Krooninen sairaus

tiivistelmä

pentaspan kalvo glykoproteiini CD133 (tunnetaan myös prominin-1) on laajalti käytetty markkerina sekä syövän ja normaaleja kantasoluja. Kuitenkin toiminta CD133 ei ole selvitetty. Tässä kuvaamme syövän kantasoluja linja perustetaan selkeä cell munasarjasyöpä (CCC) ja osoittavat, että CD133 vuorovaikutuksessa plakoglobin (tunnetaan myös γ-kateniinin), joka on desmosomien linkkeri proteiinia. Me osoittavat lisäksi, että knockdovvn CD133 RNA interferenssi (RNAi) johtaa downregulation of desmogleiini-2, joka on desmosomien kadheriinin, ja kumotaan solu- soluadheesiota ja tuumorigeenisyystesti CCC kantasoluja. Spekuloida, että CD133 voi olla lupaava kohde syövän kemoterapiassa.

Citation: Koyama-Nasu R, Takahashi R, Yanagida S, Nasu-Nishimura Y, Oyama M, Kozuka-Hata H, et al. (2013) Cancer Stem Cell Marker CD133 vuorovaikutuksessa Plakoglobin ja Controls desmogleiini-2 Protein Levels. PLoS ONE 8 (1): e53710. doi: 10,1371 /journal.pone.0053710

Editor: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 syyskuu 2012; Hyväksytty: 3. joulukuuta 2012 Julkaistu: 10 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Koyama-Nasu ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimusohjelma of Innovative Cell Biology mukaan Innovative Technology (Integrated Systems Analysis of Cellular onkogeeninen Signaling Networks), Grants-in-tuki tieteellisen tutkimuksen innovatiivisia Areas (Integratiiviset Syöpätutkimuskeskus microenvironment Network) ja tieteellisen tutkimuksen (C), Takeda Science Foundation ja osittain Global COE Program (Integratiiviset Life Science Perustuen tutkimus Biosignaling Mechanisms), MEXT, Japani. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä kantasolut uskotaan on kyky lisääntyä ja itse uudistaa ja vastaa kasvaimien synnyn, etäpesäke ja toistumisen [1], [2]. Syövän läsnäolon kantasoluja on osoitettu erilaisissa kasvaimissa [1]. Erityisesti, glioblastooma kantasoluja on tutkittu laajasti, koska ne voidaan ylläpitää seerumittomassa alustassa, jotka suosivat kasvua hermoston kantasolujen [3]. On kuitenkin vielä vaikea ylläpitää ja laajentaa syöpä kantasolut ovat peräisin muista kudoksista

in vitro

. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme onnistuneet luomaan syövän kantasoluja linjan selkeä cell munasarjasyöpä (CCC), joka on pahin ennuste keskuudessa munasarjan epiteelin syövät [4] ja osoittavat, että CD133 vuorovaikutuksessa plakoglobin, ohjaa desmogleiini-2-proteiinia tasot ja tarvitaan solujen soluadheesiota ja tuumorigeenisyystesti CCC kantasoluja.

tulokset ja keskustelu

viljelty CCC kantasoluja eristettiin potilaasta diagnosoitu CCC seerumittomissa olosuhteissa. Samanlainen kuin glioblastooma kantasoluja [5], CCC kantasoluja kasvoivat eksponentiaalisesti laminiinilla päällystetyillä astioita seerumittomissa olosuhteissa (Fig. 1A ja S1A). Kuten aikaisemmin on raportoitu muiden syöpien [3], [6], [7], CCC kantasolujen tehtiin erilaistumista, kun viljellään seerumia sisältävässä väliaineessa (CCC erilaistuneita soluja): niillä oli hieman elimellisen muutoksen (Fig. 1A), ja ekspressiotasot kantasolujen markkereita, kuten

CD133

[8],

Sox2

[9] ja

Lgr5

[10], vähenivät merkittävästi (Fig. 1 B) . Kun CCC kantasolut injektoidaan subkutaani- osaksi immuunivaste on hiiriä, kaikki hiirille kehittyi kasvaimia, jotka olivat histopatologisesti samanlaisia ​​niiden alkuperäisestä kasvaimesta (Fig. 1 C ja S1B). Sen sijaan yksikään hiirissä, CCC erilaistuneita soluja kehittyi kasvaimia, vaikka niiden kyky lisääntyä eksponentiaalisesti

in vitro

(Fig. 1 C ja S1A).

