Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tissue (TF) estäjä (TFPI) esiintyy kaksi isoformia; TFPIα ja TFPIβ. Molemmat isoformit ovat solun pinnalla kiinnittynyt pääasiassa glykosyylifosfatidyyli (GPI) ankkurit. TFPIα on myös ehdotettu sido muita pinnan molekyylien, kuten glykosaminoglykaanien (GAG: t). Solun pinnan TFPIβ on osoitettu olevan korkeampi veren hyytymistä estävä aktiivisuus kuin TFPIα, mikä viittaa siihen, vaihtoehtoisia toimintoja TFPIα. Lisäkarakterisointia ja etsiä uusia TFPI sitoutumispartnereihin on tärkeää ymmärtää täysin biologisten toimintojen soluun TFPI.

Menetelmät ja tulokset

Mahdolliset yhdistys TFPI on heparaanisulfaatin (HS) proteoglykaanien että syndekaani perhe arvioitiin kaataa tutkimuksia ja virtaussytometria analyysi. Solun pinta rinnakkaispaikantumisen arvioitiin konfokaalimikroskopiaa, ja natiivi PAGE tai immunosaostus ja sitä seuraava Western blottaus käytettiin testaamaan proteiinin vuorovaikutukseen. HEPARANASE käytettiin entsymaattisesti hajota solun pinnalla HS GAG. Antikoagulanttia potentiaalia arvioitiin käyttäen tekijän Xa (FXa) aktiivisuusanalyysiä. Knock alas syndekaani-3 endoteelin, – sileän lihas- ja rintasyövän solujen alensi TFPI pinnan tasolla 20-50%, ja yhdistys TFPIα ja syndekaani-3 solun pinnalla osoitettiin. Western blotting osoitti, että TFPIα havaittiin monimutkainen syndekaani-3. TFPI sitoutuu syndekaani-3 ei estänyt FXa sukupolvi. Poistaminen HS GAG ei vapauttanut TFPI antigeeni soluista.

Johtopäätökset

osoitti yhdistyksen välillä TFPIα ja syndekaani-3 verisuonten solujen ja syöpäsoluissa, mikä ei näyttänyt riippuvan HS GAG. Ei Antikoagulanttiaktiivisuus havaittu, että TFPI liittyy syndekaani-3, jotka voivat viitata hyytymisen riippumattomia toimintoja tähän soluun TFPI allas. Tämä on kuitenkin, vaativat lisätutkimuksia.

Citation: Tinholt M, Stavik B, Louch W, Carlson CR, Slettenin M, Ruf W, et al. (2015) syndekaani-3 ja TFPI Colocalize pinnalla Endothelial-, Smooth lihas- ja syöpäsoluja. PLoS ONE 10 (1): e0117404. doi: 10,1371 /journal.pone.0117404

Academic Editor: Aamir Ahmed, University College London, Yhdistynyt kuningaskunta

vastaanotettu: 13 tammikuu 2014; Hyväksytty: 23 joulukuu 2014; Julkaistu: 24 tammikuu 2015

Copyright: © 2015 Tinholt et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Rahoitus: Tämä työ rahoitettiin by tutkimusmäärärahat päässä Kaakkois-Norja terveydenhuoltopiirin, Hamar, Norja ja A. Jahre ja HG Andrine Berg son perustukset. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tissue (TF) estäjä (TFPI) on endogeeninen inhibiittori TF aiheuttama veren hyytymiseen, ja se esiintyy kaksi isoformia; TFPIα ja TFPIβ. Molemmat isoformit käyttää veren hyytymistä estävä aktiivisuus sitoutumalla aktiiviset kohdat TF-tekijä Vlla (FVIIa) kompleksi ja laskemaan Xa (FXa) [1, 2]. Endoteelisolut muodostavat suurimman osan TFPI tuotantoa, mutta TFPI ekspressiota on osoitettu myös muissa solutyypeissä, kuten monosyytit, sileän lihaksen solut, verihiutaleet [3-5], ja useissa rintasyöpäsolulinjoissa [6, 7].

TFPIα koostuu kolmesta peräkkäin Kunitz estävä domeenit ja erittäin positiivisesti varautuneita C-terminaaliseen päähän [8], kun taas TFPIβ sisältää kaksi ensimmäistä Kunitz-domeeneja, jota seuraa eri C-pää, joka koodaa glykosyylifosfatidyyli-inositoli (GPI) kiinnitys signaalin peptidi, ohjaamalla sen solun pintaan [1, 9]. Koska nämä olosuhde, TFPIβ yksinomaan sitoutunut solukalvoon, kun taas TFPIα voidaan joko erittää solunulkoiseen ympäristöön, tai sitoa solun pinnan läpi vielä tuntemattoman GPI liittyy molekyyliin, ja jossain määrin heparaanisulfaatti (HS ) proteoglykaanien (HSPGs) [9-12]. Funktio solun pintaan liittyvä TFPI ei ole hyvin tunnustettu, kuitenkin, TFPIβ on ehdotettu olevan vastuussa useimpien antikoagulanttiaktiivisuus solujen pinnalla, mikä osoittaa vaihtoehtoisen rooli solun sitoutunut täyspitkän silmukointivariantti TFPIα [2]. Lisätutkimuksia solupinnan liittyvien TFPI ja oletettua sitova kumppani (t) on siis keskeinen merkitys toiminnallisten ymmärtää tämän molekyylin.

