Krooninen sairaus

tiivistelmä

hajureseptorien (syrjäisimmillä alueilla) on ilmaistu hajuepiteeli, jos ne havaitsevat hajusteita, mutta myös muissa kudoksissa lisätoiminnoilla. Jotkin syrjäisimmät alueet ovat jopa yli-ilmennetään kasvainsoluissa. Tässä tutkimuksessa tunnistimme syrjäisimpien ilmaistu enterochromaffin kasvainsolujen RT-PCR, joka osoittaa, että yksittäiset solut voivat ilmentävät useita syrjäisimmille alueille. Jotkut reseptorit tunnistettu jo raportoitu muissa kasvaimissa, mutta ne ovat orpo (ilman tunnetun ligandin), koska se on asianlaita useimpien satojen ihmisen syrjäisimpien alueiden. Täten geenit koodaavat ihmisen syrjäisimpien alueiden kanssa tunnettujen ligandien transfektoitiin näihin soluihin, jotka ilmentävät toiminnallisia heterologisia syrjäisimmille alueille.

in vitro

stimulaatio näiden solujen vastaavalla OR haju- agonistit edistänyt soluinvaasiota kollageenin geelejä. Käyttäen LNCaP eturauhas- syöpäsolujen, stimulaatio PSGR (Prostate Specific G-proteiiniin kytketty reseptori), endogeenisesti yli-ilmentää OR, jonka β-iononia, sen hajuste agonisti, johti samaan fenotyypin muutoksen. Osoitimme myös, että mukana on PI3 kinaasi γ riippuvainen signalointireitille tässä edistämisessä tuumorisolujen invasiivisuus laukaisi OR stimulaatiota. Lopuksi ihon alle ymppäyksen LNCaP soluja NSG immuunivajausta hiiriin,

in vivo

stimulaatio näistä soluista PSoR agonisti β-iononia merkittävästi parannettu etäpesäkkeiden syntymistä ja leviämistä.

Citation: Sanz G , Leray I, Dewaele A, Sobilo J, Lerondel S, Bouet S, et ai. (2014) edistäminen Cancer Cell invasiivisuus ja metastaasin Emergence aiheuttamista Haju-Receptor Stimulation. PLoS ONE 9 (1): e85110. doi: 10,1371 /journal.pone.0085110

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 01 joulukuu 2013; Julkaistu: 8. tammikuuta 2014

Copyright: © 2014 Sanz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat INRA ja CNRS (National Centre for Scientific Research (Ranska). Tämä tutkimus toteutettiin soveltamisalaan LEA EBAM (Euroopan Associated Laboratory (LEA) otsikolla ”Pulssi Electric Fields sovellukset biologian ja lääketieteen”). rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

hajureseptorien (syrjäisimpien) ovat G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien ilmentyvät pääasiassa hajuaistin neuronien (OSN) on hajuepiteeli, jossa ne havaitsemiseksi ja erottamiseksi lukemattomat hajusteita mukaisesti kombinatorinen koodi, jossa OR voidaan aktivoida eri hajusteita ja hajuaineella voi stimuloida erilaisia ​​syrjäisimmät alueet [1], [2]. Lisäksi syrjäisimpien alueiden on ilmaistu kuin hajuaistin kudoksissa [3] – [5], jossa he voivat pelata muita rooleja. Ne erityisesti säätelevät sperma kemotaksista, säännellä migraation ja adheesion lihassolujen ja ohjata serotoniinin erityksen enterochromaffin (EY) solut [6] – [10]. Useat tutkimukset kertoi myös, että jotkut syrjäisimpien alueiden voi olla tuumorimarkkeri yksi heistä muokkaamalla

in vitro

leviämisen LNCaP eturauhassyövän solut [11], [12], [13], [14].

erityisesti EY solut voivat hankkia kasvaimen fenotyypin ja differentiaalisesti nimenomaista syrjäisimpien riippuen neuroendocrine karsinooma kehitys [15]. Bon-soluja, ihmisen EC-solulinja, joka on peräisin etäpesäke haiman karsinooma [16], [17], jotka on kuvattu ja endogeenisesti ilmaista syrjäisimpien [8], joka voi olla kasvainmerkkiaineet, kun yli-ilmentynyt [15]. Koska BON solut peräisin etäpesäke, tutkimme, aktivoituminen syrjäisimmille alueille agonistin hajusteita voisi olla rooli syövän etenemiseen. Tämän vuoksi päätimme tunnistaa syrjäisimpien ilmaistu BON soluissa. Kuitenkin agonisti tai antagonisti hajusteita erityisiä BON solujen syrjäisimmät alueet ovat tuntemattomia, kuten useimpien satojen tunnistettu ihmisen syrjäisimpien alueiden. Olemme siis yrittäneet kehittää malli transfektoimalla nämä solut deorphanized syrjäisimpien alueiden. Heterologinen ilmentyminen saavutettiin pystyimme arvioimaan

