Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kyky selektiivisesti havaita ja kohdistaa syöpäsolut, jotka ovat läpikäyneet epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) saattaa parantaa menetelmiä syöpien hoitoon kuten haimasyöpä. Remontin solujen glykosylaatiota aikaisemmin on liittynyt solujen erilaistumista ja sillä saattaa olla arvokas luokan molekyyli tavoitteita EMT.

Menetelmät /Principal Havainnot

Ensimmäinen askel kohti tutkii luonne glykosylaation muutoksia EMT, olemme tunnettu ilmaus glykanista liittyvien geenien kolmessa

in vitro

mallijärjestelmiin että kukin edustaa täydentävä näkökohta haimasyövän EMT. Nämä mallit olivat: 1) TGFli aiheuttama EMT, joka tarjosi katsoa vaikuttavan siirtyminen valtioiden; 2) paneelin 22 haimasyövän solulinjoissa, jotka edustivat pääte erilaistumista valtioiden joko epiteelityyppinen tai mesenkymaalisten kaltainen; ja 3) aktiivisesti-muuttolintuja ja paikallaan soluja, jotka tarjotaan katsomaan mekanismi muuttoliikkeen. Analysoimme ekspressiotietojen luettelosta 587 osallistuvien geenien glykosylaation (biosynteesissä, sokeri liikenne, glykaani sitova, jne) tai EMT. Glycogenes muutettiin suuremmalla esiintyvyys kuin kaikki muut geenit kahden ensimmäisen mallia (p 0,05 ja 0,005, tässä järjestyksessä), mutta ei siirtymistä malliin. Useita toiminnallisia teemoja jaettu aiheuttama-EMT malli ja solulinjan paneelista, mukaan lukien muutokset matriisikomponenteista ja proteoglykaanien, The sulfaatioon glykosaminoglykaanit; mannoosireseptoriin perheenjäseniä; aloittamisesta O-glykosylaation; ja tietyt sialylaatio-. Proteiini-tason muutoksia vahvistettiin Western blot ja mannoosireseptorin MRC2 ja O-glykosylaatio entsyymin GALNT3, ja solupinnan sulfatointi muutoksia vahvistettiin käyttäen Alcian Blue -värjäyksellä.

Johtopäätökset /merkitys

muutokset glycogenes ovat merkittävä osa syöpää EMT ja joille on ominaista muutokset matriisin komponenttien sulfaatio GAG: ien, mannoosireseptoreihin, O-glykosylaatio, ja erityisiä sialyloidun rakenteita. Nämä tulokset tarjoavat johtaa kohdistamiseen aggressiivinen ja lääkkeille vastustuskykyiset muodot haiman syöpäsoluja.

Citation: Maupin KA, Sinha A, Eugster E, Miller J, Ross J, Paulino V, et al. (2010) Glycogene Expression muutostyöt Associated haimasyöpä epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon in Täydentävä Model Systems. PLoS ONE 5 (9): e13002. doi: 10,1371 /journal.pone.0013002

Editor: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasilia

vastaanotettu: 26 huhtikuu 2010; Hyväksytty: 30 elokuu 2010; Julkaistu: 27 syyskuu 2010

Copyright: © 2010 Maupin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Institute (www.cancer.gov) (R03CA139225 BH, National Institutes of Health [NIH] R01 CA132571 VK, ja NIH R01 CA130940 NT), American Cancer Society (www.cancer.org) ( CSM-116801 VK), National Institute of neurologiset häiriöt ja aivohalvaus (www.ninds.nih.gov) (NIH R01 NS042262 MB) ja Van Andel Research Institute (www.vai.org). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi köyhimmistä eloonjäämislukuja merkittävistä syöpä [1]. Äärimmäinen kuolleisuutta haimasyövän liittyy sen taipumus levittää varhaisessa vaiheessa ennen diagnoosia [2], [3] ja sen kestävyys kemoterapeuttisia [2], [4]. Migraatio ja huumeiden kestävät piirteet haiman syöpäsoluja voi esiintyä askel-askeleelta tavalla, mukana lisäämällä muutoksia genetiikan ja morfologioita syöpäsolujen. Alkuvaiheen ja premaligneja valtiot ajatella koostuvan dysplastisia solujen haimatiehyitä [5], ja eteneminen adenokarsinooma on ominaista lisääntyvien epiteelisyöpäsolujen koottu putkimaiseen ductal rakenteita ympäröivät fibrotic strooman. Metastaattista levittäminen haimasyövän vaatii solujen irtautumaan epiteelin duktaaliseen rakenteita ja ottaa ominaisuuksista vaeltavia, mesenkyymisolujen. Tämä siirtyminen edellyttää valtavia remontin solun ja on todennäköisesti ajaa geneettinen poikkeavuuksia, solunulkoisia signaaleja, ja aktivointi erilaistumisen ohjelmien syöpäsoluja. Kuvaavat molekyyli muutokset liittyvät fenotyyppisiä kytkimen haimasyövän soluja epiteelityyppinen ja mesenkymaalisten kaltaiset piirteet antavat oivalluksia väyliä havaitsemiseksi ja kohdistamista tämän muuntamisen.