HSPGs ovat molekyylejä, jotka työntyvät solukalvojen tai soluväliaineen. On olemassa kaksi suurta perheitä; syndekaani ja glypikaani perheitä, jotka koostuvat neljästä kuuteen geenivarianttien, vastaavasti. Ilmaisu kuvio HSPGs on erittäin säännelty developmental-, spatial-, ja solutyypin erityisellä tavalla [13]. Syndecans ovat transmembraaniproteiineja, kun taas glypicans ovat GPI-ankkuroituja proteiineja puuttuu suora sytoplasmisen yhteys. Sekä glypicans ja syndecans pidä glykosaminoglykaanien (GAG: t), pääasiassa HS ketjuja, jotka on liitetty kovalenttisesti proteiiniin ydin [13, 14]. HS-ketjut ovat merkittäviä toiminnallisia tärkeää, koska ne ovat vuorovaikutuksessa ja sitoutuvat laaja kirjo biologisia efektoriproteiinien, kuten kemokiinien, kasvutekijät, ja soluväliaineen komponentteja. Näiden vuorovaikutusten, HSPGs osallistua monia keskeisiä solujen toimia, kuten soluadheesiota, lisääntymistä, erilaistumista ja muuttoliike. HSPGs voivat moduloida ligandin reseptoriin sitoutumisen keskittämällä sytokiinien läheisyydessä niiden suuren affiniteetin reseptorit, tai toimivat koreseptorit, mikä edistää tehokasta signaalitransduktion [14, 15]. HSPGs voi myös olla mukana patofysiologiassa, mukaan lukien maligniteetti. Modulaatiot sulfaation kuvio HS ketjut on osoitettu parantavan kasvutekijää sitova ja nopeuttaa proliferaatiota syöpäsoluissa [16].

On ehdotettu, että HSPGs voi toimia reseptorit sisäistämisen TFPI-FXa-kompleksit endoteelisoluissa, edistää antikoagulanttivaikutusta TFPI [17]. Lisäksi TFPI: n on osoitettu sitoutuvan glypikaani 3 maksasoluissa [18], ja syndekaani 4 puhdistettiin endoteelisoluista [19]. Kunitz-domeenin 3 ja C-pään TFPIα tarvitaan optimaalisen sitoutumisen endoteelisolujen pinnat [20, 21] ja hepatoomasolut [22], mikä viittaa siihen, että vain TFPIα isoformin assosioituu HSPGs.

Koska on ehdotettu, että TFPI: n saattaa olla yhteydessä HSPGs [17-19], pyrittiin edelleen luonnehtia luonne soluihin sitoutunut TFPI. Tämä suoritettiin arvioimalla ilmaus syndecans 1-4 ja sitova potentiaalia endogeenisesti ilmaistuna TFPI on syndecans solun pinnalla Ihmisen primäärisen endothelial- ja sileän lihaksen soluissa, ja pohjapinta rintasyövän soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

N /A

reagenssit

Äänenvaimennin negativ ohjaus siRNA # 5 (AM4642) hankittiin Ambion (Foster City, CA, USA). Custom suunniteltu siRNA: t vastaan ​​syndecans tuotettiin Eurofinsille MWG Operon (Ebersberg, Saksa) (S1 taulukko). Kanin anti-humaani kudostekijäreaktiotien estäjä IgG 4901 /ADG72 ja rekombinantti täyspitkä TFPI (ADG49) saatiin American Diagnostica (Stamford, CT, USA). Vuohen anti-TFPIα ab9881 ja kanin anti-syndekaani-3 ab63932 olivat Abcam (Cambridge, MA, USA). Kani-IgG-UNLB ja vuohen anti-kani-IgG (H + L) -RPE olivat molemmat Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL, USA). Anti-syndekaani-3 (sc-30883), anti-syndekaani-3 (sc-9495), The syndekaani-3 293T ohjaus lysaattia (sc-176304), normaalia vuohen IgG: tä (sc-2028), anti-aktiini (SC- 1616), ja A /G -agaroosihelmiä (sc-2003) saatiin Santa Cruz Biotechnology, USA. Rekombinantti syndekaani-3 (3539-SD), sekundaarinen vasta-aine anti-vuohi-IgG HRP: tä (HAF109), ja rekombinantti ihmisen Active HEPARANASE (7570-GH) olivat R www.cancer.med.umich.edu/breast_cell/Production/index.html) [6, 7] kasvatettiin HUMEC- valmis väliaineessa (Invitrogen), ja ihmisen sepelvaltimon endoteelisolujen (HCAEC; # CC-2585, Lot no. 6F4194, Lonza) [7] oli cultered EBM-2 (Lonza). Kaikki edellä mainitut Soluväliaineet lisäyksin on kuvattu, aikaisemmin [7]. Ihmisen sepelvaltimon sileän lihaksen soluissa (HCASMC; # CC-2583, Lot no. 3F0172, Lonza) [23] kasvatettiin SmBM pohjapinta väliaineessa SmGM-2 Yhden Quots kasvutekijöitä ja 10% FCS. Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, ja 5% CO

