Krooninen sairaus

tiivistelmä

Bone syöpä kipu on vakavin joukossa syöpä kipua ja on usein resistentti nykyisen kipulääkkeitä. Näin ollen uusien kipulääkkeiden kehittäminen tehokkaita hoidettaessa luun syöpäkivun halutaan. Verihiutaleita aktivoivan tekijän (PAF) reseptoriantagonistit äskettäin osoitettu olevan tehokas kipua lievittävä vaikutus neuropaattista kipua useissa eläinmalleissa. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin kipua lievittävä vaikutus PAF-reseptoriantagonistit luun syöpäkipusi käyttämällä reisiluun luun syöpä (FBC) hiirissä. Eläimet injektoitiin osteolyyttisiä NCTC2472 solujen sääriluu, ja sen jälkeen vaikutukset PAF-reseptoriantagonistit kipua käyttäytymistä arvioitiin. Kemialliset rakenteellisesti erityyppisiä antagonisteja, TCV-309, BN 50739 ja WEB 2086 parantaisivat allodynia ja parantaa kipua käyttäytymistä, kuten vartiointi- käyttäytymistä ja raajan käytön poikkeavuuksia FBC mallissa hiirillä. Kipu lievittävät vaikutukset näiden antagonistien saavutettiin pienillä annoksilla oli pitkäikäinen. Blockade selkärangan PAF reseptorien intratekaalinen injektio TCV-309 ja WEB 2086 tai Knockdown ilmentymisen selkärangan PAF-reseptorin proteiinia intratekaalinen siirto PAF-reseptorin siRNA tuotti myös kipua poistava vaikutus. Määrä indusoituvan PAF synteesi entsyymi lysofosfatidyylikoliinilla asyylitransferaasia 2 (LPCAT2) proteiini huomattavasti selkäytimessä elinsiirron jälkeen NCTC 2472 kasvainsoluja hiiri sääriluu. Yhdistelmä morfiinin kanssa PAF-reseptoriantagonistit kehittää merkittävä parantaminen kipua lievittävä vaikutus vastaan ​​luusyöpä kipua vaikuttamatta morfiinin aiheuttamaa ummetusta. Toistuva anto TCV-309 tukahdutti ulkonäkö kivun käyttäytymistä ja pidensi elinaikaa FBC hiirillä. Esillä olevat tulokset viittaavat siihen, että PAF-reseptoriantagonistit yhdistelmänä, tai ilman, opioidit voivat edustaa uuden strategian hoitoon pysyviä luusyöpä kipua ja parantaa potilaiden elämänlaatua.

Citation: Morita K, Shiraishi S, Motoyama N, Kitayama T, Kanematsu T, Uezono Y, et ai. (2014) lieventyminen luusyöpä Pain Salpaajien verihiutaleita aktivoiva tekijä reseptorit. PLoS ONE 9 (3): e91746. doi: 10,1371 /journal.pone.0091746

Editor: Theodore John hinta, University of Arizona, Yhdysvallat

vastaanotettu 16. lokakuuta 2013 Hyväksytty: 14 helmikuu 2014; Julkaistu 17. maaliskuuta 2014

Copyright: © 2014 Morita et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Grants-in tuki Scientific Research (B) 22390349, (C) 21592421 ja (C) 24592798 saapuneen Japanin Society for Promotion of Sciences ja National Cancer Center tutkimus- ja kehitysrahasto (23-A-30 ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kipu syöpä tuotetaan painetta, tai kemiallinen stimulointi, erikoistuneiden kipua signalointi hermopäätteitä kutsutaan nociceptors (kudosvauriokipua) tai se voi johtua vahinkoa tai sairaudesta hermosyiden itseään (neuropaattista kipua), jotka reagoi ärsykkeisiin, jotka eivät normaalisti Kivuttomalla; allodynia. Bone syöpä kipu on yksi yleisimmistä ja yleensä vakavia kiputilojen syöpäpotilailla [1].

Opioidit edelleen tukipilari syöpäkivun hallintaan, mutta lisäksi akuutteja sivuvaikutuksia pitkän aikavälin seuraukset toleranssi, riippuvuus, hyperalgesia ja tukahduttaminen hypotalamus /aivolisäke-akselilla olisi tunnustettava. Koska nykyiset käytettävissä hoidot ovat suhteellisen tehottomia luusyöpä kipua, lähes puolet syöpäpotilaista on riittämätön kivun [2], [3]. Näin ollen uusien kipulääkkeiden kehittäminen tehokkaita hoidettaessa luun syöpäkivun tarvitaan.