in vitro

invasiivisuus näiden solujen stimuloitaessa hajusteeton ligandin transfektoitujen reseptorin. Lisäksi tunnistimme PI3 kinaasi γPI3Kγ osana signalointireitiksi aiheuttama OR stimulaation ja edistää solujen invasiivisuus. Vielä fysiologinen malli, on käytetty myös

in vitro

, LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa, joka yli-ilmentävät PS GR (Prostate Specific G-proteiiniin kytketty reseptori), endogeeninen ja deorphanized OR pidetään tuumorimarkkeri ja Greenwich kuvattiin estämään näiden solujen

in vitro

[12]. Tätä mallia käytettiin sitten

in vivo

analysoida rooli syrjäisimpien alueiden stimulaatio syövän etenemiseen, joka on etäpesäke syntymistä ja leviämistä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

eläimiä käsiteltiin mukaisesti suuntaviivojen Ranskan hallituksen suhteen leikkaustoimenpiteille ja eläinten hoito. Pöytäkirja on hyväksytty eettisen kohteliaisuuden kokeissa eläimillä nimeltä ”Comité d’Ethique en kokeilua Animale de l’IRCIV” CEEA-26 (protokolla numero 2012-043).

käänteistranskriptio (RT) -PCR, kloonaus ja sekvensointi

Yhteensä-RNA: t uutettiin käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen) ja käsiteltiin DNaasi I RT suoritettiin «SuperScript ensimmäisen Strand®, Synthesis System for RT-PCR» (Invitrogen).

yksisoluisia RT-PCR, single solut kerättiin joutumisen lasipipetillä ja RT suoritettiin käyttäen «Single Cell Superscript ™ III solujen suora cDNA Synthesis System» (Invitrogen) jälkeen solujen häiriöitä, proteiinien denaturointi ja DNaasikäsittelyä.

Perättäiset PCR toteutettiin alkaen 1 ui RT tuotteiden ja käyttäen degeneroituneita alukkeita kohdistamista OR säilyneitä alueita, tai alukkeita erityisesti suunnattu tai tunnistetaan degeneroituneita alukkeita. Degeneraattialukkeita sekvenssit ystävällisesti Stephan Bieri (Givaudan, Sveitsi). Koska genomista DNA: ta ohjataan ihmisen GAPDH tai β-aktiini-alukkeet DNaasi I-käsitelty RNA: t ilman käänteistranskriptaasia.

monistetut PCR-tuotteet degeneroituneita alukkeita, kloonattiin pGEM-T-vektoriin (Promega) ja sekvensoitiin Beckman Coulter Genomics. PCR-tuotteet monistettiin spesifisillä alukkeilla oli sekvensoitiin suoraan (Beckman Coulter Genomics).

Chemicals

hajusteita, DMSO ja mineraaliöljy (M3516) ostettiin Sigma-Aldrich, Fluka tai Acros Organics on erittäin puhtaita käytettävissä. AS605240 ostettiin Euromedex (Selleck, S1410) ja gallein alkaen TOCRIS biotieteiden. Parafiini (CellWax) saatiin KML, ja hemalun, eosiini, ja safran RAL.

Nisäkäsilmentäinisvektorit

OR1G1 tai OR17-40 koodaussekvenssit on tuotu pCMV-Tag3B nisäkäsekspressioplasmidiin -vektoriin (Stratagene) siten, jolloin fuusio cmyc epitooppia reseptorin N-terminaalisessa päässä. Tuloksena vektorit nimettiin pCMV-TagOR1G1 ja pCMV-TagOR17-40.

Soluviljely ja transfektio

BON soluja (alaklooni # 7) ystävällisesti toimitti Dr. Courtney M. Townsend (Department of Leikkaus UTMB, Galveston, TX 77551, USA) [16], [17]. Niitä oli kasvatettu DMEM /F-12 (Ham) ilman fenolipunaista (Gibco Invitrogen Corporation), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, Perbio) ja antibiootteja (100 U penisilliiniä /ml ja 100 ug streptomysiiniä /ml, Invitrogen) , 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. Soluja transfektoitiin ohimenevästi pCMV-TagOR1G1 tai pCMV-TagOR17-40 käyttäen jetPEI ™ (Polyplus-transfektio) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. TAI ilmentyminen solun pinnalla tarkistettiin immunofluoresenssimikroskopialla käyttäen monoklonaalista anti-cmyc-Cy3-vasta-ainetta (C6594, Sigma-Aldrich) ei-permeabilised soluissa.

LNCaP-solut hankittiin ATCC: ltä (Clone FGC, o . CRL-1740 ™) on kanava 19, ja kasvatettiin RPMI 1640-alustassa (ATCC, nro 30-2001), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (ATCC, nro 30-2021), 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2.