2.

qRT-PCR

Kokeet neljältä syndecans suunniteltiin käyttämällä Universal Probe Library, Probe Finder ohjelmisto (Roche Applied Sciences). Probe ID ja alukesekvenssit annetaan S2 taulukossa. cDNA (19 ng) monistettiin kolmena kappaleena kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR (qRT-PCR) 100 nM koetin ja 200 nM alukkeita (Eurogentec). Keinotekoinen negatiivinen kontrolli ilman syndekaani lauseke (Ct = 40), ja endogeeninen kontrolli (18S) Ct-arvo asetetaan keskiarvo kaikkien solutyyppien tarjoilla lasketaan suhteellinen mRNA määrä (RQ) on syndecans jonka ΔΔCt menetelmällä. Tarkempi kuvaus, tutustu edelliseen julkaisu [7].

Pieni häiritsevä (si) RNA transfektioon

Perustuen aiemmin Optimointikokeet, solut transfektoitiin siRNA suunnattu syndekaani 1 -4 käyttäen Lipofectamine 2000 mukaan valmistajan suositusten. Lyhyesti, solut ympättiin 6-kuoppaisille tai 12-kuoppalevyillä saavuttaa 30-50% konfluenssiin seuraavana päivänä ja transfektoitiin 5 tai 2,5 ug Lipofectamine ja 1 tai 0,5 nmol siRNA, kokonaistilavuudessa 2 tai 1 ml: aan tuoretta medium, vastaavasti. Lipofectamine sisältävä väliaine korvattiin tuoreella väliaineella 5 tuntia transfektion jälkeen. Solujen annettiin kasvaa 2-3 päivää ennen analyysiä.

Virtaussytometria

solujen ohimenevää kaataa ja syndecans analysoitiin solun pinnan sitoutumisen TFPI spesifisen vasta-aineen, olennaisesti kuten aikaisemmin on kuvattu [7]. Erot TFPI solun pinnan tasoa laskettiin ja esitetään alennusprosenttia verrattuna ohjata soluihin (keskiarvot ± SD), joka perustuu mediaani fluoresenssivoimakkuus arvoja. Mediaani fluoresenssi-arvot soluja leimattiin merkityksetön kanin vasta-aine pidettiin epäspesifinen sitoutuminen, ja korjattiin kussakin näytteessä. Solut transfektoidaan negatiivinen kontrolli siRNA ja leimattiin merkityksetön anti-kani-vasta-aine toimi määrittää taustan tasolle, kun histogrammit luotiin (kutsutaan ”merkityksetön”). Syndekaani-3 solun pinnan tasot määritettiin samalla tavalla käyttäen syndekaani-3 spesifistä vasta-ainetta.

HEPARANASE ja heparinaasilla hoito

hajota solun pinnalla HS GAG konfluentteja soluja 12-kuoppaisille tarjottimet pestiin kahdesti PBS: llä ennen käsitelty heparanaasin (1 ug /ml) tai heparinaasi I + III (2U /ml) seerumia (SFM) varten 4-16 tuntia. SFM sisältää sopivan ajoneuvon puskurin toimi kontrollina. Käsittelyn jälkeen supernatantit kerättiin, ja solut pestiin kaksi kertaa ennen hajoamista. Vaikutus heparinaasin hoidon vahvistettiin Western-blottauksella käyttämällä D-heparaanisulfaattia vasta-aine, joka tunnistaa HS neo-epitooppien tuotettu pilkkomalla HS mukaan heparinaasilla I + III.

