Krooninen sairaus

tiivistelmä

jäkälää yhdiste usnic happo (UA) on lipofiilinen heikko happo, joka toimii protonin sukkula ja aiheuttaa mitokondrion sisäkalvon potentiaalia. Nykyisessä tutkimuksessa osoitamme, että UA indusoi muodostumista autophagosomes ihmisen syöpäsoluja, mutta oli vähäinen vaikutus normaaleissa ihmisen fibroblasteissa. Kuitenkin autophagic virtaus oli epätäydellinen, hajoaminen autophagosomal sisältöä ei tapahtunut ja happamoitumista oli viallinen. UA-käsitellyt solut oli vähentynyt ATP-tasot ja aktivoituminen AMP kinaasia sekä merkkejä solujen stressiä. UA on siten laukaisee todennäköisesti autophagosome muodostumista sekä energian ehtymisestä ja stressin olosuhteissa. Meidän tulokset osoittavat, että H

+ – shuttling vaikutus UA toimii paitsi mitokondrioita kuten aiemmin on esitetty, mutta myös lysosomeihin, ja vaikuttavat terapeuttiseen manipulointiin autophagy ja pH-määritettiin huumeiden levittämiseen.

lainaus: Bessadottir M, Egilsson M, Einarsdottir E, Magnúsdóttir IH, Ogmundsdottir MH, Omarsdottir S, et ai. (2012) Proton-shuttling Lichen yhdiste Usnic Acid Vaikuttaa Mitokondrioiden ja Lysosomaalinen Function syöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (12): e51296. doi: 10,1371 /journal.pone.0051296

Editor: Gabriele Multhoff, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 31 lokakuu 2012; Julkaistu: 05 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Bessadottir et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Eimskip Jatko rahaston ja Islannin yliopiston Research Fund (www.hi.is). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Lichens, symbioosi välillä sieni- kumppani ja photobiotic mikro-organismi, löytyy ympäri maailmaa ja aiheuttaa useita ainutlaatuisia sekundäärimetaboliitteja [1]. Dibentsofuraani johdannainen, usnic happoa (UA) on tunnettu sekundaarimetaboliittien ja on tutkittu jonkin verran [2]. Laaja valikoima biologisia vaikutuksia on raportoitu usnic hapon, esim. anti-mikrobi, anti-virus, anti-pyretic, anti-inflammatoriset ja analgeettiset vaikutukset [2]. Antituumorivaikutus UA oli ensimmäinen raportoitu kolme vuosikymmentä sitten keuhkosyövän hiirissä ja P388 leukemia [3], [4]. Se on lisäksi osoitettu, että usnic happo on antimitoottisia vaikutuksia ihmisen syöpäsolulinjoissa [5] ja aiheuttaa menetyksiä elävien solujen leukemia, keuhkosyöpä ja rintasyövän solut [6], [7]. Kuitenkin altistuminen UA ei aktivoi p53 ja ei ole ehdotettu olevan osallisena DNA-vaurioiden [8].

UA on lipofiilinen heikko happo (p

K

4,4), joka voi aiheuttaa protoni vuotojen läpi tihkuva mitokondrioiden kalvot [9]. Hiiren maksasolut usnic hapon häiritsee normaalia aineenvaihduntaa solujen irrottamalla oksidatiivinen fosforylaatio mitokondrioissa ja aktivoimalla oksidatiivisen stressin [10]. Mitokondriot on tärkeä rooli säätelyssä solukuoleman polkuja ja mitokondrioiden muutokset on kuvattu syöpäsoluissa, mukaan lukien lisääntynyt vakaus, estäen siten vapautumista sytokromi

c

ja estää apoptoosin induktion [11]. Aikaisemmat tutkimus osoitti, että UA hoito aiheuttaa mitokondrion kalvon potentiaalia kahdella eri syöpäsolulinjoissa [12]. Mielenkiintoista on, että on osoitettu, että muutokset mitokondrion kalvon potentiaali voi johtaa puhkeamista autophagy [13].

