Krooninen sairaus

tiivistelmä

Immunology perustuvat toimet on ehdotettu lupaavana parantava mahdollisuus tehokkaasti hyökätä postoperatiivisen minimaalinen jäljellä tauti ja etäinen metastaattinen lokalisoinneissa eturauhasen kasvaimia. Olemme kehittäneet kimeerisen antigeenin reseptori (CAR) rakentaa kohdistaminen ihmisen prostataspesifisen kalvo antigeenin (hPSMA), joka perustuu uuteen ja suuri affiniteetti tiettyyn mAb. Siirtomenetelmänä, käytimme viime sukupolven lentivirusvektoreita (LV), joka kantaa synteettinen kaksisuuntainen promoottori kykenee vahva ja koordinoitu ilmentymisen CAR molekyylin, ja bioluminoivaa reportterigeeni, jotta seuranta transgeenisten T-solujen jälkeen

in vivo

adoptiovanhemmat siirto. Kaiken kaikkiaan olemme osoittaneet, että CAR-ilmentäviä LV tehokkaasti transdusoiduissa lyhytaikaisia ​​aktivoitu PBMC, joka puolestaan ​​oli helposti stimuloidaan tuottamaan sytokiineja ja kohdistamaan asiaan sytotoksisen aktiivisuuden sitoutuminen PSMA

+ eturauhaskasvainsoluissa. Kun

in vivo

siirto kasvaimia omaavilla hiirillä, CAR-transdusoidut T-solut kykenivät täysin hävittämään levitetään neoplasia useimmissa hoidetuista eläimistä, mikä tukee kääntämistä tällaisen lähestymistavan kliinisessä ympäristössä.

Citation: Zuccolotto G, Fracasso G, Merlo A, Montagner IM, Rondina M, Bobisse S, et al. (2014) PSMA-Specific CAR-Engineered T Cells poistamista Disseminated Eturauhassyöpä prekliinisissä tutkimuksissa. PLoS ONE 9 (10): e109427. doi: 10,1371 /journal.pone.0109427

Editor: Natalia Lapteva, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 27, 2014; Hyväksytty: 1. syyskuuta 2014; Julkaistu: 03 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Zuccolotto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tukevat avustuksia Italian Association for Cancer Research (AIRC, IG-13121, ja Special Program Molecular Clinical Oncology 5 per mille ID 10016 AR) ja Padovan yliopisto, ”Progetti Strategici di Ateneo 2011” AR. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Adoptive soluterapian modifioimattoman ja

ex vivo

laajennettu T-solujen on osoittautunut tehokkaaksi vastaan ​​eri kasvain yhteisöjä, erityisesti melanooman ja EBV-kasvainten [1]. Nykyään geneettisen muunnoksen T-solujen voi antaa uuden kasvaimeen kohdistaminen ominaisuudet luonnossa esiintyvien lymfosyyttien voittamaan siten riippuvuus komponenteista endogeenisen immuunijärjestelmän.

Vaikka transduktion antigeenispesifisten TCR voi ohjata T-solujen toiminta perustuu samaan tunnustamista ominaisuudet, Kimeeriset antigeenireseptorin (CAR) tekniikka on potentiaali antaa T-solujen kanssa edullisia ominaisuuksia vasta-aineen, nimittäin spesifisyys, affiniteetti ja mahdollisuus kohdistaa ei-proteiini antigeenejä [2]. Lisäksi ainutlaatuinen molekyylin CAR tarjoaa joitakin toimenpiteitä toimia kasvaimen immuunijärjestelmän veronkierron strategiat: se vapauttaa T-solu tunnistaa ja aktiivisuuden MHC rajoitus ja ilmaisun, ja voi välittää kostimulatorista signaalia kautta solunsisäisiin.

terapeuttinen teho CAR T-solut ovat jo raportoitu potilailla, erityisesti kroonista lymfaattista leukemiaa (KLL) ja akuutti lymfaattinen leukemia (ALL) [3] – [6] kanssa erittäin lupaavia tuloksia eli taudista vapaan eloonjäämisen ja täydellinen hematologisten ja molekyylitason vasteet jopa henkilöillä, jotka eivät kaikki aikaisemmat tavanomaiset hoidot. Kuitenkin, hematologiset maligniteetit, erityisesti B-solujen alkuperä, voidaan pitää ihanteellinen kohde immunoterapeuttista lähestymistapoja [7]. Itse asiassa nämä pahanlaatuiset solut tarjoavat luonnollisesti kostimulatorista reseptoriligandeja ja samaa fysiologinen osastoa adoptiivisesti siirrettiin T-soluja. Lopuksi poistaminen normaalien B-solujen liittyvät ei hengenvaarallisia haittavaikutuksia, joita voidaan kliinisesti hoitaa laskimoon immunoglobuliini annon.