Konfokaalimikroskopia

Soluja ympätään steriili laminiini pinnoitettu lasi dioja ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa. Seuraavana päivänä solut pestiin kolme kertaa PBS: llä ja kiinnitettiin 10 minuutin ajan 4% paraformaldehydi, reaktio pysäytettiin 15 min 100 mM glysiiniä (pH 7,4), ja pestiin kolme kertaa ennen lukitusta 2 tuntia korkea blokkausliuosta (0,9% NaCl, 0,5% Na

3Citrate, 3% BSA ja 40 ng /ul ihmisen γ-globuliinia) jatkuvasti kallistuvan. Sen jälkeen soluja inkuboitiin 5 ug /ml vuohen anti-TFPI: n vasta-ainetta (ab9881), spesifinen TFPIα, alhaisen blokkausliuosta (0,9% NaCl, 0,5% Na

3Citrate, 1% BSA: ta ja 40 ng /ul ihmisen Gammaglubuliini) 4-5 tunnin ajan. Solut pestiin viisi kertaa PBS: ssä ennen kuin niitä inkuboitiin 1,5 tunnin ajan 1: 1500 Alexa Fluor 488 aasin anti-vuohi-vasta-aine, pestään jälleen viisi kertaa ja inkuboitiin 5 ug /ml kanin anti-syndekaani-3-vasta-aine (ab63932) yön yli 4 ° C jatkuvassa kallistumisen. Seuraavana päivänä solut pestiin viisi kertaa, ja lopuksi inkuboitiin 1: 1500 Alexa Fluor 633 vuohen anti-kani-vasta-aine 1,5 tunnin ajan. Kaikki vasta-inkuboinnit suoritettiin 4 ° C: ssa. Solut skannattu käyttäen LSM 710 -konfokaalimikroskoopilla (Zeiss, GmbH, Jena, Saksa), jossa on 40x vesiupotukseen tavoite. TFPI signaali viritettiin 488 nm, emissio mitattiin 500-600 nm. Syndekaani-3 signaali viritettiin 633 nm, emissio mitataan edellä 640 nm. Pinhole leveys asetettiin 1 Ilmava yksikkö, ja kuvia kerättiin optisella siivu paksuus on 1 pm. Konfokaaliset kuvat oli de-convolved kompensoimiseksi Optisen vääristymän käyttämällä Huygen n Essential -ohjelmisto (Scientific Volume Imaging B.V .; Laapersveld, Alankomaat). Kuvat analysoitiin ja esitettiin käyttäen Image J ohjelmaa (versio 1.4.3.67).

Lysis puskurit ja immuunisaostuskokeissa

Sum102 soluja, HCAECs ja HCASMCs korjatuista Triton lyysipuskuria (20 mM HEPES , pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, 0,2% aprotiniini, 0,6% 100 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia PMSF, ja 1,0% fosfataasinestäjällä cocktail) ja natiivin (ei-pelkistävä) PAGE-analyysillä ja immunosaostuskokeet (pelkistävät olosuhteet).

2 ug anti-syndekaani-3 tai normaalia vuohen IgG: tä (negatiivinen kontrolli) lisättiin kuhunkin solulysaattiin ja inkuboitiin immunosaostus yön yli 4 ° C: ssa. Immunokompleksien kerättiin proteiini A /G-agaroosihelmiä ja pestiin kolme kertaa Triton lyysipuskurissa ennen kiehumista SDS-latauspuskuria, jota seuraa SDS-PAGE-analyysi.

PAGE-analyysit ja immunoblottaus

Protein solun lysaatit, immunosaostumat ja rekombinantti-TFPI: n proteiini (100 ng) analysoitiin betonielementtien 4-15% Criterion Tris-HCL geelit (# 345-0028, BioRad Laboratories), jossa (vähentää) tai ilman sitä 0,1% SDS: ää (ei-pelkistävät olosuhteet) Tris- /Glycine /SDS: ää (25 mM Tris, 192 mM glysiini, 0,1% SDS: ää, pH 8,3, # 161-0772,) tai Tris /glysiini-ajopuskuria (25 mM Tris, 192 mM glysiini, pH 8,3, # 161-0771, BioRad Laboratories), tässä järjestyksessä. Natiivi näytepuskuria (# 161-0738, BioRad Laboratories) käytettiin ei-pelkistävissä olosuhteissa. Proteiinit blotattiin PVDF-membraaneille (RPN 303f, GE Healthcare), joka blokattiin 1% kaseiinia TBST 60 min huoneen lämpötilassa, inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden, pestiin kolme kertaa 10 min TBST ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Blotit kehitettiin käyttäen ECL Prime (RPN 2232, GE Healthcare). Kemiluminoiva signaaleja havaittiin Las 1000 (Fujifilm, Tokio, Japani). Immunobloteissa immunopresipitaateista tislattiin 30 minuuttia vasta-aineiden välillä. Natiivi PAGE, kaksi samanlaista immunobloteilla ajettiin rinnan varmistamaan tiettyjä signaaleja anti-TFPIα ja anti-syndekaani-3. Tämän jälkeen immunoblot irrotettiin 45 minuutin ajan (Pierce) ja uudelleenseulottiin sen varmistamiseksi, että vasta-aineet tunnistivat proteiinin monimutkainen samankokoiset. ImageJ käytettiin densitometrisellä kvantifiointiin proteiinijuovat immunobloteissa.