(A) CCC varsi ja eriytetyn (ero) viljelmässä. Vaihekontrasti valokuvat näkyvät. (B) mRNA-tasot on esitetty geenien arvioitiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä ja esitetään kertainen muutos yli mRNA-tasot CCC kantasoluja. Virhe palkit edustavat S.D. (

n

= 3). (C) CCC varsi tai erilaistuneita soluja subkutaani- istutetaan NOG hiiriä (

n

= 3). Seitsemän kuukautta transplantaation jälkeen hiiriä (ylempi) ja kasvaimet (alempi) valokuvattiin. (D) eluoituu immunopuhdistetun CD133 kalvosta osa CCC kantasolujen erotettiin SDS-PAGE: lla ja visualisoitiin hopeavärjäyksellä. (E) desmosomiproteiinien tunnistetaan massaspektrometrillä. Numerot ainutlaatuisia peptidien tunnistettu näkyvät. (F) Näytteet valmistettiin, kuten on kuvattu (D) ja immunoblotattiin vasta-aineet osoitetaan proteiineja. (G) Co-paikallistaminen CD133 (punainen) kanssa desmosomiproteiinien (vihreä). CCC kantasoluja immunovärjättiin vasta-aineilla osoitti proteiineihin. TO-PRO-3 jodidia käytettiin tuman DNA värjäytymistä (sininen). Mittaviivat edustaa 20 um.

ilmentymistä CD133 on tiukasti rajattu harvinainen väestön somaattisten ja syövän kantasolut [8]. Sen vuoksi on vaikeaa saada riittävän määrän soluja suorittaa biokemiallisia analyysi CD133 sisältävän proteiini-kompleksin. Hyödyntämällä kyky CCC kantasolujen kasvaa eksponentiaalisesti ja ylläpitää korkeaa ekspressiotasot CD133

in vitro

, ryhdyimme immunopurify endogeeniseen CD133 monimutkainen. CD133 immunosaostettiin membraanifraktio anti-CD133-vasta-aineen ja sen jälkeen vahvistuksen SDS-PAGElla ja hopeavärjäyksellä, immunopresipitaatit tehtiin nestekromatografia-massaspektrometrialla (Fig. 1 D). Tutkimuksessa yhteistyössä puhdistettu proteiinit tunnistettiin (taulukko S1), keskityimme huomiomme plakoglobin ja desmoplakin (Fig. 1 E), koska ne ovat komponentteja Desmosomi, joka välittää solu-soluadheesion [11]. Desmosomeja ovat junktionaalinen kompleksit koostuvat jäsenten kadheriinin perheen soluadheesion proteiineja ja yhdistää proteiineja, jotka pitävät solun pinnalla adheesioproteiineja solunsisäisiin keratiini tukirangan säikeitä. Plakoglobin ja desmoplakin toimivat pääasiassa desmosomien yhdistää proteiineja.

vahvistaneet kykyä CD133 olla vuorovaikutuksessa plakoglobin by

in vivo

pull-down määrityksissä. Kun lysaatti CCC kantasoluista suoritettiin immunosaostus anti-CD133-vasta-aineen, jota seurasi immunoblottaus anti-plakoglobin-vasta-aine, plakoglobin havaittiin yhdessä immunosaostettiin CD133: a (Fig. 1 F). Plakoglobin ei havaittu, kun kontrolli-IgG käytettiin immunosaostukseen. Kuitenkin meidän

in vitro

pull-down määrityksissä ei havaita yhdessä saostamalla plakoglobin fragmenttien kanssa, jotka sisältävät yksittäisiä sytoplasmadomeeneista CD133 (tuloksia ei ole esitetty). Tämä saattaa johtua siitä, että kalvo topologia CD133 on tärkeää sen yhdessä plakoglobin. Vaihtoehtoisesti CD133 ei saa suoraan liittynyt plakoglobin. Tulokset desmoplakin eivät olleet ratkaisevia, koska se kerasaostuneena joko anti-CD133-vasta-aine tai kontrolli-lgG alle meidän koeolosuhteissa.

