Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä tutkimuksessa selvitettiin vaikutuksia KML001 (NaAsO

2, natrium metaarsenite, Kominox), suun kautta otettava arseeniyhdiste, kasvuun ja kuolemaan ihmisen eturauhasen syöpäsolujen ja sen vaikutusmekanismi . Kasvun esto arvioitiin sytotoksisuusmäärityksissä läsnä ollessa tai puuttuessa apoptoosi-inhibiittori, estäjä autophagy tai antioksidantti

N

asetyyli

L-kysteiini tutkia mekanismia indusoimaa solukuolemaa KML001 PC3, DU145 ja LNCaP eturauhassyövän solulinjoissa. Elektronimikroskoopilla, virtaussytometrialla ja Western blotting käytettiin tutkimaan apoptoottisten ja autophagic mekanismeja. DU145 ksenograftimallissa käytettiin tehokkuuden määrittämiseksi KML001 in vivo. KML001 vähensi Solujen elinkelpoisuus ja prosenttiosuus kasvoi anneksiini V-positiivisia soluja annosriippuvaisesti eturauhassyöpäsoluissa, ja LNCaP-solut olivat herkempiä KML001 kuin PC3 tai DU145-soluissa. Elektronimikroskoopilla paljasti tyypillisen apoptoottisen merkkiä ja autophagic vacuoles käsitellyissä soluissa KML001. Altistuminen KML001 eturauhassyöpäsoluissa aiheuttaman apoptoosin ja autophagy on ajasta ja annoksesta riippuvaisella tavalla. KML001 indusoi annoksesta riippuvaa kerääntymistä reaktiivisia happiradikaaleja, ja sieppaamalla reaktiivisia hapen lajeja

N

asetyyli

L-kysteiiniä vähentää LC3 ja katkaistun poly (ADP-riboosi) polymeraasin. KML001 merkittävästi esti kasvaimen kasvua DU145 ksenograftimallissa. Lisäksi merkittävä lasku leviämisen ja merkittävään kasvuun apoptoosin ja autophagy havaittiin KML001 saaneilla kasvaimia kuin vehikkelillä käsiteltyjen kasvaimia. Altistuminen ihmisen eturauhasen syöpäsolujen KML001 indusoi sekä apoptoosin ja autophagic solukuoleman kautta, oksidatiivisen stressin kautta. Ja KML001 oli antiproliferatiivinen vaikutus DU145 soluihin vierassiirrekokeissa hiirillä.

Citation: Sinä D, Kim Y, Jang MJ, Lee C, Jeong IG, Cho YM, et al. (2015) KML001 indusoi apoptoosia ja Autophagic solukuolema eturauhassyöpäsoluissa kautta Oksidatiivinen stressi Pathway. PLoS ONE 10 (9): e0137589. doi: 10,1371 /journal.pone.0137589

Editor: Spencer B. Gibson, Manitoban yliopiston, CANADA

vastaanotettu: 06 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 18 elokuu 2015; Julkaistu: 09 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Sinä et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuki avustusta Korea Health Technology R Welfare (A062254 ja A102059).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka arseeniyhdisteet ovat laajalti tunnettuja syöpää indusoivien syövät monissa ihmisen kudoksissa, arseenitrioksidi (As

2O

3, ATO) on osoitettu kliinisesti olevan tehokas terapeuttinen aine akuutin promyelosyyttileukemian [1,2]. Vaikka sen syövän vastaisen vaikutusmekanismia ei ymmärretä hyvin, ATO on todettu säännellä eri biologisiin toimintoihin, kuten solujen lisääntymisen, apoptoosin, erilaistumista ja angiogeneesiä erilaisissa solulinjoissa [3]. Koska ATO onnistui akuutin promyelosyyttileukemian [1,2,4], arsenicals kokevat herätyksen modernin syövän lääketieteen [5].

Arseeni esiintyy tri- ja penta-valenttisen hapetustilojen kemiallisesti epävakaat rikkivetyä ja oksidi, ja natrium-, kalium- tai kalsium. Trivalent arsenicals, kuten KML001 (NaAsO

2, natrium metaarsenite, Kominox) ja ATO, estävät monien entsyymien reagoimalla biologisia ligandeilla, joilla on vapaa rikki ryhmiin [3,6]. Kolme suurta molekyylimekanismeja ATO aiheuttaman apoptoosin on arvioitu, joihin mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien, kaspaaseiksi, ja reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) [3]. Vaikka vaikutusmekanismi ATO on tunnettu [7-12], joka on KML001 on edelleen tutkittavana [13,14].

