimintaa. Yllättävää kyllä, huomattava ja johdonmukainen eston net proliferaatiota myönnetty miR-31, miR-34a, miR-184 ja miR-185 verrattuna säätökennotyyppi (kuva 4B). miR-204 ei inhiboinut proliferaatiota HAG-solujen (kuvio 4B). Sen sijaan, miR-204 inhiboivat merkittävästi hyökkäyksen aktiivisuutta HAG-solujen (kuvio 4C). Invasion oli samalla estettiin miR-184, mutta ei muiden tukahduttava miRNA (kuvio 4C).

(A) todentaminen yli-ilmentymisen miRNA HAG transduktanttien verrattuna mock-transdusoidut solut. Y-akseli kuvaa kertainen muutos edellä Mock-transdusoidut solut. (B) Net leviämisen transduktanttien kvantifioitiin standardoitujen XTT testi. Solujen lukumäärä määritettiin 48 h ymppäyksen jälkeen. Määrä Mock-transduktanttien määritettiin 100%. Kuviossa on esitetty edustava koe kolmesta suoritettu. (C) Invasion aktiivisuus transduktanttien määrä määritettiin 20 h-Matrigel invaasiomääritys, jossa korjaus leviämisen. Hyökkäys nopeus Mock-transdusoidut solut määritettiin 100%. Kuviossa on esitetty edustava koe 3 suoritetaan. * Merkitsee P 0,05, ** tarkoittaa P 0,01 (2-tailed

t-testi

).

Tube muodostumisen aktiivisuutta inhiboi oleellisesti miR-34a ja miR-185 , ja lievästi by miR-31 ja miR-184, mutta ei miR-204, verrattuna kontrolliin (kuvio 5, A-F). Kvantifiointi putken kokonaispituus suoritettiin käyttäen ImageJ. Tärkeää on, että laadullinen arviointi micrographic kaappaa (kuva 5, A-F) yhtyi kvantitatiivisen kokonaispituus analyysi (kuvio 5G). Ero vaikutuksia miRNA ei yksinkertaisesti johtua niiden ero yli-ilmentyminen intensiteetit (kuvio 4A). Lähes kaikki solut olivat elinkelpoisia, kun määritettiin, kuten ilmeistä 5% positiivisia trypaanisinisellä värjäyksen (tuloksia ei ole esitetty).

Tube muodostumista kyky transduktanttien testattiin 3D kulttuuri, 24 h ymppäyksen jälkeen. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. (A) edustaja mikrovalokuva 3D kulttuurin Mock transdusoimattomien HAG soluissa; (B-F) edustaja mikrovaloku- miRNA transdusoimattomien HAG soluista, kuten on osoitettu kunkin kuvan. Kaikki kuvat otettiin kiinni alle × 40 suurennus. Kaikki kuvat (A-F) on peräisin samasta edustava koe on esitetty, kolmesta suoritettu. (G) Tube muodostuminen kvantifioitiin käyttäen ImageJ analysoida luuranko plugin. Kuvio esittää keskimääräistä pituutta lasketaan kullekin transductant kaikista mikrovalokuvia jää kaikissa kolmessa kokeita. * Merkitsee P 0,05, ** tarkoittaa P 0,01 (2-tailed

t-testi

).

Yhteenvetona kaikki viisi ehdokasta tukahduttava miRNA todellakin aiheutti merkittäviä estäviä vaikutuksia syövyttäviä ominaisuuksia melanoomasolujen. Tämä on yhtäpitävä niiden merkittävä downregulation että HAG soluissa (kuvio 2) ja niiden yleistä heikkoa ilmentymistä kliinisissä näytteissä (kuvio 3). Tämä vahvistaa myös korkean suoritustehon miRNA seulontaan ja korostaa sen luotettavuutta.

helpottaminen aggressiivinen fenotyypin melanoomasolujen ehdokas onkogeeninen miRNA

Koska miRNA 17-92 klustereiden toiminnallista roolia syövässä on vakiintunut, mutta ei sitä ole testattu ihomelanooman, arvioimme miR-17 sen vaikutus aggressiivisuus PAG soluja. miR-17 kloonattiin ja stabiilisti yli-ilmentyy PAG soluissa. Tyhjä vektori toimi kontrollina. 25-kertainen yli-ilmentyminen miR-17 varmistettiin reaaliaikaista PCR: llä (kuvio 6A). Tärkeää on, miR-17-transdusoitujen PAG soluilla merkittävästi parannettu proliferatiivista aktiivisuutta (kuvio 6B), mutta ei invasiivisia kyky (kuvio 6C) tai putken muodostumisen aktiivisuutta (dataa ei ole esitetty). Nämä tulokset tukevat mahdollisesti kasvaimia aiheuttavalle vaikutukselle miR-17 melanooma.

