Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Nykyinen tutkimus tutkii vaikutusta kuume kantaman hypertermia ja lievä hypotermia ihmisen syöpäsoluissa keskittyy solujen elinkelpoisuuteen, jakaantumiseen ja HSP90 ilme.

Materiaalit ja menetelmät

A549 ja H1299 keuhkokarsinooma, MCF7 rinta adenokarsinooma, U87MG ja T98G glioblastooma, DU145 ja PC3 prostatakarsinoomassa ja MRC5 normaali sikiön keuhkojen fibroblasteista solulinjat tutkittiin. Jälkeen 3 päivän altistus 34 ° C, 37 ° C ja 40 ° C: ssa, solujen elinkelpoisuus määritettiin. Solujen lisääntyminen (Ki67 index), apoptoosin (kaspaasi 9) ja HSP90 ilmentymistä tutkittiin konfokaalimikroskopiaa.

Tulokset

Elinkelpoisuus /leviämisen kokeet osoittivat, että MRC5 fibroblastit olivat erittäin herkkiä kuume, kun he olivat resistenttejä hypotermia. T98G ja A549 olivat Thermo-suvaitsevainen, loput ovat Thermo-herkkä vaihtelevassa määrin. Siitä huolimatta, kuten yleinen vaikutus, hypotermia vähensi elinkelpoisuuden /lisääntymiseen kaikissa solulinjoissa. Hypertermia jyrkästi aiheuttama Caspase 9. U87MG eniten Thermo-herkkä solulinja. Vuonna T98G ja A549 Thermo sietävää solulinjojen kaspaasi 9 väheni. Lisäksi hypertermia voimakkaasti indusoi HSP90 tasoa T98G, kun taas jyrkkä lasku kirjattiin Thermo-herkkä PC3 ja U87MG solulinjoissa. Hypertermia herkistyneet Thermo-herkkä syöpäsolun linjat sisplatiinin ja temotsolomidi samalla sen herkistävää vaikutusta heikensi termologistiikkayritys sietävien solulinjoissa.

Johtopäätökset

olemassaolo Thermo-suvaitsevainen ja Thermo-herkkien syöpäsolujen solulinjoissa vahvistettiin, joka edelleen kannustaa tutkimusta luokitella ihmisen kasvaimen termistä mieltymys potilaan kerrostuneisuus kliinisissä tutkimuksissa. Kiinnostaa, lievä hypotermia oli universaali tukahduttava vaikutus syöpäsolujen lisääntymistä, mikä tukee radio-herkistymistä hypoteesi vähentämällä hapen ja aineenvaihdunnan vaatimuksiin.

Citation: Kalamida D, Karagounis IV, MITRAKAS A Kalamida S, Giatromanolaki A, Koukourakis MI (2015) Fever-luokan hypertermia vs. Hypotermia Vaikutus Cancer Cell elinkelpoisuus, Proliferation ja HSP90 Expression. PLoS ONE 10 (1): e0116021. doi: 10,1371 /journal.pone.0116021

Academic Editor: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians Yliopisto, SAKSA

vastaanotettu: 12 elokuu 2014; Hyväksytty: 02 joulukuu 2014; Julkaistu: 30 tammikuu 2015

Copyright: © 2015 Kalamida et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: tutkimus on rahoitettu koulutuksen ja elinikäisen oppimisen – ARISTEIA projekti, koodi ei 520, ESPA 2007-2013 GGET päätöksen luku 12605 /26.9.2012. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpäsolut, samalla tavalla muihin solu- ja elävä järjestelmä, vastata lieviä muutoksia ulkoisen lämpötilan aktivoimalla homeostaattisia biologisten mekanismien, joka yrittää ylläpitää suvaitsevaa solunsisäinen ympäristö ja kuoleman estämiseksi. Lämpötilat yli 41 ° C, ovat myrkyllisiä sekä kasvaimen verisuoniston ja syöpäsolut itse, ja niitä käytetään lämmittämään kasvaimia (Oncothermic hypertermia), jonka tarkoituksena on tukahduttaa kasvua, saavuttaa regressio tai herkistää ne sädehoitoa ja kemoterapiaa [1]. Satunnaistetut kokeet ovat osoittaneet merkittävää parannusta paikallisten tarkastusasteet in sarkoomia seututasoisen lämmönnousua yhdistettynä kemoterapiaan [2].