Autophagy on prosessi, joka voi sekä tukea syövän solujen eloonjäämistä aikana ravinteiden puutetta, mutta se voi myös edistää syöpäsolujen kuolemaa . Molekyyli polkuja, jotka määrittävät tämän kaksoisrooli hämärän peitossa, ja on todennäköistä, että funktio autophagy syövän riippuu kasvaimen vaiheessa Matkapuhelinyhteydessä ja kudosten alkuperän [14], [15]. Yli 30 erilaista proteiinia koodaavat geenit, jotka tunnetaan autophagy liittyvien geenien (ATG), on identifioitu ja tutkimukset hiiren malleissa on osoitettu, että macroautophagy on välttämätöntä ylläpito solun homeostaasin monissa kudoksissa [16], [17]. Autophagy voi laukaista ravitsemus ehtyminen tai metabolisen stressin ja voi vaihdella kysynnästä alustan hajoamisen ja ärsyke. Energia-anturi AMP-kinaasia signaaleja nisäkkään rapamysiinin kohde kompleksin 1 (mTORC1), tärkeä säätelijä autophagy, joka ohjaa suoraan proteiinisynteesiä ja anabolisia prosesseja ravinneherkät tavalla. Nälänhätä aiheuttama autophagic rakkulat muodostuu, jotka todennäköisesti sisältävät solusoolin [18], [19]. Lisäksi muut rasitusolosuhteisiin kuten vaurioitunut soluelimiin, solunsisäisiä taudinaiheuttajia tai stressi endoplasmakalvostossa voi aiheuttaa autophagy läpi eri reittejä kuin ne aktivoidaan nälkään [19]. Kypsytyksen, viimeinen vaihe autophagy, sisältää toimitus- ja hajoaminen autophagic lastin. Fusion tapahtuu lysosomeihin ja autophagic rakkulat sulautua ja sisältö on huonontunut. Happamassa ympäristössä lysosomeihin on välttämätöntä viimeisiä vaiheita autophagy, ja häiritsemällä vakuolaarisen H

+ ATP, joka on mukana happamaksi lysosomeihin loppuun autophagy voidaan estää [15], [19].

tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia tarkemmin seurauksia mitokondrion kalvon potentiaalia aiheuttama UA. Kysyimme, onko tämä aiheutti vapauttamista sytokromi

c

ja laukaisi apoptoosin. Menetys kalvojännite ja omaisuutta UA shuttle protoneja poikki kalvojen odotettaisiin johtavan laskuun ATP tuotantoon mitokondrioiden [9]. Huomasimme, että UA käsitelty syöpäsolut olivat vähentyneet ATP-tasot ja lisääntynyt fosforylaatiota AMP kinaasia. Mielenkiintoista, UA laukaisi autophagy mutta ilman hajoamista autophagosomal sisältöä, mikä viittaa kohdistuvien haittavaikutusten autophagolysosomal happamoitumista. Tuloksemme osoittavat, että induktio autophagy välitti yhdistelmä vasteena ravinteiden puutetta sekä solujen stressiä.

(A) tasot ATP mitataan luminometrissä, määrä väheni T47D-soluissa sen jälkeen, kun hoidon UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) 24 tunnin ajan. Tiedot esitetään luminesenssin /solu kunkin ryhmän verrattuna DMSO-kontrollin. Virhe palkit esittävät keskivirhettä keskiarvon, * p 0,05. (B) fosforylaatio AMP-kinaasia, varmistettiin Western-blottauksella, havaittiin T47D-soluissa hoidon jälkeen UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%), 24 ja 48 tuntia.