Olemme aiemmin ehdottaneet, että verihiutaleita aktivoiva tekijä (PAF) saattaa olla välittäjä neuropaattista kipua. PAF ruiskutus hiiren selkäytimen aiheuttama lämpö hyperalgesia ja tuntoon allodynia, jotka olivat ainakin osittain välittyvät selkärangan toimintahäiriöstä glysiinireseptoriin α3 (GlyRα3) ja blokattiin PAF-reseptoriantagonistit [4], [5]. Myöhemmät tutkimukset osoittivat PAF reseptorisalpaus lievitti kipua käyttäytymistä saavuteta hermovaurio malleissa. PAF-reseptorin antagonisti, CV-3988, pistetään lähellä takajuuren hermosolu (DRG) rotilla tai hiirillä puuttuu PAF reseptorit osoitti vähenemistä tuntoon allodynia seuraavissa Selkäydinhermo vamma [6]. Intratekaalinen injektio PAF-reseptorin antagonisti, WEB 2086, bentsodiatsepiinia johdannainen 9 päivän leikkauksen rotilla tukahdutti kehittämiseen mekaanisten allodynia rotan säästynyt hermovaurio mallin [7]. PAF-reseptoriantagonistit, TCV-309 (PAF liittyvä), BN 50739 (luonnontuote liittyvä yhdiste), ja WEB 2086, tuotti syvällinen ja pitkäkestoinen anti-allodynia vaikutuksia useissa eri neuropaattista kipua malleja hiirillä, mukaan lukien osittainen lonkkahermon ligaation vamma malli, osittain silmäkuopan alaisissa hermon ligaation mallia, krooninen kurouma silmäkuopan alaisissa hermovaurion malli (CCI malli) ja streptotsosiinia (STZ) aiheuttaman diabeteksen mallin [8]. Todisteet viittaavat siihen, että PAF vaikuttaa hermostoputken kudosvaurioita ja kipua käyttäytyminen hermovaurion jälkeen.

eläinmalleissa Edellä tutkittiin kivun luusyöpä, jossa kasvaimen solut injektoidaan paikallisesti luuhun. Tässä tutkimuksessa käytettiin reisiluun luun syöpä (FBC) hiirissä [9]. Eläimet injektoitiin osteolyyttisiä NCTC2472 soluja, ja sen jälkeen vaikutukset PAF-reseptoriantagonistit kipua käyttäytymistä arvioitiin.

Materiaalit ja menetelmät

Experimental Animals

Kokeet suoritettiin käyttäen mies C3H /kana hiiriä (CLEA Japan, Inc., Tokio), paino 20-25 g. Kaikki koemenettelyt ja eläimen käsittely tehtiin mukaan sekä pääperiaatteista Care ja käyttö Laboratory Animals hyväksymä Japani farmakologinen Society ja suuntaviivoja Hiroshiman yliopiston, Hiroshima, Japani ja suuntaviivoja, National Cancer Centerin Research Institute, Tokio, Japani. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden Hiroshiman yliopiston (Luvan numero: A-09-17 ja A-11-16), ja National Cancer Center (Luvan numero: T11-004-M02) . Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Eläimiä käytettiin vain yksi mittaus kussakin kokeessa.

Hiiri Reiden Luusyöpä (FBC) Malli

FBC malli, NCTC 2472 tuumorisolut (American Type Cuiture Collection, ATCC; Manassas, VA, USA) injektoitiin medullaariontelon distaalisen reisiluun ja C3H /HeN-hiiriä [9]. NCTC 2472 Soluja pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (kaikki tuotteet Gibco Laboratories); ja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 sitten siirrostaa viikoittain mukaisesti ATCC ohjeita. Antamista varten, solut irrotettiin kaapimalla ja sitten sentrifugoitiin 900 rpm: ssa 3 minuutin ajan. Pelletti suspendoitiin Hankin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS), ja sitten käytetään sääriluunsisäinen injektiota.

implantaation kasvainsoluja ruiskutettiin seuraavan protokollan ovat kuvanneet aiemmin Honore et ai. [9] kanssa pienin muutoksin. Lyhyesti, C3H /HeN-hiiret nukutettiin natriumpentobarbitaalilla (60 mg /kg) i.p. pistetään. Sillä sääriluunsisäinen rokotus solujen, oikea polvi kunkin hiiren taivutettiin ja sijoitettu päin kokeen ja minimaalinen ihoviillon tehtiin altistamalla sääriluun. 25 gaugen hampaiden kalvin käytettiin puhkaista sääriluun ja poistettu, 30 gaugen neulaa, joka on kytketty Hamilton ruiskun solususpensiota varovasti syötettiin medullaariontelon sääriluun. Sitten 10

5 NCTC 2472 solua suspendoitiin 5 pl HBSS olivat hitaasti injektoitiin (elävien solujen). Ohjaus ryhmiä injektoitiin 5 pl HBSS tai HBSS sisältää 10

5 NCTC 2472 solut tapetaan nopeasti jäädyttämällä ja sulattamalla ne kaksi kertaa ilman kryosuojausta ja sitten pesemällä tuoreella HBSS (deaden solut). Lopuksi Caviton EX, hammaslääkärin-luokan hydraulinen väliaikainen tiiviste (GC Dental Products, Co. Ltd., Tokio, Japani) levitettiin sääriluun viiltää alue ja kirurgisen täydennettiin ompelemalla polven iho. Ruumiinpainot tallennettiin kullekin hiirelle joka 3 päivä koko tutkimuksen ajan. Eläimet lopetettiin seuraavien painonpudotus yli 20% painostaan ​​tai upon osoittavat vastaavia oireita, kuten vakava ataxic liikkeitä tai muita neurologisia poikkeavuuksia vuoksi eettisiä ongelmia.