Koska sen oraalinen biosaatavuus, vesiliukoisuus ja alempi mediaani tappava annos ( LD

50) rotilla, KML001 sopii paremmin kliinisiä sovelluksia kuin ATO [13]. Siksi tutkittiin kyky KML001 kasvun estämiseksi ja aiheuttavat solukuoleman ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa. Olemme myös analysoi, autophagy on apoptoosiin osallistuvien KML001 aiheuttaman solukuoleman eturauhassyövän solulinjoissa. Lopuksi määritimme antituumorivaikutus on KML001 vuonna DU145 ksenograftimallissa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

Ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, PC3, DU145, ja LNCaP ostettiin ATCC: ltä (Manassas, VA, USA) ja pidettiin RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jossa oli 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä 5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa. KML001 saatiin Komipharm International (Gyeonggi-do, Korea). Z-VAD-FMK ostettiin R 0,05 ja määritettiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA).

Tulokset

vaikutus KML001 proliferaatioon eturauhassyöpäsolujen

inkubointi androgeenista riippumattoman PC3 ja DU145 ja androgeeniriippuvaisissa LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa kanssa 0.0001-200 uM KML001 72 h vähentää solujen elävyys annoksesta riippuvalla tavalla. LNCaP-solut olivat herkempiä kuin PC3 tai DU145-soluissa (kuvio 1, taulukko 1).

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla KML001 inkuboitiin 72 tuntia. AlamarBlue määritys tehtiin kolmena kappaleena. Keskiarvot on esitetty, arvo ohjaus on 100%. PC3 (●,

paksu yhtenäinen viiva

), DU145 (▲,

ohut yhtenäinen viiva

), ja LNCaP (▼,

ohut yhtenäinen viiva

).

induktio apoptoottisen solukuoleman

sen määrittämiseksi, onko hoito KML001 (10 uM) indusoi apoptoosin hienorakenteet KML001 käsiteltyjen PC3-solut analysoitiin elektronimikroskoopilla. PC3-solut käsiteltiin KML001 osoittivat tyypillisiä apoptoottisten merkkejä, kuten pienempi ydin, enemmän keskittynyt solulimassa, rypistynyt tumakalvoa, ja kromosomien tiivistetty semilunar muotoon liitteineen ydin- ja solukalvoissa. Lisäksi apoptoottiset kappaleet havaittiin, kun chromatin kondensoidaan ja revennyt ydinalan marginaali. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin DU145 ja LNCaP-soluja käsiteltiin IC

50 pitoisuuksia KML001 (5 uM ja 1 uM) (kuvio 2).

tutkimiseksi mekanismi KML001 aiheuttaman solukuoleman, teimme anneksiini V: virtaussytometrialla määrityksissä. Hoito näiden solujen kanssa KML001 saatiin positiivisten solujen anneksiini V: värjäystä vain ja positiivisten solujen anneksiini V ja PI värjäystä. Nämä tulokset osoittavat, että KML001 solukuolema kautta sekä apoptoosin ja kuolion (kuvio 3A).

(A) FACS-analyysi anneksiini V /PI-värjäyksen. Tulokset osoittavat aikaisin apoptoosin, määritellään anneksiini V-positiivisia ja PI-negatiivisia soluja, ja myöhäinen apoptoosin, määritellään anneksiini V-positiivisia ja PI-positiivisia soluja. Tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (B) Western blot analyysi ajasta ja annoksesta riippuvaa lohkaisu PARP ja aktivointi prokaspaasi-3.

myös havaittu, että altistuminen eturauhasen syöpäsolujen KML001 johti aika- ja annoksesta riippuva nousu pilkkominen PARP, sekä aktivaation procaspases-3, joka välittää luontainen apoptoosia (kuvio 3B). Vahvista rooli apoptoosin KML001 aiheuttama kuolema eturauhassyöpäsolujen, käsittelimme solut kaspaasi-inhibiittorin Z-VAD-FMK. Olemme havainneet, että lisäämällä 20 uM Z-VAD-FMK vähentynyt aktivoituminen procaspases-3 kaikissa eturauhassyövän solulinjoissa (tietoja ei esitetty), tukee oletusta, että KML001 indusoiman apoptoosin eturauhassyöpäsoluissa.

induktio of autophagic solukuoleman

onko hoito KML001 (10 uM) indusoi autophagy, The ultrarakenteen PC3 käsiteltyjen solujen tutkittiin elektronimikroskoopilla. Havaitsimme autophagic vacuoles, mukaan lukien autophagosomes tai autolysosomes, in KML001-käsiteltyjen PC3-soluja, sekä DU145 ja LNCaP-soluja käsiteltiin niiden IC

50 pitoisuuksia KML001 (kuvio 2).