immunohistokemiallinen analyysi CCC kantasolujen paljasti, että CD133 ja plakoglobin yhteistyössä sijaittava alueilla solun -solujen kontakti (kuvio. 1G). CD133 värjäytymistä ei havaittu, kun solut infektoitiin lentiviruksesta ilmentävät shRNA kohdistaminen CD133: a (Fig. 2C), mikä osoittaa spesifisyyden anti-CD133-vasta-aine. Desmoplakin havaittiin osittain kolokalisoituvat kanssa CD133: a (Fig. 1 G).

(A) CCC kantasoluja infektoitiin lentiviruksesta ilmentävät shRNA kohdistaminen CD133. Solut altistettiin mekaanisen rasituksen pipetoimalla PBS: ssä, joka sisälsi 1 mM CaCl

2 ja 0,5 mM MgCl

2. Kuvat ovat näkyvät (ylempi). Pylväsdiagrammi edustaa suhde solujen määrä /cluster numero (alempi). Virhe palkit edustavat S.D. (

n

= 3).

p

= 0,011 kanssa verrattuna hallita shRNA t testi. (B) CCC kantasoluja käsiteltiin, kuten on kuvattu (A). Solulysaatit altistettiin immunoblottaus vasta-aineita ilmoitettu proteiineja. (C) CCC kantasoluja käsiteltiin, kuten on kuvattu (A). Solut immunovärjättiin vasta-aineilla osoitti proteiinien (punainen). TO-PRO-3 jodidia käytettiin tuman DNA värjäytymistä (sininen). Mittaviivat edustaa 20 um. (D) CCC kantasoluja käsiteltiin, kuten on kuvattu (A). Solut ihonalaisesti immuunipuutteisiin hiiriin (

n

= 3). Yksitoista kuukautta transplantaation jälkeen hiiriä (ylempi) ja kasvaimet (keskellä) valokuvattiin. Pylväsdiagrammi esittää kasvaimen paino (alempi). Virhe palkit edustavat S.D. (

n

= 3).

p

= 0,007, jossa vertailu hallita shRNA t-testi.

suoritettiin immunohistokemiallinen analyysi desmogleiini-2 ja desmocollin-2, kaksi desmosomien kadheriineja, jotka on ilmaistu CCC kantasoluja . Olemme havainneet, että nämä proteiinit myös yhteistyössä paikallistaa CD133 (Fig. 1G). Erityisesti CD133 ja desmogleiini-2 oli hyvin samanlainen leviäminen. Kuitenkin, ei desmogleiini-2 eikä desmocollin-2 ei voitu havaita CD133 immunosaostumissa, mikä osoittaa, että ne eivät fyysisesti liittynyt (Fig. 1 F). Sitä vastoin, plakoglobin immunosaostumat havaittiin sisältävän CD133 sekä desmosomien kadheriineja (Fig. 1 F). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että CD133 vuorovaikutuksessa plakoglobin mutta ei desmosomiproteiinin sisältävä kompleksi desmogleiini-2 ja desmocollin-2.

vieressä tutkineet roolia CD133 säätelyssä solu-soluadheesion. Havaitsimme, että CCC kantasoluja ei voida helposti dispergoida pipetoimalla. Kuitenkin, kun solut infektoitiin lentiviruksesta ilmentävät shRNA kohdistaminen CD133, solut voidaan dispergoida pipetoimalla (Fig. 2A). Lisäksi riippuva pisara solu aggregaatiotutkimuksissa osoittivat, että CD133 Knockdown solut eivät koota tiiviisti ja voidaan dispergoida pipetoimalla (Fig. S2). Näin ollen, CD133 voi olla tärkeä tarttumista CCC kantasoluja. Selvittämiseksi molekyylimekanismin taustalla lasku solu-solu-adheesion, tutkimme ilmentymistasojen desmosomiproteiinien. Immunoblottauksen ja RT-PCR-analyysit paljastivat, että knockdovvn CD133 pienensi tasojen desmogleiini-2-proteiinia, mutta ei

desmogleiini-2

mRNA (Fig. 2B ja S3A), että tulos vahvistettiin immunohistokemia (Fig. 2C).