TF-FVIIa: n aktiivisuus

HCAEC ja Sum102-solut transfektoitiin siRNA vastaan ​​syndekaani-3 (48 h) 12-kuoppalevyillä, kuten edellä on kuvattu. Solut pestiin kahdesti pesuliuoksella (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 4 mM KCI, ja 11 mM glukoosi, pH 7,5) ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa reaktioliuokseen (pesupuskuri, jossa 5 mg /ml BSA: ta ja 5 mM CaCl

2, pH 7,5), joka sisälsi 10 nM FVIIa ja 175 nM FX. Inkuboinnin jälkeen, 50 ui siirrettiin 100 ui stop-liuosta (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM EDTA, ja 1 mg /ml BSA: ta, pH 7,5) jäissä ennen inkuboitiin 50 ui FXa substraattia (CS-11 ( 22)). Absorbanssi 405 nm: ssä kirjattiin ajan 37 ° C: ssa 45 min 15 sek välein käyttäen Spectra Max Plus 384 mikrolevynlukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Suurin nopeudet (V

max) mU /min käytettiin määrän laskemiseksi FXa luotu käyttämällä saatu standardikäyrä tunnettuja pitoisuuksia FXa. HCAEC soluja käsiteltiin PMA: lla (10 nM, 6 tuntia) ennen määritystä indusoida TF ilmaisua. ~ 600-kertaisesti säätelyä TF-mRNA-tasojen vahvistettiin käyttäen qRT-PCR: ää.

Tilastolliset menetelmät

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism-ohjelmiston versiota 5.0 (PRISM5) (GraphPad Software Inc, La Jolla , CA). Studentin t-testit suoritettiin testata merkittäviä eroja, kun tiedot on normaalisti jakautunut. Muutoin ei-parametrinen Mann Whitneyn U-testiä käytettiin. * P 0,05, ** p 0,01 ja *** p 0,001.

Tulokset

Expression tasoja syndecans in TFPI ilmentävien solujen

HSPGs ovat aiemmin olleet raportoitu sitovan TFPI. Etsimään mahdollisia TFPI sitovia ehdokkaita, mRNA: n ilmentymisen tasot syndecans 1-4 määritettiin valikoima TFPI-ilmentävien solujen. Ilmentymisen tasot syndecans vaihteli huomattavasti kolmen solutyyppien testattu; HCAEC, HCASMC, ja Sum102 (Fig. 1). Syndecans ilmennettiin kaikissa solulinjoissa, ja ekspressiotasot syndekaani-3 ja 4 osoitti ainakin vaihtelua solujen joukossa.

Sum102, HCAEC, ja HCASMC solut analysoitiin mRNA: n ilmentymisen ja syndekaani 1-4 by qRT-PCR. ΔΔCt menetelmää käytettiin lasketaan suhteellinen lausekkeeseen (RQ) vastaan ​​keskimäärin endogeenisen kontrolloivat ekspressiota kaikkien solujen, ja kynnys asetettiin Ct = 40 (ei vahvistusta). Keskiarvot + SD (n = 3 biologiset rinnastukset) esitetään.

vaikutus syndekaani kaataa solupinnalla tasot TFPI

Tutkitaan onko syndecans voisi olla potentiaalinen TFPI solun pinnan sitovia ehdokkaita, siRNA tekniikkaa on sovellettu. Jälkeen ohimenevä kaataa ja syndecans 1-4, solujen annettiin sitoutua TFPI spesifistä vasta-ainetta ja sen jälkeen värjäämällä RPE-sidottu sekundaarista vasta-ainetta ja virtaussytometria-analyysi.

Ei merkittävä lasku solun pinnan tasoa TFPI havaittiin tahansa solutyyppien jälkeen kaataa ja syndekaani 1, 2 tai 4 (tuloksia ei ole esitetty). Sen sijaan, syndekaani-3 kaataa vuonna HCAECs, HCASMCs, ja Sum102 solut vähenivät solun pinnan tasoa TFPI 52 ± 9%, 23 ± 6%, ja 39 ± 12% (keskiarvo ± SD), tässä järjestyksessä (kuvio. 2). Kaataa hyötysuhteet syndecans siRNA transfektoiduissa soluissa varmistettiin qRT-PCR: llä ja laskettu prosenttia kaataa kontrolliin verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu negatiivisen kontrollin siRNA. Knock down hyötysuhde vaihteli 69-97% for syndekaani 1, 45-85% ja syndekaani 2, 83-95% for syndekaani-3, ja 44-72% varten syndekaani 4 (S1 Kuva.). Lisäksi syndekaani-3 kaataa vahvistettiin Western-blottauksella kaikissa solutyypeissä (kuvio. 3A), ja 32 ± 13% (keskiarvo ± SD) väheneminen syndekaani-3-antigeenin tasot solupinnalla jälkeen syndekaani-3 knock alas osoitettiin virtaussytometrialla vuonna HCAEC (Fig. 3B).