Tämä merkittävä fenotyyppiset kytkin haiman syöpäsoluissa voi olla vetämänä epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT). EMT on biologinen ohjelma, joka koordinoi muuntaminen solujen erilaistumisen epiteelin ominaisuuksista vahva solu- soluadheesiota, napaisuus, ja sileä morfologia mesenkymaaliset ominaisuuksia minimaalinen solu-solu kontakteja, menetys polaarisuus, ja lisääntynyt solujen ulokkeet [2] [6], [7], [8], [9]. EMT on tavallisesti aktivoituu kehittämiseen ja haavan paranemisen aikana kudoksen uudelleen, mutta sen uskotaan olevan poikkeuksellisen aktivoidaan tietyntyyppisten syöpäsolujen antaa piirteet liittyvät erittäin tappava syöpiä. Monirivisille todisteet tukevat tärkeydestä EMT edistämisessä haimasyövän aggressiivisuus. Yleinen histologinen menetys solujen erilaistumista on erittäin tarkka ennustaja huonon lopputuloksen haimasyövän [10], [11], ja erityisiä EMT markkereita alentunut E-kadheriinin ja lisääntynyt vimentiinista korreloi huonon säilymisen [12], [13] ja hyökkäys [14]. Hiiri malleja haimasyövän kerrata, että suhde [15]. Suostumuksella nämä toteamukset, induktion transkriptiotekijän nimeltään etana, joka ohjaa E-kadheriinin tukahduttaminen, johtaa lisääntyneeseen etäpesäkkeiden ja chemoresistance haiman syöpäsoluja [16]. Lisäksi mesenkymaaliset kaltainen syöpäsolut voivat olla lääkeresistenttiä kuin niiden epiteelityyppinen kollegansa, ehdottivat korrelaatio Gemsitabiini-vastus ja mesenkymaalisten piirteet [17] ja menetys EGFR-estäjän herkkyys haiman syöpäsoluja, jotka ovat menetetty epiteelin kaltainen piirteet [8]. Intensiivinen tutkimuksia ovat löytäneet monia sääntelymekanismeja ja molekyylitason ominaisuuksia tämän konversion [2], [6], [7], [8], [9], mutta in vivo tekijöiden työssä syövässä EMT ja jotka ovat merkityksellisiä haimasyövän etenemisen eivät ole selkeitä.

glykosylaatiota syöpäsolun voidaan merkittävästi uusittu aikana EMT, vaikka luonne yhdistys ei ole hyvin tunnettu. Glykosylaatio on dynaaminen prosessi, johon liittyy yhteisiä vuorovaikutus eri glykosyylitransferaasit ja niihin liittyvien entsyymien ja Golgin laitteessa [18]. Glykaanirakenteet osallistuvat proteiinitasapainon taitto [19], [20], [21], solunsisäiseen kuljetukseen [18], [20], [22], solujen kasvuun ja erilaistumiseen, [20], [23], tarttuvuus ja muuttoliike [18], [24], ja solupohjaiset immuniteetin [20], [25], muiden toimintojen. Muutokset glykaanien on havaittu, ja osallisena erilaisissa patologisissa olosuhteissa [23], [26]. Lisäksi, hiilihydraatti rakenteita solun pinnalle ja eritetyt proteiinit ovat hyviä indikaattoreita solutyypin ja asema, koska ne erityisesti muuttaa yhdessä kehittämiseen [27], [28], solujen erilaistumisen ja aktivaation [29], [30], ja transformaatio [31]. Siksi hypoteesi, että haimasyövän EMT on ominaista tietty glykosylaatiomuutokset että pelata toiminnallisia rooleja syöpäsolujen erilaistumista tai muuttoliike.