knockdovvn CD133 käyttämällä erillistä shRNA johti myös downregulation of desmogleiini-2 (Fig. S3B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin ihmisen suoliston epiteelisolulinja Caco-2, joka myös ilmentää suuria tasoja CD133 [12] (Fig. S3C). Lisäksi knockdovvn CD133 johti hieman levinnyttä lokalisoinnin plakoglobin (Fig. 2C). Lisäksi olemme havainneet, että pudotus on plakoglobin pienensi tasojen desmogleiini-2-proteiinia (kuvio. S3D, E). Yhdenmukaisesti näiden tulosten, roikkuu pudota solu aggregaatiotutkimuksissa paljasti, että knockdovvn desmogleiini-2 pienensi tarttumisen CCC soluja (Kuva. S2). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CD133 tarvitaan vakautta ja asianmukaista sijaintia desmosomiproteiinien.

CD133 on laajalti käytetty eristämään erilaisia ​​syövän kantasoluja, kuten CCC munasarja [8], [13]. Kuitenkin sen toiminnallinen osuus kasvaimien syntyyn on ollut epäselvä. Solu-solu-adheesio on luontainen ominaisuus kiinteitä kasvaimia, ja useita raportteja ovat ehdottaneet, että desmogleiini-2 on välttämätön tuumorigeenisyyden useita kasvaimia [14]. Siten tutkimme mahdollista roolia CD133 että tuumorigeenisyyteen CCC kantasolujen käyttäen shRNA koodaava lentivirus vakaasti pudotus CD133 ilme. Soft-agar pesäkkeitä muodostavien määritykset paljastivat, että pudotus on CD133 johti vähenemiseen pesäkkeitä muodostavien kyky CCC kantasolujen (Fig. S4). Lisäksi knockdovvn desmogleiini-2 vähensi myös pesäkkeen muodostumista. Kun CD133-knockdown-soluja ihon alle injektoitiin immuunipuolustus on heikentynyt hiirissä, ne kasvoivat merkittävästi alennettua kontrolliin verrattuna soluihin (Fig. 2D). Tämä tulos viittaa siihen, että CD133 tarvitaan tuumorigeenisyyteen CCC kantasoluja.

Tässä raportissa, osoitimme, että CD133 vuorovaikutuksessa plakoglobin ja ohjaa solun soluadheesion CCC kantasoluja. Erityisen kiinnostavaa on se, että knockdovvn CD133 CCC kantasoluja vähensi tasot desmogleiini-2. Mekanismi, jolla CD133-plakoglobin kompleksin stabiloi desmogleiini-2 on vielä tutkittava. Vuonna Veren kantasolut, CD133 tiedetään rikastettu sivustoja yhteytenä osteoblastien [15]. Näin ollen, CD133 voi toimia sekä syövän ja normaali kantasolujen säätelijänä solu-solu-vuorovaikutuksia. Olemme lisäksi osoittaneet, että CD133 on tärkeää tuumorigeenisyyteen CCC kantasoluja. Tämä havainto on yhdenmukainen aikaisempien raporttien kanssa, jotka osoittavat desmogleiini-2 on osallisena kasvainten synnyssä [14]. Siksi on kiehtova spekuloida, että CD133 ja /tai desmogleiini-2 voi olla terapeuttisia kohteita CD133-positiiviset epiteelin syövän kantasoluja.

Materiaalit ja menetelmät

tuumorinäytesylinterin ja Cell Cultures

Tutkimus hyväksynyt eettinen komitea Biomedical Research on Jikei Institutional Review Board, The Jikei University School of Medicine, Tokio, Japani. Kaikki potilaat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Kasvain näyte luokitellaan selkeä solu munasarjasyöpä saatiin potilaasta, kirurginen hoito on Jikei yliopistollisessa sairaalassa. Kasvaimet pestiin, ja mekaanisesti ja entsymaattisesti hajotetaan yksittäisiksi soluiksi. Kasvainsoluja viljeltiin laminiini (Sigma) päällystetyille astia DMEM /F-12-väliaineessa (Life Technologies), joka sisälsi B27 täydentää (Life Technologies), EGF: n ja FGF2 (20 ng /ml kutakin; Wako Pure Chemical Industries). Sillä

in vitro

erilaistumista, kasvaimen soluja viljeltiin DMEM /F-12-väliaineessa (Life Technologies), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. 293FT ja Caco-2-soluja viljeltiin DMEM: ssä (Nissui), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia.

