Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tutkimuksen tarkoituksena on syövän vaikutuksia

Cudrania tricuspidata

varsi ( CTS) ote kohdunkaulan syöpäsoluja. Vaikutus CTS solujen elinkelpoisuus tutkittiin HPV-positiivisten kohdunkaulan syöpäsolujen ja HaCaT ihmisen normaalia keratinosyyttien. CTS osoitti merkittävää annoksesta riippuvaa sytotoksisia vaikutuksia kohdunkaulan syöpäsoluja. Kuitenkin, ei ollut sytotoksinen vaikutus CTS HaCaT keratinosyyttejä pitoisuuksina ,125-,5 mg /ml. Tämän perusteella sytotoksista vaikutusta, osoitimme, että CTS indusoi apoptoosia alaspäin säätäminen E6- ja E7 viruksen onkogeenejä. Apoptoosi havaittiin DAPI-värjäyksellä, anneksiini V-FITC /PI-värjäyksen, solusyklin analyysi, Western blotting, RT-PCR, ja JC-1 värjäytymisen SiHa- kohdunkaulan syövän soluja. MRNA ekspressiotasot ulkoinen tie molekyylien kuten Fas, kuoleman reseptori 5 (DR5), ja TNF-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) korotettiin CTS. Lisäksi CTS hoito aktivoitu kaspaasi-3 /kaspaasi-8 ja lohkaisu poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP). Kuitenkin, mitokondrion kalvon potentiaalia ja ekspressiotasot sisäisen reaktiotien molekyylien, kuten Bcl-2, Bcl-x L, Bax, ja sytokromi C: tä ei ole moduloitu CTS. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että CTS: n indusoiman apoptoosin aktivoimalla ulkoinen tie, mutta ei sisäisen reaktiotien, SiHa- kohdunkaulan syövän soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että CTS voidaan käyttää moduloiva aine kohdunkaulan syöpä.

Citation: Kwon S-B, Kim M-J, Yang JM, Lee H-P, Hong JT, Jeong H-S, et ai. (2016)

Cudrania tricuspidata

Stem Ote indusoi apoptoosia kautta ulkoisen reaktiotien SiHa- kohdunkaulan syövän solut. PLoS ONE 11 (3): e0150235. doi: 10,1371 /journal.pone.0150235

Editor: Yi-Hsien Hsieh, Institute of Biochemistry and Biotechnology, Taiwan

vastaanotettu 24. marraskuuta 2015 Hyväksytty: 10 helmikuu 2016; Julkaistu 9 maaliskuuta 2016

Copyright: © 2016 Kwon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee perus-ohjelman (2015R1A2A2A09001137) ja National Research Foundation of Korea (NRF), https://www.nrf.re .kr /nrf_eng_cms. D. Y. Yoon tukivat osittain Priority Research Centers Program (2012-0006686). Kirjoittajat ovat kiitollisia Pharma Teksol ja Chungcheongbukdo Bio CS niiden henkisen ja taloudellisen tuen tämän projektin. Ei ollut mitään ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: Tekijä Eun Suk Kim työskentelee kaupallinen yhtiö, Chungcheongbukdo Bio CS, ja yhtiö tukee muodossa palkkaa hänelle. Yhtiö kuitenkin ei ole enempää roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen merkitys tämän kirjoittajan on nivelletty ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Lyhenteet: HPV, ihmisen papilloomavirus; CTS,

Cudrania tricuspidata

varsi; DR, kuoleman reseptori; TRAIL, TNF-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi; PARP, poly (ADP-riboosi) polymeraasin

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on yksi yleisimmistä sairauksien naista maailmassa ja on edelleen korkea kuolinsyy naisten keskuudessa kehitysmaissa [1-2 ]. Epidemiologiset ja kliiniset tiedot viittaavat siihen, että infektio korkean riskin ihmisen papilloomavirus (HPV) tyyppejä, kuten tyypit 16 ja 18, on merkittävä rooli monitekijäinen kohdunkaulansyövän etiologian [3]. Korkean riskin HPV onkoproteiineja E6- ja E7 tärkeä rooli ylläpitämisessä kohdunkaulan syöpäsolujen kasvua. Onkoproteiineja E6 ja E7 inaktivoimiseksi tuumorisuppressorigeenin proteiinien p53 ja pRb, vastaavasti [4]. Korkean riskin HPV onkoproteiinin E6 kumppaniaan ja heikentää p53, kun taas HPV-proteiini E7 kilpailee E2F retinoblastoomaa proteiinia (pRb) sitoutumiskohtiin [5].