Käänteisesti kiinteä kasvain hoito on edelleen suuri haaste ja pitäisi parantaa olipa kyse kliinistä tehoa ja turvallisuutta. Osittainen onnistumisia koettiin vastaan ​​neuroblastooma käyttämällä GD2-erityisiä CAR T-soluja ilman esivalmistelun hoito, virtuaalinen sivuvaikutusten puuttuminen [8], [9]. Sitä vastoin mitään kliinisiä vasteita tallennettiin infuusio T-solujen ohjataan vasten folaatin reseptorin munasarjasyöpäpotilailla potilailla [10], eikä suhteessa karboksi-anhydrase IX (Caix) munuaissolukarsinoomassa potilaille [11], vaikka asiaa ”on -kohde, off-kasvain ”myrkyllisyys osoituksena jälkimmäisessä tapauksessa. Saadut kokemukset kokemukset osoittavat, että määritelmä kohdeantigeeninä turvallisuuskysymyksiä, ja pysyvyys ja kasvaimen itseohjautuva kapasiteetti infuusiona solut ovat erityisen kriittisiä onnistuneen hoidon.

käsiteltiin joitakin näistä kysymyksistä suuntaamalla eturauhasen kasvain syöpäsolut kanssa T-solujen muokattu ilmentämään CAR spesifinen ihmisen eturauhasen-erityinen kalvo antigeenin (hPSMA).

eturauhasen kasvain on vakava kliininen kokonaisuus, jossa arvioidaan 233000 uutta tapausta ja 29480 kuolemantapausta Yhdysvalloissa vuonna 2014 [12], jossa on tällä hetkellä vain lievittävän hoitoja hormoniresistentti ja metastaattisen muotoja [13]. Näille potilaille, immunoterapian on osoittautunut pätevä vaihtoehto perustuu rokotuksen muokattu koko eturauhasen tuumorisoluissa (GVAX [14]) tai PBMC esittämällä asiaa eturauhasen antigeeni (Sipuleucel-T [15]). Mitä adoptiovanhemmat soluterapia lähestymistapoja, prekliiniset tutkimukset ovat rohkaisevia tuloksia [13], [16], [17] ja kliininen arviointi on meneillään (kliiniset kokeet numero NCT01140373, NCT01929239, NCT00664196; www.clinicaltrials.gov). Tässä skenaariossa PSMA voi edustaa sopiva kohde ja itse asiassa se on tällä hetkellä hyväksi sekä kuvantamis- ja hoitotarkoituksiin. Erityisesti PSMA ekspressiotasot erottaa normaali ja syöpä- eturauhaskudokset, ja rinnakkain Gleason pisteet eturauhassyövän [18]. Mielenkiintoista on, että PSMA ekspressioon liittyy uudissuonittumisen useita kasvaimen yksiköitä, jolloin harkitaan lisäksi angiogeneesin vastaista vaikutusta.

Tässä raportoimme suunnittelu CAR vastaan ​​hPSMA perustuu uuteen ja korkean affiniteetin erityisiä mAb [19], ja fenotyyppinen ja toiminnallisen kuvauksen T-body-hPSMA sekä

in vitro

ja

in vivo

. Transduktioon, käytimme lentivirusvektorilla kuljettaa kaksisuuntaisen promoottorin, joka ohjaa samanaikaisesti ilmentymisen CAR-molekyylin ja toimittaja bioluminescent geenin. Tämän ansiosta seurantaa infuusiona T-solujen ja siten suora korrelaatio hoitotulokseen kanssa pysyvyys ja itseohjautuva kapasiteetti T-solujen. Kaiken CAR transdusoimattomien T-solut eivät ainoastaan ​​kohdistu merkityksellinen paikallista alueellista terapeuttista aktiivisuutta, mutta myös kokonaan hävittää levitetään neoplasia useimmissa hoidetuista eläimistä. Nämä tulokset tukevat voimakkaasti käännöksen tällaisen lähestymistavan kliinisessä ympäristössä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Seuraavat solulinjat käytettiin tässä tutkimuksessa: LNCaP ja PC3 , ihmisen eturauhasen sinoomasolulinjoja; Jurkat, ihmisen T lymfoblastileukemian ja 293 T [20], ihmisen alkion munuaisen solulinjassa. PC3-PIP solulinjaa, jotka ilmentävät stabiilisti ihmisen PSMA (hPSMA) [21] oli jalomielinen lahjoitus tohtori Warren Heston; LNCaP-solulinja saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). LNCaP, PC3, PC3-PIP ja Jurkat-soluja pidettiin RPMI 1640 -elatusaineessa (EuroClone, Milano, Italia), kun taas DMEM väliaineessa (Biochrom AG, Berliini, Saksa) käytettiin 293 T-solujen; sekä media täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco BRL Paisley, UK), 2 mM L-glutamiinia, 10 mM HEPES, 100 U /ml penisilliiniä, ja 100 U /ml streptomysiiniä (kaikki yhtiöltä Lonza, BioWhittaker, Basel , Sveitsi), 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä.