Materiaalit ja menetelmät

Plant Materiaali, Cell Culture ja Altistuminen testiaineiden

(+) – Usnic happoa (97%) eristettiin

Cladonia arbuscula

(Wallr.) Rabenh. (Cladoniaceae) kerättiin avoimessa maassa Islannissa, ei yksityisessä omistuksessa. Eristäminen ja tunnistaminen suoritettiin, kuten on kuvattu [12]. Aine liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO, Merck, 2951), ja laimennettiin käytettäväksi kudoksen viljelyalustaan. Kaikki testit sisältyy valvonta, jossa korkein vastaavan DMSO-pitoisuus oli käytetty. Rintasyöpä solulinjat T47D ja MCF7 ja haimasyövän solulinja Capan-2 saatiin American Type Culture Collection (ATCC) kautta LGC Promochem. T47D sisältää yhden mutatoidun kopion p53 [20], mutta Capan-2 ja MCF7 ovat homotsygoottisia villityyppisen p53: n [21]. MCF7 on estrogeenireseptoripositiiviset [22]. Ensisijainen ihmisen fibroblastit viljeltiin normaalista ihosta biopsiat ja käytetyt passage 6-13 (National bioetiikkaneuvoston lupa VSNb2006020001 /03-16; tietoon perustuva suostumus on saatu). Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä RPMI-1640 kudosviljelyelatusaineeseen (GIBCO ™, 52400), joka sisälsi 0,5% penisilliiniä ja streptomysiiniä (GIBCO ™, 15140-148) ja 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS, GIBCO ™, 10270) jossa T47D sai lisäksi 0,01 mg /ml insuliinia (Sigma, I1882), ja niitä siirrostetaan seuraavat irtoaminen trypsiinillä (0,25% trypsiiniä /EDTA, Difco ™, 215240) tarvittaessa. Solut ympättiin sopiva määrä ylittää 70-80% konfluenssiin jälkeen viljelty 24 tuntia. (+) – Usnic happoa (5 tai 10 ug /ml), metformiinin (10 mM; Sigma, D150959) ja liuotin valvontaa lisättiin ja soluja inkuboitiin vakio-olosuhteissa, eri ajanjaksoilla. Induktioon autophagy ravinteiden puutetta, soluja inkuboitiin Hankin liuosta (Sigma, H9394) viimeisen 40 minuutin inkubaation ajan.

induktio autophagic vakuolien, kaksinkertainen kalvojen ominaisuus autophagosomes, havaittiin elektronimikroskopialla on T47D-soluissa sen jälkeen, kun hoidon UA ​​(2,5 ja 5,0 ug /ml; DMSO 0,1%) 24 tunnin ajan. Mustat nuolet osoittavat autophagic vacuoles, valkoiset nuolet osoittavat kaksinkertainen kalvon muodostumisen.

(A) lisääntyminen LC3 puncta havaittiin, jonka immunofluoresenssilla T47D ja MCF7-solujen käsittelyn jälkeen UA (10 ug /ml) 24 tunnin ajan. Vaikutusta ei ollut nähtävissä normaaleissa fibroblasteissa. Mittakaavapalkki esitetty edustaa 20 um ja se koskee kaikkia paneeleja. (B) LC3 puncta solua kohti laskettiin ja kvantifioidaan ImageJ ja tiedot edustettuina LC3 puncta /solu kunkin ryhmän verrattuna DMSO-kontrollin. Virhe palkit esittävät keskivirhettä keskiarvon, * p 0,05, ** p 0,001. (C) lisäys LC3 I ja LC3 II, varmistettiin Western blottauksella, havaittiin T47D-soluissa hoidon jälkeen UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) 24 tuntia.

Arvio tasot ATP

Solut irrotetaan trypsinoimalla, pieni alikvootti poistettiin laskemista ja kerättiin käyttäen 0,5 M perkloorihappoa (Merck, 1,00519) 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sentrifugoinnin jälkeen 10 ui supernatanttia sekoitettiin 1 ml: aan tislattua vettä. Bioluminesenssi analysoinnissa käytettiin 75 ui lusiferaasin (Promega, FF2021), joka hajotettiin solujen ja edellyttäen alustan lusiferiini. Luminesenssi mitattiin luminometrissä (Turner TD 20/20) ja ilmaistiin luminesenssi /solu.

(A) ei heikkene P62 havaittiin, Western-blottauksella, vuonna T47D ja MCF7-solujen hoidon jälkeen UA ( 5,0 ja 10 ug /ml, 24 h; DMSO 0,1%). (B) Lysotracker, havaittiin fluoresenssimikroskopialla, osoittaa diffuusia värjäytymistä T47D-soluissa hoidon jälkeen UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) ja 24 h ja 72 h. (C) Lysotracker intensiteetti solua kohti kvantifioitiin ImageJ ja tiedot esitetään keskiarvona fluoresenssin arvo kunkin ryhmän verrattuna DMSO-kontrollin. Virhe palkit esittävät keskivirhettä keskiarvon, ** p 0,001. Mittakaavapalkki esitetty edustaa 100 um ja koskee kaikkia paneeleja. (D) N: o vaikutuksia Lamp2 immunovärjäystä havaittiin, käsittelyn jälkeen UA

(

10 ug /ml; DMSO 0,2%) 24 tunnin ajan. Mittakaavapalkki esitetty edustaa 100 um ja koskee kaikkia paneeleja. (E) Plasmidi ilmentävät MRFP-GFP-LC3 transfektoitiin T47D-soluihin. Puute autophagolysosomal happamoitumisen havaittiin hoidon jälkeen UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) 24 tunnin ajan, jonka havaitaan selvä GFP puncta. Mittakaavapalkki esitetty edustaa 20 um ja se koskee kaikkia paneeleja.