Cudrania tricuspidata

on lehtipuu kuuluva perheeseen

Moraceae

joka jaetaan pääasiassa Koreassa, Kiinassa ja Japanissa. Koko

C

.

tricuspidata

kasvi on hyödynnetty tärkeänä folk korjata syövän Koreassa viime vuosikymmeninä, vaikka se on myös käytetty perinteisen lääketieteen kuivatuksen neuriitti ja tulehduksen muualla Aasiassa [6]. Lisäksi useat vaikutukset

C

.

tricuspidata

ote on raportoitu, mukaan lukien antioksidantti [7] ja estäviä vaikutuksia typpioksidisyntaasia [8]. Kuitenkin syövän vaikutukset ote varren

C

.

tricuspidata

kohdunkaulan syövän soluja ei ole tutkittu.

Siten Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia syövän vastaista aktiivisuutta ja

Cudrania tricuspidata

varren (CTS) otteen HPV-positiivisten kohdunkaulan syövän solujen ja tutkimaan apoptoottisen mekanismeja CTS. Täällä me raportoimme että CTS hoito aiheuttaa apoptoosin kautta ulkoinen tie, samoin kuin läpi tukahduttaminen HPV-16 onkoproteiineja E6 ja E7 ja muuttaminen proteiinin tasot p53 ja p-pRb.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja vasta-aineet

CellTiter 96 AQ

ueous One Solution Cell Proliferation Assay Reagent [MTS, 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetrazolium] hankittiin Promega (Madison, WI, USA). Propidiumjodidia (PI) ja 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) tahra ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). NE-PER Ydin- ja Sytoplasmiset Extraction Reagenssit ostettiin Pierce (Rockford, IL, USA). Spesifisiä vasta-aineita PARP, kaspaasi-3, kaspaasi-8, p53, Bcl-2, Bcl-x L, Bax, Bid, pRb, p-pRb, ja sytokromi C ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Anti-kani-IgG (HRP) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta ja anti-hiiri-IgG HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen hankittiin Millipore (Bedford, MA, USA). Spesifisiä vasta-aineita p27, p21, ja glyseraldehydi 3-phospahte (GAPDH) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). JC-1 (5,5 ’, 6,6′-tetrakloori-1,1′, 3,3’-tetraetyyli benzimidazolycarbocyanine kloridi) hankittiin Enzo (Farmingdale, NY, USA). Yleiset-kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk ja kaspaasi-8-estäjä Z-IETD-fmk ostettiin R Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), joka sisälsi 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone Laboratories). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa 5% CO

2/95,% ilmaa kyllästyskosteus.

Solun luelinkykymäärityksillä

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTS väriaine vähennys määritys, joka mittaa mitokondrion hengityselinten toiminta. Kohdunkaulan syövän solut ympättiin (12 x 10

