Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sinkki sormi nukleaasien (ZFN) ovat tehokkaita välineitä muokkaamalla geenien soluissa. Tässä käytämme ZFNs kysellä biologisen toiminnan

ADPGK

, joka koodaa ADP-riippuvaisen glukokinaasi (ADPGK), ihmisen tuumorisolulinjoja. Hypoteesi testasimme että ADPGK käyttää ADP fosfory- glukoosi olosuhteissa, joissa ATP tulee rajoittavia, kuten hypoksia. Olemme tunnettu kaksi ZFN tyrmäys klooneja kussakin kaksi riviä (H460 ja HCT116). Kaikki neljä kloonit oli lukukehysmutaatioita kaikissa alleeleissa kohdepaikkaan eksonissa 1.

ADPGK,

ja olivat ADPGK-null immunoblottauksella.

ADPGK

tyrmäys oli vähän tai ei lainkaan vaikutusta soluproliferaatioon, vaan vaarantunut kyky H460-solujen hengissä siRNA vaiennettu heksokinaasilla-2 alle hapellista olosuhteissa, joissa klonogeeniset selviytymisen putoamisen 21 ± 3% vanhempien linjan 6,4 ± 0,8% (p = 0,002) ja 4,3 ± 0,8% (p = 0,001) ja kahden aihiot. Samanlainen lisääntynyt herkkyys klonogeeniset soluntappokyky havaittiin alle anoxia. Tällaisia ​​muutoksia ei havaittu, kun

ADPGK

oli tyrmäsi HCT116-soluissa, joita varten vanhempien linja oli vähemmän herkkä kuin H460 hapettomuudelle ja heksokinaasilla-2 hiljentäminen. Vaikka tyrmäys

ADPGK

vuonna HCT116-soluissa aiheutti muutamia muutoksia globaalissa geenien ilmentyminen, tyrmäys

ADPGK

H460-soluissa aiheuttanut merkittäviä ylössäätöä mRNA koodaavat soluadheesion proteiineja. Yllättäen, voisimme erottaa mitään johdonmukaista vaikutusta Glykolyysivaiheen mitattuna glukoosin kulutusta tai laktaatin muodostumista alla hapenpuute tai solunulkoinen happamoitumista rate (Seahorse XF Analyzer) alle hapellista olosuhteissa eri tiedotusvälineissä. Kuitenkin hapenkulutus hinnat olivat yleensä heikompi

ADPGK

aihiot, joissakin tapauksissa merkittävästi niin. Yhdessä tulokset osoittavat, että

ADPGK

voi edistää kasvainsolujen eloonjäämisen olosuhteissa korkea glykolyyttisen riippuvuus, mutta fenotyyppi johtuvat tyrmäys

ADPGK

on solulinja riippuvainen ja näyttää liity pohjustus Glykolyysivaiheen näitä rivejä.

Citation: Richter S, Morrison S, Connor T, Su J, Print CG, Ronimus RS, et al. (2013) Zinc Finger nukleaasi välittämä Knockout ADP-Dependent Glukokinaasimääritys in Cancer Cell Lines: Vaikutukset Cell Survival ja mitokondrio oksidatiivisen metabolian. PLoS ONE 8 (6): e65267. doi: 10,1371 /journal.pone.0065267

Editor: Mark Isalan, Center for Genomic asetus, Espanja

vastaanotettu 5 maaliskuuta 2013 Hyväksytty 23. huhtikuuta 2013 Julkaistu: 14 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Richter et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Royal Society of New Zealand Marsden Fund (www.royalsociety.org.nz/programmes/funds/marsden/). SLM tukee National Health ja Medical Research Council (NHMRC) Urakehitys Fellowship ja projekti avustusta NHMRC (1027226 ja 1027227). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tunnistaminen lukuisten kandidaattigeenejä kautta genomista analyysi on luonut kiireellisesti uusia lähestymistapoja asettaessa biologista funktiota. Erittäin sekvenssispesifistä sinkki sormen nukleaasien (ZFN) on apuväline kohdennettuja geenin muokkausta elävissä soluissa [1] – [6] ja ovat yksi kehittyvien funktionaalisen genomiikan välineitä tutkia genotyypin /fenotyypin suhteita. Erityisesti dimeerisiä ZFNs kykenee tunnistamaan 18-42 emäsparin sekvenssit voidaan ottaa käyttöön kaksijuosteisen DNA taukoja ainutlaatuisissa paikoissa genomissa. Nämä DNA taukoja aloittaa virhealtista ei-homologisen end liittymällä korjaus tuottaa paikkasidonnainen, heterogeeninen mutaatioita (enimmäkseen pieniä indeleitä jotka häiritsevät geenin toiminnan) tai, kun läsnä on luovuttaja-DNA-sekvenssi, esitellä määriteltyjen mutaatioiden kautta homologia-suunnattu korjaus . Viimeaikaiset tutkimukset vahvistavat korkea sekvenssispesifisyytensä of mittatilaustyönä ZFNs soluissa [7] – [10].