Kalsium kuvantamisen

BON ja LNCaP-solut ympättiin 96-kuoppaiselle viljelylevylle (musta mikrotiitterilevyllä, Greiner Bio-oni), vastaavasti klo tiheys 10

5 ja 0,5 × 10

5 solua kuoppaa kohti. 24 tuntia myöhemmin solut ladattiin 2,5 uM fluo-4 asetoksimetyyliesteri (Molecular Probes), kuten aiemmin on kuvattu [18]. Kalsium kuvantaminen suoritettiin käyttämällä käänteisen epifluoresenssimikroskooppia (CK40 Olympus) varustettu digitaalinen kamera (ORCA-ER, Hamamatsu Photonics). Ca

2+ niiden vastaukset havaittiin 460-490 nm: n virityksellä ja ≥ 515 nm emissio aallonpituuksilla. Tietojen hankinta ja analyysi suoritettiin käyttäen SimplePCI ohjelmistoa (Hamamatsu, Compix). Hajusteita ja mineraaliöljy valmistettiin ex tempore ensimmäisellä laimentamalla DMSO ja sitten sarjalaimennoksia osaksi Hanksin suolaliuokseen (Eurobio) täydennettynä 20 mM Hepes, pH 7,2. Ärsykkeiden testattiin konsentraatioilla, jotka eivät aikaan kalsiumin vasteita mock-transfektoiduissa soluissa. 1 uM isoproterenolia (Sigma-Aldrich) käytettiin positiivisena kontrollina. Ca

2 + signaali mitattiin suhteellista muutosta fluoresenssin intensiteetissä AF /F = (F-F

0) /F

0, jossa F

0 on fluoresenssi tasolla ennen stimulaatiota. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ja AF /F, joka on vähintään kaksikymmentä soluja.

In vitro

arviointi soluinvaasion

Kollageeni tyyppi I geelit valmistettiin, kuten on kuvattu de Wever [19]. Soluja viljeltiin 48 tunnin ajan, ennen kuin kylvö ne suspensiona yksittäisten solujen talletettu päälle tyypin I kollageeni geelejä. Edistää syrjäisimmillä alueilla, hajusteita ja mineraaliöljy laimennettiin ensin osaksi DMSO ja sitten kollageeni I liuoksen tai viljelyalustasta. Vaikutukset spesifisiä inhibiittoreita PI3Ky (AS605240) ja βγ alayksiköitä G-proteiinit (gallein) arvioitiin myös lisäämällä ne kollageenigeelin ja viljelyalustaan. Ohjauskalusteille, DMSO lisättiin samaan lopullinen pitoisuus laimentamiseen käytetyn näistä kemikaaleista. Lisätyn DMSO ei ylittänyt 0,2%, eikä se muuttaa määrää invasiivisen solujen verrattuna testit ilman DMSO: ssa (tuloksia ei ole esitetty). 24 tunnin kuluttua niiden kylvämisen, invasiiviset esitteleville soluille invasiivisia laajennuksia osaksi kollageenigeelin ja ei-tunkeutuvat solut laskettiin 10-15 mikroskooppikenttää satunnaisesti valittu. Tulokset ilmaistiin prosentteina invasiivisen solujen (invaasio indeksi). Morerover, F-aktiinisytoskeletonin havaittiin käyttäen rodamiinikonjugoitu phalloidin (Invitrogen). Tätä tarkoitusta varten solut fiksoitiin 20 minuuttia 3% paraformaldehydillä PBS: ssä huoneen lämpötilassa, sitten läpäiseviksi 15 minuutin ajan 0,5% Triton X-100 PBS: ssä ja blokattiin 30 minuutin ajan 2% BSA: ta, 1% glysiiniä PBS: ssä. Soluja inkuboitiin rodamiini-phalloidin (1:300) PBS: ssä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja pestiin perusteellisesti PBS: llä, ennen kuin havainnon kanssa käänteisen epifluoresenssimikroskoopilla.

Hiiret

Nod Scid Gamma ( NSG) koirashiirien kasvatettu eläintilat tilat Institut Gustave Roussy, jossa vapaasti ruokaa ja vettä. Muovi häkit oli kytketty hallinnassa tuuletettu telineisiin. Häkit eläinten kanssa altistuvat hajusteeton β-iononia kytkettiin erotettu ilmanvaihtolaitteen.

In vivo

arvioinnissa soluinvaasiota ja etäpesäkkeitä

LNCaP-solujen passage 25 ympättiin 8 viikkoa vanhoja kastroitu uros NSG hiiriä (kastraatio suoritettiin kaksi viikkoa ennen soluinokulaation). 10