Eturauhassyöpä solut altistuvat KML001 tutkittiin Western-blottauksella käyttäen anti-LC3-ainetta, joka tunnistaa sekä muotoja LC3. Olemme havainneet, että ilmentyminen LC3 ja /tai konversio LC3-II suureni ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla, suhteessa käsittelemättömiin soluihin (kuvio 4A). Vahvista roolin autophagy on KML001 aiheuttama kuolema eturauhassyöpäsolujen, käsittelimme solut autophagy -estäjä 3-MA. Olemme havainneet, että lisäämällä 2 mM 3-MA vähentynyt ilmentyminen LC3-II kaikissa eturauhassyövän solulinjoissa (kuvio 4B). Lisäksi, lisätty 1 mM 3-MA myös heikennettyjä KML-solukuolema kaikissa eturauhassyövän solulinjoissa (kuvio 4C). Yhdessä nämä tulokset tukevat hypoteesia, että KML001 indusoi autophagy-välitteisen solukuoleman eturauhassyöpäsoluissa.

(A) Western blot analyysi ajasta ja annoksesta riippuvaa muuntaminen LC3-I-II. (B) esto 3-MA KML001 aiheuttaman muuntaminen LC3 eturauhassyöpäsoluissa. (C) Soluja altistettiin 10 uM (PC3), 5 uM (DU145), tai 2 uM (LNCaP) KML001 läsnä ollessa tai poissa ollessa 1 mM 3-MA: ssa 72 tuntia. Tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 yksisuuntainen ANOVA.

hapettumisenestoaine NAC suojaa soluja KML001 solukuolema

KML001 indusoi annoksesta riippuvaisen ROS kertymistä kaikki 3 eturauhassyöpäsolulinjoissa (kuvio 5A ). Olemme myös tutkinut, mitä vaikutuksia antioksidantin NAC on KML001 aiheuttaman apoptoosin ja autophagy. Olemme havainneet, että käsittely kaikkien 3 eturauhassyövän solulinjoissa, 1 mM NAC vähentynyt ilmentyminen LC3-II: n ja proteolyysin PARP (kuvio 5B). Lisäksi, lisätty 1 mM NAC myös heikennettyjä KML-solukuolema kaikissa eturauhassyövän solulinjoissa (kuvio 5C). Nämä havainnot tarjoavat lisää todisteita siitä, että altistuminen eturauhasen syöpäsolujen KML001 aktivoitu sekä apoptoosin ja autophagy kautta oksidatiivisen stressin.

Kaikki 3 eturauhassyövän solut käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden KML001 puuttuessa tai läsnä 5 mM NAC 24 h. (A) KML001 indusoi annosriippuvaista ROS (sininen) kertymistä. Solut värjättiin DCFH-DA, ja pestään PBS: llä. Yli kolme kenttää kussakin solussa havaittu fluoresenssilla mikroskoopilla (200 x), ja edustavia kuvia näytetään. (B) NAC inhibitio KML001 aiheuttaman muuntaminen LC ja kaspaasin aktivaatio eturauhasen syöpäsoluja. (C) Soluja altistettiin 10 uM (PC3), 5 uM (DU145), tai 2 uM (LNCaP) KML001 läsnä ollessa tai poissa ollessa 1 mM NAC: ssa 72 tuntia. Tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 yksisuuntaisella ANOVA.