Täällä käytämme ZFN teknologiaa kuulustella biologisen toiminnan ihmisen geenin,

ADPGK

, joka koodaa ADP-riippuvaisen glukokinaasi (ADPGK). Yllättäen antanut laajan tutkimuksen glukoosin fosforylaation keskeisenä reaktio välittäjän aineenvaihduntaa monia vuosikymmeniä [11], nisäkkäiden ADPGK havaittiin vasta äskettäin kautta järjestyksessä samalla tavalla arkkien ADP-riippuvaista glucokinases [12]. Fylogeneettinen analyysi osoittaa esi-geeni sivusuunnassa siirretty Archaea varhain metazoan kehittyminen [12]. Puhdistettu rekombinantti hiiren [12] ja ihmisen [13] entsyymejä on vahvistettu fosforyloivan glukoosin, kanssa epätavallinen ominaisuus (kuten varten arkkien enyzmes [14]), että fosforyyli luovuttaja on ADP päinvastoin kuin hyvin tutkittu ATP-riippuvaisten selkärankaisten heksokinaasilla isoformit (HK1-4). Hiiren ADPGK on melko spesifinen glukoosin, kanssa vähemmän kyky fosfory- mannoosin ja fruktoosin (20% ja 10% korko glukoosi); sillä on alhainen näennäinen K

M sekä glukoosia (96 uM) ja ADP (260 uM), ja estyy suuria pitoisuuksia glukoosia ja sen tuotteiden AMP, mutta toisin kuin HK1-4, eikä glukoosi-6- fosfaatti. Biologisen roolin eukaryoottisten ADPGKs ei ymmärretä hyvin; RNAi näytöt

C. elegans

ja HeLa ole tunnistaneet ilmiasuun [15] – [17], vaikka tuore raportti on osoittanut roolin ADPGK T-solureseptorin signalointi kautta kulkeutuminen glykolyyttisen vuon että glyseroli-3-fosfaattidehydrogenaasin sukkula , jolloin stimulaatio mitokondrioiden reaktiivisten hapen lajien (ROS) [18]. Kuitenkin biokemialliset ominaisuudet ADPGK, erityisesti sen kykyä hyödyntää ADP, johti meidät oletuksia, että se voi olla tärkeä rooli pohjustusta Glykolyysivaiheen stressiolosuhteissa jossa ATP tulee rajoittava [12], kuten hypoksiaolosuhteissa kun solut tulevat hyvin riippuvaisia ​​glykolyyttisissä ATP sukupolven [19].

Kun otetaan huomioon glukoosin fosforylaation kasvaimen aineenvaihdunnassa, keskitymme tässä roolista ADPGK ihmisen kasvainten solulinjoissa. Syöpäsolut ovat erittäin riippuvaisia ​​Glykolyysivaiheen, ensimmäisenä havaittiin Otto Warburg 1920 [20], [21], ja siihen liittyviin metabolisiin uudelleenohjelmointi on hiljattain ehdotettu mahdolliseksi tunnusmerkki syöpä [22]. Erityisesti kohonnut glykolyyttisissä flux kasvainsoluissa katsotaan varmistavan välituotteita anabolisia väyliä ja lisätä antioksidanttipuolustusta läpi NADPH sukupolven kautta pentoosifosfaattireitistä [23], [24]. Expression of heksokinaasista on usein säädelty syöpäsoluissa osana tätä metabolisen kytkimen [25]. ADPGK ilmentyy vahvasti ihmisen kasvaimia ja kasvainsolulinjoja, sekä mRNA ja proteiini tasolla, vaikka on vain vähän viitteitä säätelyä ylöspäin suhteessa normaaliin kudos- ja (toisin kuin monet glykolyyttiset entsyymit), ei ole säädelty anoksian, hypoksia tai HIF-1 kasvaimen soluviljelmissä ja osoittaa vähäistä riippuvuutta solunulkoisen glukoosipitoisuudesta [13]. Ottaen kuitenkin huomioon, että hätätoimia ATP ehtyminen asennettaisiin nopeimmin jonka konstitutiivisesti entsyymi, ettei sääntelyn

ADPGK

ilmaisun hypoksia ei sulje pois roolia pohjustusta Glykolyysivaiheen näissä olosuhteissa.

ensimmäinen pyrkimys testata tätä hypoteesia tutkittiin estävä vaikutus

ADPGK

ilmaisun, ja ilman tukahduttaminen HK2, vuonna HCT116 ja H460 ihmisen kasvainsolulinjoissa käyttäen RNA-interferenssi [13]. Tämä tutkimus osoitti korkeampia mRNA ja proteiinin ilmentyminen sekä ADPGK ja HK2 H460 kuin HCT116-soluissa, mutta ei osoittanut mitään merkittävää vaikutusta anaerobiseen Glykolyysivaiheen (glukoosin kulutusta ja laktaatti muodostumista), tai klonogeeniset solujen eloonjäämistä Lyhytaikaisella anoxia joko linja , vaikka pieni lasku aerobista pinnoituksen tehokkuuden H460-solujen osoitettiin, kun

ADPGK

pudotettiin [13]. Kuitenkin esto

ADPGK

ilmentyminen oli epätäydellinen tässä tutkimuksessa (tyypillisesti ~60-90% vähennys proteiinia merkitty western blottauksella), herättää kysymyksen, onko jäljellä ADPGK toiminta on saattanut peittyä fenotyyppi.