Koska ensimmäinen askel tämän hypoteesin testauksessa, tutkimme ilmaus glykosylaation liittyvien geenien kolmessa malli järjestelmien EMT tai muuttoliike. Seurata geenien ilmentymistä on kokeellisesti enemmän mukautuva kuin kattavammin luonteenomaiset glykaanirakenteet liittyvät kunkin mallin järjestelmään, ja siksi valitsimme tämän reitin alustavan tutkimuksen. Vaikka se ei ole mahdollista päätellä glykaanirakenteet yksinkertaisesti geenien ilmentymistä glycogenes, ilmaisun muutoksia glycogenes tarjota oivalluksia suuria rakenteellisia muutoksia sekä johtaa tavoite pistettä terapeuttiseen interventioon. Expression muutoksia glycogenes aiemmin on tarkasteltu keskittynyt mikrosiruja tai PCR paneelit on suunniteltu erityisesti mittaamaan asiaankuuluvat selostukset [32], [33], [34]. Tässä osoitamme käytön koko genomin ilmentymisen profilointi kaapata samat tiedot valikoivasti analysoimalla tietoja kohdegeenin luettelo 587 glykaani liittyvien geenien (mukaan lukien geenit, jotka liittyvät EMT). Etuna tässä lähestymistavassa on kyky käyttää standardia ilmaisua profilointi alustoja sekä historiatiedot, jota ei luotu nimenomaan tutkia glycogenes. Käytimme soluviljelmäjärjestelmiä joissa EMT voitaisiin ohjata stimuloimalla TGF (malli 1) tai jossa päätelaite erilaistumisen tilasta erilaisia ​​solulinjoja voidaan luokitella joko epiteelin kaltainen tai mesenkymaalisten kaltainen (malli 2). Lisäksi tutkimme geeniekspressiomalleja soluissa, jotka oli joko aktiivisesti muuttaa tai paikallaan (malli 3). Jokainen malli järjestelmä edustaa eri osa solun käyttäytymistä koskevat EMT: aktiivinen siirtyminen valtioiden, terminaali eriyttäminen valtioiden tai aktiivisuutta muuttoliikettä. Me raportoimme tässä suuria muutoksia glykaanin liittyvien geenien ilmentymistä, jotka liittyvät kunkin mallin järjestelmiä ja jotka ovat yhteisiä välillä mallijärjestelmissä.

Tulokset

Glycogene ilmentymisen TGF-indusoidun EMT

ensimmäinen malli järjestelmä, jossa selvitimme glycogene ilmentyminen muuttuu oli TGFli induktion EMT solulinjoissa Pancin-1 ja A549. A549-solulinja ole johdettu haimasyöpä vaan se sisältyi antaa tietoa yleispätevyyttä yhdistysten kanssa EMT. Lisäksi, etsimällä geenejä, jotka muuttuvat molemmissa solulinjoissa, me vähentää luettelon kandidaattigeenien. TGF-hoito johti liukeneminen solun soluadheesiota ja lisäykset kara ulokkeiden molemmissa soluissa linjat (kuva S1). Koko genomin ekspressiomittaukset saatiin käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen avulla Affymetrix geenilastut. Saat rajattu analyysi kiinnostuksen kohteena olevia geenejä, käytimme lista 587 liittyvistä geeneistä glykosylaation ja EMT-liittyvät reitit (katso taulukko S1).

ensimmäinen tutki glykosylaation liittyviä geenejä osoitti korkeampaa ilmaisun muutokset kuin kaikki muut geenit (taulukko 1), mikä saattaa viitata merkittävä asema glykosylaatiomuutokset vuonna EMT. Kaikista geenit, 1524 ainutlaatuinen Affymetrix tavoitteita muuttunut ilmentyminen sekä Pancin-1 ja A549-hoidon jälkeen TGF. Koska meidän glykaanirakenteessa liittyvät geenit edustivat 1,5% koko ainutlaatuinen Affymetrix U133 Plus 2.0 tavoitteita, satunnainen esitys glycogenes ennustaa vastaavan 1,5% edustus glycogenes (tai 23 geenit) joukossa, joka muutti ilmaisua. Kuitenkin 40 1524 geenien (2,6%) oli glycogenes meidän tavoite luettelosta. Tämä ero oli merkitsevä by chi-neliö analyysi (X

2 = 13,05, p 0,05). Tämä tulos viittaa siihen, rikastuminen transkription säätelyyn glykanista liittyvien geenien TGFli aiheuttama EMT.

tarkastelu geenien muutettiin yli 1,5-kertainen molemmissa solulinjoissa (taulukot 2 ja 3 ) paljasti joitakin toiminnallisia teemoja. Suurin muutos oli proteoglykaani SPOCK1, joka sisältää glykosaminoglykaani sivuketjut heparin- ja kondroitiini-sulfaatti [35]. Tähän liittyy proteiiniin, geenejä, jotka muuttavat glykosaminoglykaanin sulfation oli säädelty, kuten SULF2, CHST3, ja CHST11 ja HAS2 oli säädelty, joka on mukana synteesi glykosaminoglykaanin Hyaluronaani. Lektiini kaltaista reseptoria osallisena solun liikkuvuus ja soluväliaineen remodeling, MRC2, säädeltiin voimakkaammaksi. Muutokset aloittamisesta O-glykosylaatio ilmaistaisiin GALNT2 ja GALNT10 muutoksia, ja matriisi tarttuvuus muutoksia edustaa säätelyä useita integriinien ja matriisin proteiini LAMC2 (gamma 2 laminiini). Muita kohonnut geenit edustavat EMT ja TGF merkinantotoimintoihin. Kuusi geenit, joilla on alentunut ilme ei osoittanut erityistä rikastamiseen spesifisyys, jossa ST8SIA4 on ainoa pienentää glykosyylitransferaasi.