Drug Administration

Gabapentiini (1 – (aminometyyli) -sykloheksaanietikkahappo) saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Morfiini saatiin Takeda Pharmaceutical Co., (Osaka, Japani). WEB 2086 (3- [4- (2-kloorifenyyli) -9- metyyli-6

H

tieno [3,2

f

] [1], [2], [ ,,,0],4] triatsolo [4,3

] [1], [4] diatsepin-2-yyli] -1- (4-morfolinyyli) -1-propanonia) saatiin Tocris Bioscience ( Ellisville, MO). TCV-309 (3-bromi-5 – [

N

fenyyli-

N

– [2 – [[2- (1,2,3,4-tetrahydro-2-isokinolyyli – karbonyylioksi) etyyli] karbamoyyli] etyyli] karbamoyyli] -1-propylpyridinium nitraatti), ja BN 50739 (tetrahydro-4,7,8,10methyl- (kloori-2phenyl) 6 [dimetoksi-3,4-fenyylitio] metyylitiokarbonyyli-9 pyrido [4 ’, 3’-4,5] tieno [3,2

f

] triatsolo-1,2,4 [4,3

] diatsepiini-1, 4) lahjoitti Takeda Pharmaceutical Co., ja Institute Henri Beaufour, vastaavasti.

TCV-309 ja WEB 2086 liuotettiin kumpikin steriiliin keinotekoista aivo-selkäydinnesteessä (ACSF) tai suolaliuosta. BN 50739 liuotettiin liuottimeen, joka sisälsi 25% 2-hydroksipropyyli-β-syklodekstriiniä (Sigma /RBI, Natick, MA) ja tislattua vettä, pH säädettiin arvoon ~6 käyttäen 1 N NaOH: lla, ja laimennettiin asianmukaisesti ACSF tai suolaliuosta. Muut reagenssit liuotettiin ACSF tai suolaliuosta. Lääke liuokset juuri valmistettuja jokaisena koepäivänä. ACSF koostumus (mM) oli NaCl 142, KCI 5, CaCl

2 2 H

2O 2, MgCl

2 · 6H

2O 2, NaH

2PO

4 1,25, D glukoosi 10, HEPES 10, pH 7,4. TCV-309, BN70329 tai WEB 2086 annettiin laskimoon 30 min-3 h ennen kivun arviointia.

knockdovvn PAF Receptor selkäytimessä

knockdovvn PAF-reseptorin suoritettiin mukaan edellisen raportin [5]. siRNA: t sisällytettiin hemagglutinoivat viruksen Japani (HVJ) -Envelope mukainen vektori valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, sekoittamisen jälkeen 40 ui (1 määrityksen yksikkö, AU) ja HVJ-Envelope Vector 4 ui sulkevan tekijän, seos sentrifugoitiin (10000 x

g

, 10 min, 4 ° C), ja pelletti suspendoitiin 10 ul: ssa puskuriliuosta. Sitten 10 ui seosta, jossa oli 3 siRNA: iden liuosta (# 1, # 2 ja # 3, 1 ug /ul kutakin) lisättiin, ja seosta pidettiin jäillä 5 minuuttia. Steriili ACSF (10 ui), joka sisälsi synteettisen siRNA-dupleksit (0,45 pmol /eläin) injektoitiin subaraknoidaalinen väliseen tilaan L5 ja L6 selkärankaiset tajuissaan hiirillä. Sekvenssit siRNA oligonukleotidi (sense) olivat seuraavat: PAF-reseptori (# 1, 5′-CACCUCAGUGAGAAGUUUUACAGCA-AG-3 ’; # 2, 5′-ACCCUUCCAAGAAACUAAAUGAGAU-AG-3′; # 3, 5’-CAACUUCCAUCAGGCUAUUAAUGAU- AG-3 ’; kohdennussekvenssiä ympäri asentoon 1005-1029, 232-256, 893-917, vastaavasti,

pafr

, GenBank no. D5087). Lisäksi paritonta siRNA kolme tai neljä nukleotidin yhteensopimattomuuksia valmistettiin tutkia epäspesifinen vaikutuksia siRNA-dupleksit (siRNA # 4, 5′-ACUCUGCCAAGAGACUACAUGAGAU-AG-3). Nämä valitut sekvenssit toimitettiin myös BLAST hakuun (bioinformatiikan keskus Institute for Chemical Research, Kyoto University, Japani) vastaan ​​hiiren genomin varmistaa, että vain yksi geeni hiiren genomissa oli kohdistettu. siRNA: t ostettiin iGENE Therapeutics Inc. (Tsukuba, Japani).

