Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kasvainsoluista tulevat riippuvaisiksi sekä aktivoitu onkogeenien ja proliferatiivinen ja pro-eloonjääntisignaaleja antamat epänormaali kasvain microenvironment. Vaikka lukuisia liukoisen tekijät on tunnistettu, jotka muovaavat välinen ylikuuluminen kasvainsolujen ja strooman, sitä ei ole osoitettu, miten onkogeeninen mutaatioita kasvainsoluissa muuttaa niiden vuorovaikutusta normaalien solujen kasvaimen mikroympäristössä.

Keskeiset havainnot

osoitti, että isogeenisissä HCT116 ja HKE-3-soluja, jotka eroavat toisistaan ​​vain läsnäolo KRAS alleeli, sekä stimuloivat makrofageja tuottamaan IL1B. Puolestaan ​​makrofagit parannettu Wnt signalointia, lisääntymistä ja selviytymistä sekä HCT116 ja HKE-3-soluissa, jotka osoittavat, että signalointi onkogeeninen Kras kasvainsoluissa ei vaikuta niiden vuorovaikutusta makrofaagien. HCT116-solut ovat heterotsygootteja β-kateniinin (HCT116

WT /MT), kätkeminen yksi villityypin (WT) ja yksi mutantti (MT) alleeli, mutta isogeenisiin linjat, jotka kantavat vain WT (HCT116

WT) tai MT β-kateniinin alleelin (HCT116

MT) on luotu. Osoitimme, että makrofagit edistetään Wnt-signalointi kuljettavat solut MT β-kateniinin alleeli, mutta ei HCT116

WT soluja. Tämän mukaisesti havainnon, makrofagien ja IL1B jättänyt vakauttaa Snail in HCT116

WT soluja, ja suojella näitä soluja TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Lopuksi osoitettiin, että HCT116-solut, jotka ilmentävät vallitsevaa negatiivista TCF4 (dnTCF4) tai HCT116-solujen vaimennettu Snail ei stimuloida IL1B tuotantoa makrofageissa, jotka osoittavat, että kasvaimen solut aktivoivat makrofageja kautta Wnt-riippuvaisen tekijän.

Merkitys

Tuloksemme osoittavat, että onkogeeniset β-kateniinin mutaatioita kasvainsoluissa, ja myöhempi aktivointi Wnt signalointia, paitsi laukaista solun sisäinen muutoksia, mutta on myös merkittävä vaikutus ylikuuluminen syöpäsolujen kanssa kasvaimeen liittyvä makrofagit.

Citation: Kaler P, Augenlicht L, Klampfer L (2012) aktivointi mutaatiot β-kateniinin koolonkarsinoomasoluissa Alter näiden välinen makrofageihin; merkityksestä Snail. PLoS ONE 7 (9): e45462. doi: 10,1371 /journal.pone.0045462

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 22 elokuu 2012; Julkaistu: 21 syyskuu 2012

Copyright: © Kaler et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat CA 111361 (LK), U54 CA 100926 (LA) ja P30-13330 NCI (National Cancer Institute (USA)). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Beta kateniinin (β-kateniinin) on E-kadheriinin sitova proteiini ja näin ollen sillä on tärkeä rooli solu-solu-adheesion [1]. Lisäksi se toimii efektori Wnt signalointia [2]. Koska Wnt signalointia β-kateniinin fosforyloituu GSK3p, jolloin sen ubikinaation ja sen jälkeen hajoamisen proteasomin [3]. Aktiivisuus β-kateniinin ohjataan tuumorisuppressorigeenin adenomatoottisen polypoosin coli (APC) ja inaktivoivat mutaatiot APC-geeni, joka estää β-kateniinin hajoamiseen, on havaittu, että suuri enemmistö satunnaista paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [4], [5] . Lisäksi noin 10% paksusuolen ja peräsuolen syöpiä mutaatioita GSK3p fosforylaatiokohta sijaitsee N-päässä β-kateniinin [6]. APC mutaatiot ja β-kateniinin mutaatiot ovat toisensa poissulkevia paksusuolen syöpä, koska ne molemmat johtavat vakauttamiseen β-kateniinin ja konstitutiivisen β-kateniinin /TCF transkriptionaalista aktiivisuutta.