Elektronimikroskopian

24 tunnin inkubaation aika vakio-olosuhteissa solut kerättiin trypsinaatiolla ja vahvistettu 1 ml glutaraldehydi (Ted Pella Inc., 18426) liuosta 60 min huoneen lämpötilassa, sitten sentrifugoitiin ja säilytettiin 0-5 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Poistamisen jälkeen glutaraldehydi, kaksi tippaa 2% hyydytettyä liuosta (Ted Pella Inc., 19225) tislattua vettä lisättiin solupelletti, sekoitetaan varovasti ja säilytettiin 0-5 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Sitten näytteet pestiin kahdesti PBS: llä ja osmiumtetroksidilla (Ted Pella Inc., 18463) lisättiin kuhunkin näytteeseen yhden tunnin ajan ja pestiin jälleen PBS: llä. Näytteet leikattiin 2-5 mm palasiksi alle makroskooppia käyttämällä partakoneen teriä. Kappaleet poistettiin vesi etanolilla (Merck, 64271D) lisäämään pitoisuuksina, alle kierto. Epoksihartsin (Ted Pella Inc., 18300) lisättiin, ensin 01:01 (tilavuus: tilavuus), jossa 99% etanolilla (Merck, 64271) yhden tunnin ajan, sitten kahdesti hartsi vain yhden tunnin ajan joka kerta. Muotit asetettiin sen jälkeen uuniin 70 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Sitten hartsi viipaloitu kera veitsi (paksuus noin 0,5 pm) ja värjättiin toluidiinisinisellä valinta näytteiden leikkaamista varten timantti veitsellä (70-100 nm paksuus). Näytteet sijoitettiin kupari runko ennen värjäämällä 0,06 g /ml lyijy-sitraattiliuosta (Ted Pella Inc., 19314), ja visualisoitiin käyttämällä Philips EM300 elektronimikroskoopilla. Kuvat ennustetaan kehitettiin käyttäen standardimenetelmiä kuvauksiin. Kehitetyn kalvo skannata tietokoneelle, jossa on Nikon Coolscan V ED.

(A) väheneminen p-p70S6K havaittiin, immunoperoksidaasivärjäyksellä, käsittelyn jälkeen UA (10 ug /ml; DMSO 0,2% ) 24 tuntia. Mittakaavapalkki esitetty edustaa 100 um ja koskee molempia paneeleja. (B) lisääntyminen p-eIF2α havaittiin, käsittelyn jälkeen UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) 6 tuntia.

Immunosytokemia

Immunofluoresenssivärjäystä solut otettiin talteen ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (Sigma, P6148) ja värjättiin anti-sytokromi

c,

hiiren IgG2a monoklonaalinen vasta-aine (Abcam, ab110325), pilkottiin kaspaasi-3, kanin polyklonaalista vasta-ainetta (Cell Signaling, 9661) tai LAMP2, hiiren IgG1 monoklonaalinen vasta-aine (H4b4, saatu University School of Medicine, Baltimore), ja sen jälkeen Alexa Fluor punainen 546 vuohen anti-kani-lgG-vasta-ainetta (Invitrogen, A11010), Alexa Fluor vihreä 488 vuohen anti-kani-IgG-vasta- (Invitrogen, A11070) tai Alexa Fluor punainen 546 vuohen anti-hiiri-IgG