Behavioral Analysis FBC Model

käytösanalyyseja oli esimuotoillut seuraten protokollaa kuvattu aiemmin [5], [10]. Kipu-liittyvä käyttäytyminen on FBC mallissa arvioitiin ennen ja jälkeen lääkkeen annon 11 päivää kasvaimen istutuksen. Kokeellinen ja valeleikatuilla eläimet arvioitiin käynnissä kivun perustuu vartiointi käyttäytymiseen, liikuteltaviin kivun perustuu raajan käytön poikkeavuus, ja allodynia-käyttäytymistä, joka perustuu von Freyn hehkulamppuja testi ja sivellin testi. Vartiointi käyttäytyminen, raajan käytön poikkeavuus ja allodynia, kuten kipu arvioitiin samoilla eläimillä. Hiiret pantiin kirkkaasta muovista havainnointi ja niiden annettiin totuttaa 15 min. Sitten, spontaani vartiointi käyttäytymistä arvioitiin aikana 2 minuutin tarkkailujakson aikana. Nosturin aika takakäpälän on samanpuoleiseen puolella liikuttaessa mitattiin vartiointi käyttäytymistä. Raajan käyttö poikkeavuus pisteytettiin asteikolla 0-4: 0, normaali käyttö raajan; 1, lievä ontua; 2, kirkas ontua; 3, osittainen käytön laiminlyönti raajan; ja 4, täydellinen käytön laiminlyönti raajan. Allodynia-käyttäytymistä arvioitiin kevyesti silitti loukkaantunut jalka siveltimellä (allodynia pisteet) tai arvioida mittaamalla käpälän poisvetämisen kynnys vastauksena Probing joukon kalibroitu hienoja filamentteja (allodynia kynnys) kuten on raportoitu aiemmin [5]. Allodynia pisteet sijoittui kuvanneet Minami et al. [11]: 0, ei vastausta; 1, lievä squeaking kanssa yritetty siirtyä pois silitti koetin; 2, voimakas squeaking, puree silitti koetin ja ponnekkaasti paeta silitti koetin. Arvot ovat keskiarvoja koko pisteet arvioitiin 3 kertaa kunakin ajankohtana (mahdollinen maksimipisteet kunakin ajankohtana: 2 /hiiri). Vartija ajat olivat huomattavasti pitkittynyt 5 ja 6 päivää kasvaimen istuttamisen jälkeen verrattuna arvoihin ennalta istutusta. Samoin eläimet alkoi myös epänormaalista raajan käyttää 5 päivän kuluttua kasvaimen implantaation ja poikkeavaan käyttäytymiseen oli huomattavampi myöhemmin päivinä. Allodynia kynnys arvioitiin mittaamalla käpälän poisvetämisen kynnys vastauksena tunnustelemalla von Frey monofilamentteja, ja merkittävä kynnys laskee havaittiin sen jälkeen, kun 3

rd jälkeisen päivän kasvaimen istutuksen verrattuna arvoihin ennalta istutusta, ja lasku saavutti huipun jälkeen 5 ja 7 päivää. Allodynia pisteet arvioitiin mittaamalla sijoittui vaste kevyesti silitti siveltimellä, ja merkittävät pisteet nousee havaittiin sen jälkeen, kun 4 päivää post kasvaimen istutuksen verrattuna arvoihin ennalta istutusta, ja kasvu saavutti huippunsa jälkeen 6 ja 8 päivää. Koko kokeen, käyttäytymiseen testaus suoritettiin sokea olosuhteissa yhden kokeilija. Injektiot suoritettiin sokea toinen henkilö. Intratekaalinen injektio suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [4].

määritys lyso-PAF-asetyylitransferaasin (lyso-PAF AT) /Lysophospha- tidylcholine asyylitransferaasin 2 (LPCAT2), PAF Synthesis entsyymi

lannerangan alueilla selkäytimen (L2-L6) saatiin valeleikatun (deaden soluja istutettiin) tai jolla on kasvain. Selkäytimen kudokset (4,8-5,0 mg) homogenoitiin 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), joka sisälsi 1 mM EDTA: ta, 1 mM EGTA, 10 mM NaF, 10 mM β-glyserofosfaatti ja 1 ug /ml erilaisia ​​proteaasi-inhibiittoreita ( benzamdine, leupeptiiniä ja antipaiini). Homogenaatti saatettiin reagoimaan 0,6% NP-40: ssa 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, mitä seurasi sentrifugointi 15000 rpm: ssä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti saatiin. Supernatantti sekoitettiin tilavuus suhde on 4:01 10 mM Tris-HCl (pH 6,8), joka sisälsi 10% (v /v) glyseroli, 2% natriumdodekyylisulfaattia (SDS), 0,01% bromifenolisinistä ja 0,5% β-merkaptoetanoli , minkä jälkeen kiehumispiste 70 ° C: ssa 30 minuutin ajan.