Kuitenkin, lämpötila alle 41 ° C, ns kuume kantaman kuume, on myös suora vaikutus syövän solujen ja kudosten biologian, herkistävät kasvaimet sädehoidon ja kemoterapian. Koko kehon hypertermia välillä 38-40 ° C on käytetty hoidossa laaja-levinnyt etäpesäkkeitä yhdessä kemoterapian [3, 4]. Lisääntynyt veren virtaus, joka mahdollistaa lisääntynyt kasvaimen hapettuminen ja kemoterapia saatavuus on luultavasti yksi tärkeimmistä mekanismeista synergian [5, 6]. Proteiini vahinko on myös kriittinen vaikutus lämpötila on yli 39 ° C, mutta tarkka polkuja soluntappokyky jäädä hämäräksi [7]. Esto homologisen rekombinaation on myös ehdotettu kasvainten Chemosensiti- [8].

Lisäksi lievä lämmönnousua täydentävänä terapian syöpään immuuni-hoito on esittänyt useissa prekliinisissä ja kliinisissä tutkimuksissa, parantamalla antitumor immuunivasteita. Hyperthermia- indusoi paremman immuunivasteen sisältää HSP sukupolven, antigeeniä esitteleviä soluja aktivaation ja lymfosyytit mainosliikennemuutoksiin [9]. Lisäksi ylimääräistä näyttöä siitä, että fysiologiset vasteet aiheuttama hypertermian vaikuttaa microenvironment kasvaimen todennäköisimmin mekanismilla, johon lämpöherkkä check-pistettä säätelevä kasvain verisuonten verenkierron, lymfosyyttiliikennettä, tulehduksellinen sytokiiniekspressiota, kasvain aineenvaihdunta, ja viimeisenä mutta ei vähäisimpänä, sekä mukautuva ja synnynnäisen immuniteetin toimintaa [10]. Lisääntynyt aktiivisuus luonnollisten tappajasolujen vastaan ​​koolontuumorisolut on todennettu hiirillä kun lämpötila nostettiin 39,5 ° C [11].

Heat-Shock proteiinit (HSP: t) ovat jyrkästi ajan säännelty hypertermistä olosuhteissa, niiden korkeampi affiniteetti kertyy laskostumattomassa proteiinit vapauttaa HSF-1 transkriptiotekijän sidottu HSP: t, jotka tulee ytimet aloittaa HSP-geenin transkription [11]. HSP: t suojaavat soluja vastaan ​​lämmön aiheuttamaa proteiinin vahinkoa heidän kaitsija toimintaa. Kuitenkin pitkäaikainen lämmitys voi aiheuttaa HSP tasoilla regressio normaalille tasolle. Päinvastoin, korkeat lämpötilat kynnysarvoa voi estää HSP synteesiä, joka suosii solukuoleman [12]. Yksityiskohtaisemmin HSP90 /Hsp70-pohjainen kaperoni- kone on osoitettu ohjaamaan signalointia proteiinin funktion, kaupan ja vaihtuvuus. On myös ehdotti äskettäin, että Hsp90 ja Hsp70 säädellä käsittelyä vaurioitunut ja epänormaalien proteiinien hajoamisen kautta Ubikitiini-proteasomireitillä. Tutkimus HSP90 erityisesti, on erittäin tärkeää, kun otetaan huomioon, että tähän mennessä tieteellinen mielenkiinto keskittyi sääntelyä sen ”tyypillinen asiakas proteiineja, mutta viimeaikaiset tiedot viittaavat siihen, että HSP90 vuorovaikutuksessa dynaamisesti eri proteiineja, jotka eivät ole klassisia HSP90 asiakkaita. Siksi HSP90 rooli signalointi ja säätelemällä laadunvalvontaa ja kohtalo vahingoittuneiden proteiinien on erittäin tärkeää. [13]

Joka tapauksessa, syöpäsolun vaste lämmönnousua voi riippua sekä lämpötilat ja valotusaikoja, ylimääräisiä ympäristöolosuhteet ja varmasti, solutyypistä tutkittavana. Nykyisessä tutkimuksessa tutkimme vaikutus kuume kantaman hypertermia monenlaisia ​​syöpäsoluja, jotka osoittavat, että sen vaikutus elinkelpoisuuteen ja proliferaatio on solu-riippuvaista. Hypotermia, paljon vähemmän tutkittu kunnossa syöpäsolun järjestelmissä, tutkittiin myös. Vaikutus hyper- ja hypotermia on HSP90 ilmentymistä tutkittiin tarkemmin. Lopuksi hypertermistä Chemosensiti- tutkittiin kahdessa glioblastoomasolulinjoissa (T98G ja U87MG) ja kaksi keuhkosyövän solulinjoja (A549 ja H1299). T98G ja A549, ainoa Thermo sietävä soluista tutkittiin verrattuna kahden edustavan, Thermo-herkkä solulinjat saman kasvaimen tyyppi, U87MG ja H1299, vastaavasti, sopivan kemoterapiaa huumeita kullekin syöpä, yhdessä lievä hypertermia, jotta voidaan tutkia mahdollisen herkistymistä tai vastus.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät

A549 (ihmisen keuhkojen adenokarsinooma, CLS GmbH, Saksa), H1299 (ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, ATCC), MCF7 (ihmisen rinta- adenokarsinooma, CLS GmbH, Saksa), U87MG (ihmisen glioblastooma-astrosytooma, CLS GmbH, Saksa), DU145 (ihmisen eturauhasen syöpä, CLS GmbH, Saksa), PC3 (ihmisen eturauhasen adenokarsinooma, CLS GmbH, Saksa) ja MRC5 (ihmisen sikiön keuhkojen fibroblasteista, CLS GmbH, Saksa) solulinjoja viljeltiin käyttäen DMEM Peruselatusaineen (31885-023, Gibco) ja T98G (ihmisen glioblastooma multiforme, ATCC) solulinjaa kasvatettiin MEM Peruselatusaineen (10370-047, Gibco). Sekä perus- elatusaineet täydennettiin 10% FBS: ää (FB-1000/500, Biosera), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (15140-122, Gibco) ja 2 mM L-glutamiinia (25030, Gibco). Soluja pidettiin vakio-olosuhteissa, 37 ° C, 5% CO2: ssa kostutetussa ilmakehässä ja käytettiin saavuttaessaan 70-90% konfluenssiin.

proliferaatiotestillä

Kyky solujen lisääntymisen eri inkubaation lämpötiloissa testattiin proliferaatiomäärityksessä. Solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 1000 solua /kuoppa, levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 h helpottaa sitoutumista ja normaalin kasvun ja sitten pantiin 34 ° C: ssa, 37 ° C ja 40 ° C, vastaavasti, kolmena peräkkäisenä päivänä. Planktonin kasvu määritykset kaikilla tarkastelluilla solulinjoissa ja kasvun lämpötilat suoritetaan samanaikaisesti. Solujen lisääntyminen mittaukset tehtiin 24h välein käyttäen alamarBlue elinkykyyn Reagent (DAL1100, Invitrogen) mitattuna 540 nm eksitaatio ja 590 nm emissio aallonpituuksia, vuonna Fluostar Omega mikrolevylukijalla (BMG LABTECH). AlamarBlue määritys (DAL1100, Invitrogen) on luotettava menetelmä solun elinkelpoisuuden [14]. Tämä määritys, käyttämällä metabolista aktiivisuutta solujen vähentää resatsuriini (hapettunut muoto, 7-hydroksi-3H-fenoksatsin-01-03-10-oksidi) ja resorufiini, määrällisesti solujen määrä aktiivista mitokondrioita, koska resatsuriini pelkistys suoritetaan mitokondrion entsyymit [15]. Kokeet suoritettiin kolme kertaa, jotta voidaan vahvistaa tulosten merkityksen.

Western Blot analyysi

glioblastoomasolulinjoissa (U87MG ja T98G) viljeltiin tavanomaisissa olosuhteissa, kuten aiemmin mainittiin. Nämä solulinjat valmistettiin samalla inkuboitiin 34 ° C: ssa ja 40 ° C: ssa 72 tuntia. Solut hajotettiin käyttäen sakkaroosia lyysipuskuria täydennetty proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorin cocktail (Cell Signaling). Proteiinikonsentraatiot mitattiin sijoitettu BCA-proteiinimäärityksellä kit (Thermo Scientific Pierce, USA). Erityiset kanin polyklonaalinen ensisijainen vasta-aineita käytettiin western blot-analyysi, anti-HSP90 (1: 1000, ab13495, Abcam) ja anti-Caspase9 (1: 1000, ab47537, Abcam).

Koko osa näytteet erotettiin epäjatkuva SDS-geeleissä käyttäen 10% erotus- ja 5% pinoaminen geelejä. Neljäkymmentä mikrogrammaa solu-uutteet geelin pinnalle. Immunoblottaus suoritettiin käyttäen PVDF-PSQ kalvoja (Millipore Corp.). Jälkeen estovaihe 5% rasvatonta kuivamaitoa 150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, joka sisälsi 0,1% (v /v) Tween 20 (TBS-T) huoneenlämpötilassa (RT) 2 tunnin ajan, kalvot olivat hybridisoitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden. Sitten membraanit hybridisoitiin 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa toisen vasta-aineen, vuohen polyklonaalista kanin lgG: tä (H + L) HRP (1: 3,000, Biorad, 1706515, USA), ja lopuksi kehitetään Amersham ECL Western blotting tunnistus reagenssit ja analyysijärjestelmää (RPN2209, GE Healthcare) käyttäen Chemidoc MP Imaging System (Biorad, USA).