6 solut suspendoitiin 75 ui RPMI 1640 plus 75 ui matrigeelin (BD Biosciences) ja pistää neulalla (26 G) ihonalaiseen tilaan, 2 sivustoja kussakin kylkeen hiirillä. Hajusteeton β-iononia ensin laimennettiin DMSO: hon pitoisuuteen 100 mM ja sitten RPMI + Matrigel seoksen lopullinen pitoisuus 100 uM. DMSO lisättiin myös samalla annos RPMI + matrigeelin seoksen ilman hajuste. Ensimmäinen ryhmä 5 hiiren ympättiin LNCaP-soluja (n läsnä ollessa DMSO) ja ei saanut mitään muuta käsittelyä. Viisi muuta hiiret inokuloitiin LNCaP-soluja (n läsnä ollessa DMSO) ja harjattu mineraaliöljyä kolme kertaa päivässä 6 viikon ajan ja sen jälkeen kolme kertaa viikossa, lopettamiseen asti. Kolmas 5 hiiren ryhmä inokuloitiin LNCaP-solujen läsnä ollessa, β-iononia DMSO: ssa. Nämä hiiret harjattu 1 mM β-iononia suoraan laimennetun mineraaliöljyssä kolme kertaa päivässä 6 viikon ajan ja sen jälkeen kolme kertaa viikossa, lopettamiseen asti. Ennen tappamista, jotkut eläimet tutkitaan ensin tomoscintigraphy (SPECT, NanoSPECT /CT Bioscan) käyttäen

99m-MDP, klassinen luun gammakuvaus agentti toiminnallinen kuvantaminen luun. Tämä analyysi ei suoritettu kaikille eläimille, koska se näytti vähemmän tietoa kuin röntgensäteet tutkimuksessamme. Näin kaikki hiiret tutkittiin

in vivo

mukaan Mikrotietokonetomografia tomografia (μCT) (CT120, General Electric Healthcare) havaitsemiseksi luun etäpesäke. 360 X ray ennusteet kerättiin 1 ° välein (100 kVp, 50 mA, 20 ms altistuminen) noin 5 min yhteensä skannauksen aikana. Kuvat jälleenrakennettiin 3D volyymit (50 pm resoluutio) on rekonstruktio klusterin käyttäen muunneltua teltta-FDK conebeam algoritmi (GE rekonstruktio ohjelmisto). 3D-data prosessoitiin käyttäen MicroView (GE Healthcare). Tietojen analyysi suoritettiin ensin yksittäisiä viipaleiksi (aksiaalinen, koronan, sagittaalinen) sitten rekonstruoitu volyymit ja MIP kuvia (maksimi-intensiteetin projektio). Eläimet lopetettiin kun kasvaimen koko ylitti 1,500 mm

3. Kun ruumiinavaus, kasvaimet ja kudokset tiedetään satama etäpesäkkeitä eturauhasen kasvaimia, kuten imusolmukkeet, keuhkot ja piikit, otettiin näytteet. Maksat ja Tyson rauhaset myös näytteet, jotkut maksa esiintyy poikkeavia ja jotkut Tyson rauhasten yllättävän suuri. Fiksoitiin 24 tuntia formaldehydin tallennetaan sitten 70% etanolilla 4 ° C: ssa. Varten piikit, kalkin toteutettiin vielä inkuboitu 10% EDTA, pH 7,4, 4 ° C: ssa yhden viikon aikana. Kaikki näytteet kuivattu etanoliin ja parafiiniin. Leikesarjojen 5 um paksuus valmistettiin ja vaha tolueeniin ja niihin lisätään etanolia ja sen jälkeen vedellä. Jotkin leikkeet värjättiin hemalun (RAL), eosiini ja Safran (HES värjäys). Immunohistokemia suoritettiin muihin kohtiin käyttämällä anti-PS GR (LS-A6332, Cliniscience), anti-PSA (ab9537, Abcam) tai kanin seerumia negatiivisena kontrollina, Vectastain Elite ABC-Peroxidase Kit Rabbit IgG (Cliniscience), ja DAB paljastus (SK-4100, Vector).

tulokset

syrjäisimpien endogeenisesti ilmaiseman BON solujen

Koska BON soluissa näyttää heterogeeninen morfologia, me eristetty homogeeninen alakloonit. TAI ilmentyminen tutkittiin nested PCR cDNA yhdeksästä klooneista käyttäen degeneroituneita alukkeita kohdistamista OR säilyneitä alueita, ja PCR-tuotteet sekvensointi. Havaitsimme syrjäisimpien selostukset kuudessa klooneista (taulukko S1). Niistä viisi näkyy ilmentymisen useamman kuin yhden OR-geenin tai pseudogeenistä, ja paneeli syrjäisimpien tunnistettu vaihteli klooni klooni. Näiden tulosten vahvistamiseksi, suoritimme sisäkkäisiä PCR alukkeilla erityisesti suunnattu aikaisemmin tunnistetut syrjäisimmille alueille. Itse asiassa kaikki yhdeksän kloonia, ilmaistuna syrjäisimpien transkriptit (taulukko 1), ja joitakin niistä (OR7D2, OR1F1) havaittiin useimmissa klooneja. On korostettava, että OR7A17, OR7D2 ja OR2A1 selostukset myös useissa kasvaimissa (EST lueteltu HORDE tietokannassa).