Glycogene Expression on Haimasyöpä Cell Line Panel

Toinen mallijärjestelmä oli paneeli 22 haimasyövän solulinjoissa. Moninaisuus solujen morfologiaa ja adheesion käyttäytymistä havaittiin joukossa solulinjoissa (kuvio 1). Tietyt solulinjat on vahva epiteelin ominaisuudet (pyöristetty morfologioita ja lukuisat solu-solu koskettimet), kun taas toiset ovat selvästi mesenkymaaliset kaltainen (kara-ulokkeita ja muutama solu-solu kiinnikkeistä). Siksi pyrimme tunnistamaan geeniekspression ominaisuudet, jotka erottavat nämä kaksi käyttäytymistä. Tämä vertailu ei koske suoraan EMT, vaan antaa oivalluksia terminaalin eriyttäminen, joihin liittyy mesenkymaaliset ja epiteelin fenotyyppien.

mesenkyymikasvaimia kaltaisia ​​solulinjoja esitetään kaksi ylintä riviä, ja epiteelin kaltainen solulinjoja ovat pohjassa kahdessa rivissä. Huomaa lisääntynyt solujen hajottaa ja karan ulokkeita nähdään mesenkymaaliset kaltaisia ​​soluja verrattuna tiukempi solu-solu-adheesion ja pallomainen muoto ominaista epiteelisolujen. Kuvat otettiin talteen faasikontrastimikroskopiaan 10-kertaisella suurennuksella.

ryhmitelty solulinjoissa joko epiteelin kaltainen tai mesenkymaalisten kaltainen perustuu morfologiaan ja klustereiden (kuvio 1). Solulinjat kuten CAPAN-2, HPAF-II, ja BXPC-3 on tiheä, pyöristetty pesäkkeet ja oli yksiselitteisesti luokiteltu epiteelin kaltainen. Toisaalta ääripäässä MiaPaca-2 ja MPanc-96 osoitti selvästi mesenkymaaliset ominaisuuksia matalan solu-vuorovaikutuksiin ja kara kuten solujen ennusteita. Muut solulinjat olivat vaikea luokitella näiden ominaisuuksien näyttää ristiriitaisia ​​tai osittainen ominaisuuksia kunkin. Siksi tarkasteltiin ilmentymisen EMT liittyvien geenien keinona luokituksen (kuva S2). Niistä geenit (katso kuva S2 täydellistä luettelossa), ZEB1 transkriptiotekijä selvimmin vastasi morfologia ja korreloivat voimakkaasti alaspäin säätely epiteelin merkki, E-kadheriinin (CDH-1) [6], [7], [8 ], [9] mesenkymaaliset kaltaisia ​​soluja. Silmiinpistävä kahtiajako soluja, jotka olivat negatiivisia tai positiivisia ZEB1 oli ilmeistä, jakamalla solulinjat kuuteen, jotka olivat mesenkymaaliset kaltainen ja 16, jotka on epiteeli-, kuten. Tämän perusteella luokitus, ilmaus E-kadheriinin (CDH-1) oli merkittävästi ylöspäin säännelty (p≤0.01) ja ilmentymistä vimentiinista (VIM) oli merkitsevästi säädeltiin (p≤0.01) epiteelisoluissa. Proteiinin ekspressiokuvio näiden kahden geenin vahvistettiin Western blot (kuvio 2). Sen vuoksi käytimme tätä luokitusta seuraavissa analyyseissä.

Lysaatit kerättiin valittu solulinjat, fraktioitiin SDS-PAGE, ja tutkittiin Western blot. Korostettu nauhat ovat odotettu molekyylipainot 110 kD E-kadheriinin, 57 kD vimentiinista, ja 42 kD aktiini.

tutki glykaanitähteen liittyvät geenit olivat eri ryhmien välillä osoitteessa korkeampi kuin kaikkien muiden geenien (taulukko 1). Tarkkaan sattumalta, koska meidän glykaanitähteen liittyvät geenit edustivat 1,5% koko ainutlaatuinen Affymetrix U133 Plus 2.0 tavoitteet, odotimme vastaava 1,5% edustus glycogenes keskuudessa luettelo koko muuttuu geenejä. Kuitenkin on 3675 antureista joka osoitti merkitsevästi muuttunut ekspressiotasoja (p≤0.05) välillä mesenkymaaliset kaltaisia ​​soluja ja epiteelin kaltaisia ​​soluja, 87 (2,37%) oli glycogenes meidän tavoite luettelosta. Chi-neliö analyysi osoitti näiden tulosten olevan erittäin merkittävä (X