Immunoblottaus -määritykset

saadut näytteet ajettiin elektroforeesilla 2 tuntia huoneen lämpötilassa polyakryyliamidigeeleillä (pinoaminen 3% geeliä, ja erottamalla geelissä 10% ) ja sitten blotattiin polyvinyylideenifluoridia kalvoja on aiemmin hoidettu 100% metanolia. Siirretty proteiinit kalvot estettiin inkuboimalla estämällä liuoksen, 5% rasvatonta maitoa, joka sisälsi pesupuskurilla (20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 137 mM NaCl: a ja 0,1% Tween 20), 25 ° C: ssa 1 hr. Kalvot altistettiin primaarinen vasta-aine seuraavasti: vastaan ​​LPCAT2 (1:1,000, Sigm); vastaan ​​β-aktiini (1:1,000; IMGENEX Innovations in Functional Genomics, sandiego, CA), laimennettiin pesupuskuria, joka sisälsi 1% kuorittua maitoa yön yli 4 ° C: ssa, mitä seurasi peseminen kolme kertaa pesupuskurilla, ja sitten inkuboimalla sekundaarinen vasta-aine seuraavasti: varten LPCAT2 vasta-aineen ja β-aktiini-vasta-aine, anti-kani-lgG-vasta-ainetta, joka oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (1:2,000; DakoCytomation, Glostrup, Tanska), huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Kalvot jälleen huuhdeltiin kolme kertaa pesupuskurilla ja kehitettiin parannetun kemiluminesenssi (ECL) western tunnistusjärjestelmä (ECL reagenssit, ostettu Thermo Fisher Scientific, ja Nacalai Tesque Inc., Kioto Japani; ImageQuant ™ LAS 4000 mini tunnistusjärjestelmä, GE healthcare Japani, Tokio, Japani). Tiheys kunkin kaistan analysoitiin käyttämällä NIH Image ohjelmisto, ja densitometrinen yksiköt korjattiin käyttämällä arvoa β-aktiini. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SEM.

Morfiini aiheuttama ummetus

Hiiret tarjotaan ruokaa ja vettä halun ennen koeaika, ja molemmat (tai ilman TCV-309) ryhmät kulutetaan vertailukelpoinen määriä ruokaa ennen testiä mitattuna yli 24 tunnin ajanjaksoon testiympäristössä. Ei ruokaa eikä vettä oli saatavilla testin aikana. Hiiriä häkissä akryyli laatikoissa ruudukon lattiat keskeytetty yli suodatinpaperin. Ulosteen boli kerättiin kustakin ryhmästä hiirten tunnin välein 1 tunnin ajan injektion jälkeen suolaliuosta tai eri annoksilla morfiinia ja painon ulosteen boli kirjattiin indeksinä ummetusta morfiinin.

Generation of Kaplan-Meier Survival käyrät

terveyden hiiriä tutkittiin päivittäin. Hiiret, jotka esitetään sairauden merkit tapettiin murtamalla niska suositusten mukaisesti meidän eettisen komitean. Kokemuksemme mukaan nämä merkit edeltävät kuolinhetkellä mukaan pari päivää. Kuoleman ajankohta kirjattiin kunkin hiiren jotka on löydetty kuolleena tai tapettiin. Kaplan-Meier-eloonjäämiskäyrät luotiin käyttäen Graphpad Prism-ohjelmiston (versio 4, Graphpad, Inc, San Diego, CA).

Tilastollinen analysointi

Kaikki tiedot ilmoitetaan arvot keskiarvo ± SEM (vakio keskivirhe). Graphpad Prism-ohjelmiston version 4 käytettiin suorittamaan tilastollisen analyysin. Mitä tilastollinen analyysi kivun liittyvä käyttäytyminen, vertailuja allodynis viereen, poisvetämiskynnys, vartiointi- käyttäytymistä ja raajan käytön poikkeavuus eroja lääkettä saaneissa ryhmissä ja ajoneuvon käsitellyssä ryhmässä arvioitiin käyttäen kaksisuuntaista ANOVA seurasi by Tukey-Kramer testi, tai parittoman Opiskelijan

t

-testi. Vertailut mediaanielinajassa suoritettiin käyttäen log-rank ja Gehan-Breslowin-Wilcoxonin testejä. Todennäköisyys arvo (P) 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Vaikutukset systeeminen anto Erityiset PAF -reseptorin tuntoon allodynia ja Pain käytöshäiriöiden FBC Malli Hiiret