2a-vasta-ainetta (Molecular Probes, A11018) varten tumavärjäystä TO-PRO-3 jodidia (Invitrogen, T3605) käytettiin. Sillä LC3 havaitsemiseksi solut kiinnitettiin metanolilla (Sigma, 34860) 10 minuutin ajan -20 ° C: ssa ja värjättiin anti-LC3B (D11), kani-IgG monoklonaalinen vasta-aine (Sigma, L7543) ja sen jälkeen Alexa Fluor vihreä 488 vuohen anti -rabbit IgG vasta-ainetta (Invitrogen, A11070). Värjätyt solut visualisoitiin ja valokuvattiin alle -konfokaalimikroskoopilla (Zeiss, LSM 5 Pascal). Sillä immunoperoksidaasivärjäystä solut kiinnitettiin metanolilla (Sigma, 34860) ja 5 min -20 ° C: ssa ja värjättiin anti-fosfo-p70S6 kinaasi (Thr389, 108D2), kani-IgG, monoklonaalinen vasta-aine (Cell Signaling, 9234), anti- -LC3B (D11), kani-IgG monoklonaalinen vasta-aine (Sigma, L7543) ja anti-p62 (SQSTM1), kanin polyklonaalinen vasta-aine (Enzo, PW9860), jota seurasi inkubointi hiiren monoklonaalinen anti-kani-immunoglobuliini IgG1κ (Dako, M0737), kanin polyklonaalista anti-hiiri immunoglobuliinit IgG (Dako, Z0259), PAP, piparjuuriperoksidaasi ja hiiren monoklonaalinen anti-piparjuuri immunokompleksit, IgG1 (Dako, P850) ja DAB-tabletit, (DAKO, S3000). Värjätyt solut visualisoitiin ja valokuvattiin alle valomikroskoopin alla (Leica DMI 3000B).

Western blot -analyysi

Solut kerättiin ja lyysattiin RIPA-puskurilla. Proteiinipitoisuus kvantifioitiin spektrometrisesti käyttäen Bradford-reagenssia (Sigma, B6916). Proteiinit erotettiin NuPAGE 10% Bis-Tris Mini Geelit siirrettiin 0,2 jiM polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvo elektroforeesin. Membraanit tutkittiin käyttämällä koettimena anti-fosfo-AMPKα (Thr172) kani-IgG monoklonaalisia vasta-aineita (Cell Signaling, 4188), anti-p62 (SQSTM1), kanin polyklonaalinen vasta-aine (Enzo, PW9860), anti-LC3B (D11), kani-IgG monoklonaalinen vasta-aine (Sigma, L7543), anti-fosfo-eIF2α (Ser51) kanin polyklonaalinen vasta-aine (Cell Signaling, 9721) tai anti-G3PDH kanin anti-ihmis-polyklonaalista vasta-ainetta (R 0,05 ja p 0,001 vastaavasti. Kuvat ja tiedot esitetään edustavat mitä havaittiin ainakin kolme erillistä koetta.

Tulokset ja keskustelu

sisäisen reaktiotien apoptoosin laukaisee avaaminen huokoset ulompaan mitokondrion kalvon johtava vapautuminen sytokromi

c

sytosoliin ja aktivointi kaspaasi cascade [26]. Seurata aikaisemmat työt vaikutuksista UA mitokondrion kalvon potentiaalia [12] selvitettiin sytokromi

c

vuoto ja pilkkominen kaspaasi-3 immunovärjäyksellä että rintasyövän T47D ja haiman solulinja Capan-2. Ei sytokromi

c

vapautuminen tai lohkaista kaspaasi-3 tuotteet olivat havaittavissa käsittelyn jälkeen usnic hapolla (10 ug /ml) 24, 48 ja 72 tuntia (data näytetään 72 tuntia, Fig. S1A ja Fig. S1B ). Nämä tulokset tukevat aiempien tietojen UA aiheuttaa myöhään kuolion mutta ei apoptoosin [12], ja osoittavat, että vaikka mitokondrion pH-gradientti häiriintyy, mitokondriot itse ovat ehjät.

On raportoitu, että usnic happo syyt irrotus mitokondrioiden [27], inhiboi mitokondrion hengitystä ja aiheuttaa laskua ATP tasojen hiiren maksasoluissa [10]. Geenien ilmentyminen tietoja mikrosiruanalyysi on vahvistanut ehdotusta, että usnic happo sukkulat protoneja vastaan ​​kaltevuus luoma mitokondrion elektronin kuljetus, koska se johtaa geenien induktioon liittyvät kompleksit I-IV elektroninsiirtoketju [9]. Tutkia asiaa tarkemmin, ATP-tasot arvioitiin ja fosfory- AMP kinaasia analysoidaan T47D-soluissa. Tulokset osoittavat, että UA hoito johtaa sellulaaristen määrien aleneminen ATP jälkeen 24 tunnin hoidon (5,0 ug /ml, p = 0,0523, 10 ug /ml, p = 0,010). Kuten odotettua, alentuneesta ATP liittyvän kohonneeseen fosforylaatioon AMP kinaasia jälkeen sekä 24 ja 48 tuntia hoitoa (10 ug /ml) (Fig. 1A ja B).