Ihon alle ksenoqraftit

Viikon kuluttua lentivirus infektion, 1 x 10

5 solua injektoitiin ihonalaisesti 6 viikon ikäiseen NOG hiiriä (Central Institute for Experimental Animals) (

n

= 3). Kasvaimet histologisesti analysoitiin jälkeen hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) värjäys. Tutkimus hyväksyttiin eläinten eettisen komitean, The University of Tokyo, Tokio, Japani. Kaikki eläin koemenettelyn tehtiin mukaisesti politiikkaa eläinten eettisen komitean, The University of Tokyo, Tokio, Japani.

kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen NucleoSpin RNA Clean up kit (Takara) ja käänteiskopioitiin cDNA: han käyttämällä PrimeScript RT Master Mix (Takara). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen LightCycler480 SYBR Green I Master ja LightCycler480 Instrument (Roche). Tulokset normalisoitiin kanssa havaittu arvo

glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH)

. Alukkeet, joita käytetään real-time PCR olivat seuraavat:

GAPDH

eteenpäin (5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ’),

GAPDH

reverse (5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′);

CD133

eteenpäin (5′-AGTGGCATCGTGCAAACCTG-3 ’),

CD133

reverse (5′-CTCCGAATCCATTCGACGATAGTA-3′);

Sox2

eteenpäin (5′-TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA-3 ’),

Sox2

reverse (5′-CTGGGGCTCAAACTTCTCTC-3′);

Lgr5

eteenpäin (5′-GATTTCCTGCTTGACTTTGAGG-3 ’),

Lgr5

reverse (5′-GCAGGTGTTCACAGGGTTTG-3′);

plakoglobin

eteenpäin (5′-GATCTTCCGGCTCAACACC-3 ’),

plakoglobin

reverse (5′-GATGTTCTCCACCGACGAGT-3′);

desmogleiini-2

eteenpäin (5′- GGAAATTTTCAAGCTTTTGATGA-3 ’),

desmogleiini-2

reverse (5′-CCACAGAGATCCAATTATCTCTATCTT-3′).

Vasta

hiiren monoklonaalinen vasta-aine (mAb) ja CD133 (AC133) saatiin Miltenyi Biotec. Hiiren mAb desmocollin-2/3 (7G6), desmogleiini-2 (6D8) ja α-tubuliinin olivat Santa Cruz Biotechnology. Hiiren mAb plakoglobin oli BD Biosciences. Hiiren mAb GAPDH oli Milliporesta. Hiiren mAb desmoplakin (2Q400) oli peräisin Abcam ja käytetään immunohistokemiallisesti. Kanin polyklonaalista vasta-ainetta (pAb) ja desmoplakin oli peräisin Abcam ja käytetään immunoblottauksella.

Immunosaostusanalyysi ja Immunoblottausmääritys

Kalvo osa soluista hajotettiin hajotuspuskuriin [50 mM HEPES-NaOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP40, 1 mM ditiotreitolia ja proteaasiestäjäseostabletit (Roche)] (Fig. 1 D). Vaihtoehtoisesti kalvo fraktio hajotettiin hajotuspuskurissa, joka sisälsi 1% digitoniinia sijasta NP40 (Fig. 1 F). Lysaatit inkuboitiin anti-CD133, anti-plakoglobin tai valvontaa IgG1 immobilisoidaan Aktivoitu CH-Sepharose 4B (GE Healthcare) 4 h 4 ° C: ssa. Viiden pesun lyysipuskurilla, sitoutuneet proteiinit eluoitiin 100 mM glysiini-HCl: ää ja altistettiin trypsiinihajotus. Sen jälkeen kun oli poistettu suola ZipTip (C18, Millipore), näyte saatettiin nestekromatografia-massaspektrometrialla. Immunoblottausta eluoitu proteiinit fraktioitiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Immobilon-P, Millipore). Membraani tehtiin immunoblot-analyysillä käyttäen alkaliseen fosfataasiin konjugoitua anti-hiiri tai kani IgG: tä (Promega), kuten sekundäärisiä vasta-aineita. Visualisointi suoritettiin käyttäen NBT /BCIP kolorimetristä substraattia (Promega).