Effects of TCV-309 on allodynia ja kipu käyttäytymistä (vartiointi käyttäytyminen ja raajan käytön poikkeavuus) tutkittiin FBC mallissa hiirillä. TCV-309 vaihteluväli 10-300 ug /kg i.v. annoksesta riippuen vähensi allodynia pisteet (kuvio 1A) ja lisäsi poisvetämiskynnys (kuvio 1 B) klo 11-15 päivä kasvaimen istuttamisen jälkeen hiirissä. Vaikutukset TCV-309 olivat melko pitkäikäinen. Esimerkiksi TCV-309 merkittävästi lievittää mekaaninen allodynia yhdellä injektiolla 100 ug /kg, i.v. jonka huippu vaikutusta 1-2 päivää injektion jälkeen enintään 6 päivää. Vartiointi käyttäytymistä jatkuvasti pahentanut havaintojakson aikana, kun taas osa käyttää poikkeavuus saavutti maksimaalisen vasteen ja jatkuu vuosina (kuvio 1 C, 1D). Vartiointi käyttäytyminen ja raajan käyttää poikkeavuuden myös parannettiin TCV-309. TCV-309 enintään 1 mg /kg ei vaikuttanut käyttäytymisestä tai motoriikka arvioiman Rotarod testissä (tuloksia ei ole esitetty). Muut PAF-reseptoriantagonistit, BN 50739 ja WEB 2086, myös parantaisivat allodynia ja kipu käyttäytymistä FBC mallissa hiiret (Figure1E-1 H).

TCV-309 0,01-0,3 mg /kg, WEB 2086 0,1 mg /kg, BN 50739 0,1 mg /kg tai vehikkeliä ruiskutettiin laskimoon 11 päivää post kasvaimen siirrosta. Ohjaus hiiret saivat injektioita ajoneuvolla: suolaliuosta tai 25% 2-hydroksipropyyli-β-syklodekstriiniä. Kipu liittyvään käyttäytymiseen, joka kehittyi kasvaimen istutuksen jälkeen hiirillä eivät vaikuttaneet ajoneuvon hoitoja. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM. n = 11 hiirtä ryhmässä. † P 0,05, * P 0,01 verrattuna vastaavaan kontrolliin (vehikkelikäsitellyt) arvot, määritettynä varianssianalyysillä seurasi Tukey-Kramer-testi.

Effects of piirityksen Spinal PAF reseptoreiden allodynia ja Pain käytöshäiriöiden FBC Model Hiiret

vahvista paikalle syöpäkivun lievitykseen PAF-antagonistit, vaikutukset intratekaalisen injektion TCV-309 ja WEB 2086, ja myös häiriöitä ilmaus selkärangan PAF reseptorien avulla siRNA PAF-reseptorin mRNA tutkittiin. Spinal anto 10 pg näiden lääkkeiden 13 päivä jälkeinen kasvaimen istutuksen tuotti nopean ja merkitty tukahduttaminen tuntoon allodynia ja maksimivaikutus saavutetaan 1 jälkeisen päivän istutuksen ja suppressoi merkitsevästi allodynia 4 päivän sisällä (kuvio 2A). Kipu vapauttaa vaikutukset arvioitiin poisvetämiskynnys, vartiointi- käyttäytymistä ja raajan käytön poikkeavuus intratekaalisen injektion TCV-309 ja WEB 2086 saavutettiin myös (kuvio 2B-2D).

(A-D); Kasvaimen solut istutetaan intramedulla vasemman reisiluun luun 13 päivää ennen intratekaalista (i.t.) injektiota PAF-reseptoriantagonistit. TCV-309 (10 pg /hiiri), WEB 2086 (10 pg /hiiri) tai ajoneuvon injektoitiin intratekaalisesti ajankohtana ”0”. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM., N = 8-12 hiirtä per ryhmä. * P 0,01 verrattuna vastaavaan ohjaus (vehikkelikäsitellyt) arvot, määritettynä varianssianalyysillä seurasi Tukey-Kramer-testi. Ohjaus hiiret saivat pistoksia ajoneuvoon: ACSF. Kipu liittyvään käyttäytymiseen, joka kehittyi kasvaimen istutuksen jälkeen hiirillä ei vaikuttanut ajoneuvon hoitoja. (E-H); siRNA tai virheellinen siRNA PAF-reseptorin mRNA: ta transfektoitiin selkäytimen 13 päivää kasvaimen istutuksen jälkeen. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. n = 8-10 hiirtä per ryhmä. † P 0,05, * P 0,01 verrattuna vastaavaan kontrolliin (paritonta siRNA transfektio) arvoja, kuten määritettiin analysoimalla valiance seurasi parittoman Studentin

t

-testi. Ohjaus hiiret saivat injektioita paritonta siRNA tai ajoneuvoon: HVJ-vaipan vain. Kipu liittyvään käyttäytymiseen, joka kehittyi kasvaimen istutuksen jälkeen hiirillä ei vaikuttanut yhteensopimattomien siRNA tai ajoneuvon hoitoja.