hypertermistä Chemosensiti- kokeita

Chemosensiti- kokeissa 1000 solua /kuoppa maljattiin 96-kuoppalevylle sopivassa viljelyalustassa. Soluja inkuboitiin kliinisesti vahvistettu lääkkeet; keuhkosyövän solulinjat: A549 ja H1299 100 μΜ sisplatiinin ja glioblastoomasolulinjoissa: T98G ja U87MG 500 μΜ temotsolomidia. Solut, samanaikaisesti lääkehoitoa, inkuboitiin 24 at 37 ° C ja 40 ° C, vastaavasti, kun taas solujen elinkelpoisuus arvioitiin 24 tunnin kuluttua itämisajan mukaan alamarBlue määritys ja solujen eloonjäämisen prosenttiosuudet (%) laskettiin. Tilastollinen analyysi jonka 2way ANOVA testi (n≥ 10 mittausta kullekin ryhmälle, ** p = 0,0037 varten 5a p = 0,0097 varten 5b, joka on tilastollisesti merkitsevä kummassakin tapauksessa) ja kuvaaja esitys on tehty käyttäen GraphPad Prism versio 5.01 tilastollinen paketti (GraphPad Software Inc., USA). Kokeet suoritettiin kolme kertaa, jotta voidaan vahvistaa tulosten merkityksen.

konfokaali immunofluoresenssimenetelmällä ja Kuva-analyysi

Immunofluoresenssivärjäystä varten soluja kasvatettiin nro 1,5 lasipeitinlevyille, vahvistettu 3.7 % paraformaldehydillä /PBS, pH 7,4, 20 min 37 ° C: ssa ja sitten läpäiseviksi PBS /0,1% v /v Triton X-100, pH 7,4, 5 min ajan huoneenlämpötilassa. Lisäksi, soluja blokattiin PBS /5% w /v BSA: ta, pH 7,4 20 minuuttia ja värjättiin eri primaaristen vasta-aineiden: anti-Ki67-hiiren monoklonaalinen (1: 150, DAKO) ja anti-Caspase9 kanin polyklonaalista (1: 100; Abcam ), anti-HSP90-kanin polyklonaalista (1: 100; Abcam), 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Solut pestiin PBS: ssä, pH 7,4, inkuboitiin asianmukaisten CF 488 ja 564 sekundaarisia vasta-aineita RT: ssä ja DNA vastavärjättiin Hoechst 33342 (1 ug /ml; Sigma-Aldrich). Kun lopulliset pesujen peitelaseja asennettu kotitekoinen Mowiol kiinnitysväliaine. Imaging suoritettiin räätälöidyn Andor vallankumous Spinning Disk konfokaali System rakennettu jalusta (IX81, Olympus), jossa 60x objektiivi ja digitaalikameran (Andor Ixon + 885) (CIBIT Facility, MBG-Duth). Kuvan hankinta suoritettiin Andor IQ 2 -ohjelmisto. Optiset leikkeitä tallennetaan joka 0,3 pm. Kaikki konfokaalimikroskopia kuvat esitellään tässä työssä ovat 2D enimmäisvoimakkuutta ennusteita z-pinon kuvia (ImageJ 1.47v National Institute of Health, USA).

Kuvan voimakkuus analyysi saatujen tietojen sarjaa on suoritettu käyttämällä ImageJ 1,47 v (National Institute of Health, USA) ohjelmiston. Kuvankäsittely makroja on mukautetun kehitetty määrällisesti tasoja tutkitaan proteiinien (% fluoresenssin intensiteetti) kaspaasi 9 ja HSP90 alalla etua.

Kuva-analyysi ja kvantifiointi Ki67 ilmaisun tumassa on suoritettu käyttämällä räätälöinyt makroja ImageJ ohjelmisto 1.47v (National Institute of Health, USA). Populaatio n soluja (n≥ 20) on analysoitu, ja Ki67 kvantifiointiin. Soluja luokiteltiin kolmeen luokkaan, mukaan niiden pikselin yksiköissä, mikä Ki67 ekspressiotasot. Luokka Olin alaluokan lukien solut 1000-5000 pikselien vihreä kanava (Ki67 kuvantaminen) ja III oli ylempään luokkaan, mukaan lukien solut, joissa on enemmän kuin 7501 pikseliä, kun taas luokka II mukana 5001-7500 arvot, vastaavasti.