Anti-hPSMA CAR sukupolven

CAR vastaan ​​hPSMA antigeeni sisältää täydellisen sekvenssin anti- hPSMA scFv johdettu anti-hPSMA D2B hybridooma [19]. Tämä sekvenssi kloonattiin monikloonauskohtaan (MCS), ja pSecTag2A-vektoriin (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Milano, Italia). MCS: n pSecTag2A plasmidin käsittää kahden sekvenssin: 5 ’, hiiren Ig kappa-kevytketjun leader-sekvenssi V-J2-C ja 3’ Myc Tag järjestyksessä. Siten johtaja-ScFv-myc-sekvenssi käytettiin CAR sukupolvi. Leader-ScFv-myc-fragmentti monistettiin PCR: llä ja insertoitiin pBS SKII konstrukti (Invitrogen). Osa CD28 (emäkset 438-759), ja CD3ζ intrasellulaarisen domeenin (227-563 alue), jotka on molemmat valmistettu cDNA EBV-specific CD4

+ T-solujen [22], fuusioitiin PCR: llä ja insertoidaan sitten pBS SKII vektorin alavirran Leader-ScFv-myc fragmentti. Tämä vektori sitten sekvensoitiin Centro Ricerca Interdipartimentale Biotecnologie Innovative (CRIBI) Padovan yliopisto, Italia. Anti-hPSMA CAR sekvenssi lopulta subkloonattiin pcDNA3.1-vektoriin (Invitrogen). Tarkistaa, kyky ajaa ilmentymisen CAR-molekyylin membraanin, tätä vektoria käytettiin transfektoimaan 293 T-soluja käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

LV plasmidit ja lentivirus valmistelu

seuraavat lentiviral pakkaus vektoreita käytettiin: pMDLg /pRRE, pRSV-Rev, pMD2.VSVG ja pADVantage, kaikki ystävällisesti toimitti tri L. Naldini (San Raffaele, Milano, Italia). Siirto vektori # 945.pCCL.sin.cPPT.SV40ployA.eGFP.minCMV.hPGK.deltaLNGFR.Wpre on itsestään inaktivoiva (SIN) HIV-johdettu vektori [23], joka kuljettaa minCMVPGK erilaiset kaksisuuntaisen ajava promoottori samanaikainen ilmaisu kahden geenien antisense-orientaatiossa. Siirto vektoreita, joita käytetään tässä tutkimuksessa anti-hPSMA CAR-sekvenssi (saatu PMA-T-elimen vektori) kontrollin alaisena hPGK promoottorin, ja eGFP (tehostettu vihreä fluoresoiva proteiini) tai tulikärpäsen lusiferaasi (fluc) reportteri geenejä valvontaa minCMV. PMA-T-runko vektori ja fluc sekvenssi syntetisoitiin mukaan GeneArt, Life Technologies (Regensburgin, Saksa). Lentiviruksen tuotanto 293-T-soluja on kuvattu aiemmin [23]. Lentivirusvektoria koodaavat vain fluc [24] käytettiin transdusoimaan PC3-PIP soluissa.

Western blot-analyysi

293 T-soluja, transfektoimattomia tai transfektoitu pcDNA3.1-CAR, hajotettiin puskurissa, joka sisälsi 50 uM Tris-HCI, pH 6,8, 2% natriumdodekyylisulfaattia (SDS), 2% β-merkaptoetanolia, 10% glyserolia, ja 0,1-0,05% bromifenolisinistä (al Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA ) proteiinit erotettiin 10% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Immobilion-P, Millipore, Bedford, MA, USA). Membraani blokattiin 5% rasvatonta maitoa (Sigma-Aldrich) TBS: ssä ja 0,05% Tween 20, jota seuraa inkubaatio primaarisen vasta-aineen (hiiren anti-c-Myc-mAb, 1:1000, Sigma-Aldrich), yhden tunnin ajan huonelämpötila. Kolmen 10-minuutin pesua PBS-Tween, HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG sekundääristä vasta-ainetta (laimennettu 1:10000, Amersham, Milano, Italia) lisättiin yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa maidossa. Kalvo kehitettiin käyttäen SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, IL, USA) ja visualisoitiin käyttäen kemiluminesenssi. Signaalin voimakkuus mitattiin käyttäen Bio-Rad XRS kemiluminesenssidetektiolla järjestelmän (Life Science Group, Milano, Italia).

Jurkat solun transduktio

arvioimiseksi toimivuutta LV vektoreiden, Jurkat-soluja inkuboitiin virus- supernatantin (hPSMA /eGFP LV CAR tai hPSMA /Luciferase LV CAR) 15 tunnin ajan, kun läsnä oli 8 ug /ml protamiinisulfaattia (Sigma-Aldrich). Virtaussytometria ja Bioluminescence (BLI) analyysit tehtiin eri ajankohtina lähettää transduktion arvioida CAR ja eGFP ilmaisun tai lusiferaasiaktiivisuutta.