Solut tippuu alas syndekaani-3 siRNA teknologia analysoitiin tasoja solun pinnalla TFPI virtaussytometrialla. Histogrammi esittää mediaani fluoresenssivoimakkuus jälkeen saatu TFPI spesifistä vasta-ainetta merkintöjä A) Sum102 soluja, B) HCAEC solut ja C) HCASMC soluja. Syndekaani-3 pudotti soluja (siSDC3); katkoviiva, negatiivinen kontrolli siRNA; musta yhtenäinen viiva ja merkityksetön kontrolli; harmaa yhtenäinen viiva. Yksi edustava koe kolmesta erillisiä kokeita (n≥6 biologinen rinnastukset) esitetään kunkin solutyypin.

A) syndekaani-3-antigeenin tasoa (55 kDa monomeerisiä muoto) solulysaatteja HCAECs Sum102 soluja, ja HCASMCs Western-blottauksella käyttäen anti-syndekaani-3 ja lastaus ohjaus (aktiini). Yksi edustaja kalvo kahden näytetään. Syndekaani-3-proteiinin juovien voimakkuudet (normalisoinnin jälkeen vastaan ​​latauskontrollina) verrattuna kontrolliin soluja kullekin solutyypin. Rekombinantti syndekaani-3 (rSDC3) toimi positiivisena kontrollina (~ 110 kDa). B) Solun pinta liittyy syndekaani-3 tasoa analysoitiin virtaussytometrillä sisään HCAEC soluissa. Histogrammi esittää mediaani fluoresenssivoimakkuus saatu syndekaani-3 spesifistä vasta-ainetta merkintöjä. Syndekaani-3 pudotti soluja (siSDC3); tummanharmaa tummennetut, negatiivinen kontrolli siRNA; keskiharmaa tummennetut ja merkityksetön kontrolli; vaaleanharmaa tummennetut. Yksi edustava koe kahdesta yksittäisten kokeiden (n = 4 biologinen rinnastukset) on esitetty.

Ei heparanaasin (S2 kuvio.) Eikä heparinaasi I + III (tuloksia ei ole esitetty) hoitoon Sum102, HCAEC ja HCASMC solut muuttivat TFPI antigeenin tasot solusupernatanttien verrattuna ohjata soluihin.

vaikutus TFPI kaataa sen syndekaani-3 mRNA ilmaisun

Knock alas syndekaani-3 ei vaikuttanut TFPI mRNA ilmaisu (Fig. 4A) tai TFPI-proteiinin tasot (Fig. 4B). Kuitenkin kokeita sen arvioimiseksi, yksisuuntaisen sääntelymekanismin olemassa. Syndekaani-3 mRNA ilmentyminen väheni keskimäärin 30% kolmessa erillisessä altaissa Sum102 soluja, jossa molemmat TFPI isoformit vakaasti tippuu alas (TFPI kaataa hyötysuhde oli 40-60%, kuten on kuvattu Stavik

ym

. 2011 [6]). Mitään eroja syndekaani-3 mRNA ekspressiotasot havaittiin, kun vain TFPIβ isoformin, joka pudotettiin (Fig. 5) (jäljempänä TFPIβ kaataa hyötysuhde oli 53% ja 64% varten shRNA7b ja shRNA 9b). Vuonna HCAEC ja HCASMC soluja, 48% ja 43%: n vähennys syndekaani-3 mRNA: n ekspressio havaittiin solujen 88-94% ohimenevä TFPI (α + β) kaataa (48 tuntia). Lisäksi kaataa on TFPIα isoformin yksin (TFPIβ lauseke pysyi ennallaan) in Sum102 soluissa (72 tuntia) ja HCAECs (48 tuntia) johti vastaavaan 34% ja 53%: n vähennys syndekaani-3 mRNA ilmaisun. TFPI kaataa hyötysuhteet kaikissa solutyypeissä käytetyt esitetään S3 kuvassa.

A) HCAEC, Sum102 ja HCASMC solujen syndekaani-3 pudotti analysoitiin TFPI mRNA ilmentyminen qRT-PCR. ΔΔCt menetelmää käytettiin lasketaan suhteellinen TFPI ilmaisu (RQ) kontrolliin verrattuna soluihin (neg. Ohjaus siRNA). Keskiarvot + SD (n≥6 biologinen rinnastukset) kolmesta erillisestä kokeiluja on esitetty. B) TFPI antigeenin tasot mitattiin ELISA: lla solulysaatteja HCAEC, Sum102 ja HCASMC jälkeen syndekaani-3 kaataa. TFPI-antigeenin tasot suhteessa kontrollisoluihin on esitetty. Keskiarvot + SD (n≥6 biologinen yhtäläisyyksiä) kahden yksittäisen kokeissa esitetään.

syndekaani-3 mRNA: n ekspressio mitattiin qRT-PCR kolmessa riippumattomassa stabiilien kloonien molemmat isomuodot TFPI (α + p) pudotettiin (shRNA 4, 6 ja 7) ja kaksi riippumatonta stabiilien kloonien kanssa vain TFPIβ isoformin pudotettiin (shRNA7β ja 9β). Tulokset normalisoitiin endogeenistä ohjaus ja suhteellinen lausekkeita (RQ) laskettiin viitaten tyhjän vektorin kontrolli solut (pSiRPG). Keskiarvot + SD (n = 3 biologiset rinnastukset) esitetään.