4 solua /ml) 100 ul: medium /kuoppa 96-kuoppalevyille, niitä inkuboitiin yön yli, ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla CTS, kuten edellä kuviossa legendoja, 24 tuntia . Solujen elinkelpoisuus laskettiin arvioimalla MTS aineenvaihduntaa, kuten aiemmin on raportoitu [10]. Lyhyesti, media näytteet (100 ui) poistettiin ja niitä inkuboitiin 100 ui MTS-PMS-mix-liuoksella 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Optinen absorbanssi mitattiin 492 nm: ssä käyttäen ELISA-lukijaa (Apollo LB 9110, Berthold Technologies GmbH E7, 5′-TGA AGG ACA TGG CTT AGA AGT G-3 ’(eteenpäin), 5′-GGT GCA AGG GTC ACA GTG TT-3′ (reverse); TRAIL, 5’-AAG TTT GTC GTC GTC GGG GT-3 ’(eteenpäin), 5′-TGG TGC AGG GAC TTC TCT CT-3′ (reverse); Fas, 5’- TGA AGG ACA TGG CTT AGA AGT- 3 ’(eteenpäin), 5′-GGT GCA AGG GTC ACA GTG TT-3′ (reverse); DR5, 5’-CAG AGG GAT GGT CAA GGT CG- 3 ’, 5′-TGA TGA TGC CTG ATT CTT TGT GG-3′; ja GAPDH, 5’-TGG GCT ACA CTG AGC ACC AG-3 ’(eteenpäin), 5′-GGG TGT CGT TGT TGA AGT CA-3’ (reverse).

Western blot-analyysi

Soluja käsiteltiin eri konsentraatioina CTS: ssa 24 tuntia, otettiin talteen, pestiin PBS: llä, ja sentrifugoitiin (1890 x

g

, 5 min, 4 ° C). Saatu solujen pelletit suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin, joka sisälsi 50 mM Tris (pH 7,4), 1,5 M natriumkloridia, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,25% natriumdeoksikolaatti, 0,1% natriumdodekyylisulfaatti (SDS), ja proteaasi estäjä cocktail. Solulysaatit inkuboitiin jäissä 1 h ja kirkastettiin sentrifugoimalla 17010 x

g

30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus kvantitoitiin käyttäen Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja UV-spektrofotometrillä. Solulysaatit erotettiin 10-12% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE). Proteiinit siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (PVDF; Millipore, Bedford, MA, USA), joka blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa liuotetaan Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi Tween-20 (2,7 M NaCl, 53,65 mM KCI, 1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1% Tween-20) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa tietyn ensisijaisen vasta-aineita. Pesun jälkeen kalvoja inkuboitiin toisen vasta-aineilla (HRP konjugoitua anti-kani tai anti-hiiri-IgG) 1 h huoneen lämpötilassa. Pesun jälkeen blotit analysoitiin käyttämällä Länsi-Zol Plus ja western blot tunnistusjärjestelmä (Intron Biotechnology, SungNam, Etelä-Korea).

Nuclear ja sytoplasman fraktiointiin

CTS-käsitellyt solut olivat kerättyjen ja fraktioitu käyttäen NE-PER ydin- ja Sytoplasmiset Extraction reagenssit (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA) valmistajan protokollan.

Analyysi mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) B

MMP (Δψ

m) arvioitiin JC-1 värjäystä ja virtaussytometria. SiHa-solut ympättiin 60 mm: n viljelyastioihin (2,5 x 10

5 solua /kuoppa) ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla CTS. Solut kerättiin trypsiini-EDTA: lla ja siirrettiin 1,5 ml: n putkiin. JC-1 (5 ug /ml) lisättiin soluihin ja sekoitettiin, kunnes se oli täysin liuennut, minkä jälkeen soluja inkuboitiin pimeässä 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa inkubaattorissa. Solut sentrifugoitiin (300 x

g

, 5 min, 4 ° C), pestiin kahdesti PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 200 ui PBS: ää. Liuokset jaettiin käyttäen FACSCalibur väline ja analysoitiin CellQuest ohjelmisto (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Koko protokolla suoritettiin vähän valoa.