Arvioidaan tarkemmin, että toisin kuin OSN, BON solut co-express useita syrjäisimmillä alueilla, analysoimme TAI lauseke on yksisoluisia tason. Onnistuimme monistamaan cDNA vastaavat GAPDH tai β-aktiini useimpien testattujen solujen, mutta OR cDNA voitiin monistaa vain muutaman soluja, luultavasti siksi, että hyvin alhainen tai mRNA: ta yhden solutasolla. Tuloksemme osoittavat, että jotkut single BON solut eivät ilmentävät enemmän kuin yksi tai transkripti (kuvio S1a).

n heterologinen funktionaalisen ekspression syrjäisimpien BON soluissa

Koska BON solujen endogeenisesti express syrjäisimmille alueille, me infered, että ne voivat myös heterologisesti ilmentävät funktionaalista syrjäisimpien transfektion jälkeen OR1G1 ja OR17-40 geenejä. BON solut näyttivät ilmaista nämä heterologisia reseptoreita ja altistaa ne solukalvon (kuvio S1B). Olemme myös löydetty BON soluissa transkriptio REEP1, proteiini, joka helpottaa ilmaisutavoille OSN [20] (Kuva S1c). Sitten osoitettiin, että heterologisesti ilmaistuna reseptorit ovat toiminnallisia, indusoi kalsium- vasteen, kun ne stimuloidaan niiden ligandia (1-nonanolia ja OR1G1 ja helional varten OR17-40 [18], [21]) (kuvio 1). Kalsium vaste, joka indusoitiin stimuloimalla OR17-40 reseptori on vähäisempää kuin indusoima stimulaatio OR1G1 reseptorin, mutta se on huomattava. Erot tai vastetasot voi johtua eri ekspressiotasoja reseptorien eri kytkennän tehokkuutta endogeenisen G-proteiinit heterologisissa soluissa, tai eri tehokkuutta ligandit. Mock-transfektoituja soluja ei vastannut nonanoli eikä helional, joka osoittaa, että hajusteita testattujen eivät ole agonisteja syrjäisimpien alueiden endogeenisesti ilmaistu BON soluissa.

BON soluja transfektoitiin ohimenevästi ilmaista OR1G1 tai OR17-40 reseptoreihin. 72h myöhemmin solut fluo-4, ja stimuloitiin vastaavien haju- ligandien transfektoitujen syrjäisimpien (1-nonanolia ja helional). Kalsium vasteet johtuen vuorovaikutuksesta OR ja sen erityisen hajuaineella agonisti on ilmaistu keskimääräisen fluoresenssi-vaihtelu AF /F (%). (Avoimet ympyrät) OR1G1 soluja, 1-nonanoli; (Täytetyt vinoneliöt) OR17-40 soluja, helional; pylväät osoittavat keskihajonnan (n = 3). Mock-transfektoiduissa soluissa ei vastannut 1-nonanolia eikä helional.

TAI-indusoidun parantamiseksi solun invasiivisuus

käyttäminen BON solujen heterologisesti ilmentävät OR1G1 tai OR17-40 reseptoreihin, arvioimme invasiivisuus I-tyyppisen kollageenin geelit [19] nämä solut, stimuloidaan tai ei ole hajusteeton agonistit syrjäisimmät alueet. Puuttuessa hajuaineilla stimulaatiota, invasiivisuus BON soluja ei muutettu heterologisen ilmentymisen syrjäisimmät alueet (hyökkäys indeksi jää noin 3%, kuva 2a). Nonanoli stimulaatio kasvoi merkittävästi hyökkäyksen indeksi OR1G1-ilmentävien solujen (OR1G1 solut) kertoimella 2,7, kun taas helional stimulaatio lisäsi hyökkäyksen indeksi OR17-40 solujen kertoimella 2,5 (kuvio 2a). Havaitsimme, että 10

-6 ja 10

-7 M nonanoli aiheuttamaa saman hyökkäyksen tasolla, kun taas 10

-6 M ilmestyi tehokkaampi aktivoimaan OR1G1 kalsiumia kuvantaminen kokeissa. Tämä voi johtua siitä, ettei BON solujen päästä suuremman hyökkäyksen tasoa (noin 10% invasiivisia soluja). Nonanoli ja helional ei ollut merkittävää vaikutusta valetransfektoidun ohjaus soluissa. Nonanoli ei ollut merkittävää vaikutusta OR17-40 ilmentäviä soluja, eikä helional on OR1G1 ilmentäviä soluja. Lisäksi, vanilliini, antagonisti OR1G1 reseptorin [22], pystyi erityisesti torjumaan invasiivisuus aiheuttama nonanoli on OR1G1 soluissa. Hyökkäys indeksi valvonnan solujen kannustanut nonanoli yksin tai seoksena nonanoli ja vanilliinia pysyi muuttumattomana (kuvio 2a). Invasiivisia solu extensions I-tyyppisen kollageenin geelit, kuvaavat invasiivisia soluja, havaittiin myös, kun immunoleimaus F-aktiini cystoskeleton (kuvio 2b). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että

in vitro,

syrjäisimpien stimulaation hajusteita voidaan erityisesti edistää invasiivisuuden OR-ilmentäviä syöpäsoluja.