2 = 18,9, p≤0.005). Tämä suuntaus jatkui korkeampaa merkitystä 1212 ainutlaatuinen Affymetrix tavoitteet ilmi varsin erilaisia ​​ekspressiotasoja (p≤0.01). Näiden tavoitteiden, 30 (2,48%) oli meidän luettelossa glycogenes, myös merkittävä ero Chi-square analyysi (X

2 = 8,12; p≤0.005). Tämä analyysi ehdotti rikastuminen transkription säätelyyn glykanista liittyvien geenien solujen erilaistumista välillä mesenkymaalisten ja epiteelin fenotyyppien.

geeniekspression muutoksia tässä mallissa järjestelmä esitetään yhteenveto taulukoissa 4 ja 5. Kuten edellä, proteoglykaani oli kaikkein merkittävästi yli-ilmentyy mesenkymaaliset kaltaisia ​​soluja, tässä tapauksessa VCAN (versikaani), ja geenit säätelevät sulfatointi glykosaminoglykaanien oli säädelty, kuten SULF2, CHST7, SGSH, ja NDST2. Matriisimodifikaatio oli myös edustaa säätelyä VIM (vimentiinista) ja LAMA4 (alfa 4 laminiini). Toisin kuin aiheuttama-EMT malli, osallistuvat geenit aluevaltaus tai laajentamalla glykaanitähteen ketjut säädellään ylöspäin mesenkymaaliset kaltaisia ​​soluja, kuten MGAT5B, ST3GAL2, ST6GALNAC4, POMGNT1, ja B3GNT1. Mesenkymaaliset kaltaisten solujen osoitti myös silmiinpistävää alassäätöä joissakin geenejä, varsinkin GALNT3, mikä käynnistää O-glykosylaatio. GALNT3 oli alassäädetty kaikissa kuudessa mesenkymaalisten kaltaisia ​​soluja, joiden keskimääräinen lasku ~1000-kertaiseksi. Kaksi C-tyypin lektiinien olivat myös alassäädetty, LY75 ja CLEC3A. Ilmentymiskuviot Näiden geenien selvästi erottaa mesenkymaalisten kaltaiset solulinjat epiteelin kaltainen (kuvio 3).

geenit olivat mukana, joka oli merkitsevästi erilainen (p 0,01) ilmentymisen tasojen mesenkymaaliset kaltainen ( saraketunnisteista väriltään punainen) ja epiteelin kaltainen (sarake etiketit väriltään musta) solulinjat. Ilmaisu arvot log-muunnettiin (pohja 10) ja mediaani keskitetty rivillä. Arvo kunkin neliön osoitetaan väripalkkia.

Glycogene ilmaisun siirtymiseen ja paikallaan haimasyöpäsoluissa

Kolmas malli järjestelmä oli vertailun aktiivisesti vaeltavat solut paikallaan soluihin [36]. Panc-1 ja MiaPaca-2-solut ympättiin, kuten 1 mm: n on määritelty kehällä ja solujen annettiin kulkeutua 48 h. Kaksi erillistä morfologiset populaatiot havaittiin. Solut reuna solun klusterin siirtynyt pois alueelta suuren solutiheyden (RIM) ja otti klassisen mesenkymaalisten ilmiasuun kara ulokkeita ja menetys solun soluadheesion. Solut, jotka pysyivät erittäin asutuilla keskus (ydin) osoitti suurempaa välistä adheesiota ja olivat pyöristetty ulkonäöltään. Solut kerättiin osaksi ”vanteen” ja ”ydin” ryhmiä selektiivisesti kerätä kunkin näiden kahden ryhmän.

2,778 ainutlaatuinen tavoitteet muuttunut ilmentyminen vähintään +/- 0,25-kertainen sekä siirryttäessä MiaPaca-2 ja Panc-1 verrattuna niiden paikallaan kollegansa (taulukko 1). Koska meidän glykaanirakenteessa liittyvien geenien edusti 3,0% koko ainutlaatuinen Agilent kaikkiaan Human Genome Microarray Kit (4 x 44K antureista), Sattumiin ennusti vastaavan 3,0% edustus glycogenes keskuudessa luettelo geenien muuttunut. Kyseisen tason edustuksen todellakin havaittu, kun 84 2778 geenien (3,0%), joilla on muuttunut ilmentymistasot olivat glycogenes meidän tavoite luettelosta. Chi-square analyysi paljasti, että ero havaittu muutos glycogenes ei ollut merkittävä verrattuna odotettuun arvoon. Nämä tulokset eivät viittaa rikastuminen sääntelyn glykanista liittyvien geenien kuvaavat eroja aktiivisesti vaeltavat ja paikallaan soluja.