hiljentäminen endogeenisen HPV16 E6- ja E7 ilmaisuja siRNA

siRNA: t E6: n ja E7 ja salattu siRNA ostettiin Dharmacon (Dharmacon, Lafayette, CO ). E6 siRNA-sekvenssin ja E7 siRNA-sekvenssin, käytettiin, kuten on kuvattu aiemmin raportoitu [11]. Tukahduttaa transkriptio endogeenisen HPV16 E6- ja E7-geenit, SiHa-soluja väliaikaisesti transfektoitiin yhdessä synteettisen siRNA: t ja HPV16 E6- ja E7-tai nontargeting siRNA käyttäen Lipofectamine RNAiMAX reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

tilastollinen analyysi

tiedot esitetään keskiarvona ± SEM vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin Studentin t-testiä. *

p

0,05 tai **

p

0,005 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

tunnistaminen fenolisten yhdisteiden CTS

havainnut mahdollisia lääkkeiden komponenttien (kuvio 1, taulukko 1) ja suuren määrän klorogeenihappo (taulukko 2) CTS uutteen käyttäen HPLC. Taulukossa 2 luetellaan komponenttien CTS uutetta, joka sisälsi klorogeenihappoa, (+) – katekiinin, kofeiinihappoa phloretic happo, veratric happo, hesperidiinimetyylikalkoni, quercetin, ja naringetiini. CTS uute sisälsi monipuolista fenoliset hapot ja oli runsaasti klorogeenihappoa (64,42 mg /g). Klorogeenihappoa on raportoitu olevan syövän vastaisia ​​ja antioksidanttisia ominaisuuksia [12-15]. Kversetiini, hesperidiini, ja muiden fenolisten happojen, kuten kofeiinihappoa on myös raportoitu olevan syövän vaikutuksia useiden syöpätyyppien [16-18]. Kuitenkin, nämä yhdisteet olivat läsnä pieninä pitoisuuksina CTS uutteen.

seitsemäntoista erilaisten fenolisten hapon näytteen koostumus analysoitiin vertaamalla spektrin näytettä ja standardeja komponentteja sovitettu luomaan standardikäyrä välille piikin pinta-ala per komponentti määrittää määrän muutos. (A) Seitsemäntoista erilaista viitteen fenolisten happo yhdisteitä. (B)

Cudrania tricuspidata

varsi (CTS) ote. HPLC-analyysi osoitti, että läsnä kahdeksan yhdisteet, jotka vastaavat 8 mm 17 standardin yhdisteitä. 5, 7, 11 huiput edusti klorogeenihappoa, kofeiinihappoa ja veratric happo, vastaavasti.

CTS indusoi sytotoksisia vaikutuksia kohdunkaulan syöpäsoluja ja normaalit keratinosyytit

sytotoksisia vaikutuksia CTS arvioitiin useissa solulinjoissa käyttäen MTS-määritystä. Kohdunkaulan syövän solulinjat ja HaCaT normaali keratinosyytit käsiteltiin eri pitoisuuksilla ja ajanjaksoja (kuvio 2). Kuten kuviossa 2B, elinkelpoisuutta kohdunkaulan syövän solujen väheni annoksesta ja ajasta riippuvaa tavalla CTS uutetta. Elinkelpoisuus CaSki HPV16-positiivisten solujen vähentynyt aika- ja annosriippuvaisesti CTS uutetta, mutta vähemmässä määrin kuin mitä havaittiin SiHa HPV16-positiivisia soluja. Lisäksi, CTS ei ollut sytotoksista vaikutusta in HaCaT Ihmisen normaali keratinosyyttien pitoisuudet 0,125-0,5 mg /ml (kuvio 2A). Siksi päätimme tehdä tutkimuksen mekanismia taustalla indusoiman apoptoosin CTS uute SiHa kohdunkaulan syöpäsoluja.

(A) HaCaT, (B) SiHa ja CaSki soluja käsiteltiin 24-48 tuntia erilaisilla pitoisuudet CTS-uutetta, jonka jälkeen solujen elinkelpoisuus tutkittiin käyttäen MTS-määritystä. Tulokset * p 0,05 ja ** p 0,005 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. CTS-käsiteltyjä soluja verrattiin kontrolliin soluihin.