(a) BON-soluja transfektoitiin ohimenevästi ilmaista OR1G1 tai OR17-40 reseptoreita tai valetransfektoidun. Solut ympättiin kollageenin tyyppi I geelit ja kannustanut vastaavien haju- ligandit OR1G1 ja OR17-40 reseptorit (nonanoli: OR1G1 agonisti, vanilliinista OR1G1 antagonisti, helional: OR17-40 agonisti). Invasiivisia solut laskettiin 24 tuntia myöhemmin. Tulokset esitetään hyökkäyksen indeksin. (B) muuttaminen F-aktiinitukirangan BON solujen kollageenin tyyppi I matriiseja. F-aktiini paljastui rodamiinikonjugoitu phalloidin. Invasiivisia extensions kollageenigeelien luonteenomaiset invasiivisia solut on merkitty nuolilla. (C) LNCaP-solut ympättiin I-tyyppisen kollageenin geelit ja stimuloi PSGR ligandeja (β-iononia: agonisti, α-iononia: antagonisti). Invasiivisia solut laskettiin 24 tuntia myöhemmin. Tulokset esitetään hyökkäyksen indeksi suhteessa valvoa soluja ilman hajuste stimulaatiota. Keskihajonta kontrolli oli 13,42%. Tilastot suoritettiin käyttäen kaksisuuntaista Student testi ja palkit osoittavat keskihajonta (n = 3).

vahvistaneet tämän tuloksen käyttämällä LNCaP eturauhassyövän solut, jotka ilmentävät endogeenisesti OR, The PS GR. Tämä reseptori on tunnettu ja -antagonisteja hajusteita [12], vastaavasti β-iononia ja α-iononia. Käytimme 100 uM pitoisuus β-iononia edistää LNCaP-soluja, koska tämä annos oli jo raportoitu stimuloivan PSGR [12], ja se indusoi korkein invasiivisuus LNCaP-soluja meidän käsissämme (tuloksia ei ole esitetty). Kuten on esitetty kuviossa 2c, stimulaatio PSGR 100 uM β-iononia lisääntynyt invasiivisuus LNCaP-solujen kertoimella 2,75, ja tämä vaikutus oli täysin kumonnut antagonisti α-iononia. Yksin tämä antagonisti ei ollut vaikutusta LNCaP hyökkäystä tasolla. Vaikka ei ole mitään negatiivista kontrollia LNCaP-solut, jotka eivät ilmaista PSoR, jyrkkä farmakologinen vaikutus α-iononia puoltaa tietyn vaikutuksen β-iononia kautta PSoR stimulaatiota. Poissulkeminen ei spesifinen kemiallinen vaikutus β-iononia LNCaP-solujen indusoimaan invasiivisuus tukee myös se seikka, että α-iononia, joka on hyvin samanlainen kuin P-iononia ja levitettiin kaksi kertaa β-iononia annoksen, ei indusoinut invasiivisuus LNCaP-soluja. Lisäksi testasimme vaikutus 100 uM β-iononia on invasiivisuus PC3-solut, muut eturauhassyövän solut, jotka eivät ekspressoi PS GR [12], ja meillä ei ole noudattanut lisääntynyt invasiivisuus näissä soluissa. Koetulokset alla myös ajatusta, että LNCaP invasiivisuus voidaan parantaa PSoR stimulaatiota.

osallistuminen PI3Ky solussa invasiivisuus aiheuttama syrjäisimpien alueiden

PI3Ky aktivointi kautta GPCR: t voivat olla mukana muuttamassa toimintoja, kuten hyökkäys [23], ja ylikuulumisen hajuaineilla signalointi ja PI3Ky kuvailtiin hajuaistin aistineuroneihin [24], [25]. Meillä on siis tutkittava, onko PI3Ky voisi olla osa signalointireitin, joka laukaisee hajusteeton aktivoituminen syrjäisimpien alueiden ja edistää solujen invasiivisuus. Ensin osoitti ekspressiota PI3Ky in BON ja LNCaP-soluissa raakalysaatit immunoblottaus vasta-aineen kohdistaminen PI3Ky (tuloksia ei ole esitetty). Sitten arvioitiin invasiivisuus BON solujen hetorologously ilmentävät OR1G1 tai LNCaP-solujen stimuloitaessa agonisteja OR1G1 tai PSGR, kun läsnä on spesifinen inhibiittori PI3Ky (AS605240). 10

-6M of AS605240 on raportoitu täysin estää PI3Ky [26]. Koskevat BON soluihin käyttäen 10

-6M ja 10

-7M of AS605240 löysimme samalla suuri (noin 80%), mutta ei kokonaisvähennykselle solun invasiivisuus edistetään OR1G1 upon nonanolia stimulaation (kuva 3), mikä osoittaa, että maksimaalinen vaikutus havaitaan 10