Vähemmän geenit osoittivat differentiaalikaavojen ryhmien välillä kuin edellä malleissa (taulukot 6 ja 7). Kahdeksan kohdegeenien voimistunutta ilmentymistä yli 1,5-kertaisesti sekä vaeltavat MiaPaca-2 ja Panc-1. Ei geenit kasvoi yli kaksinkertaiseksi molemmissa solutyypeissä. Mitään selvää teemat glycogene toiminto olivat havaittavissa joukossa geenien lisääntynyt ilme. Yhdeksän kohdegeenien vähentynyt ekspressiotasot yli 1,5-kertaisesti sekä Siirtyminen MiaPaca-2 ja Panc-1. Kaksi liittyvät poistamisen mannoosin biosynteesin N-glykaanien, MAN1A2 ja MANBA. Limakalvon MUC12 oli ainoa geenin vähentynyt ilmentyminen yli kaksinkertaiseksi molemmissa solutyypeissä.

Jaettu Geenit ja Functional teemat

tutkimme seuraavaksi tiettyjen geenien ilmentyminen muutokset olivat yhteisiä kahden tai useamman mallin järjestelmiä. Tällainen analyysi on hyvä antaa lisää ohjeita, mitkä geenit ovat tärkeitä useita ominaisuuksia EMT tai ovat toiminnallisesti tärkeitä liittyvissä prosesseissa EMT. Päällekkäisyys välinen malli järjestelmien oli vähäistä. Verrattaessa TGFli aiheuttama EMT ja solulinjan paneelista, vain kolme geeniä olivat yleisiä: ZEB1 ja SULF2 oli säädelty molemmissa malleissa, ja CDH1 väheni molemmissa. Käyttämällä tiedot vain siltä Pancin-1 solulinja in TGFp aiheuttama ja vaeltavat solumalleja, ST6GALNAC4 lisääntynyt ja PIGM väheni kaikissa mallijärjestelmissä. Nämä tulokset osoittavat, että vaikka glycogenes on muuttaa kunkin mallin ja erityisen rikastettu indusoidun-EMT ja solulinjan paneelista, erityisen osallistuvat geenit ovat kukin erilaisia ​​järjestelmien välillä.

Vaikka monet muuttaa geenejä erilaiset indusoituneen-EMT malli ja solulinjan paneelista useita toiminnallisia teemoja olivat läsnä molemmissa. Hallitsevin yhteinen teema oli modulaatio glykosaminoglykaanin (GAG) komponentti soluväliaineen. SPOCK1 ja VCAN (versikaani) ovat molemmat matriisiproteiineista laakeri GAG ketjuja, ja molemmat järjestelmät ilmestyivät-säätely geenien lisätä ja ottaa pois sulfaatti näistä ketjut, kuten SULF2, CHST3, CHST11, HAS2, CHST7, SGSH, ja NDST2. Alcian Blue -koe sen edelleen luonnehtia yleinen sulfation tasojen epiteelin ja mesenkymaalisten kaltaisten solulinjojen sekä induktion jälkeen EMT in Pancin-1 TGF (kuva 4). Merkittävä nousu yleisen sulfation nähtiin mesenkymaalisella kaltainen solulinjoissa (p = 1,29 x 10

-5). Asiakkuutta EMT in Pancin-1 TGF jatkoi suuntaus merkittävästi lisätä yleistä tasoa sulfaatiokohtaa (p = 0,027). Nämä tulokset vahvistavat cellular sulfation muutoksia kahden mallin järjestelmän, jossa ne ehdottamia geeniekspressiota.

(A) RT-PCR suoritettiin lysaatit osoitetusta solulinjoista, ja intensiivisyys kaistojen odotetun -koko eri geeniä kvantifioitiin. Opiskelijan t-testiä (antamat tulokset p-arvo) suoritettiin vertaamalla juovien voimakkuudet välillä mesenkymaalisten kaltaiset solulinjat (lihavoitu) ja epiteelisolujen linjat. Lisäksi korrelaatio on laskettu (antamat tulokset r-arvo) välillä RT-PCR-tulokset ja microarray data. Glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin cDNA: n lastaus ohjaus. (B) vertailu GALNT3 proteiinin tasot Western blot valituilla haimasyövän solulinjoissa. Lysaatit kerättiin valittu solulinjat, fraktioitiin SDS-PAGE, ja tutkittiin Western blot. Mesenkymaalisten kaltainen solu on merkitty lihavoituna. Korostettu nauhat ovat odotettu molekyylipainot 73 kD GALNT3 ja 42 kD aktiini. (C) MRC2 proteiinin tasot mitataan Western blot TGF käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen. Solulinjoja joko altistettiin 5 ng /ml TGF tai käsittelemätöntä mukaisesti seerumistarvaatio 72 tuntia ennen solujen lyysiä. Korostettu nauhat ovat odotettu molekyylipainot ~167 kD MRC2 ja 42 kD aktiini.