kaksiulotteinen (2D) keskiarvo projektio z-pinon kuvia kvantitoitiin käyttäen standardia koko neliön alue, jossa integroitu intensiteetti arvot on mitattu. Tilastollinen analyysi jonka 2way ANOVA testi (n≥ 20 solua kullekin ryhmälle, * p 0,0001) ja kuvaaja esitys on tehty käyttäen GraphPad Prism versio 5.01a tilastopaketista (GraphPad Software Inc., USA).

tulokset

vaikutus hyper- ja hypotermian solujen kasvuun

jälkeen 3 päivän itämisaika alla kuume alue lämmönnousua, muutoksia solujen lisääntymistä /elinkelpoisuus olivat vahvasti riippuvaisia ​​kustakin solulinjasta ( kuva 1). Normaali fibroblastisolulinjan, MRC5, oli erittäin herkkä hypertermia, osoittaa vallalla solukuolemaa vaikutus. U87MG glioblastoomasolulinjan oli myös erittäin herkkä kuume, joka indusoi 10-kertainen väheneminen solujen kasvua. Eturauhasen DU147 ja PC3 sekä keuhkojen H1299 ja rintojen MCF7 syövän solulinjat myös lämpö- herkkä. Päinvastoin, T98G glioblastoma ja A549 keuhkosyövän solulinjoja lämpö-suvaitsevainen, mikä osoittaa kasvua kasvaa 1,87 ja 1,18 kertaiseksi.

% muutos suhteellisten loisteputki yksikköä (RFU: t), kuten tallennettu alamarBlue määritys, sen jälkeen 3 päivää altistuksen solujen hypotermia (34 ° C) tai hypertermia (40 ° C) verrattuna normothermia (37 ° C).

hypotermia 34 ° C: ssa, ja toisaalta tänään ollut melko yhtenäinen vaikutus, mikä johtaa sekä normaalin MRC5 fibroblasteissa ja kaikkien syöpäsolujen linjojen elinkelpoisuuden (Fig. 1). Tämä vähennys vaihteli 1,23 ja 7,40 kertaiseksi vuonna DU145 ja U87MG solulinjoissa, vastaavasti, verrattuna kontrolliin (37 ° C) solut, laskettuna kolmantena päivänä inkubaation.

vaikutus hyper- ja hypotermia päälle Ki67 leviämisen indeksi

Koska solujen lisääntymistä /elinkelpoisuuden arvioi alamarBlue määritys on seurausta yhdistetyn leviämisen ja kuolemantapaukset, me tutki vielä solujen lisääntymistä käyttämällä Ki67 leviämisen indeksin. 3 päivän kuluttua solujen inkuboinnin hypertermia johti lisääntyneeseen osa solujen luokan III inT98G ja A549 (1,3 ja 1,4 kertaiseksi) solulinjat verrattuna normothermia. Tämä laski 1,1 yli 45 kertainen muualla solulinjojen (Fig. 2a). Ominaisuus ja edustava konfokaali kuvat Ki67 tumavärjäystä ja muuttuu altistuttuaan hypertermia on esitetty kuvassa. 2b.

2a: muutokset Ki67 leviämisen indeksin luokan jälkeen 3 päivän solujen altistaminen hypotermia (34 ° C) tai hypertermia (40 ° C) verrattuna normothermia (37 ° C). 2b: Edustavia konfokaali microcopy kuvat osoittavat ydinvoiman Ki67 immuunivärjäysmenetelmällä muuttamalla intensiteetti altistumisen jälkeen lämmönnousua (40 ° C).

Hypotermia johti lasku solujen kertymisen luokan III ryhmässä 1,2 jopa yli 45 kertaiseksi kaikissa solulinjoissa lukuun ottamatta DU145 eturauhassyöpäsolulinja, jossa tämä korotettiin 1,6 kertaiseksi.

vaikutus hyper- ja hypotermia on kaspaasi 9 tasoa

konfokaali immunofluoresenssimenetelmällä kuvia kaspaasin 9 ilmentyminen solulinjoissa altistumisen jälkeen hypertermian ja hypotermia on esitetty kuvassa. 3a. Tontit fluoresenssin voimakkuuden muutokset altistuminen hypertermian ja hypotermia on esitetty kuvassa. 3b ja 3c, vastaavasti.

3a: edustaja konfokaali microcopy kuvat osoittavat sytoplasmista kaspaasi 9 ilme muuttuu intensiteetti altistumisen jälkeen hypotermia (34 ° C) tai hypertermia (40 ° C) verrattuna normothermia (37 ° C) ( suurennus x60). 3b, c: Densitometria suoritetaan konfokaali microcopy kuvia kaspaasi 9 Immunovärjäyksen altistumisen jälkeen hypotermia (34 ° C) tai hypertermia (40 ° C) verrattuna normothermia (37 ° C).