CTS aiheuttaa morfologisia muutoksia ja apoptoosia SiHa soluissa

faasikontrastimikroskopiaan osoitti, että CTS solukuolema ja morfologisia muutoksia SiHa-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla, kun 24 tunnin jälkeen (kuvio 3A). DAPI värjäys käytettiin tarkkailla ydin- tiivistyminen, merkkiaine apoptoosin. Nuclear tiivistymistä oli merkittävästi ja annoksesta riippuen kasvoi CTS-käsitellyt solut verrattuna kontrolliryhmän-soluissa (kuvio 3B ja 3C). Anneksiini V-FITC /PI-värjäys on yleensä käytetään havaitsemaan apoptoosia ja nekroosia. Apoptoosi vahvistettiin lisäksi anneksiini V-FITC ja PI-värjäyksen jälkeen 24 h hoidon CTS. SiHa-soluja käsiteltiin CTS pitoisuuksina 0,125-,5 mg /ml 24 tuntia, oli huomattavasti suurempi osuus apoptoottisten solujen verrattuna kontrolliryhmän solujen, mikä osoittaa, että CTS: n indusoiman apoptoosin. Kuitenkin, ei ollut muutoksia CTS käsiteltyjen HaCaT soluja (kuvio 3D).

(A) mikroskooppinen kuvat SiHa käsiteltyjen solujen CTS 24 tuntia. Kuvat on otettu mukaan faasikontrastimikroskopiaan 100 x suurennus. (B) Fluoresenssi mikroskooppiset kuvat SiHa-soluja käsiteltiin CTS 24 tuntia. Nuclear tiivistyminen ja chromatin kutistuminen havaittiin. (C) Tiedot apoptoottinen ytimet koko DAPI värjätyt solut tiivistää bar kaavioita. Tulokset *

p

0,05 ja **

p

0,005 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. (D) käsittelyn jälkeen ilmoitetun pitoisuuden CTS 24 tuntia, SiHa ja HaCaT solut värjättiin anneksiini V-FITC /PI.

CTS estää E6 /E7 ilmentyminen ja säätelee ilmentymistä E6 /E7-kohdistaminen anti-kasvain tekijät

E6 ja E7 onkoproteiineja tiedetään aiheuttavan hajoamisen p53 ja pRb, vastaavasti. Siksi alas-säätely E6 ja E7 oncogenes voisi odottaa johtavan palauttaminen p53 ja pRb tasolla [19-20]. HPV-16 E6 ja E7-mRNA: n ekspressiotasot tutkittiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä. E6-mRNA: n ilmentyminen väheni CTS käsiteltiin SiHa-soluja verrattuna ei-käsiteltyyn kontrolliryhmään soluissa. Lisäksi E7-mRNA: n ilmentyminen väheni myös (kuva 4A). Ilmaisu taso p-pRb oli alassäädetty, mutta pRb ilme oli ennallaan CTS-käsiteltyjen SiHa-soluissa (kuvio 4B). CTS annoksesta riippuvalla lisääntynyt ekspressiotaso p53, jolloin modulaatio loppupään tekijät p21 ja p27. Kuten on esitetty kuviossa 4B, p21 ja p27 ilmentymisen tasot kasvoivat annoksesta riippuvalla tavalla CTS hoitoon, kuten odotettua.

(A) mRNA: n tasot onkoproteiineja E6 ja E7, kuten havaitaan qRT-PCR: llä. (B) Western blot analyysit pRb, p-pRb, p53, p21, ja p27. SiHa soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden CTS 24 h.

CTS estää solusyklin etenemisen ja moduloi solusyklin liittyvät tekijät

vaikutuksen arvioimiseksi CTS solusyklin etenemiseen, me tutkimme solusyklin tilan virtaussytometrialla. Edellisessä kokeissa ekspressiotasot p53 ja alavirran geenien p21 ja p27 korotettiin hoidon jälkeen CTS (kuvio 4B). Verrattuna ei-käsiteltyjen kontrollisolujen, CTS-käsitellyt solut osoittivat merkittävää ja annoksesta riippuvaa kerääntymistä osa-G1-vaiheeseen (kuvio 5B). Kuitenkin, ei ollut merkittäviä muutoksia populaatioiden solujen G0 /G1, S ja G2 /M vaiheiden hoidon jälkeen CTS (kuvio 5A).