TFPI ja syndekaani-3 rinnakkaispaikantumisen

tutkimiseksi edelleen, jos alennettu sitoutuminen solun pinnan TFPI johtui välitön vaikutus syndekaani-3 kaataa, me tutki TFPIα ja syndekaani-3 colocalized solun pinnalla. Rinnakkaispaikantumisen varmistettiin käyttämällä kaksinkertainen värjäystä ja konfokaalimikroskopialla in Sum102, HCAEC, ja HCASMC soluja. Rinnakkaispaikantumisen ei jakautunut tasaisesti, varsin korkeita ahtaisiin paikkoihin solukalvon (Fig. 6, S4 kuvassa., Ja S5 kuvassa.).

Kiinteät solut kaksinkertainen värjättiin TFPI (vihreä) ja syndecan- 3 (punainen) ensisijainen vasta-aineita ja Alexa Fluor sekundaarisia vasta-aineita, joissa 488 ja 633 nm: n virityksellä aallonpituuksilla, vastaavasti, ennen kuvien otettiin käyttäen konfokaalimikroskopia. Keltainen väri overlay kuvat osoittavat paikkatietojen päällekkäisyys TFPI ja syndekaani-3. Sum102 soluja (ylhäällä), HCAEC solut (keskellä) ja HCASMC soluja (alhaalla). Mittakaava 50gM (30 uM zoomatulla kuvia). Yksi edustava koe kolmesta erillisestä kokeesta jokaisen solutyypin.

tunnistaminen TFPI-syndekaani-3 proteiinikompleksi

Vaikka konfokaali kuvantamisen ehdotti, että TFPIα ja syndekaani-3 asui samassa fyysisen sijainnin (Fig. 6, S4 kuvassa., ja S5 kuvassa.), natiivi PAGE seurasi myöhemmin Western blottaus suoritettiin testaamaan vuorovaikutusta kahden molekyylin (Fig. 7A). Proteiinia teissa Sum102, HCAEC, ja HCASMC solut, kaksi proteiinia komplekseja vaeltavat todettavissa massat ~ 150 kDa ja ~ 180 kDa tunnustetaan sekä anti-TFPIα ja anti-syndekaani-3 (Fig. 7A). Kaksi kompleksit todennäköisimmin johtuvat eri translaation jälkeisiä modifikaatioita, kuten glykosylaatio. Heikompi bändit havaittiin HCAEC soluja, mikä alempi proteiinin pitoisuuksia sovelletaan. Suhteellisen suuri koot havaittu kompleksit osoittivat, että TFPIα (Fig. 7B, 45 kDa) oli läsnä dimeroidun muodossa syndekaani-3, joka on kooltaan noin 110kDa (Fig. 7C). Koko arvioiden tulisi kuitenkin tulkita varoen, koska ei-pelkistävissä (natiivi) olosuhteita käytettiin ja koska tarkka erottaminen suuren molekyylipainon komplekseja elektroforeesilla yleensä on haastava.

Proteiini lysaatit eristettiin solut, altistetaan natiivi PAGE-analyysin tai immuunisaostuskokeissa ja analysoitiin Western-blottauksella. A) Native PAGE lysaatit Sum102 soluista (20 ug), HCAECs (12 ug) ja HCASMCs (18 ug) immunoblotat- anti-TFPIα (ylhäällä) ja anti-syndekaani-3 (alhaalla) (yksi edustaja kalvo kolmesta on esitetty), B) SDS-PAGE täyspitkän rekombinantin TFPIα proteiinin immunoblot-anti-TFPIα, ja C) SDS-PAGE syndekaani-3 293T-ohjaus lysaattia immunoblotat- anti- syndekaani-3. D) HCAEC (40 ug), E) SUM102 (160 ug) ja F) HCASMC (40 ug) lysaatit altistettiin immunosaostus käyttäen kahta erilaista syndekaani-3-vasta-aineita (n = 2 sc-30883, n = 1 SC- 9495) tai vuohen kontrolli-IgG: tä (n = 2). Lysaatit ja immunosaostumat analysoitiin läsnäolo endogeenisen syndekaani-3 ja TFPI immunoblottauksella. Rekombinantti TFPIα proteiini (ylempi vasen paneeli) ja solulysaatti (alempi vasen paneeli) käytettiin positiivisena kontrollina immunoblottaus-in D-F.