Hypertermialaite jyrkästi aiheuttama Caspase 9. U87MG thermo-herkkä solulinja, joka oli myös kaikkein syvällinen vähentämistä solujen elinkelpoisuuden alamarBlue kokeita. Kiinnostaa, sekä T98G ja A549 Thermo sietävää solulinjoissa, kaspaasi 9 tasot alenivat hypertermia, mikä viittaa apoptoosin estävästi Hypertermian näissä solulinjoissa. Kaikkein Thermo-herkkä kaikkien, MRC5 solulinja, ei kuitenkaan näytä lisääntynyt kaspaasi 9 tasoa viittaa kuoleman riippumattomat kaspaasi 9 polkuja.

Hypotermia aiheuttama kaspaasi 9 U87MG, DU145 ja MCF7-solut, yhteisymmärryksessä jos alennettu elinkelpoisuuden osoitettu alamarBlue kokeita. Muissa solulinjoissa, kaspaasi 9 ilmaisu pysyi vakaana tai sitä pienennettiin tapauksessa T98G soluja, mikä viittaa siihen, että jos apoptoosin reitit aktivoituvat hypotermia nämä ovat kaspaasi 9 riippumattomia.

Western blot-analyysi suoritettiin thermo-suvaitsevainen T98G ja thermo-herkkä U87MG glioblastoomasolulinjoissa on esitetty kuvassa. 3d, tukemalla aiemmin esitti tuloksia. Hypertermia aiheuttama Caspase 9. Thermo-herkkä U87MG solulinjan, vaikka tämä pienennettiin termo sietävä yksi, T98G. Hypotermia vähennetään Caspase 9 tasoilla T98G solulinjassa, kun taas mitään ilmeistä muutosta noteerattiin U87MG yhdessä.

vaikutus hyper- ja hypotermian HSP90 tasoilla

edustaja konfokaalimikroskopia ja immunofluoresenssimenetelmällä kuvia vaikutus hypertermia ja hypotermian on HSP90 solulinjoihin on esitetty kuvassa. 4a. Käyrät fluoresenssin voimakkuuden muutokset esitetään kuviossa. 4b ja c.

4a: edustaja konfokaali microcopy kuvat osoittavat sytoplasmista HSP90 ilme muuttuu intensiteetti altistumisen jälkeen hypotermia (34 ° C) tai hypertermia (40 ° C) verrattuna normothermia (37 ° C) (suurennos x60) . 4b, c: Densitometria suoritetaan konfokaali microcopy kuvia HSP90 immunovärjäyksen. 4d: Western blot kuvia HSP90 ilmaisun Thermo sietävä T98G ja Thermo-herkkä U87MG solulinjoissa.

Hypertermia voimakkaasti lisännyt HSP90 tasot T98G Thermo sietävä solulinjassa, kun taas terävä pudotus kirjattiin thermo-herkkä PC3 ja U87MG solulinjoissa. Toisaalta, HSP90 tasot selvästi vähentää kaikissa solulinjoissa tutkitaan hypotermia. Western blot-analyysi suoritetaan lämpö- sietävä T98G ja lämpö- herkän U87MG glioblastoomasolulinjoissa on esitetty kuviossa. 4d, vahvistaen tulokset konfokaalimikroskopialla.

hypertermistä Chemosensiti-

Altistuminen Thermo sietävien A549 ja Thermo-herkkä H1299 keuhkosyövän solulinjat sisplatiini, avain huumeiden käytettiin kliinisissä käytännössä hoitoon keuhkosyöpää, osoitti, että kuume alue lämmönnousua voimakkaasti herkistyneet H1299 huumetta, mutta sen vaikutus A549-solulinja oli minimaalinen (Fig. 5a).

5a: elinkelpoisuus keuhkosyövän solulinjat A549 ja H1299 jälkeen 24h saaneet sisplatiinia alle normothermic ja kuumetta valikoima hypertermistä olosuhteissa. 5b: elinkelpoisuus glioblastoomasolulinjoissa T98G ja U87MG jälkeen 24h altistuksen temotsolomidille alle normothermic ja kuumetta valikoima hypertermistä olosuhteissa.