-7M of AS605240. Siten PI3Ky näyttää olevan tärkeä rooli välittämisessä BON solussa invasiivisuudesta ajama OR stimulaation sen erityinen haju-, vaikka muut signaalinvälitysreittien saattaa myös olla mukana. Osallistuminen PI3Ky on vahvistettu LNCaP-soluja (kuvio 3). Toisin BON soluihin, PI3Ky estäjä AS605240 aiheuttama vähennys LNCaP invaasiokyvyn jopa ilman PSoR stimulaatiota. Siksi PI3Ky näyttää olevan mukana myös pohjapinta invasiivisuus LNCaP-soluja. Lisäksi koska PI3Ky voidaan aktivoida G

βγ alayksikköä G-proteiinit kautta GPCR aktivaation [27], käytimme gallein, G

βγ alayksiköstä: n estäjä, joka häiritsee vuorovaikutuksen G

βγ alayksiköt jossa PI3Ky [28], ja osoittivat, että se torjua parantamiseksi LNCaP solun invasiivisuus indusoiman PSGR stimulaation (kuvio 3). Tämä tulos tukee myös osallistumista PI3Ky in invasiivisuus kasvainsolujen aiheuttamien OR stimulaatiota.

BON soluja hetero- ilmentävät OR1G1 reseptoria ympättiin kollageenia tyyppi I geelit ja stimuloitiin nonanolia (OR1G1 agonisti) vuonna läsnäolo tietyn PI3Ky estäjä (AS605240). LNCaP-solut ympättiin I-tyyppisen kollageenin geelit ja stimuloitiin β-iononia (PS GR-agonistia) läsnäollessa tietyn PI3Ky estäjä (AS605240) tai inhibiittori βγ alayksiköistä G-proteiinit (gallein). Invasiivisia solut laskettiin 24 tuntia myöhemmin. Tulokset on esitetty hyökkäyksen indeksi suhteessa, että kontrollisolujen (ei haju- tai AS605240 eikä gallein). Keskihajonta ohjaus oli 4,74% torjunta- BON solut ja 13,86% torjunta- LNCaP. Tilastot suoritettiin käyttäen kaksisuuntaista Student testi ja palkit osoittavat keskihajonta (n = 3).

OR aktivaation aiheuttama tehostaminen syöpäsolun invaasiokyvyn

in vivo

Koska

in vitro

parantamiseksi solun invasiivisuutta syrjäisimpien alueiden aktivointi ehdottaa mahdollista roolia (ainakin jonkin verran) syrjäisimpien etäpesäkkeiden syntymistä

in vivo

, me ympätty LNCaP eturauhaskasvainsoluissa subkutaanisesti immuunivajaisiin NSG (NOD SCID gamma) hiirillä. Eläimet jätettiin joko hoitamatta tai päivittäin sivellään iholle PSoR agonistin β-iononia laimennettu mineraaliöljyyn (öljyinen täyteainetta soveltamisessa tarvittavia lipofiiliseen hajusteita päälle hiiren ihon), tai mineraaliöljyä yksinään kontrollina. Kasvaimen koko mitattiin ja etäpesäkkeitä havaittiin

in vivo

kuvantaminen ja post mortem immunohistokemia käyttäen vasta-aineita kohdistamista PSgr- tai PSA (prostataspesifisen antigeenin) (esimerkkejä selkärangan ja keuhkojen etäpesäkkeet näkyvät kuvassa 4). PS GR ekspressiota havaittiin primaarikasvaimille ja kaikissa etäpesäkkeitä (ks muita esimerkkejä kuvassa S2), joka vahvistaa, että tämä reseptori oli läsnä ja mahdollisesti aktivoida kokeissa. Ilman hoitoa, etäpesäkkeitä syntyi lähinnä imusolmukkeet solmut ja occasionnally selkärangan ja maksassa (kuvio 4a). Etäpesäkkeitä sijaitsevat imusolmukkeet solmut hyvin kehittyneet, kun ne, jotka sijaitsevat selkärangan ja maksassa olivat micrometastases. Määrä etäpesäkkeiden kasvoi käsittelemällä mineraaliöljyä ja niiden sijaintia oli erilaisia, kun läsnä on β-iononia. Oikeastaan, etäpesäkkeet ilmestyi keuhkoissa ja Tyson rauhaset vain hiiriä hoidettiin β-iononia (3 out of 5 eläinten Tyson rauhaset ja 2 out of 5 eläinten keuhkoissa). Lisäksi etäpesäkkeet sijaitsevat Tyson rauhaset oli pitkälle kehittynyt, joiden koot lähestyy 1,000 mm