Tässä tutkimuksessa olemme kiertää epätäydellinen vaiennettaisi

ADPGK

käyttämällä erityisiä ZFNs toteuttaa usean alleelinen mutaatiotapahtumaa inaktivointi geenin, tuottaa ADPGK-null H460- ja HCT116 solulinjoissa. Pari ZFNs käytetään tässä kohdistaa genomisesti ainutlaatuinen 37 emäsparin tunnistussekvenssiin ensimmäisten eksonia

ADPGK

geeni. Kaksi itsenäistä

ADPGK

-null kloonien vahvistettu lukukehysmutaatioita kertyi kussakin geneettinen tausta. Nämä kloonit määriteltävä niiden leviämisen, klonogeeniset selviytyminen ja glykolyyttisissä vuon aerobisissa ja anaerobisissa olosuhteissa. Solunulkoinen happamoituminen (mittana Glykolyysivaiheen) ja mitokondrioiden hapenkulutusta mitattiin myös käyttäen Seahorse XF analysaattori. Lopuksi, kyky näistä solulinjoista kasvavan tuumoriksenografteja, ja vakaan tilan osuus hypoksinen solujen tuloksena kasvaimissa, verrattiin vanhempien linjat.

Tulokset

Generation

ADPGK

-null Cell Lines käyttäen ZFNs

ADPGK

putosi kahdessa geneettisissä taustoissa (HCT116 ja H460) käyttäen CompoZr ™ ZFNs mittatilaustyönä käyttöön kaksinkertaisen säikeen katkoksia klo genomisesti ainutlaatuinen kohdepaikkaan ensimmäisen eksonin

ADPGK

geenin (kuvio 1A). Kyky ZFNs mutaatioiden sivustosta testattiin HCT116-soluissa käyttäen Surveyor ™ mutaation havaitseminen määrityksessä (kuvio 1 B), seuraavasti lipidi-pohjainen kotransfektion GFP-plasmidin ja FACS-lajittelu 24 tuntia myöhemmin rikastamiseksi transfektoitujen solujen . 473 emäsparin alue ympäröi ZFN leikkaus sivuston monistettiin PCR ja tuotteet denaturoitiin ja uudelleen hehkutettu tuottaa epäsuhta kuplia ZFN leikata sivustoja. CEL-II-nukleaasia [26] pilkkomisen epäsuhta kuplia tuloksena ennustettu tuotteet (256 ja 217 bp) pilkkomista varten kohdepaikkaan. Band densitometrian kuvan kuvion 1B osoitti, että suhde summataan pilkkoutumistuotteet vanhempien bändi oli 66% (0,399 /0,601) varten ZFN käsiteltyä DNA valmistajan toimittamia (kaista 2) ja 68% (0,403 /0,597) for ZFN-transfektoitujen HCT116-solujen (kaista 4) tässä kokeessa, mikä osoittaa tiheä site-spesifisiä mutaatioita. Myöhemmin kokeita, elektroporaatiota sijasta rasva-transfektioon edelleen lisätä transfektiotehokkuudet.

(A): n ominaisuudet

ADPGK

geenin, jossa sijainti-alukepareilla ja dimeerinen ZFN kohdistaminen site. (B) PCR /CEL-II nukleaasi (Surveyor) määritys mutaation havaitsemiseen klo ZFN kohdepaikkaan. HCT116-solut transfektoitiin pari ADPGK ZFNs ja GFP-plasmidi. Yksi päivä myöhemmin genomi-DNA: ta valmistettiin yhdistettiin, FACS-lajiteltu GFP-positiivisten solujen määrityksessä (kaista 4). Kaista 1: DNA-tikkaat. Kaista 2: positiivinen kontrolli-DNA ADPGK ZFN-käsiteltyjen K562-solut. Kaista 3: käsittelemätön HCT116-solut. (C) ADPGK ZFN käsiteltyjen HCT116-solut kloonattiin ja seulottiin

ADPGK

Western blot. (D) Perimän DNA kopioida numeron qPCR varten alukeparia CNV1-3. Tulokset piirretään suhteessa WT DNA, jossa on kaksi

ADPGK

alleeleja. (E) Sekvensointi ZFN tunnistuskohdan (ennustettu cut päällä pienellä) johti poistot (-) ja lisäykset (alleviivattu)

ADPGK

-null HCT116 klooneja C3 ja IC10. Johdettua kappale numero kunkin alleelin on esitetty.