T-elimet sukupolven

tuottaa T-elimissä, PBMC terveistä luovuttajista aktivoitiin 48 tuntia OKT-3 (50 ng /ml; Ortho Biotech Inc., Raritan, NJ, USA) ja ihmisen IL-2 (hIL-2, 300 U /ml; Proleukin, Novartis Pharmaceuticals, Horsham, UK ). T-solut infektoitiin sitten virussupernatanttia 18 tuntia 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, läsnä ollessa protamiinisulfaattia (40 ug /ml; Sigma-Aldrich) ja hIL-2 (500 U /ml ). Sitten supernatantti muuttaa tuoretta täydellistä elatusainetta, joka sisälsi hIL-2 (100 U /ml). Seitsemänkymmentä kaksi tuntia myöhemmin PBMC analysoitiin CAR ja eGFP ilmaisun, ja lusiferaasin aktiivisuuden. PBMC kutsutaan T-body-hPSMA /eGFP ja T-body-hPSMA /fluc kun transdusoitiin hPSMA /eGFP LV CAR tai hPSMA /lusiferaasia LV CAR, vastaavasti. T-elimet stimuloitiin uudelleen kerran viikossa säteilytettyä (60 Gy) PC3-PIP klo 10:01 suhteessa. Täydellistä alustaa tuoretta IL-2 täydennettiin kahdesti viikossa.

Vasta-aineet

CAR-ilmentäviä soluja leimattiin anti-c-myc-mAb: n (klooni 9E10, Sigma-Aldrich) tai isotyyppikontrolli (hiiren lgG1, Southern Biotech, Milano, Italia), jonka jälkeen sekundääristä vasta-ainetta (PE-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG, Southern Biotech). Solunpintamarkkereiden leimattiin käyttäen Apc-, FITC- tai PE-konjugoiduilla vasta-aineilla CD4, CD8, CD57, CD27, CD28, CD62L (BioLegend, San Diego, CA, USA), CCR7 (eBioscience, San Diego, CA, USA) , ja suhteellinen isotyyppikontrolleja ostetaan samat yhtiöt.

Sytotoksisuusmääritvs

sytotoksinen aktiivisuus T-body-hPSMA /eGFP ja T-body-hPSMA /fluc arvioitiin standardin 4 h

51Cr-release assay kuten aiemmin raportoitu [25], eri ajankohtina transduktion jälkeen. PC3, PC3-PIP ja LNCaP käytettiin kohdesoluihin.

Sytokiinien vapautuminen määrityksissä

Arvioidaan IFN-γ tuotantoa, ELISA IFN-γ Screening Set (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) käytettiin, mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 1 x 10

6 T-soluja ympättiin 1 x 10

6 kohdesoluja (PC3 tai PC3-PIP) kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaisilla pyöreäpohjaisilla levyillä. Sytokiinieritys mitattiin 12 tunnin kuluttua inkubaation käyttäen T-elinten eri vaiheissa erilaistumista. Negatiiviset ja positiiviset kontrollit edustivat trandusoidun PBMC ja T-elimet stimuloimattomissa tai käsiteltiin 40 ng /ml PMA: ta ja 4 ug /ml Ionomycin (Sigma-Aldrich), tässä järjestyksessä. Supernatantit analysoitiin sitten VICTOR X4 (PerkinElmer, Zaventem, Belgia).

Hiiret ja

in vivo

kokeita

In vivo

kokeissa mukana 6 8 viikon ikäisiä uroksia SCID, rag2

– /- /yc

– /- ja NOD /SCID-hiirten (Charles River Laboratories, Calco, Como, Italia), joka pidettiin erityisen taudinaiheuttajista vapaat eläin laitos Department of Surgery, Oncology ja Gastroenterology, Padovan yliopisto (Italia). Eläimiä pidettiin kanssa 12-tunnin valo /pimeä sykli, lämpötilan (22 +/- 1 ° C) ja kosteus (55 +/- 5%) valvottuun tilaan. Kaikki hiiret saivat vapaasti vettä ja huolto ruokavalio. Kaikki häkeissä sijoitettu jopa 6 eläimiin ja sisälsi lastuja ja pahviputkeen ympäristön rikastamiseen. Menettelyt, joissa käytetään eläimiä ja niiden hoito on sopusoinnussa vakiintuneiden ohjeiden, jotka noudattavat kansallisia ja kansainvälisiä lakeja ja politiikkaa (DL 116/92 ja sitä seuranneet yleiskirjeet), ja kokeellinen protokolla (nro 7/2012) hyväksyi paikallinen eettinen komitea Padovan yliopisto (CEASA). Aikana

in vivo

kokeissa eläimiä kaikissa koeryhmään tutkittiin päivittäin lasku liikunnan ja muiden taudin oireita; vakavasti sairaita eläimiä (laihtuminen yli 15%, uneliaisuus, ryppyiset hiukset, alhainen lämpötila) tapettiin hiilidioksidilla yliannostukseen.

Winn määrityksessä.

Winn määritys suoritettiin injektoimalla s.c. SCID-hiirten kanssa 5 x 10

6 PC3 tai PC3-PIP kasvainsoluja eläintä kohti sekoitettuna joko RPMI tai T-body-hPSMA /eGFP soluja (5 x 10

6 /hiiri; 6 hiirtä /ryhmä). Kasvaimen tilavuus laskettiin seuraavalla kaavalla: V (mm

3) = (d

2 * D) /2, jossa d (mm) ja D (mm) ovat pienimmän ja suurimman kohtisuorassa kasvaimen halkaisija, vastaavasti, joka arvioidaan mittaamalla tulkilla.