Tämä lasku solujen energiatasot ja liipaisu anturielementin järjestelmän voisi olettaa aiheuttavan autophagy. Elektronimikroskoopilla analyysi T47D solut käsiteltiin UA (2,5 ja 5,0 ug /ml) 24 tunnin ajan osoitti selvempi läsnäolon autophagic Vakuoleissa kaksinkertaisella kalvot ominaista autophagosomes verrattuna kontrolli (Fig. 2). Nämä tulokset olivat seuranneet analyysi LC3 puncta immunofluoresenssilla, ja arvio runsaudesta autophagosomes, eri ajankohtina ja hoitoja kolmen solutyyppejä (Fig. 3A, Fig. 3B ja kuvio. S2A-C). Mitään vaikutuksia ei havaittu hoidon jälkeen UA (10 ug /ml) 2 tuntia tahansa kolmesta solulinjoja, mutta havaittiin kasvua hoidon jälkeen anti-diabeettinen lääkettä metformiini T47D rintasyövän solulinjan, joka ei ollut poistuneet pitkäaikaisessa hoidossa. Metformiini on aikaisemmin osoitettu stimuloivan AMP-kinaasia jo yhden tunnin kuluttua [28]. 24 tunnin kuluttua hoidon UA ​​(10 ug /ml) merkittävä kasvu LC3 puncta oli ilmeinen verrattuna kontrolleihin kahdessa rintasyövän solulinjoissa. Immunoperoksidaasivärjäys T47D-solujen osoitti myös lisääntynyt läsnäolo LC3 puncta jälkeen UA hoidon (Fig. S2D). Nämä havainnot varmistettiin vielä havainnoimalla lisääntyminen LC3 I ja LC3 II Western blottauksella (kuvio. 3C). Vaikutukset normaalille iholle fibroblasteja ei merkitä. Vertailun vuoksi solut ilman ravintoa 40 min inkubaatio ravinteiden vapaan Hankin tasapainotettu ratkaisu. Vaikka silmämääräinen tarkastus ehdotti läsnäolo autophagosome muodostuminen nälkään soluissa (Kuva. 3A), LC3 puncta oli vaikea laskea ja tämä ankara hoito ei ollut hyvin siedetty soluja.

Kun havaittu lisääntyminen LC3 puncta hoidon jälkeen UA, tutkimme onko muodostumista autophagic vacuoles seurasi autophagic muutostilassa. Tasot autophagosomal lastin p62 arvioitiin altistumisen jälkeen UA. Pitoisuus p62 on osoitettu vähentävän jos autophagic vuo kasvaa, koska se hajoaa prosessi [29]. Muodostaminen autophagosomes seurauksena hoidon UA ​​24 tunnin kuluttua (5,0 ja 10 ug /ml) T47D ja MCF7-solut (Fig. 4A ja kuvio. S3) ei seurannut hajoamista sisäistetty proteiinia. Koska p62 hajoamista 24 tuntia ehdottaa häiriöitä lysosomaalisen happamoitumisen ja autophagolysosome kypsymisen, jotka voivat johtua siitä, että protonin shuttling ominaisuudet usnic hapon koko lysosomaalisen kalvon, kuten nähdään depolarisaation mitokondrioiden [9], [10].

arvioi tarkemmin vaikutusten UA on lysosomeihin käytimme lysosomaalisen markkeri lysotracker in T47D-soluissa, jotka etiketit ja seuraa hapan organelles soluissa. Tulokset paljastivat erittäin diffuusin kasvu lysotracker värjäytyminen T47D-soluissa jälkeen UA hoitoa 24 ja 72 tuntia (Fig. 4B ja Fig. 4C). Tämä värjäytymistyyppi on tulkittu lysosomaalisen laajentuma kuin aiheuttama käsittelemällä klorokiinin, joka kerääntyy lysosomeihin. Käsitellyissä soluissa klorokiinin immunovärjäys lysosomaalisen kalvon proteiinin Lamp1 kopioitu kuvio saatu lysotracker, mikä vahvistaa lysosomaalisen laajentuma [30]. Sen sijaan kokeissa, immunofluoresenssivärjäystä lysosomaalisen proteiinin Lamp2 ei osoittanut mitään morfologisia muutoksia ja eroa ei havaittu käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen (Fig. 4D). Tämä osoittaa, että lysotracker oli värjäämällä ulkopuolella lysosomiin ja voidaan selittää, että se, että säilyttäminen väriaineen sisällä lysosomeihin riippuu happamassa pH: ssa [31]. Diffuusi lysotracker värjäytyminen seuraavan UA hoidon voi siis johtua protonit on edestakaisin ulos lysosomiin, samalla tavoin kuin tapahtuu koko mitokondrion kalvon.