kloonit eristettiin

ADPGK

ZFN saaneilla populaatiot seulottiin immunoblottauksella puuttumisen luonteenomaisen 54-kDa ADPGK band. Kaksi ehdokasta aihiot (HCT116 C3 ja IC10) ilman havaittavaa ADPGK proteiinia (kuvio 1 C) tunnistettiin kahdesta eri kierrosta transfektion (C3 turvatarkastuksesta 12 kloonien jälkeen FACS rikastamiseen, ja IC10 131 klooneista elektroporaation jälkeen ilman virtausta lajittelua käyttäen olosuhteita, jotka antoi transfektion tehokkuus -70% käyttämällä GFP-plasmidi), mikä osoittaa yleisesti matala taajuus bi-alleelinen knockout johtaa täydelliseen menetykseen immunologisesti proteiinia. Suurempi osuus kloonien näyttivät osoittavan alennetussa ADPGK proteiinin ilmentymisen (tuloksia ei ole esitetty), mikä johtuu mahdollisesti mutaatiosubstituoimalla inaktivaatio yhden alleelin. Sen testaamiseksi, matalataajuista null linjat (2/143 kloonit) kuvastaa vaarantunut selviytymistä tai proliferaatiota bi-alleelinen aihiot, me seurasimme taajuus mutaatiot ZFN transfektoiduissa HCT116 altaan käyttämällä Surveyor (PCR /CEL-II nukleaasia) määritys. 256 ja 217 emäsparin bändejä vähentynyt yli kaksi viikkoa kulttuuri (kuva S1A), vaikka vastaavaa laskua ajan nähtiin erillisellä ZFN pari kohdistaminen 8

th eksonin

POR

(kuva S1B) , joka koodaa NADPH; sytokromi P450 oksidoreduktaasi. POR-null HCT116 klooneja eristettiin korkeammalla taajuudella (3/14) käyttäen

POR

ZFN pari. Täten etenevä menetys

ADPGK

ja

POR

mutaatioita on todennäköisesti osoitus heikentynyt leviämisen /eloonjäämistä solujen korkeimmat plasmidien kopioluvun transfektion jälkeen.

Kopioi numero sisällä

ADPGK

geeni arvioitiin kahden ADPGK nolla kloonia (C3 ja IC10) mukaan qPCR käyttämällä alukeparia reunustavia ZFN kohdesekvenssin (CNV2 ja 3) ja toinen tunnustaa eksonia 7 (CNV1) 31 kb pois (Kuva 1 D). Tämä osoitti, että läsnä kaksi kopiota

ADPGK

että aihiot, kuten vanhemman linjan (yhdenmukainen Sanger Cancer Genome Project; www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP/cghviewer /CghViewer.cgi), lukuun ottamatta yhden kopion alue lähellä ZFN tavoite vetoavat HCT116 klooni C3. Sekvensointi poikki ZFN kohdepaikan perimän DNA näistä null klooneista osoittivat lukukehysmutaatioita molemmissa (kuvio 1 E). Nämä lukukehyksen tuottaa ennenaikaisen stop-kodonit tuloksena ennustettu typistettyjä proteiineja 75 ja 84 aminohappoa, josta puuttuu ADP kinaasidomeeni sijaitsee aminohappojen 52 ja 497 koko pituuden isoformin (www.uniprot.org), ja näin ollen niiden odotetaan olevan katalyyttisesti epäaktiivinen. Toteaminen vain yhden mutatoidun (ja ei WT) sekvenssin klooni 1C10, yhdistettynä kopioluvun kaksi on CNV2 ja 3, viittaa siihen, homologisen rekombinaation avulla alkuperäisen ZFN aiheuttama mutaatio templaattina johti vähentämiseen homotsygoottisiksi. HCT116 C3 myös vain yhden sekvenssin ZFN kohdepaikassa, mutta kopioluku yksi CNV2 ja 3 ehdotettu suuri poisto. Tämä vahvistettiin monistamalla ja sekvensoimalla laajennettu alue, tunnistetaan 2963 poisto ulottuu CNV2 ja CNV3 sivustoja (kuva S2).

transfektio H460 solut samalla

ADPGK

ZFN plasmideja ei tuottanut

ADPGK

-null kloonien seulonta 127 kloonien jälkeen nucleofection yksin ja seulonta 24 kloonien jälkeen nucleofection ja FACS rikastamiseen. Tämä alhainen tehokkuus saattaa heijastaa toimii kolme