Massaspektrometrinen analyysi ja proteiini Identification

haulikko proteomic analyysit tehtiin lineaarinen ion trap-orbitrap massaspektrometriä (LTQ- Orbitrap Velos, Thermo Fisher Scientific) yhdistettynä nanoflow LC-järjestelmä (Dina-2A, KYA Technologies) kuten aiemmin on kuvattu [16]. Proteiini tunnistus suoritettiin etsimällä MS ja MS /MS-tulokset vastaan ​​RefSeq (National Center for Biotechnology Information) ihmisen proteiini tietokanta (32968 proteiinisekvenssien vuodesta 12 syyskuu 2011) käyttäen Mascot ver. 2.3.02 (Matrix Science). Metioniinin hapetus, proteiini N-terminaalinen asetylointi ja pyro-glutamination N-terminaalista glutamiinia asetettiin muuttuja muutoksia. Enintään kaksi jäi cleavages annettiin meidän tietokantaan haku ja toleranssi massan poikkeama asetettiin 3 miljoonasosaa (ppm) peptidin massat ja 0,8 Da MS /MS huiput, tässä järjestyksessä. Proteiini tunnistus perustui kriteeri on ainakin yksi MS /MS dataa Mascot tulokset, jotka ylittivät kynnysarvot (

p

0,01).

RNA Häiriöitä

shRNA oligonukleotidisekvenssien olivat seuraavat: CD133 # 1 (5′-GGAUACACCCUACUUACUAAA-3 ’), CD133 # 2 (5′-GCACUCUAUACCAAAGCGUCA-3′), desmogleiini-2 # 1 (5’-GUUAGCGAGAGCAUGGAUAGA-3 ’), desmogleiini -2 # 2 (5’-GCAUUAUCAGUAAUAAUUUGU-3 ’), plakoglobin (5′-GAGCAUGAUUCCCAUCAAUGA-3’).

Lentivirus Production

Lentivirusvektori (CS-RfA-CG) ilmentävät shRNA ohjaa H1-promoottori transfektoitiin pakkaus vektorit pCAG-HIV-gp ja pCMV-VSV-G-RSV-Rev osaksi 293FT-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Life Technologies). Kaikki plasmidit ystävällisesti H. Miyoshi (RIKEN Bioresource Center, Japani). Virussupernatanttia puhdistettiin ultrasentrifugoimalla 25000 rpm 90 minuutin ajan (SW28 roottori, Beckman). Infektio tehokkuutta seurattiin vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP) ilmentyminen kuin se ohjaa CMV-promoottori.

immunohistokemia

Solut maljattiin laminiini-pinnoitettu lasipeitinlevyille ja kiinteiden jääkylmällä metanolilla . Soluja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla jälkeen inkuboitiin toissijaisen vasta konjugoitu Alexa 488 tai 594 (Life Technologies). Sillä CD133 visualisointi, soluja inkuboitiin anti-CD133-vasta-aineen konjugoituna R-fykoerytriini. TO-PRO-3 jodidia (Life Technologies) käytettiin tuman DNA värjäystä. Solut valokuvattiin kanssa LSM510 META laser skannaus mikroskooppi (Carl Zeiss).

soluhajotusprosessin määritys

5 x 10

4-solut ympättiin laminiini-pinnoitettu 12-kuoppalevyille. Solut irrotettiin elylevyillä solukaapimella ja johdetaan 10 kertaa läpi 200-ul pipetin kärki PBS, joka sisälsi 1 mM CaCl

2 ja 0,5 mM MgCl

2. Kuvat otettiin vangiksi faasikontrastimikroskopiassa. Laajuus soluhajotusprosessin edusti suhde solujen määrä /cluster numero.