3. Keuhkoissa, vain mikroetäpesäkkeet havaittiin, kuten selkärangan ja maksassa. Koska hiiret uhrata samaan aikaan, mutta riippuen kasvaimen koosta, osoitamme kuvioissa 5b ja 5c kehitys ajan määrän metastaasien lukumäärän mukaan ja uhrattiin hiirien ja keskimäärin etäpesäkkeiden hiirtä kohti aikaan of uhrauksia kunkin koeryhmän. Havaitsimme, että hiiret, joita käsiteltiin mineraaliöljyä tai β-iononia oli uhrattu aikaisemmin, koska nopeampi kasvaimen kasvua, ja että ne näytetään merkittävä kasvu etäpesäkkeitä määrä verrattuna käsittelemättömiin hiiriin. Samanaikaisesti myös havaittu, että kasvaimia kehittyi 85%: n ympättiin sivustoja hoitamattomilla hiirillä, kun he olivat vähemmän lukuisia (50%) mineraaliöljyssä tai β-iononia hoidetuissa hiirissä.

etäpesäkkeitä on merkitty nuolilla. Selkärangan, etäpesäkkeet havaittiin käyttämällä Mikrotietokonetomografia tomografia (maksimi-intensiteetin projektio) ja vahvisti post mortem HES värjäys ja immunohistologialla käyttäen anti-PSA (eturauhasen spesifisen antigeenin) ja anti-PS GR vasta-aineita (vain yksi etäpesäke on esitetty). Keuhkoissa, etäpesäkkeet leimasi HES värjäystä ja immunohistologialla käyttäen anti-PSA ja anti-PS GR vasta-aineita.

(a) määrä etäpesäkkeiden havaittu erilaisissa kudoksissa jälkeen hiiret uhrata (valkoinen: käsittelemätön kontrolli hiiret, harmaa: hiiret, joita käsiteltiin mineraaliöljy, musta: hiiret, joita käsiteltiin 1 mM β-iononia mineraaliöljyssä). (B) kumulatiivinen määrä etäpesäkkeitä, riippumatta niiden sijainnista, funktiona välinen aika LNCaP rokotus ja hiiret uhrata (valkoinen: käsittelemätön kontrolli hiiret, harmaa: hiiret, joita käsiteltiin mineraaliöljy, musta: hiiret, joita käsiteltiin 1 mM β -ionone mineraaliöljyssä). Hiiret tapettiin, kun kasvaimen koko ylitti 1,500 mm

3. Lukumäärä uhrattiin hiirien suluissa kunakin ajankohtana ja jokainen hiirten ryhmässä. (C) käyrät raportointi suhteet lukumäärän metastaasien lukumäärän mukaan uhrataan hiirten ajan funktiona (musta katkoviiva: käsittelemätön kontrolli hiiret, harmaa: hiiret, joita käsiteltiin mineraaliöljy, musta: hiiret, joita käsiteltiin 1 mM β-iononia mineraaliöljyssä).

tulokset kanssa mineraaliöljyä oli kiehtova. Koska syrjäisimmät alueet voidaan aktivoida eri molekyylit [2], [12], [18], me tutkimme, mineraaliöljy voi stimuloida PSoR in

in vitro

soluinvaasiota määrityksissä ja kalsiumia kuvantaminen kokeita. Mineraaliöljy lisäsi sekä invasiivisuus ja kalsiumia vaste LNCaP-soluja, ja PS GR-antagonisti α-iononia kumottu näitä vaikutuksia (kuvio 6 a, b). Nämä tulokset osoittavat, että mineraaliöljy komponentti stimuloitujen LNCaP-solujen kautta PSoR, edistää niiden invasiivisuus. Lisäksi LNCaP invasiivisuus aiheuttama mineraaliöljyä estyi PI3Ky tai G

βγ alayksiköt estäjät (vastaavasti AS605240 ja gallein), jotka osoittavat, että PI3Ky on mukana tässä prosessissa, koska se osallistuu solujen invasiivisuus aiheuttama β-iononia. Vaikka mineraaliöljy parannettu etäpesäkkeiden syntymistä, etäpesäkkeiden esiintyminen oli vielä selvempi, kun läsnä on β-iononia, jolloin solut leviää keuhkoihin ja Tyson rauhaset, joka tapahtui vain läsnäollessa β-iononia. Kaikki nämä tiedot lähentyvät sen osoittamiseksi, että stimulaation Tai PSoR, voi edistää levittämistä eturauhaskasvainsoluissa ja etäpesäkkeitä sukupolvi.

(a) LNCaP-solut ympättiin kollageenia tyyppi I geelit ja stimuloitiin mineraaliöljyn tai mineraaliöljyä sekoitettu 10

-4M β-iononia, 2,10

-4M α-iononia, 10

-7M AS605240 tai 10

-5M gallein. Mineraaliöljy oli ensimmäinen laimennettiin 1/4 DMSO: ssa (mineraaliöljy ei ole täysin liukoiseksi tällä annoksella, mutta tämä antoi meille mahdollisuuden odottaa erittäin suuri liukenemisen mineraaliöljy komponentit), ja sitten liuos laimennettiin 1/1000 elatusaineessa tai kollageeni I geeliä. Invasiivisia solut laskettiin 24 tuntia myöhemmin. Tulokset on esitetty hyökkäyksen indeksi suhteessa, että kontrollisolujen (vain DMSO). Pylväät osoittavat keskihajonnan. Keskihajonta ohjaus oli 3,67%.