ADPGK

alleelien H460 (Sanger Cancer Genome Project), jota vahvistettiin kanssa qPCR-pohjainen kopioluvun määritys (kuva S3). Kaksi kloonia oli vähentynyt ADPGK proteiinin tasot (ID5 ja VD6; kuvio 2A), mikä viittaa siihen, ne voivat tehdä mutanttialleelia, joten ne suoritetaan toinen kierros ZFN transfektion (elektroporaatio ja FACS), joka tarjoaa 5/121 klooneja, joilla ei ole havaittavaa ADPGK proteiinin kahden valittiin lisäanalyysiä varten (IID10 päässä ID5 ja IIE5 päässä VD6) (kuvio 2A). Kopioluvun määrittäminen (kuvio 2B) yhdessä sekvensointi ZFN kohdepaikan (kuvio 2C) osoitti homotsygoottinen kehysmuutosdeleetiot yhdisteen poisto /emässubstituution mutaatio kloonin H460 IIE5 antaa ennustetun katkaistun proteiinin 89 aminohappoa. Clone IID10 oli 62 bp: n deleetio on vähintään yksi alleelin, mahdollisesti tuottaa proteiinin 62 aminohappoa, kun taas toinen alleeli (t) suorittaa useita päällekkäisyyksiä DNA-segmentin alavirtaan ZFN leikkaus päällä, jotka eivät olleet täysin tunnistettu.

(A) Western blot-H460-solujen transfektion jälkeen ADPGK ZFNs (kloonit ID5 ja VD6), ja

ADPGK

-null klooneja, jotka ovat peräisin näistä toisen kierroksen ZFN transfektion (IID10 ja IIE5). (B) Perimän DNA kopioida numeron qPCR varten alukeparia CNV1-3. Tulokset piirretään suhteessa WT DNA, jossa on kolme

ADPGK

alleeleja. (C) Sequencing poikki ZFN leikkaus sivusto näyttää poistot (-) ja lisäykset (alleviivattu) varten

ADPGK

alleelien H460 klooneja IID10 ja IIE5.

leviämisen ja kyky muodostaa klooneja

ADPGK

Knockout Cell Lines

ADPGK-null-solulinjoja sekä geneettiset taustat osoitti samanlaista kaksinkertaistaminen kertaa WT linjat, kun viljellään tavanomaisissa aerobisissa soluviljelmässä olosuhteissa (kuvio 3A ja B), jossa on mahdollista hieman laski soluproliferaatioon varten HCT116 IC10 linja. Pesäkemorfologiaa faasikontrastimikroskopiassa oli myös samanlainen kuin vanhempien solulinjojen (kuvio 3C ja D), vaikka H460 IID10 solut olivat hieman alttiimpia pyöristystä ylöspäin ja irrotessa lautasen.

(A /B). Solutiheys ymppäyksen jälkeen 24-kuoppalevyille 10

5 /ml. Arvot ovat keskiarvo ja SEM kolmelle rinnakkaiselle viljelmälle. (CD). Faasikontrastimikroskopiaa (10 × tavoite suurennus) WT ja Knockout kloonien T-pulloissa.

tutkimiseksi edelleen leviämisen, HCT116 ja H460-solulinjoja viljeltiin normoksia 54 ja 72 tuntia, vastaavasti, ja solujen määrä, soluvolyymiä, solusyklin jakelun ja kyky muodostaa klooneja mitattiin (taulukko 1). Merkittäviä eroja ei havaittu HCT116 C3 verrattuna WT; kuitenkin kaksinkertainen kasvu G1 vaiheessa soluissa nähtiin HCT116 IC10, sopusoinnussa väheneminen leviämisen edellä mainittiin. Plating tehokkuus oli samaa luokkaa kaikkien kolmen HCT116 solulinjoissa, mutta hitaampi leviämisen HCT116 IC10 näkyi merkittävästi vähentynyt siirtomaa säteellä. Molemmat H460

ADPGK

-null kloonit osoittivat pieni mutta merkittävä lasku solujen määrä, ja pieni lisäys G2 /M vaiheessa olevien solujen. Lisäksi H460 IID10 oli lisääntynyt keskimääräinen solun tilavuus ja osoitti suuntaus laskivat pinnoitus tehokkuuden vähenemisestä sekä siirtomaa säde, johtuen mahdollisesti irtoaminen solujen pesäkkeistä. Kaiken kaikkiaan tulokset viittaavat vähäinen vaikutus proliferaatioon, mutta tämä ei ollut yleinen löydös poikki solulinjat ja kloonit.

Global Gene Expression in

ADPGK

-null Lines

sen tutkimiseksi, tyrmäys

ADPGK

vaikuttaa geenien ilmentyminen, kaksi

ADPGK

-null klooneja (HCT116 C3 ja H460 IIE5) samanlaisia ​​leviämisen ja pesäkemorfologiaa niiden vanhempien linjat valittiin microarray analyysi käyttäen Affymetrix Human Gene 1.0 ST mikrosiruja. Single kulttuurien HCT116-C3

ADPGK

-null linja ja HCT116 vanhempien soluja verrattiin ensimmäisessä kokeessa, ja kahtena kulttuureja sekä HCT116-ja H460 paria toisessa kokeessa.

transcriptome on

ADPGK

-null HCT116 C3 linja näytti olevan suurin piirtein samanlainen kuin WT HCT116-linjan (kuvio 4A) eikä ilmentyvät eri transkriptien tunnistettiin kun väärä löytö korko säädettiin 5%: iin Benjamini -Hochberg menetelmällä. Vaikka tämä analyysi ehdotti, että määrä ilmeisesti differentiaalisesti ilmaisi selostukset ollut odotettua suurempi johtuu sattumasta, on yhä mahdollista, että pieniä määriä mRNA-transkriptien voi olla autenttisesti säännelty seuraavia