(A) todentaminen miR-17-5p over-ilmentyminen PAG transduktanttien verrattuna mock-transdusoidut solut. Y-akseli kuvaa kertainen muutos edellä Mock-transdusoidut solut. (B) Net leviämisen PAG transduktanttien kvantifioitiin standardoitujen XTT testi. Solujen lukumäärä määritettiin 48 h ymppäyksen jälkeen. Määrä Mock-transduktanttien määritettiin 100%. Kuviossa on esitetty edustava koe 3 suoritetaan. (C) Invasion aktiivisuus PAG transduktanttien määrä määritettiin 20 h-Matrigel invaasiomääritys, jossa korjaus leviämisen. Y-akseli kuvaa prosenttiosuus tunkeutuu soluihin. Kuviossa on esitetty edustava koe kolmesta suoritettu. ** Tarkoittaa P 0,01 (2-tailed

t-testi

).

miRNA-välitteinen säätely aggressiivinen melanoomaa ominaisuudet

in vivo

syöpäbiologian,

in vitro

tulokset eivät useinkaan välttämättä vastaa

in vivo

käyttäytymistä. Tätä varten vaikutukset valittujen tukahduttava miRNA olivat edelleen arvioitiin

in vivo

melanooman ksenograftimalleissa. Vaikutusta ehkäisevän miRNA, miR-34a ja miR-185 kasvaimen kasvu mitattiin ihonalaisen injektion jälkeen 3 x 10

5 HAG transduktantit. Kasvainmassoja seurattiin 28 päivän ajan injektion. Yli-spesifisten miRNA vahvistettiin pre-injektio (tuloksia ei ole esitetty). Tärkeää on, tilastollisesti merkitsevän eston kasvaimen kasvua havaittiin sekä miR-34a ja miR-185 transducatnts, verrattuna kont- kasvaimia (kuvio 7A). Mukaillen nämä tulokset,

ex-vivo

punnitsemalla kasvain eksplantaattien päättyessä kokeiden vahvisti, että keskimääräinen kasvaimen massa sekä miR-34a ja miR-185 transducatnts oli pienempi kuin Mock-transdusoitujen kasvaimia (kuvio 7B) .

in vivo

yli-ilmentyminen transdusoitujen miRNA vahvistettiin kasvaimen eksplanttien (kuvio 7C). Nämä tulokset tukevat kanssa ilmaisun tuloksia ja toiminnalliset tukahduttava vaikutus osoitti

in vitro

(Kuva 4-5).

(A) Seuranta kasvaimen kasvua SCID-NOD-hiiristä. Kukin ryhmä koostui seitsemästä hiirestä. Edustava koe neljästä suoritettu näkyy. Tilastollinen merkitsevyys testattiin 2-tailed-pariksi

t-testillä

; (B) keskimääräinen paino kasvainten kudosviljellyn päättyessä kokeilun. Tilastollinen merkitsevyys testattiin 2-tailed

t-testillä

; (C) yli-ilmentyminen transdusoitujen miRNA vahvistettiin päättyessä kokeilun kaikista kasvaimista kanssa qPCR. * Merkitsee P 0,05.

Keskustelu

Tähän mennessä useimmat yritykset luonnehtia roolit miRNA syövän yleisesti tai melanooman erityisesti, ovat keskittyneet ero profilointia normaalien solut verrattuna niiden pahanlaatuisten vastine soluihin [19], [20]. Tämä lähestymistapa mahdollisti tunnistaminen miRNA jotka osallistuvat malignin transformaation prosessissa. Tässä olemme keskittyneet tunnistamiseen miRNA suoraan säätelevät syövän aggressiivinen ominaisuuksia melanoomasolujen. Tavoitteena tätä lähestymistapaa oli kartoittaa miRNA, mahdollisuus osallistua mekaanisesti eri sairauksien fenotyypit ja lopulta hahmotella niiden säätelevän roolin aggressiivinen syöpä ominaisuuksia. Käytimme kaksi isogeenisiin täsmäsi melanoomasolulinjoja, jotka olivat peräisin kahdesta eri etäpesäkkeiden samasta potilaasta. Nämä solulinjat merkittävästi eroavat invasiivisia, proliferatiivinen ja tuumorigeenisia ominaisuudet (kuvio 1). Koska yhteinen geneettinen tausta solujen, meidän perustelu oli, että ero ilmentyminen miRNA olisi korreloivat hyvin niiden ero aggressiivista fenotyyppi.