Vaikutus DU145 ksenografteissa

injektoidaan subkutaanisesti nude-hiiriin 5 x 10

6 DU145 solujen testaamiseksi vaikutuksia KML001 on androgeeni- riippumattoman eturauhassyövän soluissa in vivo. Sen jälkeen, kun kasvaimen koko saavutti 100 mm

3, me annetaan KML001 (2,5 tai 10 mg /kg /d) ja niitä 4 viikkoa. Vuonna DU145 ksenograftimallia, kasvaimen kasvu inhiboitui KML001 verrattuna ajoneuvoon (kuvio 6A). Mutta KML001 hoito ei vaikuttanut hiirten kehon painon (kuvio 6B) B

Ajoneuvojen ja KML001 ryhmä hiiriä suun kautta sai suolaliuosta ja KML001 (2,5 tai 10 mg /kg /vrk) 4 viikkoa. *

p

0,05 vs. ajoneuvo.

Seuraavaksi kokeessa määritimme vaikutus KML001 proliferaatioon, apoptoosiin, ja autophagy kasvainkudoksissa korjattu eläimistä eri hoitoryhmissä. Vuonna immunohistokemiallinen värjäys ja leviämisen merkki Ki-67, pienensi merkitsevästi Ki-67 immunovärjäys havaittiin KML001 saaneilla kasvaimia kuin vehikkelillä käsiteltyjen kasvainten (kuvio 7A). Vuonna TUNEL-määrityksessä merkittävästi suurempi apoptoottisia soluja havaittiin KML001-käsitellyt tuumorit kuin vehikkelillä käsitellyt tuumorit (kuvio 7B). Western blot -analyysissä havaittiin, että ekspressio LC3 ja /tai konversio LC3-II kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla, suhteessa ajoneuvon-käsitellyt tuumorit (kuvio 7C).

kolme kentät kunkin hiiret olivat havaittu fluoresenssilla (200 x) ja kirkkaan kentän mikroskoopit (200 x), tässä järjestyksessä. Edustavat kuvat kummassakin hoitoryhmässä näytettiin. Ajoneuvojen ja KML001 ryhmä hiiriä suun kautta sai suolaliuosta ja KML001 (2,5 tai 10 mg /kg /vrk) 4 viikkoa. *

p

0,05 vs. ajoneuvo.

Keskustelu

Eturauhassyöpä on yksi johtavista kuolinsyistä miesten Yhdysvalloissa [19]. Vaikka aggressiivinen pyrkimyksiä kohti varhaisen havaitsemisen ja hoidon väheneminen kuolleisuus eturauhassyöpään, eturauhasen syöpä on toiseksi yleisin syy syövän kuoleman miehillä vielä. Vaikka alkuvaiheen eturauhassyövän edellyttää androgeenireseptorin kasvuun ja täten reagoi androgeenideprivaatio hoito, tauti voi edetä androgen itsenäisyyttä ja ehkä reagoi androgeeniablaatio [20]. Doketakseli-pohjainen chemotherapies ovat osoittaneet lievittävä ja selviytymisen etuja potilaille, joilla kastraatio kestävä eturauhassyövän, mutta hoitotulokset ovat yleisesti tyytymättömiä mediaani elinaika vain 16-18 kuukausi [21,22]. Joten se ei ole vain tärkeää kehittää tehokkaita keinoja estää tai hidastaa muodostumisen kastraation vastustuskykyisten eturauhassyöpä, mutta myös kehittää uusia kemoterapeuttiset aineet hoitoon kastraation vastustuskykyisten eturauhassyöpä.

Koska ATO näytettiin olla dramaattisia vaikutuksia potilailla, joilla on akuutti promyelosyyttinen leukemia [1,2], tämä aine on myös testattu potilailla, joilla on kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien eturauhassyöpä [23]. Sekä ATO ja KML001 ovat kolmiarvoisen arsenicals ja samanlaiset aineet liuoksessa, joilla on samanlaiset sytotoksisuutta androgeenista riippumaton eturauhassyöpä soluihin [13]. Kuitenkin oraalinen hyötyosuus ja vesiliukoisuus KML001 ehdottaa sen kliininen sovellettavuus verrattuna ATO. Lisäksi KML001 osoitettiin olevan korkeampi LD

50 (41,6 mg /kg) rotilla, verrattuna ATO (14,6 mg /kg) [13]. Joten testasimme kykyä KML001 kasvun estämiseksi ja aiheuttavat solukuoleman ihmisen eturauhassyövän solu. Olemme havainneet, että KML001 vähensi leviämisen kaikkien 3 eturauhassyövän solulinjoissa, on enemmän myrkyllisiä androgeeniriippuvaisissa LNCaP-soluja kuin androgeenin riippumaton soluja. Vielä tärkeämpää on, KML001 oli antiproliferatiivinen vaikutus androgeenista riippumaton DU145 solujen kasvua in vitro ja in vivo.