Altistuminen Thermo sietävien T98G ja U87MG Thermo-herkkä glioblastoomasolulinjoissa kohteeseen temotsolomidi ainoa hyväksytty lääke hoitoon ihmisen glioblastooma, osoittivat, että lämmönnousua 40 ºC voimakkaasti herkisti U87MG solulinjan huumetta, mutta ei herkistymisvaikutuksia todettiin, että T98G yksi (Fig. 5b).

keskustelu

The effect of kuume kantaman hypertermia normaaleilla ja syövän solubiologian ja sen mahdollisen roolin ja vaikutus solujen herkkyyttä kemoterapiaa ja sädehoitoa edelleen huonosti, vaatii lisätutkimuksia. Lievä hypertermia on raportoitu olevan inhiboiva vaikutus solujen proliferaatioon. Aiemmassa tutkimuksessa kuitenkin Morrissey

et al

myös raportoitu stimuloiva vaikutus lieviä lämmönnousua 38 ° C U87MG solulinja, joka oli voimakkaasti päinvastainen 40 ° C: ssa [16]. Johtopäätös tekemät nämä tutkijat koskien ero torjunnan lisääminen solulinjoja pienille lämpötilan nousua on varmasti tärkeä. Nykyinen tutkimus on johtanut siitä löydettiin kaksi solulinjoista (T98G ja A549), jotka näyttävät olevan vastustuskykyisiä vaikutus hypertermian 40 ° C: ssa. Ihmisen A549-solulinja on aikaisemmin raportoitu olevan vastustuskykyisiä lämpö tappaminen at 43-45 ° C verrattuna U87MG solulinjan [17], mutta ero vastaus vaihtelee leviämisen soluun tappaminen on hyvin siedetty ihmiskehoon 40 ° C on uusi. Yhdistelmät kuume kantaman hypertermia voi siis hidastaa etenemistä etäpesäkkeitä termologistiikkayritys herkkää kasvaimista U87MG-käyttäytyminen, kun taas G2-M-faasin kohdistaminen lääkkeet voivat osoittautua kriittinen hoitoon lämpö-sietävä T98G-kasvaimia yhdessä koko kehon kuumeen induktio tai paikallisia myrkyttömiä lämmitys.

Toisaalta, terapeuttinen merkitys hypotermian ei pidä aliarvioida, ja on tutkittava perusteellisesti eläinmalleissa, sillä noin puolet tutkituista solulinjoista osoittivat 3- 7-kertaiseksi vähentäminen elinkelpoisuuden 34 ° C: ssa. Nykyinen tieto sen vaikutus syöpäsolujen on rajallinen. Hypotermia 28 ° C: ssa näyttää suojata ensisijaisesti normaalien fibroblastien verrattuna syöpäsoluja vastaan ​​5-fluorourasiilin [18]. Tutkimuksessamme 34 ° C: ssa, ihmisen normaaleja fibroblasteja kärsi vähentynyt lisääntyminen siinä määrin, kuitenkin varsin vähäinen verrattuna useimpien syöpäsolulinjoja. Pienentynyt aineenvaihduntaa ja hapen kulutusta kasvainten alttiina hypotermia voi myös olla tärkeä kasvain säteilylle herkäksi [19], hypoteesi, joka on myös testattu kliinisessä käytännössä [20]. Rooli hypotermian estämällä syöpäsolujen tarttumista endoteelisoluihin ja siten muuttoliikettä mikä näkyy Zhang

et al

[21], antaa ylimääräistä pohjan lisätutkimuksia käyttö hypotermian syövän hoito vaihtoehto.

tutkittiin lisäksi kuoleman aiheutuvaa lievä lämpötilan muutokset useissa solulinjoissa on kaspaasi-9-välitteisen. Asparagiinihappo spesifisen proteaasin kaspaasi-9 on osallisena mitokondrioiden syöttämällä reitin. Sytokromin c vapautumiseen mitokondrioista aktivoi Rahastolla-1 (apoptosome), joka puolestaan ​​pilkkoo pro-entsyymi kaspaasi-9 osaksi aktiivisin muoto. Kuitenkin, pilkkominen ei ole olennainen kaspaasi-9 apoptoottista aktiivisuutta [22]. Tutkimuksessamme hypotermia ja hypertermia aiheuttama kaspaasi-9 useilla herkillä solulinjoissa kuten U87MG, DU145 ja MCF7 mukaisesti alennettu elinkelpoisuuden totesi. Muissa tapauksissa, kaspaasi-9 ilmaisun pysyi vakaana, mikä viittaa siihen, että jos apoptoottisia reittejä aktivoituvat hypotermia nämä ovat kaspaasi 9 riippumattomia. Esimerkiksi AIF (apoptoosin indusoiva tekijä) tai kaspaasi-8 ja 12 ovat vaihtoehtoisia apoptoottisia kaspaasi-9 riippumaton apoptoottisia reittejä [23]. Kiinnostaa, että T98G ja A549 Thermo sietävää solulinjoissa, kaspaasi-9-pitoisuus laski alle kuume-vaihteli hypertermia, joka tarjoaa todisteita väylän hyväkseen joidenkin solulinjojen paeta mitokondrioiden liittyvän apoptoosin.