ADPGK

geenin inaktivaatio HCT116-soluissa. Ei ollut todisteita muutoksia ilmentymisen glykolyyttisissä geenien muut kuin ilmeinen 2-kertainen lasku glukoositransportterin

SLC2A3

. Kiehtovan kuitenkin sisällä kärkipään 22 koetinsarjojen (taulukko S1), selostukset kahdeksan Y-kromosomin geenien alassäädetty tyrmäys linjaa. Vertailtiin karyotyyppi HCT116-C3 WT linja, olemme huomanneet, että jälkimmäinen sisältää solujen ala- populaation säilyttää Y-kromosomi taas HCT116 C3 linjan (ja HCT116 1C10 viiva) käsittää vain yhden karyotyyppi puuttuu Y-kromosomi (taulukko S2 ). Siten säätely alaspäin Y-kromosomin transkriptien voi olla artefakti johtuvat kloonivalinnan of Y-miinus variantti.

RNA analysoitiin Affymetrix Human Gene 1.0 ST mikrosiruja (A) scatterplot osoittaa tarkoittaa ilmaus arvot HCT116 C3 verrattuna WT (3 kulttuureissa kukin). (B) scatterplot osoittaa tarkoittaa ilmaus arvot H460 IIE5 vs. WT (2 viljelmät kukin). (C) Lämpö kartta 50 kärkipään ilmennetty eri koetinsarjojen kahtena kulttuureissa H460 WT ja H460 IIE3. (D) qPCR RNA 3 rinnakkaisten soluviljelmistä kukin H460- WT ja

ADPGK

Knockout klooneja IIE5 ja IID10, normalisoitu vastaan ​​18S rRNA.

Knockout on

ADPGK

H460 (klooni IIE5) aiheutti selvästi suuremman muutoksen geenin ilmentymistä (kuvio 4B). Selkeimmin koetin asetettu kadheriinin 11 (

CDH11

) pieneni merkitsevästi, 150-kertaiseksi, H460 IIE5 (p = 0,03). Mikään muu ilmentyvät eri transkriptit havaittiin, kun väärä löytö korko säädettiin 5%: iin Benjamini-Hochberg menetelmä, konservatiivinen tilastollinen kynnyksen, joka on sopiva, kun niin harvat toistojen ovat käytettävissä. Kuitenkin piirtämällä ilmaus erot kärkipään 50 koetin settiä lämpökarttana osoittaa näkyvää, mutta ei tilastollisesti merkitsevä eroa WT H460- linjan ja IIE5 H460 tyrmäys klooni rinnakkaisviljelmien (kuvio 4C). Vaikka ei havaittu muutoksia runsaasti glykolyyttisen mRNA kaksi koodaavien mRNA säätelijöitä solun aineenvaihduntaan ei ilmeisesti ekspressoitua eri hieman alle tilastollisen merkitsevyyden (

PPARGC1A

, 3-kertainen vaimentua, ja

AKT3

, 2,7-kertainen voimistunut). Kadheriinit 2, 6 ja 10 olivat myös ilmentyvät eri 2,5-kertainen, mutta alapuolella merkitys. Kärkipään 150 koetin settejä H460 (taulukko S3) valittiin lisäanalyysiä kanssa geenin ontologian työkalun DAVID ([27]; https://david.abcc.ncifcrf.gov/tools.jsp). Lähes 50%: n tulo geenien, jotka liittyvät solukalvon ja ennustettu olevan glykosyloitunut, 20% oli lokalisoitu solunulkoiseen tilaan ja -16% liittyi solun tarttumiseen (taulukko S4). Analyysi käyttäen GeneSetDB koulutusjakson analyysityökalun [28] paljasti myös, että kärkipään 150 koetin settejä H460-soluja merkittävästi rikastettu (p≤0.05) Gene ontologia (GO, https://www.geneontology.org/) luokkien ”vyöliitos organisaation ja” Cell risteyksessä kokoonpano ”, ja että Reactome (https://www.reactome.org/) rakenteisen luokat” vyöliitos vuorovaikutusta ”ja” soluliitos organisaation.

jotta voitaisiin vahvistaa tukahduttaminen mRNA kadheriinin 11 ja muut soluadheesiomolekyylit, joka näytti olevan ilmentyvät eri seuraavat

ADPGK

knockout (

NCAM2

,

L1CAM

ja

CDH2) B, niiden ilmentyminen kvantifioitiin qPCR H460 WT ja sekä

ADPGK

-null klooneja IIE5 ja IID10 (kuvio 4D).