Suurikapasiteettinen seulonta paljasti suuren kohortin ilmentyvät eri miRNA välillä erittäin (HAG ) ja huonosti (PAG) -aggressive melanooma solulinjoja (kuvio 2). Oletimme, että HAG

alhainen miRNA ovat ehkäisevästä ja HAG

korkea miRNA ovat onkogeenisia. Todellakin, tarjoamme huomattavasti aineistoa hypoteesia, jonka ektooppinen ilmentyminen viittä HAG

alhainen miRNA HAG soluissa (kuviot 4, 5, 7) ja yksi HAG

korkea miRNA vuonna PAG soluissa, edustajana tästä ryhmä (Kuva 6). Tämä on ensimmäinen raportti onnistuneesti osoittaa systemaattisen lähestymistavan metodologisen tunnistamiseen miRNA suoraan säännellä aggressiivinen syöpä ominaisuuksia. Runsaasti tunnistettu miRNA jotka säätelevät ominaisuudet melanooman solujen aggressiivisuus kannattaa käyttää isogeenisen solulinjojen ero fenotyyppi kuin seulonta-alustan.

Ilmaisu Näiden miRNA validoitiin 15 matalan passage primääriviljelmiä, jossa tarkoittaa taso miR-17 on suurempi kuin ehkäisevän Mirs, mikä vahvistaa fysiologista merkitystä (kuvio 3). Ilmaisu Näiden miRNA pitäisi tutkia tarkemmin tulevaisuudessa etenemistä kudossiruina, ja niiden ennusteen arvioinnissa testattiin vastaavasti.

Tässä työssä olemme keskittyneet ryhmä joko hyvin tunnettu miRNA tiedetään olevan rooli muiden pahanlaatuisten kasvainten (miR-17, miR-31 ja miR-34a), ja toinen ryhmä suhteellisen luonteva miRNA osalta niiden roolia pahanlaatuisten prosessien (miR-184, miR-185, miR-204). Huomionarvoista, roolit kaikki nämä miRNA ei ole koskaan kuvattu ihomelanooma.

miR-31 oli raportoitu aiheuttavan inhiboivia vaikutuksia etäpesäke rintasyövän [33], [34] ja mesoteliooma [17] , kun se on potentiaalinen kasvaimia synnyttävän asemassa kuin pään ja kaulan okasolusyöpä ja keuhkosyövän [35], [36]. miR-34a johdonmukaisesti raportoitu tukahduttava miRNA monissa maligniteettien [37]. Tuloksemme kanssa samaa ehdotettu estävän rooli miR-34a ja miR-31. Lisäksi miR-34a on aiemmin raportoitu kohdistaa c-Met [16]. Koska c-Met: n on raportoitu osallistua tubulogenesis prosesseja c-Met /HGF-järjestelmä [38], on houkuttelevaa spekuloida, että mekanismi, jolla miR-34a estää putken muodostumiseen on kautta tämän geenin. Kasvaimia synnyttävän ominaisuudet miR-17-5p käsiteltiin aiemmin julkaisuista muiden pahanlaatuisten kasvainten [13]. Suostumuksella näistä raporteista, ektooppinen ilmentyminen miR-17-5p vuonna PAG soluissa parannettu proliferaationopeus (kuvio 6B).

Sen sijaan, hyvin vähän tiedetään miR-184, miR-185 ja asennuspalveli- 204 syövässä. Useimmat nykyiset tutkimukset miR-184 ja miR-204 keskittyä niiden roolit kehittämistä ja morfogeneesiin, joita voitaisiin ennustaa laskennallisesti (Täydentävä taulukko S1). Harvat julkaisuissa miR-184 syövän osoitti ristiriitaisia ​​vaikutuksia, joko tukahduttava [39] tai onkogeenisten [40]. Yksi raportti osoitti, että miR-204 esti etäpesäke pään ja kaulan okasolusyöpä [41]. Toinen kuvattiin downregulation miR-204 erittäin invasiivisia melanooman sub-line verrattuna ei-invasiivisia isogeenisestä vastine [19], joka tukee havaintomme koskien hyökkäyksen estävä aktiivisuus miR-204 (Fig. 4C). miR-185 on silti enimmäkseen luonteva, mutta viime aikoina se osoitettiin aiheuttavan tukahduttava vaikutus useissa maligniteettien kohdistamalla Six1 onkogeeni [42], [43]. Tulevaisuuden haasteena olisi rajata kohdegeenin verkostoja näiden miRNA ja ymmärtää molekyylitason perustan niiden kasvainten heikentävän rooli.