HCT116-solut ovat heterotsygootteja β-kateniinin, kätkeminen yksi villityypin (WT) alleeli ja yksi mutantti (MT) alleelin inaktivaation SER45, yksi tähteistä fosforyloituu GSK3p, joka on usein mutatoitunut kasvaimissa [6], [7]. Isogeenisiin HCT116 solulinjoja, jotka kantavat vain WT tai MT alleeli on luotu tutkia roolia onkogeenisten β-kateniinin signalointi paksusuolisyövän [8], [9]. Kuten odotettua, poistetaan MT β-kateniinin alleelin HCT116-soluissa merkittävästi vähentää β-kateniinin /TCF-välitteisen transkriptionaalisen aktiivisuuden näissä soluissa. Kun koko tasot β-kateniinin olivat samanlaiset soluissa, joissa häiriöitä WT tai MT β-kateniinin alleelin inaktivaatio MT alleelin johti uudelleenjako β-kateniinin solukalvoihin liittyy soluliitos [8], [9]. Yllättäen ilmaus tyypillinen Wnt kohdegeenien, kuten c-myc, ei vähennetty siitä poistamista mutantti β-kateniinin alleeli, ja kasvu ominaisuudet näiden solujen vakio-olosuhteissa ei vaikuta merkittävästi

in vitro

[ ,,,0],8]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että mutaatiot β-kateniinin, aloittamisen lisäksi lukuisia solun sisäinen muutoksia, voi vaikuttaa myös vuorovaikutukseen kasvainsolujen komponenttien kanssa kasvaimen microenvironment ja siten edistää kasvainten kehittymistä

in vivo

.

raportoi äskettäin, että kasvainsolun peräisin oleva tekijä (t) aktivoitu makrofageja tuottamaan IL1B, joka puolestaan ​​inaktivoi GSK3p, nostivat fosforyloitumaton β-kateniinin ja kannustanut Wnt signalointi HCT116-soluissa [10]. Olemme osoittaneet, että makrofagien johdettuja tekijöitä stimuloitiin Wnt signalointia NF-KB-riippuvaisella tavalla [11]. Tämän mukaisesti konstitutiivisen aktivaation IKK2 suolen epiteelisolujen, joka on riittävä indusoimaan suoliston kasvaimia hiirissä, laukaisee liikkeelle makrofagien ja ilmaisu erilaisia ​​proinflammatoristen sytokiinien, mukaan lukien TNF: n ja IL1B [12], ja soluja, joilla on konstitutiivinen aktivointi IKK2 näytetä aktivoitu Wnt signalointia.

: HCT116 ja HKE-3-soluja verrattiin niiden kyvyn suhteen indusoida IL1B perifeerisen veren monosyyteissä (Mo). Kyky THP1 makrofagien ja IL1B aiheuttavan Wnt signalointia HCT116 ja HKE-3-soluissa (B), edistää klonogeeniset kasvu (C) ja suojaamaan TRAIL: n indusoiman apoptoosin (D) mitattiin.

osoitti, että makrofagi-johdettuja tekijöitä vakauttamiseksi Snail paksusuolen syöpäsoluissa [13], transkriptiotekijä, joka edistää invasiivinen ja metastaattinen fenotyypin induktion kautta epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) [14]. Snail on Wnt kohdegeenin [15], [16], mutta se on myös osoitettu olevan vuorovaikutuksessa β-kateniinin ja kostimuloida Wnt kohdegeenien [15] – [17], mikä osoittaa, monimutkainen vuorovaikutus Wnt signalointia ja Etana. Lisäksi, Snail säätelee kasvua ja selviytymistä kasvainsolujen, ja on yhdistetty muodostumista syövän kantasoluja [18]. Lisääntynyt Wnt signalointia ja vakauttamiseen Snail siis viittaavat vahvasti siihen, että makrofagi-johdettu tekijät lisäävät kantasolujen ominaisuuksia syöpäsoluja, jotka edistävät etäpesäkkeitä ja näyttää resistenssiä hoidon. Tämän mukaisesti, osoitimme, että makrofagi johdettuja tekijöitä suojattu syöpäsolujen TRAIL: n indusoiman apoptoosin [13].

V: isogeenisiin HCT116 solulinjat poistettuun WT (HCT116

MT) tai MT β- kateniinin alleelin (HCT116

WT) transfektoitiin TOP-LUC reportterigeenin ja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla IL1B tai viljeltiin THP1 makrofagien kuten on osoitettu. B: HCT116-soluja transfektoitiin NF-KB-reportterigeenin ja käsiteltiin TNF ja IL1B kuten on osoitettu.