HSP90, Toisaalta, on raskas jäsen HSP perheen, jolla on tärkeä rooli kasvaimen kasvua, on myös yhteydessä huonoon ennusteeseen rintasyövän ja muiden pahanlaatuisten kasvainten [24]. HSP: t ovat ajan säädellään hypertermistä olosuhteissa [11], suojaamaan soluja vastaan ​​lämmön aiheuttamaa proteiinin vahinkoa heidän kaitsija toimintaa. Useat HSP90 estäjät on kehitetty ja on osoitettu

vivo

olla tumoristatic ja olevan synergistinen vaikutus kemoterapiaa ja muiden tavoite hoitojen [25]. Havainto, että hypotermia vähensi ilmentymistä HSP90 kaikissa solulinjoissa tutkittiin on mielenkiintoinen. Vt fyysisenä aineena estäjä HSP90, hypotermia voi olla synergistinen vaikutus kemoterapiaa, samoin kuin kemiallisia estäjiä. Kiinnostaa, hypertermia parannettu HSP90 ilmaisun Thermo sietävä T98G solulinjassa, mikä viittaa suojaava tehtävä HSP90 näissä solulinjoissa kukoistavat alla lämpimässä.

Hypertermia on myös tutkittu yhdistettynä kemoterapiaa huumeita. Aikaisemmin on raportoitu, että samanaikainen hypertermia ja sisplatiinin indusoiman solukuoleman T-leukemiasolujen eri molekyylitason mekanismeja, tällä tavalla parannetun sisplatiinin aiheuttama sytotoksisuuden kuume voidaan selittää [26]. Samanlaisia ​​tietoja on raportoitu faasin I-II tutkimuksessa, jonka tavoitteena on arvioida toteutettavuus ja vakavaa myrkyllisyyttä yhdistelmä sisplatiinin, säteilytys ja hypertermia, hoidettaessa pinnallista kohdunkaulan solmukohtien etäpesäkkeitä pään ja kaulan alueen syöpä, jossa toteutettavuus yhdistelmän sisplatiinin, säteilytys ja paikallinen ulkoinen mikroaaltouuni lämmönnousua hyväksyttävän toksisuusprofiili on vahvistettu. Tästä syystä Lisäksi ehdotetaan, että trimodaalinen hoito vaatii lähempää arviointia keinona parantaa tehoa säteilytys tapauksissa solmukohtien etäpesäkkeitä pään ja kaulan kasvaimet [27]. Tutkimuksessamme kokeita samanaikainen altistuminen keuhkosyövän ja glioblastoomasolulinjoissa kuume valikoima hypertermian ja kliinisesti vahvistettu kemoterapeuttisten osoitti, että herkistymistä myönnettyä hypertermian koskivat lähinnä Thermo-herkkä solulinjoissa, kun taas sen herkistävää vaikutus oli huomattavasti huonompi termologistiikkayritys sietävä solulinjat. Tämä löytää edelleen tukee tarvetta kehittää kliinisiä menetelmiä, osaa tunnistaa lämpö- herkkiä kasvaimia, jotka hyötyisivät eniten jos käsitelty yhdistetyn hypertermian ja kemoterapiaohjelmat. Olipa Thermo suvaitsevainen kasvaimet saattavat herkistynyt hypertermistä kemoterapiaa estämällä HSP90 tai olennaiset biologiset reitit edelleen hypoteesi edelleen kokeiluihin.

Voidaan päätellä, että syöpäsolut reagoivat eri tavalla lievä lämpötilan muutoksiin, ovatko nämä kohti lieviä hypotermia tai kuume-alue hypertermia. Thermo sietävä ja Thermo-herkkien solujen linjat on tunnistettu kuume alue kuume, joka kannustaa tutkimusta tunnistaa sopivia menetelmiä kliiniseen ryhmittelyä ihmisen kasvaimissa mukaan termisen mieltymys. Tällainen luonnehdinta mahdollistaisi kliinisissä tutkimuksissa myrkyttömällä paikallisen tai koko kehon hypertermia potilailla oletetaan olevan herkkiä tällaisille hoitoja. Kiinnostaa, lievä hypotermia oli estävä vaikutus soluproliferaatioon kaikissa soluissa tutkittiin, mikä viittaa siihen, että hypotermia olisi tukahduttaa kasvaimen replikointi ja aineenvaihduntaa useimmissa ihmisen kasvaimissa, mikä tukee radio-herkistymistä hypoteesi lisäämällä hapetus vähentämällä hapen ja aineenvaihdunnan vaatimuksiin.