(A) Cell cycle profiilit CTS käsitellään SiHa solut. (B) osuus solujen sub-G1 vaiheeseen. Tulokset **

p

0,005 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. CTS-käsitellyt solut verrattiin käsittelemättömiin soluihin.

vaikutukset CTS ovat riippumattomia sisäisen reaktiotien

Mitokondriovauriot on tärkein tekijä luontainen apoptoosireittiä. Kun mitokondriot kalvo mahdollisia romahtaa, sytokromi C vapautuu sytosoliin, jonka jälkeen se muodostaa apoptosome kanssa Rahastolla-1 ja kaspaasi-9 [21]. Mitata mitokondrion kalvon mahdollinen romahtaminen seuraavat CTS hoidon, suoritimme JC-1 värjäystä ja FACS-analyysiä. Kuten esitetään S1A kuvassa, JC-1 piikkiä ei siirtynyt seuraavia CTS hoitoa. Lisäksi Western blot analyysit osoittivat, että CTS hoito ei muuta ekspressiotasot pro-apoptoottisen tekijän Bax tai näiden anti-apoptoottisten tekijöiden Bcl-2 ja Bcl-x L. Lisäksi sytokromi C ei julkaistu sytosoliin (S1B kuvio). Näin ollen päättelemme, että amplifikaatio apoptoottisen signaalin jälkeen CTS käsittely on riippumaton signalointi kautta luontainen apoptoosireittiä.

CTS-indusoitua apoptoosia välittävät kautta syöttämällä reseptorin signalointi

Koska olemme osoittaneet, että luontainen apoptoosireitin ei ollut mukana CTS: n indusoiman apoptoosin, me seuraavaksi keskittyneet ulkoista apoptoosireitin. Ulkoista apoptoosireittiä vastaanottaa signaaleja sitovat ekstrasellulaarisen syöttämällä ligandin proteiinien proapoptoottiset syöttämällä reseptoreihin (DRS) [22]. Ulkoista polku lähettää signaaleja solunulkoisia ligandien kautta proapoptoottiset DRS apoptoottista kaspaasi koneet [23]. Lisäksi, Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) on mukana apoptoosin, sekä useita muita solun prosesseja. Tutkimme ekspressiotasot ulkoinen tie liittyvät tekijät TRAIL, DR5, ja Fas SiHa- soluissa CTS hoidon (kuvio 6A). Tuloksemme osoittivat, että CTS hoito ylössäätelee mRNA tasoja TRAIL, DR5, ja Fas. Proteiinin ilmentyminen kaspaasi-3, kaspaasi-8, PARP, ja Bid, pilkottiin annoksesta riippuvaisella tavalla CTS (kuvio 6B). Lisäksi olemme tunnistaneet tiettyjä caspases mukana proapoptoottisten mekanismi CTS. SiHa solut esikäsiteltiin caspases estäjiä, mukaan lukien yleinen kaspaasiestäjä ja kaspaasi-8-estäjä. Kuten on esitetty kuviossa 6C, esikäsittely yleisen kaspaasi-inhibiittorin Z-VAD-FMK ennen CTS hoitoon merkittävästi estetty CTS: n indusoiman apoptoosin. Samanlainen estävä vaikutus CTS: n indusoiman apoptoosin tuottamaa kaspaasi-8-estäjä Z-IETD-FMK. Nämä tulokset osoittavat, että kaspaasi-3, kaspaasi-8, ja PARP aktivoidaan kautta DR-välitteisen signaloinnin aikana CTS: n indusoiman apoptoosin.

(A) mRNA: n tasoja TRAIL, DR5 ja Fas havaittuna qRT-PCR: llä . (B) Western blot-analyysi ulkoinen tie liittyviä tekijöitä. SiHa-soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden CTS 24 tuntia. (C) Western blot analyysi vaikutuksista CTS esikäsittelyn jälkeen yleisen kaspaasiestäjä Z-VAD-FMK tai kaspaasi-8-estäjä Z-IETD-FMK SiHa- soluissa.