TFPI-syndekaani-3 vuorovaikutus analysoitiin myös immunosaostuksella. Immunosaostus syndekaani-3: HCAEC lysaatista käyttäen kahta erilaista syndekaani-3-vasta-aineiden paljasti rasaostamalla TFPI (Fig. 7D), viittaa siihen, että TFPI liittyvät syndekaani-3. Yhdenmukainen natiivi-PAGE-analyysi (kuvio. 7A), TFPI-syndekaani-3 kompleksi oli läsnä myös SUM102 (Fig. 7E) ja HCASMC lysaatti (Fig. 7F), vaikka TFPI sateeseen ilmestyi hieman heikompi.

TFPI jakelu seuraavat syndekaani-3 kaataa

jotta voidaan vahvistaa kohtalo TFPI syndekaani-3 vajaiden solujen, TFPI antigeeni mitattiin ELISA supernatantissa Sum102 ja HCAEC solujen jälkeen kaataa of syndekaani -3. Tämä johti 20-30%: n nousu TFPI-antigeenin tasot supernatantissa verrattuna kontrollisoluihin (Fig. 8).

TFPI-antigeenin tasoja (yhteensä) mitattiin ELISA: lla supernatanteista Sum102 (vasemmalla) ja HCAEC (oikealla) jälkeen syndekaani-3 kaataa. Suhteellinen TFPI-antigeenin tasoja kontrollisoluihin verrattuna esitetään. Keskiarvot + SD (n≥9 biologinen yhtäläisyyksiä) kahden (HCAEC) ja kolme (Sum102) yksittäiset kokeet esitetään.

TF-FVIIa aktiivisuus pinnalla syndekaani-3 kaataa solujen

tutkia, TFPI sitoutuu syndekaani-3 voisi pidättää TF koagulanttiaktiivisuus, mittasimme TF-FVIIa aktiivisuus pinnalla Sum102 ja HCAEC solut ennen ja jälkeen ohimenevää kaataa of syndekaani-3. TF-FVIIa aktiivisuus määritettiin epäsuorasti kvantifiointiin FXa syntyy kolorimetristä määritystä, jossa FVIIa ja FX oli eksogeenisesti lisätty tarttuneet solut. Ei muutoksia FXa sukupolven jälkeen syndekaani-3 kaataa havaittu missään kahden solutyypin (Fig. 9). Kuten odotettua, ~ 2-kertainen nousu TF-FVIIa: n aktiivisuus havaittiin lisättäessä anti-TFPI määritystä (positiivinen kontrolli).

Sum102 ja HCAEC soluja tippuu alas syndekaani-3 (siSDC3) oli analysoitiin TF-FVIIa solun pinta-aktiivisuutta, epäsuorasti, kuten FXa sukupolvi. HCAEC-soluja stimuloitiin 10 nM PMA: lla 6 tuntia ennen analyysiä. Anti-TFPI lisättiin yhdessä kokeessa, jossa HCAEC soluihin. Keskiarvot + SD (n≥8 biologinen rinnastukset) kolmesta erillisestä kokeita esittelyyn.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet yhdistyksen endogeenisesti ilmaisi TFPI että transmembraaninen syndekaani-3 HSPG-molekyylin. Lähestymistapamme on ollut kaataa ilmaus HSPGs kuuluvien syndekaani perhe, ja analysoida TFPI antigeenin pinnan tasossa virtaussytometrialla. Valitsimme endothelial-, sileä lihas-, ja rintasyövän soluja, joilla on suuri endogeenisiä TFPI lauseke tutkittavaksi. Syndekaani ekspressiotasot vaihteli näiden solutyyppien mukaisesti siihen, että HSPG ilmaus eroaa solussa tyyppi- ja kehittävän erityisellä tavalla [13, 24]. Alennettu solun pinnan tasot TFPI havaittiin virtaussytometrillä jälkeen syndekaani-3 kaataa kaikissa kolmessa solutyypeissä, osoittaa osallistumista syndekaani-3 solun pinnalla yhdistys TFPI. Lisäksi vähentynyt syndekaani-3 mRNA: n ekspression HCAECs ja Sum102 solujen TFPIα tippuu alas, ja Sum 102 soluissa sekä TFPI isoformeja (α + β) tippuu alas, mutta ei TFPIβ yksin, tukee lisäksi suhde syndekaani-3 ja TFPI, erityisesti TFPIα isoformin. Onko tämä suora tai epäsuora sääntely on vielä selvittämättä.

Aiemmin syndekaani 4 puhdistettu EA.hy926 soluista on osoitettu sitovan TFPI kiinteän faasin määritys [19]. Parhaan tietämyksemme, voimme täten tarjota ensimmäisen kertomuksen TFPI assosiaatiota syndekaani molekyyliin solun pinnalla.