Hanging Drop Cell aggregaatiotesti

Solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä ja resuspendoitiin 5 x 10

5 solua ml väliaineessa. 7.5 x 10

3-soluja keskeytetään roikkuu pudotuksia kansi viljelymaljaan ja annettiin laskea yhteen yön yli. Sillä trituroimalla solut johdetaan 10 kertaa läpi 200-ul pipetin kärki. Kuvat otettiin vangiksi faasikontrastimikroskopiassa. Koko hiukkasten mitattiin käyttäen ImageJ 1.46r ohjelmistoa.

tukeminen Information

Kuva S1.

karakterisointi CCC kantasoluja. (A) leviämisen kinetiikkaa CCC kantasoluja. CCC varsi ja eriytetty (ero) soluja viljeltiin osoitettujen kertaa. Pylväsdiagrammi edustaa päivä (

x

-akselin) ja solujen määrän (

y

akselin). (B) kudospatologisia analyysi tuumoriksenograftien. HE värjäys on CCC kantasolujen ksenografti ja potilaiden kasvain näkyy.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0053710.s001

(TIF) B Kuva S2.

CD133 ja desmogleiini-2 tarvitaan tarttuvuuden CCC kantasoluja. CCC kantasoluja infektoitiin lentiviruksesta antaisi shRNA kohdistamista CD133 tai desmogleiini-2. Solut ympättiin riippuva pisara viljelmiin ja koota yhteen yön yli. Ennen (-) ja jälkeen (hiertäminen) solut altistettiin mekaaniselle rasitukselle pipetoimalla, kuvat otettiin kiinni faasikontrastimikroskopiassa (ylempi). Pylväsdiagrammi edustaa keskihiukkaskoko verrattuna soluihin, jotka ilmentävät ohjaus shRNA (alempi). Virhe palkit edustavat S.D. (

n

= 3). NS, ei merkittävää; *,

p

0,05 t testiä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0053710.s002

(TIF) B Kuva S3.

CD133 ja plakoglobin ohjata ekspressiotasot desmogleiini-2. (A) CCC kantasoluja infektoitiin lentiviruksesta ilmentävät shRNA kohdistaminen CD133. MRNA-tasot on ilmoitettua geenien arvioitiin kvantitatiivisella RT-PCR ja esitetään kertaluokkamuutos yli mRNA-tasoja soluissa, jotka ilmentävät ohjaus shRNA. Virhe palkit edustavat S.D. (

n

= 3). (B) CCC kantasoluja infektoitiin lentiviruksesta ilmentävät shRNA kohdistaminen CD133 (CD133 shRNA # 2). Solulysaatit altistettiin immunoblottaus vasta-aineita ilmoitettu proteiineja. (C) Caco-2-solut infektoitiin lentiviruksesta ilmentävät shRNA kohdistaminen CD133. Solulysaatit altistettiin immunoblottaus vasta-aineita ilmoitettu proteiineja. (D) CCC kantasoluja infektoitiin lentiviruksesta ilmentävät shRNA kohdistaminen plakoglobin. Solulysaatit altistettiin immunoblottaus vasta-aineita ilmoitettu proteiineja. (E) CCC kantasoluja käsiteltiin, kuten on kuvattu (D). MRNA-tasot on ilmoitettua geenien arvioitiin kvantitatiivisella RT-PCR ja esitetään kertaluokkamuutos yli mRNA-tasoja soluissa, jotka ilmentävät ohjaus shRNA. Virhe palkit edustavat S.D. (

n

= 3).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0053710.s003

(TIF) B Kuva S4.

CD133 ja demoglein-2 tarvitaan kiinnittymisestä riippumatonta kasvua CCC kantasoluja. CCC kantasoluja infektoitiin lentiviruksesta antaisi shRNA kohdistamista CD133 tai desmogleiini-2. Solut siirrostettiin pehmeässä agarissa ja viljeltiin 2 viikkoa. Pylväsdiagrammi esittää pesäkeluvussa suhteessa soluihin, jotka ilmentävät ohjaus shRNA. Virhe palkit edustavat S.D. (

n

= 4). *,

p

0,05 kanssa verrattuna hallita shRNA t testiä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0053710.s004

(TIF) B Taulukko S1.

Täydellinen peptidien tunnistettu massaspektrometrianalyysissä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0053710.s005

(XLSX) B