Down-regulation of E6 ja E7-geenit parannettu CTS aiheuttaman apoptoosin

sen tutkimiseksi, CTS-aiheuttaman apoptoosin voisi vaikuttaa E6 /E7 tasoilla, E6 /E7 siRNA transfektoitiin ja käsiteltiin CTS. Apoptosis aktivoivat proteiinit kuten kaspaasi-3, kaspaasi-8, ja PARP oli enemmän lohkaista E6 /E7 siRNA transfektio ja CTS hoito (Kuva 7). p-pRb ekspressiotaso aleni E6 /E7 siRNA transfektoitujen SiHa soluja verrattuna ohjata siRNA transfektoituja soluja. Kuitenkin p53 ekspressiotaso ei muuttunut (kuvio 7). Nämä tulokset osoittavat, että CTS voisivat tukea apoptoosin induktio kautta alas-säätely E6 /E7-mRNA ilmaisuja.

Western blot-analyysi apoptoosin liittyvät tekijät transfektion jälkeen ohjaus siRNA tai E6 /E7 kohdistaminen siRNA.

keskustelu

päätavoitteena Tutkimuksemme oli vahvistaa syöpälääkkeen tehoa ja niihin liittyvien mekanismien CTS ihmisen kohdunkaulan syöpäsoluja. CTS uute esti kohdunkaulasyövän soluproliferaation HPV-positiivisten SiHa ja CaSki soluja. Sytotoksinen teho CTS HPV-16-positiivisia SiHa-soluissa oli hieman parempi kuin sen tehoa CaSki-soluissa (kuvio 2). Tämä vaikutus saattaa johtua siitä, että määrä HPV-genomin kopiota CaSki-soluissa on suurempi kuin SiHa-soluja [24]. Tämä havainto viittaa siihen, että kokonaismäärä HPV kappaleena solut voivat ovat vaikuttaneet niiden alttiutta proapoptoottiset vaikutuksia CTS [24]. Lisäksi osoitimme, että CTS alassäädetty ekspressiotasot onkogeenien E6 ja E7 HPV-16-positiivisia solulinjoja. Kuten odotettua, joka perustuu vähentynyt eks- E6, olemme vahvistaneet, että p53: n ekspressio lisääntyi annoksesta riippuvaisella tavalla. Mielenkiintoista, vähentynyt ilmentyminen E7 ei liittynyt muuttunut pRb ilme; kuitenkin, p-pRb väheni annoksesta riippuvaisella tavalla CTS (kuvio 4B). Tämä tulos muistutti aiemmat raportit osoittavat, että esto E7 johti pienentyneeseen fosforylaatioon pRb muuttamatta yleistä pRb proteiinin ilmentymisen [20].

CTS uute sisältää useita fenoliyhdisteiden (kuvio 1). Klorogeenihappoa on läsnä korkein pitoisuus joukossa. Klorogeenihappoa on raportoitu olevan syövänvastainen, antioksidantti, ja diabeteslääkkeet vaikutukset [14, 25-26]. Lisäksi klorogeenihappoa on toinen tärkeä bioaktiivisen komponentin kahvin jälkeen kofeiini [25]. Klorogeenihappoa stimuloi glukoosin kuljetuksen L6 luustolihasten kautta AMPK aktivointi, joka osaltaan myönteisiä vaikutuksia diabetekseen [25]. Lisäksi klorogeenihappoa on antioksidantti, joka voi hidastaa release glukoosia verenkiertoon aterian jälkeen [26]. Lisäksi, klorogeenihappoa voi aiheuttaa solujen DNA-vaurioita ja apoptoosin keuhkosyövän soluja ilman vaikutusta normaalin keuhkojen fibroblasteista [14]. Kuitenkin syövän vaikutukset klorogeenihappoa kohdunkaulan syöpäsolut ei ole kattavasti tutkittu. Kahvihappo hapot ovat monissa luonnon kasveja [27] ja on osoitettu tukahduttaa kasvaimen kasvua tuumorin solujen proliferaatiota ja lisäämään antioksidantti [28]. Aiemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että kahvihappo hapot estivät proliferaatiota, tarttuvuus, ja muuttoliike A549 ihmisen keuhko- syöpäsoluja ja HT29-D4 koolonsyöpäsoluihin [29]. Lisäksi, hesperidiini, naringetiini ja kversetiiniä on raportoitu olevan anti-syöpä vaikutuksia useissa syöpäsolutyyppien [16-17, 30-31].