vaikutukset kunkin yksittäisen miRNA ehkä ole ilmeisesti olla identtisiä välillä

in vitro

ja

in vivo

asetelmia. Esimerkiksi kun miRNA-34a ja -185 osoitti vahvaa antiproliferatiivisia vaikutuksia

in vitro

(kuva 4B), ne vaikuttivat paljon maltillisemmin kasvaimen kasvunopeus

in vivo

(kuvio 7A ). Tämä voi johtua suuri ero ilmentymisessä intensiteetin välillä

in vitro

ja

in vivo

asetukset (kuvio 4A ja 7C). Kuitenkin,

in vivo

kokeet viittaavat siihen, että vaikka yli-ilmentymisen taso on suhteellisen heikko (kuvio 7C), kokeellinen tulos, jossa otetaan huomioon useita biologisten prosessien, kuten kasvaimen kasvua, voi silti heijastaa tukahduttava vaikutus yli-ilmentynyt miRNA (kuvio 7). Lisäksi nämä kokeet yksinkertaistaa mahdollisuuden kombinatorisista sääntelyn vaikutuksista eri miRNA, joka voi toimia joko konsertti tai häiriön [44]. Siten koordinoitu downregulation ja säätelyä miRNA voi muotoilla tietty fenotyyppi, vaikka muutokset kunkin miRNA ekspressiotaso eivät ole äärimmäisiä. Todellakin, olemme havainneet useita suoria ja käänteinen tilastollinen korrelaatiot testattujen tukahduttava miRNA kliinisessä melanooma yksilöitä, jotka voivat ehdottaa synergistisiä tai antagonistisia vaikutuksia joukossa (tuloksia ei ole esitetty). Tulos vuorovaikutuksesta eri tukahduttava miRNA tulisi tutkia tarkemmin syventää ymmärrystä fenotyypin muotoiluun yhdistelmämutageneesillä miRNA kuvioita, ja koska synergistiset estävä yhdistelmät voivat tarjota vankka johtoa innovatiivista hoitoa.

Kaiken kaikkiaan tämä on ensimmäinen raportti, joka menestyksekkäästi osoittanut systemaattinen lähestymistapa tunnistamiseen miRNA suoraan säännellä aggressiivinen syöpä ominaisuuksia. Meillä on kuvattu kuusi miRNA edistää aggressiivinen fenotyyppi ihomelanooman sekä

in vitro

ja

in vivo

, ja liittyy huomautuksista kliinisistä näytteistä. Tunnistaminen miRNA jotka muokkaavat aggressiivinen fenotyyppi tauti voi johtaa innovatiivisten tulevien hoidon ja molekyylitason lavastus järjestelmiä. Viimeaikaiset julkaisut osoitti mahdollisuus suunnata kokeellisen melanooman etäpesäkkeiden käyttämällä nanohiukkasten kuljettaa miR-34a [45] tai synteettistä miRNA agonistia [46].

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläin työ hiirillä suoritettiin seuraavien hyväksyntää Institutional Review Board of Sheba Medical Center (562/2010). Kaikki kliiniset näytteet peräisin potilaista, joista melanooma viljelmät perustaa, saatiin hyväksymisen jälkeen eettisen komitean Israelin terveysministeriön (IMoH hyväksyntä nro 3518/2004). Kaikki potilaat ovat halukkaasti allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuksen muodossa.

Solut

Kaksi isogeenisiin ihmisen ihon melanoomasolulinjat C8161-soluja (Highly aggressiivinen – HAG) ja huonosti aggressiivinen C81-61 (Huonosti aggressiivinen – PAG) [29] ystävällisesti toimitti Dr. Mary Hendrix (Lasten Memorial Research Center, Chicago, USA). Nämä solulinjat saatiin kahden eri etäpesäkkeiden samasta potilaasta. Primäärisen melanooman viljelmät kehitettiin poistettiin kirurgisesti metastaattinen melanooma leesioita (IMoH hyväksyntä nro 3518/2004) ja kasvatettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [47]. PAG-soluja kasvatettiin Hamin F10 keskipitkän lisäys 15% FBS, Pen /Strep ja 1 x MITO + (BD Biosciences). Normaali ihmisen orvaskeden Melanosyyteissä pidettiin seerumivapaassa ainutlaatuinen väliaineessa (Promocell). 293T-solut (ATCC) ylläpidettiin DMEM (Gibco /Invitrogen), joka sisälsi 10% FBS: ää (DMEM /FBS).

miRNA ilmentymisen analyysi

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen Mirvana miRNA Isolation Kit ( Ambion). Korkea-seulontaan miRNA suoritettiin reaaliaikainen PCR: llä käyttäen TLDA muodossa TaqMan MicroRNA sarjat (Applied Biosystems). Spesifisten miRNA ja U6-RNA (kuten endogeeninen kontrolli) suoritettiin seuraavasti käänteisen transkription 200 nt RNA jakeet, käyttäen TaqMan MicroRNA sarjat (Applied Biosystems). Cutoff tasot merkitys määritettiin vähintään 4-kertainen suhde tutkituista näytteistä ja sykli 36 rajana ilmentämiseen alue, joka perustuu aiempiin arviointiin tätä tekniikkaa.