Loco alueiden hoitoon.

arvioimiseksi terapeuttista potentiaalia paikallista alueellista hoitoa, SCID hiiriin ruiskutettiin sc 5 x 10

6 PC3-PIP-soluissa. Kun kasvaimet tulla kouraantuntuva noin neljä päivää myöhemmin hiiret satunnaistettiin kontrolliryhmään (ne jätetään hoitamatta) tai koeryhmän (ne injektoitiin intralesionaalisesti kanssa CAR-transdusoituja T-solut 72 tuntia transduktion jälkeen; 6 hiirtä /ryhmä). Kaksi ensisijaista tulokset analysoitiin: kasvaimen kasvua seurattiin ajan kuluessa mittaamalla tulkilla ja kokonaiselinaika tallennettiin.

systeeminen hoito ihonalaisen eturauhasen kasvaimia.

arvioimiseksi terapeuttista aktiivisuutta systeemisen T -body hallinto, SCID-hiiriin injektoitiin sc 5 x 10

6 PC3-PIP-solujen ja 4 päivää myöhemmin he saivat i.v. T-body-hPSMA /fluc (10 x 10

6 /hiiri) 72 tuntia tai 5-6 viikkoa transduktion (n = 6); käsittelemättömien eläinten toimi kontrolliryhmässä (n = 6). T-solujen biojakaantuminen arvioitiin bioluminenssina kuvantaminen (BLI) samoissa olosuhteissa, paitsi että hiiriin injektoitiin sekä PC3-PIP tai PC3 kasvainsoluja oikealla ja vasempaan kylkeen, vastaavasti.

Disseminoitunutta eturauhasen kasvain malli.

perustaa malli levitetään eturauhasen kasvain, SCID, rag2

– /- /yc

– /- ja NOD /SCID-hiiriin ruiskutettiin iv joissa on eri määrä (välillä 1 x 10

5-5 x 10

6) of fluc Transdusoimattomia PC3-PIP-solut (6 hiirtä /ryhmä). Kasvaimen siirteen ja kasvua arvioitiin BLI. Lisäksi kasvaimettomina SCID, rag2

– /- /yc

– /- ja NOD /SCID-hiiriin injektoitiin 20 x 10

6 T-body-hPSMA /fluc, arvioida niiden kohtalon BLI (6 hiirtä /ryhmä).

Adoptive immunoterapian kokeita.

omaksutun immunoterapiaa kokeissa bioluminoivia PC3-PIP injektoitiin iv NOD /SCID ja rag2

– /- /yc

– /- hiirille (1 x 10

5 /hiiri). Neljä päivää myöhemmin, eläimet satunnaistettiin kontrolliryhmään (ne jätetään hoitamatta) tai koeryhmässä, jossa he saivat i.v. 20 x 10

6 T-body-hPSMA /eGFP 3 kertaa viikossa (6 hiirtä /ryhmä). Kasvaimen kasvua seurattiin viikoittain BLI, ja selviytyminen kirjattiin.

Quantitative Bioluminescence

Quantitative BLI on tehokas tekniikka, jonka avulla saada useita kuvia pituussuunnassa ja, samaan aikaan, vähentää eläinten numerot. Bioluminesenssi kuvia kerättiin kanssa IVIS Lumina II Imaging System (PerkinElmer). Kymmenen 15 minuuttia ennen kuvantaminen, eläimet nukutettiin isofluraani /happi- ja annettiin i.p. 150 mg /kg D-lusiferiini (PerkinElmer) PBS: ssä. Kolme hiirtä oli kuvattu samanaikaisesti valotusaikaa vaihtelee 0,5-3 min. A12 x 12 cm näkökenttä ja matala, keskitaso tai korkea laatikointi tasot sovellettiin herkkyyden maksimoimiseksi ja spatiaalinen resoluutio. Ventral kuvat saatiin kullekin eläimelle ja määrällisesti läpi kiinnostavan alueen (ROI). Living Image Software (PerkinElmer) käytettiin hankkimaan ja määrällisesti bioluminisenssimääri- kuvantamisen aineistoja.

sy- tofluorimetrisillä arviointi hPSMA ilmaisun kasvavilla kasvaimissa

Tuumorisolut suspensioita saatiin pilkkomalla entsymaattisesti 270 yksikköä /ml DNaasi, 35 U /ml hyaluronidaasia, ja 200 U /ml kollagenaasi-puskuria (kaikki Sigma-Aldrich). Sen jälkeen, kun 30-min inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, solut vietiin läpi 70 um: n solusiivilän (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Näytteet värjättiin sitten 4 ° C: ssa, jossa on hiiren anti-hPSMA mAb [19], jota seuraa PE-konjugoidun anti-hiiri-lgG1 sekundaarista vasta-ainetta (BioLegend) ja analysoitiin FACSCalibur (BD) -virtaussytometriä. Tiedot arvioitiin FlowJo ohjelmisto (TreeStar Inc., Olten, Sveitsi).