Apoptoosi välittää ulkoisen ja sisäisen polkuja. Luontainen reitin välittyy mitokondrion ulkokalvon läpäiseväksi (MOMP) ja sytokromi c vapautumista mitokondriot sytoplasmaan [32-33]. Sytosoliin, sytokromi c indusoi kokoonpanon apoptosome, joka sisältää sovittimen proteiini Rahastolla-1 ja apoptoosin aloittamiseksi proteaasi kaspaasi-9. Apoptosome muodostuminen aktivoi kaspaasi-9, joka aktivoi efektori kaspaasien [34]. Ulkoista reitti vastaanottaa signaaleja sitoutumisen kautta solunulkoisen proteiinin ligandien proapoptoottiset DR: sijaitsee solun pinnalla [23]. Vaikka useat DR: on kuvattu, keskityimme Fas (CD95) ja DR5 ja niiden ligandit, kuten Fas-ligandin (Fas L) ja TRAIL [35]. DR: on solunsisäinen kuolemadomeenille joka rekrytoi adaptoriproteiineja ja kaspaasi-8 [36]. Sitovat kuoleman ligandin DR johtaa muodostumiseen kuoleman aiheuttavia signalointikompleksiin (DISC), joka koostuu kuoleman reseptorin, FADD ja kaspaasi-8 [37]. DISC aktivoi alavirran signalointiryöpyn johtaen apoptoosin [38-40]. Olemme tutkineet, jotka reitit ovat mukana indusoiman apoptoosin CTS SiHa- kohdunkaulan syövän soluja. Vaikka luontainen polku liittyvät tekijät eivät vaikuttaneet CTS hoito (S1 kuvio), ekspressiotasot ulkoinen tie liittyvät tekijät, kuten Fas, DR5, TRAIL, ja kaspaasi-8, vaikuttivat CTS käsittely (kuvio 6).

tulokset osoittavat, että CTS on syvällinen syövän vastaisen vaikutuksen kohdunkaulan syövän soluja. Tämä on ensimmäinen osoitus, että kyky CTS ekspression inhiboimiseen HPV-16 E6 ja E7 onkogeenien ja apoptoosin, jota välittää ulkoinen tie kohdunkaulan syövän soluissa. Kuitenkin lisätutkimuksia tunnistaa erityinen yhdisteiden CTS vastaa sen syöpää ehkäisevistä vaikutuksista.

tukeminen Information

S1 Kuva. Vaikutukset CTS mitokondrion kalvon potentiaalia ja sytokromi C vapautumisen SiHa kohdunkaulan syöpäsoluja.

(A) Ero JC-1 värejä analysoitiin virtaussytometrialla. JC-1 aggregaatit (oranssi) ovat tyypillisiä terveitä soluja, kun taas JC-1 monomeerejä (vihreä) ovat tyypillisiä apoptoottisten solujen. (B) Western blot -analyysi anti-apoptoottisten tekijöiden Bcl-2 ja Bcl-x L, pro-apoptoottinen tekijä Bax ja sytokromi C SiHa- kohdunkaulan syövän soluja. SiHa soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden CTS 24 h.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0150235.s001

(TIF) B

Kiitokset

Tämä tutkimus oli tukee perus-ohjelman (2015R1A2A2A09001137) ja National Research Foundation of Korea (NRF). (https://www.nrf.re.kr/nrf_eng_cms). D. Y. Yoon tukivat osittain Priority tutkimuskeskuksen Program (2012-0006686).