Knockdown ilmentymisen selkärangan PAF reseptoriproteiinia saavutettiin intratekaalinen siirto PAF-reseptorin siRNA hiirillä. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, vähennetään merkittävästi PAF-reseptorin ilmentymisen normaaleissa hiirissä ja hiirissä 15 päivän kuluttua leikkauksesta iskiashermoon saavuttaen 37,5 ± 5,4% ja 29,9 ± 4,9%: n ohjaus 3 päivän kuluttua siRNA transfektion, vastaavasti, kun taas lauseke ei heikennä HVJ-E vektorin yksin tai virheellinen siRNA [5]. SiRNA transfektio 13 päivää tuumorin istuttamisen allodynia pisteet, poisvetämiskynnys, vartiointi- käyttäytyminen raajan käytön poikkeavuus parannettiin piikin vaikutus 2 3 päivän kuluessa siRNA transfektion, vaikka kivun helpotus toiminta vähitellen katosi yli 9 päivää (Kuva 3E-3H). Injektio sopimattomasta siRNA ei vaikuttanut kehitykseen allodynia ja kivun käyttäytymistä. Määrä LPCAT2 proteiinin huomattavasti selkäytimessä 8, 15 ja 30 päivän kuluttua transplantaation NCTC 2472 kasvainsolujen hiiriin sääri- (kuva 3). Tulokset tukevat käsitystä, että PAF kasvu selkäytimessä kasvainta kantavien hiirten voi liittyä kipua tuotantoa ja että paikalle kivun helpotusta toiminnan PAF-reseptoriantagonistit liittyy selkäytimen FBC hiirillä.

muuttaminen selkärangan LPCAT2 ilmaisun 3, 8, 15, ja 30 päivää sen jälkeen, kun tasot immunoreaktiivisuus normalisoitiin kuin β-aktiini ja edustettuina% induktio verrattuna arvoihin valeleikkaus (deaden solut istutettiin) hiirillä (keskiarvo ± SEM ., n = 5-7). * P 0,05, *** P 0,001 verrattuna vastaavat arvot valeleikataan hiiriä (pariton Studentin

t

-testi).

voimistuminen analgeettista tehoa by Combination PAF -antagonistien kanssa Morphine

Bone syöpä kipu on yksi vakavimmista syöpien kipua ja usein eivät vastaa hoitoon jopa opioidianalgeettien kanssa. Yhdistelmät opioidien ja ei-opioidianalgeettien ovat yleinen käytäntö saada paremmin kipua lievittävä vaikutus kliinisessä työssä. Yhdistetty anto morfiinin kanssa TCV-309 tutkittiin (kuvio 4A). Morfiini 0,1 ja 0,3 mg /kg injektio 1 päivä sen TCV-309 3 ja 10 ug /kg annon tuotti vähentynyt selvästi allodynia pisteet 30 minuutin kuluttua morfiinin injektion ja vaikutus palasi jokaisen tason TCV-309 yksin 3 4 tuntia antamisen jälkeen. Yhdistelmä morfiini 1 mg /kg gabapentiinia 10 mg /kg i.v. ei ollut mitään merkittävää anti-allodynia vaikutus (kuvio 4B). Suuri gabapentiiniannos, 30 mg /kg, oli tuotettava ohimenevä anti-allodynia vaikutus. Morfiini yksin oli vain vähän kipua lievittävä vaikutus 0,3 3 mg /kg, s.c. ja pieni vaikutus 10 mg /kg FBC mallissa. Korkeampi annos 30 mg /kg morfiinia oli vähemmän tehokas (kuvio 4C).

TCV-309, 3 ja 10 ug /kg, injektoitiin i.v. 10 vuorokauden kuluttua kasvaimen istutuksen ja morfiinia 0,1 mg /kg ja 0,3 mg /kg injektoitiin s.c. 1 päivä injektion jälkeen TCV-309 (A). Gabapentiini 10 ja 30 mg /kg i.v. injektoitiin 11 päivää kasvaimen transplantaation ja morfiinia, 1 mg /kg ruiskutettiin 30 minuutin kuluttua gabapentiinin injektion (B). Morfiini 0,3-30 mg /kg injektoitiin 11 päivää post kasvaimen siirron (C). Kipua, kuten käyttäytymistä arvioitiin 20 minuutin kuluttua morfiinin injektion. Erilaisten annosten TCV-309 injektoitiin i.v. 11 vuorokautta kasvaimen istutuksen ja morfiinia 0,3 mg /kg injektoitiin s.c. 1 päivä injektion jälkeen TCV-309 (D). Yksi päivä injektion jälkeen TCV-309, eri annoksilla morfiinia injektoitiin (E). Ohjaus hiiret saivat pistoksia ajoneuvoon: suolaliuosta. Kipu liittyvään käyttäytymiseen, joka kehittyi kasvaimen istutuksen jälkeen hiirillä eivät vaikuttaneet ajoneuvon hoitoja. Jokainen ryhmä sisälsi 11 hiirillä.