tutustua autophagosome kypsymisen jälkeen, UA hoidon, käytimme plasmidirakenne , tfLC3 (MRFP-GFP-LC3 tandem-merkitty fluoresoiva proteiini), joiden kanssa olemme transfektoitiin T47D solut. Tätä menetelmää on aiemmin käytetty seurata autophagic kypsymiseen. GFP-LC3 menettää fluoresenssi johtuu lysosomaalisen happamuus taas MRFP fluoresenssi on vakaa [23], [24]. Tulokset osoittivat, että nälkään soluissa GFP-fluoresenssi vaimennetaan mikä happamissa olosuhteissa ja hajoamista lysosomaalisen hydrolaasit, kun taas MRFP fluoresenssi säilyi vakaana. Hoidon jälkeen UA: ssa 24 tuntia, GFP, sekä MRFP fluoresenssi havaittiin osoittaa häiriöitä autophagolysosomal happamoitumisen ja heikentynyt hajottavien olosuhteet käsittelyn jälkeen UA (Fig. 4E). Epäonnistuminen näiden solujen loppuun autophagy voisi myötävaikuttaa kertymiseen autophagic vacuoles ja säilyttäminen vahingoittumattomia p62.

Yksi adaptiiviset toiminnot useimmat syövät on säädeltyyn pH. Normaaleissa soluissa solunsisäinen pH-arvo on pienempi kuin solunulkoinen pH. Syöpäsoluissa kaltevuus on päinvastainen luoda suotuisa ympäristö metastasointiin. Korkeampi solunsisäinen pH pidetään lisääntyneen H

+ efflux muutosten vuoksi ilmaisu ja /tai aktiivisuutta solukalvon pumppujen ja kuljettajat [32]. PH-gradientti kasvainsoluissa on hyödyllistä solujen kertyminen heikkoja happoja, kuten usnic happoa, joka aiheuttaa heikkoja happoja olevan lähinnä neutraali matalassa pH: ssa ja helpottaa niiden siirtämistä membraanin poikki. Hoidon UA ​​osoittaa merkittävää geenien induktioon, jotka on yhdistetty komplekseja I-IV elektroninsiirtoketju, joka voisi olla kompensoiva mekanismi säilyttää protonigradienttia poikki mitokondrion sisäkalvon [9], [32].

Tutkimukset useiden perinyt oireyhtymiä altistavien erilaisia ​​kasvaimia ja karsinoomia ovat johtaneet tunnistaminen mTOR-reitin säätelijänä autophagy. Joukossa alavirtaan tavoitteet mTORC1 ovat p70S6K ja 4EBP1, joilla on keskeinen rooli solusyklin ohjaus ja lisääntymistä [33], [34]. Kuviossa. 1B osoitamme, että UA aktivoi AMP-kinaasi, joka signaloi mTORC1 monimutkainen. Tutkitaan alavirtaan tavoitteiden mTORC1 olemme analysoineet vaikutuksia UA-käsiteltyjen solujen fosforyloitua p70S6K immunoperoksidaasivärjäyksellä. Tulokset osoittivat merkittävää vähenemistä värjäytymisen hoidon jälkeen 24 tunnin ajan (Fig. 5A). Solut reagoivat ravinteiden puutetta indusoimalla autophagy mutta tämä prosessi voi myös laukaista solustressiä [19]. Tutkitaan jos UA voitaisiin laukaista autophagy muilla mekanismilla testasimme todisteita solujen stressiä T47D-soluissa hoidon jälkeen UA (10 ug /ml) 6 tuntia. Lisääntynyt fosforylaatiota eIF2α, joka on yksi tunnustettu merkkejä ER stressiä, havaittiin (Fig. 5B).