ADPGK

mRNA kvantitoitiin myös qPCR, ja todettu olevan alhainen transkriptio runsautta mutanttiklooneissa sopusoinnussa nonsense-välitteisen rappeutuminen. Expression of

CDH11

voimakkaasti vaimennetaan

ADPGK

aihiot ( 10000-kertainen H460 IIE5 ja -200-kertaisesti H460 IID10).

NCAM2

ja

L1CAM

RNA laskivat alueella 30-40-kertainen ja 3-4-kertaiseksi, sekä

ADPGK

-null klooneja.

CDH2

vasta vähentynyt H460 IIE5 (~1000-kertainen). Sen sijaan tämä tukahduttaminen

CDH11, NCAM2 ja LICAM

ei havaittu, kun

ADPGK

lyötiin alas ~ 80% WT tasosta vuoteen siRNA (kuva S4) viittaa siihen, että täydellinen menetys geenin toiminto voidaan tarvita tämän fenotyypin.

vaikutus

ADPGK

Knockout Cell Survival ja Glykolyysi in HK2-köyhdytettyä Cells and Under Hapettomuus ja Hypoksia

edellä tutkimukset osoittivat vähän jos mitään vaikutusta

ADPGK

knockout soluproliferaatioon tai pinnoituksen tehokkuus (kyky muodostaa klooneja) normaaleissa kasvuolosuhteissa. Siksi testataan onko ADPGK voisi edistää solujen selviytymiseen glukoosin fosforylaatiota rajoitetaan käsittelemällä

HK2

siRNA, tai kun glykolyyttisissä kysyntä on kasvanut tiukasti anaerobisissa olosuhteissa (6-h anoxia). Yksi päivä transfektion jälkeen H460 WT, IIE5 ja IID10 kanssa

HK2

siRNA tai GC-sovitettu ohjaus siRNA,

HK2

pudotus mitattuna qPCR oli välillä 70-80% (kuvio 5A ). Kaksi päivää transfektion jälkeen ohjaus siRNA, solujen määrä Knockout klooneja ei ollut merkittävästi erilainen kuin WT, vaikka pieni suuntaus vähentää proliferaatiota tunnettu H460 IID10 kuten edellä (kuvio 5B).

HK2

siRNA vähensi solumäärät WT kulttuureissa vertailuryhmään nähden siRNA, ja molemmat Knockout kloonit osoittivat pieni mutta merkittävä vielä lasku solujen määrä verrattuna

HK2

siRNA käsitelty WT (kuvio 5B) . Pinnoitus tehokkuutta käsiteltyjen solujen ohjaus siRNA, sai 10 päivän kuluttua uudelleen maljaussolut, myös pienentyä IID10 linjan (-50% ja että H460 WT), mutta ei IIE5 (kuvio 5C).

HK2

pudotettiin siRNA kahdessa riippumattomassa kokeessa, yhdistettynä täällä, joista kukin sisälsi kolme biologista rinnakkaisnäytteiden WT ja kaksi kutakin tyrmäyksellä klooni. (A) HK2 mRNA qPCR yhden päivän kuluttua siRNA transfektion. (B). Solujen määrä kahden päivän kuluttua siRNA transfektion, jolloin solut maljattiin uudelleen klonogeenisten määrityksessä. (C) Pinnoitus hyötysuhteet kaksi päivää sen jälkeen transfektion ohjaus siRNA. (D) vaikutus

HK2

siRNA on klonogeenisten eloonjääntifraktio kahden päivän kuluttua transfektiosta, suhteessa soluihin, jotka on transfektoitu ohjaus siRNA. (E) vaikutus 6 tunnin anoxia on klonogeeniset eloonjääntifraktio suhteessa hapellista valvontaa, määräytyy maljaussolut hapettomaan kammiossa kaksi päivää sen jälkeen siRNA transfektion ja siirtämällä aerobinen yrityshautomo 6 tuntia myöhemmin. (F) vaikutus

HK2

siRNA on klonogeeniset eloonjääntifraktio altistumisen jälkeen 6 h hapenpuute suhteessa vastaavan hapettoman valotuksen jälkeen ohjaus siRNA.

Kyky glykolyyttisten rajoituksen (

HK2

siRNA) tai lisääntynyt glykolyyttiset kysynnän (anoksia) edelleen tukahduttaa kyky muodostaa klooneja arvioitiin laskemalla elossa osa (pinnoitus tehokkuutta murto-osa siitä, että normoxic ohjaus siRNA-käsitellyt solut).

HK2

siRNA tappoi 79% H460-WT (eloonjääntifraktio 0,21 kuviossa 5D), ja saadut pesäkkeet olivat pienempiä (40%: n vähennys keskimääräinen pesäkkeitä säteen; tuloksia ei ole esitetty). Erityisesti molemmat

HK2

siRNA transfektoitu

ADPGK

-null solulinjat osoittivat lisäksi erittäin merkittävä ~ 4-kertainen menetys kyky muodostaa klooneja (kuvio 5D), ilman muita muutoksia pesäkkeen koko, verrattuna WT myös käsitelty

HK2

siRNA. Kun soluja uudelleen pinnoitettu anaerobisessa kammiossa ja altistettiin 6 h anoxia ennen kuin se siirretään aerobinen CO

2 yrityshautomo, klonogeeniset eloonjäämistä WT solujen väheni 71% (kuvio 5E) ja pesäkkeiden säde 30% (ei esitetty). Molemmat H460

ADPGK

-null solulinjat olivat huomattavasti herkempiä tappaminen alle anoxia (kuvio 5E), ilman muita muutoksia siirtomaa säteellä.