Tilastollinen

Kaplan-Meier tuote-raja-menetelmä suoritettiin arvioida eloonjäämiskäyrien, ja vertailu selviytymisen välillä ryhmiä suoritettiin käyttäen log-rank-testi. Tilastolliset analyysit tehtiin kanssa Sigmaplot (versio 12.3) tilastopaketista.

Tulokset

Rakentaminen ja kehittää tehokas kaksisuuntaisen LV anti-hPSMA CAR ilmaisu

CAR sekvenssi suunniteltu, että koodattu seuraavat komponentit-kehyksen 5 ’ja 3’ päissä (Fig. 1A): johtosekvenssi, yhden ketjun vaihtelevan fragmentti (ScFv), uuden anti-hPSMA-vasta-aine IgGD2B [19], c-myc-tag-sekvenssin, ja CD28: n kostimulatorista molekyyliä, jotka liittyvät CD3ζ sekvenssin. Päätimme käyttää hyväksi tätä uutta anti-PSMA scFv (scFvD2B) rakentamiseen meidän CAR, koska se on hyvin houkutteleva ominaisuudet, erityisesti nanomolaarista affiniteettia kohde, joka on samanlainen kuin osoituksena koko J591-vasta-ainetta [19] . Lisäksi meidän scFvD2B osoittaa korkea spesifisyys ja tunnistaa eri epitoopin että tunnustettu J591 vasta-, joka arvioidaan kilpailu kokeet suoritettiin radio-immunoligands tai biotiinilla leimattujen vasta-aineiden ([19] ja tietoja ei näytetty).

(A) Anti-hPSMA CAR kartalla. EY: solunulkoinen domeeni; TM: transmembraanidomeeni; IC: solunsisäinen domeeni. (B) sy- tofluorimetrisillä profiilia CAR ilmentymisen transfektoiduissa 293-T-soluissa. 293 T-soluja transfektoitiin pcDNA3.1-vektori, joissa CAR-sekvenssin ja analysoitiin virtaussytometrialla 24 tunnin kuluttua (tumma viiva). Transfektoimattomissa solujen (harmaa juoni) toimi kontrollina. (C) CAR ilmaisun arvioituna Western-blottauksella 24 tuntia (rivi 1) ja 7 päivää (linja 2) lähettää 293 T-solujen transfektio. Negatiiviset kontrollit olivat pelkästään väliaineen (linja 3) ja transfektoimattomilla 293 T-solut (rivi 4). Rivi 5, molekyylipainomerkit. (D) Lineaarinen kartta rekombinanttivirusvektori sisälsi minCMVPGK kaksisuuntainen promoottori (22). Erityisesti reportterigeenin (eGFP tai Luciferase) on valvonnassa minCMV promoottorin, kun taas CAR-geeni on hallinnassa ja hPGK promoottorin. (E) transduktio Jurkat-solujen LV CAR anti-hPSMA /eGFP. Koekspressoimalla c-myc ja eGFP LV transdusoimattomien Jurkat-soluissa, kuten arvioitiin virtaussytometrialla. Pistekuvaajan raportoi tapahtumista aidatulla täydelliseen eläviä soluja; yli 90% soluista yhdessä ekspressoivat sekä c-myc ja eGFP. (F) transduktio Jurkat-solujen LV CAR anti-hPSMA /Luciferase.

Vasen paneeli

, c-myc lauseke (musta) Jurkat-soluissa 72 tuntia transduktion jäl- arvioituna virtaussytometrialla. Harmaa juoni edustaa isotyyppikontrollia.

Oikea paneeli

, arviointi lusiferaasiaktiivisuuden LV-transdusoiduissa Jurkat-soluja (2 x 10

5 /kuoppa) mukaan BLI.

arvioimiseksi kapasiteettia konstruktin ajaa reseptorin ekspressio että oikein asennettu solukalvon, anti-hPSMA CAR-sekvenssi kloonattiin pcDNA3.1 vektoriin ja tuloksena plasmidia käytettiin väliaikaisen transfektion 293-T-solut. Eri ajankohtina sen jälkeen kimeerisen reseptorin arvioitiin sy- tofluorimetrisillä ja Western blotting -analyysi (Fig. 1B ja 1C, vastaavasti), käyttäen anti-c-myc-mAb. Tulokset paljastaa, että auto oli oikein asennettu kalvo ja oli odotettu molekyylipaino (noin 60 kDa); CAR ilmentyminen oli jo havaittavissa 24 tuntia transfektion jälkeen, ja häviävät nopeasti seuraavina päivinä, koska ei ole valinnan vaiheessa (Fig. 1 C). Sen jälkeen CAR-sekvenssi insertoitiin LV kuljettaa kaksisuuntaisen promoottorin, joka mahdollisti transkription reportterigeenin (eGFP tai fluc) ylävirran minimaalinen promoottori minCMV, ilman että se vaikuttaa alavirtaan ekspressiota anti-hPSMA CAR tehokkaan hPGK promoottorin (kuvio . 1D). Arvioimaan toiminnallisuus lentivirusvektoreita, Jurkat-solut transdusoitiin LV CAR hPSMA /eGFP ja LV CAR hPSMA /fluc. CAR osoittautui erittäin ilmaistaan ​​jo 72 tuntia transduktion jälkeen, mistä on osoituksena suuri osa c-myc