ATO vaikuttaa pahanlaatuisten solujen kautta erilaisia ​​mekanismeja, moniosaisia ​​signaalintransduktioreitteihin ja johtaa apoptoosin, antiproliferatiivinen aktiivisuutta, ja angiogeneesiä torjuvina [3]. Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet, että ATO ja KML001 voi kohdistaa telomere /telomeraasikompleksin [8-10,13]. KML001 sitoutuu telomeerisesti sekvenssit ja heikentää telomeerivasta, jolloin telomeeri- liittyvän DNA-vaurioita induktioon ja telomeerivasta poistuman. Lisäksi, ATO havaittiin indusoivan tyypin II ohjelmoidun solukuoleman, autophagy, pahanlaatuisissa glioomasolut [11,24]. Olemme osoittaneet tässä, että KML001 hoito johti muodostumista autophagic vakuolien, kuten dokumentoitu elektronimikroskopian. Lisäksi KML001 sai aikaan ajasta ja annoksesta riippuvaa lisääntymistä LC3-II. Käyttämällä autophagy estäjä 3-MA, olemme vahvistaneet, että mekanismi KML001 solukuolema liittyy autophagy. Autophagy ei ole vastuussa vain solukuolemaa, vaan osallistuu myös tappava signalointi tapahtuman aiheuttamaan apoptoosin tai nekroosin [25,26].

Lisäksi huomasimme, että aktivointi autophagy ja apoptoosin KML001 välittyi oksidatiivisen stressin. ROS on keskeinen asema välittämisessä sytotoksisuus aiheuttama KML001. Useissa tutkimuksissa on havaittu, että ROS tärkeä rooli säätelyssä sekä normaali solun prosesseja ja taudin etenemiseen [27-29]. Lisäksi kertynyt ROS on tunnettu avainvälituote sytotoksisuuden aiheuttama kemoterapia-aineiden, mukaan lukien ATO [3].

Yksi huolissaan arseenin käyttöä kliinisiin sovelluksiin on sen ihmisissä. Kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että ATO pitoisuuksilla alle 2 uM ei indusoi vakavia sivuvaikutuksia [30,31]. Kuten edellä on mainittu, KML001 oli vähemmän myrkyllistä rotille saman pitoisuuden ATO [13]. Tutkimuksessamme KML001 ei ollut haitallista vaikutusta kehon painoon DU145 ksenograftin hiirillä. Tuloksemme siis viittaavat siihen, että KML001 voivat olla kliinisesti käyttökelpoisia potilailla, joilla on kastraatio kestävä eturauhassyöpä.

Kun useimmat kemoterapeuttisten aineiden pyritään estämään niiden kasvua kastraation vastustuskykyisten eturauhassyöpä, androgeeniriippuvaisten ja riippumaton eturauhassyöpä solut on raportoitu olevan yhtä alttiita ATO: n indusoiman apoptoosin [23]. Lisäksi esto ATO oli selvempi eturauhassyövän soluissa, jotka ilmentävät androgeenireseptorin kuin eturauhasen syöpäsoluissa tyhjentynyt androgeenireseptorin, ja eston androgeenireseptorin aktiivisuutta ATO ja androgeenireseptorin antagonisti, bikalutamidi, on lisäaineen [24]. Nämä tulokset voivat oikeuttaa tulevaisuuden arviointi vaikutuksista KML001, yksin tai yhdessä androgeenien puute hoidon, sen etenemiseen androgeeniriippuvaisen LNCaP ja androgeeniriippumattomuuteen nude hiirillä ksenograftimallia.

Johtopäätökset

Olemme osoittaneet tässä, että altistuminen androgeeniriippuvaisen ja riippumaton eturauhassyöpä solujen KML001 aktivoitu sekä apoptoosin ja autophagic solukuoleman kautta oksidatiivista stressiä. Lisäksi KML001 oli antiproliferatiivinen vaikutus androgeenista riippumaton DU145 soluihin in vivo.

Kiitokset

KML001 annettiin päässä Komipharm International Co., Ltd., Gyeonggi-do, Korea.

Tämä tutkimus tukee avustuksia Korea Health Technology R Welfare (A062254 ja A102059).