HK2

Knockdown yhdistettynä anoxia oli samanlainen vaikutus elinkyvystä mikä nähdään aerobisissa olosuhteissa, jälleen huomattavasti suurempi vaikutus

ADPGK

-null kuin WT riviä (kuva 5F).

Erityisherkkä molempien ADPGK knockout H460 kloonien hapettomuudelle vahvistettiin toisessa koesarjassa, sekä ilman glykolyyttisellä estäjän 2-deoksi-D-glukoosia (kuva S5). Nämä kokeet osoittavat selvästi, että

ADPGK

on suojaava vaikutus solukuolemaa alla anoxia ja kun

HK2

huutokaupataan aerobisissa tai hapettomissa olosuhteissa H460 solulinjassa.

samanlainen tutkimus että H460 solulinjojen suoritettiin HCT116 WT ja sen

ADPGK

-null johdannaiset C3 ja IC10 (kuva S6). Tässä tapauksessa ainoa tilastollisesti merkitsevä vaikutus

ADPGK

Knockout oli vaatimaton väheneminen pinnoituksen tehokkuuden (valvonnan siRNA-käsitellyt solut), joka näytti olevan voimakkaampaa kuin kokeessa ilman valvontaa RNA transfektio raportoitu Taulukko 1. knockdovvn

HK2

, ja altistuminen hapettomuudelle 6 tuntia, aiheutti vähemmän solun tappaminen HCT116 WT kuin H460 WT solujen tekijällä ~ 2, ja tyrmäys

ADPGK

teki ei lisätä tappamista

HK2

siRNA tai anoxia että HCT116 taustalla.

lisäksi tutkinut, pitkäaikainen altistus hypoksian (0,2% happea kaasufaasissa) on samanlainen vaikutus H460

ADPGK

-null kloonien kuten on esitetty anoxia. Kaikki kolme solulinjat lisääntyneet yhtä suuria hypoksiaolosuhteissa 3 tai 6 d, jossa ei ole merkittävää eroa kertaistanut clonogens viljelmää kohti (kuvio S7A). Vastaavasti

ADPGK

tyrmäys ei ollut johdonmukaista vaikutusta kasvuun HCT116 clonogens alle 0,2% happea 3, 6, tai 9 päivää (kuvio S7b).

todettu eroja vaikutukset

ADPGK

tyrmäyksellä eloonjäämiseen H460 soluja anoxia vs. 0,2% happea johti meidät testaamaan aktivoitumista avatulla proteiinivaste (UPR), joka on enemmän lausutaan ankarissa kuin kohtalainen hypoksia [29], [30].

XBP1

silmukoinnin jonka IRE-1 endonukleaasi, merkkiaine UPR [31], osoittivat samanlaisia ​​lisäyksiä H460

ADPGK

-null klooneja ja WT solujen jälkeen 6-h anoxia (kuvio S8) .

vaikutukset

ADPGK

Knockout on Glykolyysi ja mitokondrio Metabolism

seuraavaksi testasimme ovatko vaikutukset

ADPGK

ejektori H460 selviytyminen alla anoxia heijastavat roolia ADPGK glykolyysissä. Glukoosin kulutus ja laktaatin muodostumisen aikana 6-h anoxia tukahdutettiin kun

HK2

pudotettiin H460 (kuvio 6A, B) ja HCT116 (kuvio 6C, D) solulinjat, todetaan, että glukoosi fosforylaatio on nopeutta rajoittava glykolyysiin näissä olosuhteissa. Yllättäen ei havaittu halvemmalla glykolyyttistä nopeudella

ADPGK

aihiot, ja glykolyysin että aihiot ollut mitään herkempiä

HK2

tukahduttaminen. Samoin knockdovvn

HK2

tukahdutettu vakaan tilan ATP-tasot (joko aerobinen tai anaerobinen tilanne) H460 solulinjoissa, mutta tämä vaikutus ei ollut suurempi tahansa

ADPGK

-null klooneja (kuvio 7A). Anoxia ja

HK2

siRNA oli vain vähäisiä vaikutuksia ATP tasoilla HCT116 WT soluissa, sopusoinnussa pienempi vaikutus näiden hoitojen klonogeeniset selviytyminen kuin H460-soluissa, ilman ilmeisiä eroja

ADPGK

knockout klooneja (kuvio 7B).

glukoosinkulutus (A, D) ja laktaatti muodostumista (B, E) mitattiin 2 vuorokautta transfektion jälkeen ohjaus siRNA tai

HK2

siRNA. coli

. (B).