Tässä osoitamme, että kyky HCT116-solujen stimuloivan makrofagien on täysin riippuvainen läsnäolo endogeenisen mutantti β-kateniinin ja myöhemmin vakauttamiseen Snail epiteelisoluissa, jotka vahvistavat hypoteesia, että hankinta onkogeenisten mutaatioiden suolen epiteelisolujen muuttaa vuorovaikutukseensa mikroympäristön. Osoitimme, että koolonkarsinoomasoluissa stimuloida makrofagien kautta tuote on Wnt kohdegeenin. Tuloksemme viittaavat siihen, että Snail säätelee tämän geenin ilmentyminen ja siten on keskeinen rooli välinen ylikuuluminen koolonkarsinoomasoluissa ja makrofagit.

V: Vanhempien HCT116-solut tai HCT116 kanssa poistettu WT tai MT β-kateniinin alleeli oli käsitelty TRAIL puuttuessa THP1 makrofagien tai IL1 kuten on osoitettu. B: laajuus apoptoosi määritettiin ää 4 itsenäisestä kokeesta. C: HCT116

WT ja HCT116

MT solut käsiteltiin TRAIL puuttuessa tai läsnä TNF ja laajuudesta apoptoosin määritettiin PI-värjäyksellä.

Tulokset

mutaatiot β-kateniinin, mutta ei kras, muuta paksusuolensyöpä soluinteraktiot makrofagien

raportoitu, että paksusuolen syövän soluja, kautta liukoinen tekijä, aktivoida makrofageja erittämään IL1B, mikä puolestaan ​​edistää β- kateniinin /TCF4 transkriptionaalista aktiivisuutta syöpäsoluissa ja stimuloi niiden kasvua [10]. Sen määrittämiseksi, onko hankkiminen onkogeenisen KRAS mutaatio kasvainsoluissa muuttaa niiden vuorovaikutusta makrofaagien, suoritimme kokeiluja HCT116 ja HKE-3-solut, isogeenisiin solulinjoja, jotka eroavat toisistaan ​​vain läsnäolo KRAS alleeli [19]. Osoitimme, että molemmat HCT116 ja HKE-3-solujen aiheuttama IL1B ääreisveren monosyyteissä, esiasteita kasvaimeen liittyvien makrofagit (Fig. 1A). Vastaavasti makrofagien ja IL1B stimuloidaan Wnt signalointia (Fig. 1 B), edistänyt kasvua (Fig. 1 C) ja suojattu HCT116 ja HKE-3 solujen TRAIL: n indusoiman apoptoosin (Fig. 1 D). Nämä tutkimukset osoittivat, että läsnäolo onkogeenisten KRAS kasvainsoluissa ei ole merkittävää vaikutusta niiden vuorovaikutus kasvaimeen liittyvien makrofagien.

A: B: HCT116

WT ja HCT116

MT-soluja käsiteltiin TRAILin puuttuessa tai läsnäollessa IL1B osoittamalla ja lokalisointi β-kateniinin määritettiin immunofluoresenssilla soluissa käsitelty TRAIL puuttuessa tai läsnä on IL-1β: n tai TNF kuten on osoitettu. B: laajuus kaspaasin 8 aktivaation ja pilkkominen PARP ja β-kateniinin määritettiin immunoblottauksella.

HCT116-solut ovat myös heterotsygootteja β-kateniinin, joka sisältää yhden villityypin (WT) alleeli yksi mutantti (MT) alleeli, jossa on 3-bp: n poistuman, joka eliminoi seriinitähde kodonissa 45 [7], jolloin β-kateniinin stabilointi ja aktivointi Wnt signalointia. Voit selvittää, onko läsnäolo aktivoitu, MT β-kateniinin kasvainsoluissa säätelee niiden vuorovaikutusta makrofaagien suoritimme kokeita HCT116 solut poistetaan joko WT (HCT116

MT) tai MT β-kateniinin alleelin (HCT116

WT) [8]. Isogeenisissä solulinjoja käsiteltiin IL1B tai viljeltiin kanssa THP1 makrofageissa. Kuten vanhempien HCT116-soluissa, makrofageissa ja IL1B aiheuttama Wnt signalointia HCT116

MT soluja (Fig. 2A). Sen sijaan, HCT116

WT soluja, mikä osoitti alempi Wnt signalointia, jättänyt vastaamatta IL1B tai makrofaagien lisääntynyt Wnt signalointia (Fig. 2A). Kyky IL1B ja TNF aktivoi NF-KB: n, suuret signalointireitille aktivoida Näiden sytokiinien, eivät vaikuttaneet asemaa β-kateniinin (Fig. 2B), mikä osoittaa reitin spesifisyys, ja on johdonmukainen aiempaan toteamukseen NFKB signalointi on ylävirtaan Wnt signaloinnin [11]. Nämä tulokset osoittivat, että läsnä MT β-kateniinin alleeli kasvainsoluissa, mikä johtaa konstitutiivinen β-kateniinin /TCF4 aktiivisuutta, muuttaa niiden vuorovaikutus makrofagien.