Toinen teema yhteistä on indusoituneen-EMT malli ja solulinja paneelissa oli muutoksia lectin- kuten reseptorit mannoosireseptorin perhe. Neljä tämän perheen jäseniä, MRC1, MRC2, LY75, ja CD302, ovat transmembraaninen endosyyttinen reseptoreita useita hiilihydraattia sitovaa domeenia. MRC2 oli voimistunut ja CD302 oli säädellä vähentävästi indusoidussa-EMT malli, ja LY75 oli alassäädetty solulinjassa paneeli. Kaksi EMT-malleissa on myös jaettu muutoksia jäsen N-asetyyligalaktosamiini (GalNAc) transferaasin perhe, jotka katalysoivat alkuperäisen lisäämällä GalNAc on seriinin tai treoniinin tähteen musiini-tyyppinen O-kytketty glykosylaatio. GALNT2 ja GALNT10 olivat säädellään ylöspäin aiheuttama EMT, ja GALNT3 oli voimakkainta diskriminaattori epiteelin kaltainen ja mesenkymaalisten kaltaisia ​​soluja solulinjassa paneeli, jossa ilme laskee alle mitattavissa tasoa mesenkyymisolujen (kuva 4).

Validation of Gene Expression erot

ero geeniekspression mesenkymaaliset kaltainen ja epiteelin kaltaisten solulinjojen vahvistettiin tiettyjen geenien käyttäen RT-PCR: ää ja Western blot (kuvio 5). Väliset korrelaatiot RT-PCR ja mikrosirujen tulokset olivat yleensä yhdenmukaiset, jossa vahvin korrelaatioita nähnyt GALNT3, 0,912; ZEB1, 0,774; GMPPA, 0,735; ja MAN2B2, 0,713; ja heikompi korrelaatiot ST3GAL6, 0,509; ja PMM1, 0,415. Proteiini-tason muutokset vahvistettiin Western Blot for GALNT3 ja MRC2. GALNT3 tunnistus oli positiivinen epiteelisolujen linjat BXPC-3, HPAF II, ja SU86.86 vaikka ei huomata mesenkymaalisten kaltainen solulinjoja MiaPaca-2, MPanc-96, ja Panc-1. MRC2 havaittiin vain A549, Panc-1, ja MiaPaca-2 ja osoitti kohonneita hoidon jälkeen TGF näiden kolmen solulinjoissa. Ei ollut havaittavissa oleva määrä MRC2 varten BXPC-3 tai HS766t läsnä ollessa tai poissa ollessa TGFp.

Alcian Blue määritys suoritettiin lysaatit osoitetusta solulinjat, ja yleinen sulfaation kunkin solulinjan oli määrällisesti mittaamalla absorbanssi väriaineen aallonpituudella 600 nm. Opiskelijan t-testiä (antamat tulokset p-arvo) suoritettiin vertaamalla absorbanssien välinen mesenkymaalisten kaltainen solulinjoja (lihavoitu) ja epiteelisolujen linjojen välillä sekä Pancin-1 jälkeen 72 tunnin TGFp hoidon ja käsittelemättömän Panc- 1. Hepariinia käytettiin sulfatoitu GAG ohjaus. (A) valokuva tuloksena säilyttäminen Alcian Blue väriaineen jälkeen saostumisen sulfatoitu glykaanien ja myöhemmät jousitus. Toinen sarake edustaa mesenkymaalisten kaltainen solulinjojen ja säilytti enemmän tahra, että niissä on korkeampi sulfatoidut glykaanien solulysaateissa. (B) Bar kaavioita erot absorbanssin 600 nm: ssä solulinjat. Mesenkymaaliset kaltaiset solulinjat (lihavoitu) oli merkittävästi korkeampi absorbanssi kuin jäljellä epiteelin solulinjoja (p = 1,29 x 10

-5). (C) Bar kaavioita erot absorbanssin 600 nm: ssä Panc-1 sen jälkeen, kun 72 tunnin altistusta 5 ng /ml TGF tai käsittelemätöntä mukaisesti seerumistarvaatio. Pancin-1 jälkeen TGF hoidon oli merkittävästi korkeampi absorbanssi kuin käsittelemättömän Pancin-1 (p = 0,027).