+ solujen havaittiin virtaussytometrialla analyysi (Fig. 1 E ja 1 F). Erityisesti, CAR-ilmentävät solut olivat yli 90%, kun transdusoitu LV CAR hPSMA /eGFP (Fig. 1 E) ja enemmän kuin 60%, kun käytetään LV CAR hPSMA /fluc (Fig. 1 F,

vasen paneeli

). On huomattava, että kaksisuuntainen LV vektorit ilmestyi ajamaan ilmentymistä joko CAR ja toimittaja geenit hyvin tasapainoinen tehokkuus, mistä on osoituksena korkea intensiteetti eGFP signaalin (Fig. 1 E) ja asiaan Lusiferaasiaktiivisuutta (Fig. 1 F,

oikea paneeli

).

fenotyyppinen karakterisointi CAR transdusoimattomien T-solujen populaatioita

sukupolven T-solupopulaatioiden ilmentävät anti-hPSMA CAR, nopea laajeneminen protokolla kehitettiin . Optimaalinen tartunta aika perustettiin 48 tunnin kuluttua OKT3 aktivointia, koska tänä ajankohtana saimme prosentuaalisesti eniten CAR ilmentävien T-solujen (kuvio. 2A,

vasen paneeli

), ja vähemmän eriytetty fenotyyppi arvioituna korkean ilmentymisen CD27, CD28 ja CD62L markkereita (Fig. 2A,

Keski paneeli

). Myöhemmin laajennus protokolla mukana viikoittain -uudelleenstimulaation kanssa PC3-PIP soluja, jotka sallitaan nopea ja jatkuva lisääntyminen molempien T-body-hPSMA /eGFP ja T-body-hPSMA /fluc populaatioiden (Fig. 2A,

oikeassa paneelissa

).

(A) Aseta Transduktiomenetelmiä protokollan ja kasvun kinetiikka.

Vasen paneeli

, PBMC aktivoitiin OKT3 hetkellä 0 ja transdusoitiin samanaikaisesti (Td0), tai sen jälkeen 48-h (Td2) tai 72-h (Td3) tuntia. Virtaussytometria-analyysi c-myc: n ilmentyminen 72 tuntia infektion jälkeen.

Keski paneeli

raportoi ilmentymä CD27, CD28 ja CD62L kolmessa eri aktivointitilat /infektion raportoitu

vasen paneeli

.

Oikea paneeli,

laajennus T-body-hPSMA /fluc ja T-body-hPSMA /eGFP transdusoidut kuluttua 48 h aktivoinnin vastauksena viikoittain -uudelleenstimulaation kanssa PC3-PIP-soluissa. Trandusoidun PBMC käytettiin kontrollina. (B) Fenotyyppikuvaus ja CAR ilmaisun transdusoiduissa T-solujen stimuloitaessa.

Vasen paneeli

, Expression pinnan merkkiaineiden T-body-anti-hPSMA /fluc eri ajankohtina (3, 11 ja 18 päivää) transduktion, joka arvioidaan virtaussytometrialla. Tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta. Päällekkäiset tuloksia saatiin T-body-anti-hPSMA /eGFP.

Oikea paneeli,

prosenttiosuus c-myc

+ solujen LV CAR hPSMA /fluc ja LV CAR hPSMA /eGFP transduktoitu- T-solujen populaatioita eri ajankohtina lähettää transduktio. Kuviossa on esitetty keskiarvo +/- SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. (C) kinetiikka CD4 ja CD8 osajoukkoja transdusoiduissa T-solujen populaatioita. Expression of CD4 ja CD8 merkkiaineiden c-myc

+ – aidatulla T-body-hPSMA /eGFP

(vasen paneeli) B ja T-body-hPSMA /fluc (

oikea paneeli)

populaatiot eri ajankohtina lähettää transduktio, joka arvioidaan virtaussytometrialla. Tiedot ovat peräisin edustava koe kolmesta joka tuotti samankaltaisia ​​tuloksia.

Paremmin tilaa määrittäviä erilaistumisen CAR transdusoimattomien T lymfosyyttien infektion aikana, antigeeninen uudelleenstimulaatiot, ilmentäminen pintamerkkiaineita (CD62L, CD27, CD28, CCR7-, CD57) arvioitiin sy- tofluorimetrisillä analyysi. Seitsemänkymmentä kaksi tuntia transduktion jälkeen, kehittyvien profiili oli oleellisesti alussa efektori-T-soluja, kuten on esitetty korkean ilmentymisen CD62L, CD27 ja CD28, läsnäolo CCR7-positiivisten solujen ja alhaisen ilmentymisen CD57 (Fig. 2B,

vasen paneeli

). Sen jälkeen uudelleenstimulaatiot antigeenin kanssa, T-solut hankittiin väli- effektori ilmiasuun asteittain alas-modulaatiota CD62L, CD28 ja CCR7 ja lievästä kasvusta CD57 ilmentymisen (Fig. 2B,

vasen paneeli

). Mielenkiintoista, kun taas myöhempi kohtaaminen antigeenin johti laajentamiseen CAR ilmentävien väestöstä (Fig. 2B,

oikea paneeli

), kahtiajako voitiin havaita välillä laajenee T solualaryhmiä. Itse asiassa, kun taas CAR ekspressio oli lähes sama kuin sisällä CD4