: Makrofagit ja IL1B inaktivoida GSK3p toimintaa HCT116 ja HKE-3-soluissa. B: tasot Snail määritettiin HCT116-soluissa, jotka viljeltiin THP1 makrofagien tai stimuloitiin IL1B puuttuessa tai läsnä on LY294002 kuten. C: HCT116

WT ja HCT116

MT-solua viljeltiin THP1 makrofagien tai hoidettiin IL1B tai TNF kuten 24 tuntia. D: n kyky THP1 makrofagien ja rekombinantti IL1B aiheuttaa Wnt signalointia verrattiin transfektoiduissa soluissa epäspesifinen (NSP) tai Snail erityisiä siRNA.

makrofagit eivät suojele HCT116-solut, joilla ei ole MT β- kateniinin alleeli TRAIL indusoi apoptoosin

osoitti, että makrofagi-johdettu tekijät suojaavat paksusuolensyöpä soluja TRAIL: n indusoiman apoptoosin mekanismilla riippuvainen Wnt signalointia [13], mikä viittaa siihen, että HCT116

WT solut (joista puuttuu mutantti β-kateniinin alleeli), joka ei vastannut makrofagien tiiviimmän Wnt signalointia (Fig. 1), voi näyttää muuttuneen vastaus TRAIL. Käsittelimme vanhempien HCT116-solut, HCT116

WT ja HCT116

MT solujen TRAIL puuttuessa tai läsnäollessa THP1 makrofagien tai IL1B. Kuten on esitetty kuviossa. 3, HCT116-soluja, joista puuttuu mutantti β-kateniinin alleelin (HCT116

WT) näytetä lisääntynyt herkkyys TRAIL-indusoitua apoptoosia, mikä on johdonmukaista sen kanssa, että Wnt signalointi suojaa soluja TRAIL-indusoidun apoptoosin [20]. Toisin kuin vanhempien HCT116-solut ja HCT116-solut poistetaan WT β-kateniinin alleelin (HCT116

MT), HCT116

WT soluja ei suojattu TRAIL aiheuttaman apoptoosin makrofagien, IL1B (Fig. 3A, B) tai TNF: llä (Fig. 3C).

: HCT116 transfektoitiin tyhjällä vektorilla tai dnTCF4 olivat viljeltiin yhdessä ensisijaisen perifeerisen veren monosyyttejä (Mo) 24 tuntia ja sen määrä IL1B määritettiin ELISA: lla. B: HCT116 tai HKE-3-solut transfektoitiin NSP (epäspesifinen) tai Snail erityisiä RNAi viljeltiin THP1 monosyytit ja määrä IL1B määritettiin ELISA: lla.

Vaikka kätkeminen mutantti β-kateniinin HCT116-soluja näyttää pääasiassa solukalvon lokalisaatio β-kateniinin [8]. Solujen käsittely TRAIL laukaisi menetys erillisten solukalvojen värjäytymistä sekä HCT116

MT ja HCT116

WT soluja (Fig. 4A), sopusoinnussa pilkkominen β-kateniinin TRAIL-käsitellyissä soluissa (Kuva. 4B) . Vaikka TNF ja IL1B palautettu kalvo lokalisaatio β-kateniinin HCT116

MT soluja, ne eivät vaikutusten lieventämiseksi TRAIL HCT116

WT soluja (Fig. 4A). Näin ollen, makrofagien ja IL1B eivät estäneet TRAIL-indusoitua pilkkominen β-kateniinin, kaspaasi-8, ja sen jälkeen käsittely PARP HCT116

WT-solut (Fig. 4B).

IL1B puolestaan sitoo IL1R kasvaimen soluihin ja stimuloi Wnt signalointia. Olemme osoittaneet, että makrofagien peräisin oleva tekijä vakauttamiseksi Snail kasvainsoluissa, mikä edelleen edistää Wnt signalointia, jota tarvitaan kykyä kasvainsolujen aktivoida makrofageja tuottamaan IL1B.