Keskustelu

Kyky tunnistaa tai valvonnan EMT haimasyövän voisi johtaa parempaan hoitostrategioita. Luonnehdinta molekyylitason muutoksia liittyy EMT on ensimmäinen askel purkautuu joitakin mekanismeja ajo tätä prosessia. Määrittely glykaanirakenteeseen muutoksia, jotka liittyvät EMT voi olla erityisen tärkeää ymmärtää tätä prosessia, kun muistetaan osallistumista glykaanien muissa solujen erilaistumisen prosesseihin. Koko genomin ilmentymisen profilointi yhdistettynä kohdegeenin luettelo 587 glykosylaation liittyvien geenien oli käytännöllinen keino tutkia glykosylaation tässä biologisessa järjestelmässä. Lisäksi käytetään kolmea in vitro mallissa järjestelmät osoittautunut hyödylliseksi tutkia täydentävien näkökohtia epiteelin ja mesenkymaaliset valtiot eli aktiivinen siirtyminen valtioiden, terminaali eriyttäminen valtiot, ja teko muuttoliikettä.

merkityksen glykaanin muutoksia EMT tukivat taajuus muuttuu glykosylaation liittyvien geenien (taulukko 1). Glykaanin liittyvien geenien muutettiin useammin kuin oli ennustettu kahdessa mallijärjestelmissä, TGFp aiheuttama EMT ja solulinjan paneelit, mutta ei solujen vaeltamiseen malli. Se havainto, että glykaani remodeling on tärkeä näkökohta solujen erilaistumista prosessi olisi sopusoinnussa aikaisemman työn, jotka osoittavat glykanista muutosten kantasolujen biologiassa ja immuuniaktivaatiota [27], [31], [37]. Puute suuria glycogene muutoksia solujen kulkeutumiselle saattaa osoittaa, että vaeltavien soluja ei oikeastaan ​​erottaa, vaan ainoastaan ​​muuttamalla lauseke mekaniikka muuttoliikkeen. Siksi glykaanirakenteessa muutokset saattavat olla tärkeämpiä indikaattoreina solutyypin ja tila pikemminkin kuin toiminnallinen avustajat muuttoliikettä. On kuitenkin syytä huomata, että muuttaminen glykosyylitransferaasin toiminnan solulinjan mallit ovat osoittaneet ero vaikutuksia leviämiskyky

in vitro

[38], [39], [40]. Kun kyseessä on Pancin-1 ja MiaPaca-2, ne voivat jo hallussaan glykaanirakenteeseen-koneet, joita tarvitaan tehostettua leviämiskyky; jatkokäsittelyä ei ehkä ole tarpeen. Tämä alue tutkimus rajattiin myös kahteen haimasyövän solulinjoissa hyvin erityisissä

in vitro

olosuhteissa. Tulevaisuuden analyyseistä enemmän solulinjoja ja eri menetelmiä erottaa muuttavien Kiinteiden solut voivat tuottaa uusia havaintoja.

toiminnalliset teemoja yhteinen aiheuttama EMT malli ja solulinja paneelissa antaa joitakin oivalluksia roolit Glykosyloinnin EMT . Muutostyöt proteoglykaanien ja sulfatoituminen entsyymejä ehdottaa tärkeyttä valvonnan GAG sulfatoituminen vuonna EMT. Tämä havainto on johdonmukainen aiempien tutkimus osoittaa muutoksia matriisikomponenteista kuten versikaani [41] ja muutokset GAG sulfatoituminen [42] yhdessä syövän, erityisesti aggressiivinen syövän muotoja. Syöpä edistäviä toimintoja versikaani voi toimia kautta säätelemiseksi kasvutekijän aktiivisuutta ja vuorovaikutuksessa immuunijärjestelmän ja stroomasolujen [43], toiminnot, jotka voitaisiin muuttaa muutoksilla sulfatoituminen. SPOCK1 voi toimia läpi samanlaisia ​​mekanismeja, mutta on tutkittu vähemmän. SULF2, joka oli voimakkaasti säädelty sekä järjestelmiä ja toimii poistaa sulfaatit tiettyjen GAG ketjut, myös on liittynyt keuhkojen syövän synnyn [44] ja tuumorigeenisyyteen haiman syöpäsoluja [45]. Syöpä edistäviä toimintoja SULF2 näyttävät toimivan aktivoimalla Wnt signaloinnin tai vapauttavat kasvutekijöitä soluväliaineen, joka voi olla myös pro-angiogeeninen vaikutus. Yhdistyksen näistä toiminnoista syövän EMT viittaa siihen, että syöpäsolut käynnissä EMT käyttää kunnostus ekstrasellulaaritilan tulla erittäin invasiivisia.