vaikutukset usnic happo autophagy voidaan verrata kuvattu anti-malarialääkeresistenssi klorokiini joka on tällä hetkellä kliinisissä kokeissa yhdistelmänä syövänvastainen hoito [19]. Klorokiiniä on heikko emäs (p

K

8,5) ja kerääntyy lysosomeihin joka tulee laajentunut ja huonosti, estämällä autophagic flux [19]. Sen sijaan, usnic happo on heikko happo, joka sukkuloi protoneja koko kalvoja, mikä lisää lysosomaalinen pH, kuten on esitetty säilyttäminen GFP-signaalin, mutta lysosomaalisen muoto ei ollut vaikutusta (LAMP2 värjäys). ER stressi indusoi proteasomin esto ja ER-liittyvä autophagy on tämän vuoksi erityisen olennaista syövän hoito proteasomiestäjät. On osoitettu, että yhdistämällä klorokiini kanssa proteasomin estäjä bortetsomibi lisää kasvainsolukuoleman

in vitro

ja

in vivo

[35]. Soluunottoa ja solunsisäistä jakelua huumeiden pH vaikuttaa [32], [36]. Klorokiini voidaan esimerkiksi estämään solunsisäisen sitomisen lysosomeihin [36], mutta sillä ei ole vaikutusta mitokondrioiden kertyminen daunorubisiinin, mikä viittaa siihen, että yhdiste ei vaikuta mitokondrioiden pH [37]. Kuten usnic happo vaikuttaa pH lysosomeihin ja mitokondrioita ennustetaan vaikuttavan solunsisäisen huumeiden levittämiseen.

Yhteenvetona edellisessä tutkimus on osoittanut, että UA aiheuttaa mitokondrion kalvon potentiaalia. Nykyisessä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että tämä ei johda vapautumista sytokromi

c

ja liipaisu apoptoosin. H

+ shuttling vaikutus UA toimii kahdella -organellien mitokondrioita ja lysosomeihin sekä sen vaikutus autophagosome muodostuminen on todennäköistä laukaista sekä ravitsemuksen ehtyminen ja stressin olosuhteissa. Autophagic vuo on kuitenkin epätäydellinen ja hajoaminen autophagosomal sisältöä ei tapahdu. Meidän havainnot vaikuttavat terapeuttiseen manipulointiin autophagy ja pH-määritettiin huumeiden levittämiseen.

tukeminen Information

Kuva S1.

UA ei aiheuta apoptoosia. (A) Sytokromi c vuoto ei ollut havaittavissa, joita immunofluorescense on T47D ja Capan-2-solujen käsittelyn jälkeen UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) 24, 48 ja 72 tuntia. (B) N: o katkaisutuotteiden kaspaasi-3 oli havaittavissa hoidon jälkeen UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) 24, 48 ja 72 tuntia. Mittakaavapalkki esitetty edustaa 20 um ja se koskee kaikkia paneeleja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0051296.s001

(TIF) B Kuva S2.

UA indusoi muodostumista autophagosome vakuolien. LC3 puncta solua kohden laskettiin ja kvantifioidaan ImageJ ja tiedot esitetään 95% perhe-viisasta luottamustasolla. (A) T47D solut käsiteltiin UA 2 ja 24 tuntia. (B) MCF7-solut käsiteltiin UA 2 ja 24 tuntia. (C) Normaali ihmisen fibroblasteja käsiteltiin UA 2 ja 24 tuntia. (D) lisääntyminen LC3 immunoperoksidaasivärjäystä havaittiin, ja T47D-soluissa hoidon jälkeen UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) 24 tunnin ajan. Mittakaavapalkki esitetty edustaa 100 um ja koskee molempia paneeleja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0051296.s002

(TIF) B Kuva S3.

UA ei johda hajoamista P62. Ei väheneminen p62 immunoperoksidaasivärjäystä havaittiin, ja T47D-soluissa hoidon jälkeen UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) 24 tunnin ajan. Mittakaavapalkki esitetty edustaa 100 um ja koskee molempia paneeleja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0051296.s003

(TIF) B

Kiitokset

Olemme kiitollisia jäsenet Biomedical Center University of Iceland, Jóhann Arnfinnsson apua kanssa elektronimikroskoopilla ja Jenny Björk Þorsteinsdóttir tekniseen tukeen. Kiitämme Anna Helga Jónsdóttir apua tilastoihin.