† P 0,05, * P 0,01 verrattuna vastaavaan kontrolliin (vehikkelikäsitellyt) arvot, määritettynä varianssianalyysillä seurasi Tukey-Kramer-testi.

§P 0,01 verrattuna vastaavaan ohjaus (ajoneuvon hoitaa ilman morfiini) arvot, määritettynä varianssianalyysillä seurasi parittoman Studentin

t

-testissä.

annos-vaste suhde TCV-309 ja morfiinin yhdistelmä on esitetty kuvassa 4D ja kuviossa 4E. Morfiini 0,3 mg /kg ja TCV-309 0,1-1,0 ug /kg kullakin annoksella yksinään ei ollut anti-allodynia vaikutus, mutta yhdessä, allodynia pisteet laski yli 90% riippuen annos TCV-309 (kuvio 4D ). Morfiini yhdistettynä TCV-309 10 ug /kg niinkin alhainen kuin 0,03 mg /kg tuotti merkittävän anti-allodynia vaikutus ja poistivat allodynia vaste 0,3 mg /kg (kuvio 4E). Kahdeksan päivää injektion jälkeen TCV-309, WEB 2086 ja BN 50739, kipua poistava vaikutus näiden yhdisteiden ei tullut merkittävästi (kuvio 5). Kuitenkin lisäanta- morfiinia 0,3 mg /kg vielä huomattavasti lievittää allodynia ja kipu käyttäytymistä (kuva 5). Nämä tulokset osoittivat, että PAF-reseptoriantagonistit saavuttaa pitkäkestoinen voimistumisen analgeettista vaikutusta, kun morfiini annettiin.

TCV-309, WEB 2086 ja BN 50739 annettiin 11 vuorokautta kasvaimen istutuksen. Morfiini 0,3 mg /kg s.c. injektoitiin 8 päivä injektion jälkeen PAF-reseptoriantagonistit. Allodynia (A, B), vartiointi- käyttäytyminen (C) ja raajan käytön poikkeavuus (D) arvioitiin 20 min injektion jälkeen morfiinia. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM. n = 11 hiirtä ryhmässä. * P 0,01 verrattuna vastaaviin kontrolliarvoihin, määritettynä varianssianalyysillä seurasi parittoman Studentin

t

-testissä.

vaikutus PAF -antagonistien on Morphine aiheuttamaa ummetus

ummetus on yksi yleisimmistä sivuvaikutusten morfiini ja se näkyy lähes kaikissa hoidetuilla potilailla morfiinin. Jos este vaikutus morfiinin suoliston toimintaa ei voimistua, tämä haittavaikutus morfiinin voidaan pienentää pienentämällä annosta morfiinin häiritsemättä analgeettinen vaikutus. Morfiini vähensi ulostetta 1 mg /kg s.c. ja poistanut sitä yli 10 mg /kg. Annosriippuvainen ummetus vaikutusta morfiinin ei vaikuttanut TCV-309 10 ug /kg (kuvio 6).

Normaali hiiret saivat eri annoksia morfiinia ja kertynyt ulosteet lattialla yli 60-309 oli pistetään 1 vrk ennen morfiinin antamista. Data ilmaistaan ​​keskiarvona. n = 10 hiirtä ryhmässä.

Toistuva anto TCV-309 suojattu ulkoasun Pain-like Behavior

Koska anti-allodynia vaikutus TCV-309 oli pitkä- kestäviä, vaikutus toistuvan annostelun tutkittiin. Verrokkihiirten tuntoon allodynia ilmestyi kolme päivää kasvaimen istutuksen jälkeen ja saavutti huippuun vaste 8 päivää. Vartiointi käyttäytyminen näytti 10 vuorokauden kuluttua kasvaimen istutuksen ja vähitellen kasvanut yli 30 päivää, kun taas osa käyttää poikkeavuus ilmestyi 8 päivää ja saavutti maksimin noin 16 päivän kuluttua implantaatiosta (kuvio 7A-7D). Injektio TCV-309 0,3 mg /kg, i.v. aloitettiin päivänä istutettiin kasvaimeen ja jatkettiin 4 päivän välein 28 päivää. Pain käyttäytymistä arvioitiin allodynia pisteet, poisvetämiskynnys, vartiointi- käyttäytymistä ja raajan käytön poikkeavuus ei näy annostelun aikana (kuva 2). Siten käsittely TCV-309 ennen kipu nousi suojattu kriisi kipua ja toleranssin TCV-309 kivunlievitystä ei kehittynyt.

antaminen TCV-309 0,3 mg /kg i.v. aloitettiin 6 tuntia ennen kasvaimen implantaation annetaan kerran päivässä ja edelleen 4 päivän välein korkeintaan 28 päivää. Allodynia (A, B), vartiointi käyttäytyminen (C) ja raajojen käytön poikkeavuus (D) arvioitiin 3 h ja 1, 2, 3 päivän kuluttua TCV-309 injektio.