+ ja CD8

+ T-solujen populaatioita heti infektion jälkeen, antigeeninen uudelleenstimulointi määritetään progressiiviseen kertymiseen CD8

+ T-solujen osajoukon vain, joka lähes kokonaan voitti CD4

+ T-solujen kuukausi yksi transduktion jälkeen (Kuva. 2C).

toiminnallinen luonnehdinta CAR ilmentävien T-solujen

CAR ilmaisu edellyttäen transdusoituun väestöstä kyky tunnistaa hPSMA antigeenin pinnalla eturauhassyövän solulinjoissa, ja välittää korkean ja spesifisen sytotoksisuuden (Fig. 3A). Itse asiassa sekä T-runko-hPSMA /fluc ja T-body-hPSMA /eGFP populaatiot hajotimme hPSMA-transfektoidut PC3-soluja, kun taas säästävät antigeeninegatiivista vastine; mikä tärkeintä, ne olivat myös kykenee tunnistamaan LNCaP kohdesoluja, jotka luonnollisesti harbor hPSMA antigeenin. Sytotoksisuus oli jo selvää, vaikkakin matalalla tasolla, 3 päivää transduktion jälkeen ja kasvoi maksimaalinen tasolla vain kerta kierroksen antigeenin direstimulaatioon, pysyy sen jälkeen vakiona jopa 2 kuukautta infektion jälkeen. Muut kuin kohdistamalla asiaankuuluva sytotoksista aktiivisuutta, CAR-transdusoidut T-solut eri erilaistumisen vaiheissa myös tuottanut suuria määriä IFN-γ vastauksena hPSMA ilmentävien kasvainsolujen (Fig. 3B ja 3C) vastaan, mutta ei hPSMA negatiivisen kontrollin soluissa. Negatiivisena kontrollina, infektoimattomat T-solut eivät tuottaneet IFN-γ, kun viljeltiin yhdessä PC3-solujen muokattu ekspressoimaan pinnan hPSMA antigeenin.

(A) lyyttistä aktiivisuutta T-body-hPSMA /eGFP ja T -body-hPSMA /fluc. Sytotoksisuus analysoitiin 3, 11 ja 60 päivää transduktion jälkeen; PC3, PC3-PIP ja LNCaP-soluja käytettiin kohdesoluina. Trandusoidun PBMC toimi negatiivisena kontrollina. Vuonna vasemmassa yläkulmassa kunkin paneelin prosenttiosuuksien c-myc

+ T-solut raportoidaan. Kuviossa on esitetty keskiarvo +/- SD 4 erillisen kokeen. (B) IFN-γ eritys upon antigeenin stimulaatiota. IFN-γ tuotantoa analysoitiin eri ajankohtina sen jälkeen PBMC transduktio stimuloimalla T-body-hPSMA /fluc kanssa PC3-PIP hPSMA

+ tai PC3 hPSMA

– syöpäsolun linjat. T-elimet stimuloimattomissa tai käsitelty PMA /Ionomycin edusti negatiiviset ja positiiviset kontrollit, vastaavasti. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin T-body-hPSMA /eGFP. (C) c-myc ilmentymistä T-body-hPSMA /fluc populaatioiden testattiin IFN-γ tuotantoa.

Analyysi terapeuttista tehoa anti-hPSMA T-elin hallinto vastaan ​​paikallinen eturauhasen kasvaimia

In vivo

terapeuttista tehoa CAR-transdusoitujen T-solujen eri erilaistumisen vaiheissa (72 tuntia tai 5 viikkoa transduktion jälkeen) oli alun perin arvioitiin käyttäen Winn määritystä (Fig. 4A). Erityisesti kun PC3-PIP kasvaimen solut ko-ruiskutettiin T-body-hPSMA /eGFP ei kasvaimen kasvua ei havaittu (kuvio. 4A,

vasen paneeli

) riippumatta erilaistumisen vaiheessa T-elinten . Toisaalta, T-solujen siirto ei vaikuta merkittävästi kasvua hPSMA-negatiivisten PC3 kasvainsoluja (Fig. 4A,

oikea paneeli

).

(A) Winn määritys. PC3-PIP (

vasen paneeli

) ja PC3 (

oikea paneeli

) tuumorisolut inokuloitiin s.c. SCID-hiirissä, yksin tai sekoitettuna 01:01 T-body-hPSMA /eGFP vastakkaisiin kylkiin samasta eläimestä. Kasvaimen kasvua seurattiin ajan kuluessa mittaamalla tulkilla.