Nämä tiedot vahvistivat, että solut, joilla on aktiivinen Wnt signalointi näyttää muuttunut vastauksena makrofagien johdettuja tekijöitä, jotka saattavat vaikuttaa niiden herkkyys terapeuttisia aineita.

puute Snail vakautumisesta HCT116-solujen inaktivoidun MT β-kateniinin alleelin

Wnt signalointia on ollut osoitettu edistävän transkriptio, vakautta ja ydinvoiman lokalisointi Snail [15], [16]. Todellakin osoitimme, että inaktivointi GSK3p mukaan LiCI: tai tietyn GSK3p estäjä, AR-A014418, oli riittävä kohottamaan Snailin HCT116-soluissa [13]. Osoitimme, että yliekspressio Snail edistää TCF4-β-kateniinin jentymisen, ja että hiljentäminen Snail häiritsee Wnt-signalointi HCT116-soluissa [13], sopusoinnussa kyky Snail yhdistää β-kateniinin ja yhteistyöhön säännellä ilmentyminen Wnt kohdegeenien [17], [21].

makrofagien ja IL1B inaktivoida GSK3p sekä HCT116 ja HKE-3-solut (Fig. 5A) ja johdonmukaisesti, vakauttaa Snail riippumatta läsnäolon KRAS mutaatioita kasvainsoluissa [13]. Aktivointi GSK3p tietyn PI3K estäjä, YL294002, poissuljettua macrophage- ja IL1β- aiheuttama vakauttaminen Snailin HCT116-soluissa, mikä vahvistaa, että makrofagi johdettuja tekijöitä vakauttaa Snail sillä ne kykenevät inaktivoimaan GSK3p (Fig. 5B).

Osoitimme aikaisemmin, että makrofagi johdettuja tekijöitä ei vakauttaa Snail in HCT116 soluissa, jotka ilmentävät dnTCF4, johdonmukaista sen havainnon kanssa, että aktiivinen Wnt signalointia vaaditaan vakauttamiseen Snail [13]. Tässä vertasimme kykyä makrofagien johdettujen tekijät vakauttamiseksi Snail in HCT116-soluissa, jotka oli deleetio joko WT tai MT β-kateniinin alleeli. Kuten vanhempien HCT116-soluissa, makrofageissa, IL1B ja TNF vakiintui Snail in HCT116

MT-soluissa (kuvio. 5C). Sen sijaan, makrofagi-johdettu tekijät eivät vakauttamiseksi Snailin HCT116

WT-solut (Fig. 5c), sopusoinnussa kyvyttömyys makrofagien parantaa Wnt signalointia näissä soluissa (kuvio. 1). Me vaiennetaan Snail in HCT116-soluissa ja vahvisti, vastaa meidän julkaistujen tietojen [13], makrofageissa ja IL1B jättänyt stimuloida Wnt signalointia puuttuessa Etana (Fig. 5D).

tuumorisoluja aktivoida makrofageja kautta Wnt-riippuvaisen tekijän

osoitti, että kasvain eristettyjen tekijä (t) stimuloivat makrofageja erittämään erilaisia ​​liukoisen tekijät, kuten IL1B, sytokiini, perustimme vaadittiin välinen ylikuuluminen kasvaimen solut ja makrofagit [10 ]. Olemme osoittaneet, että HCT116-solut, jotka ilmentävät dnTCF4 ole edistää perifeerisen veren monosyyteistä erittää IL1B (Fig. 6A), joka vahvistaa, että Wnt-signalointia tarvitaan ilmentämiseen kasvaimen peräisin tekijä, joka stimuloi makrofageja.

Samoin vaimentaminen snail, joka on Wnt kohdegeenin in HCT116 tai HKE-3-soluissa johti kyvyttömyys näiden solujen laukaista IL1B tuotanto transformoiduissa THP1 monosyyteissä (Fig. 6B). Yhdessä nämä tiedot vahvistivat, että koolonkarsinoomasoluissa aktivoida makrofageja kautta Wnt /Snail-säännelty tekijä, jota tarvitaan tuotannon IL1B.

Keskustelu

Vaikka asianmukaisesti stimuloi makrofageja on luontainen kyky tappamaan kasvainsoluja, on käynyt selväksi, että makrofagit rekrytoidaan kasvaimen mikroympäristöä ja muokanneet tuumorista peräisin tekijät menettävät kyvyn tuhota syöpäsoluja. Lisäksi on todettu, että kasvaimeen liittyvät makrofagit (TAM) tarjoavat liukeneva tekijöitä, jotka edistävät kasvua, selviytymistä ja metastaattinen leviäminen koolonkarsinoomasoluissa [22] – [24]. Useat makrofagi-johdettuja tekijöitä on tunnistettu, jotka säätelevät syöpäsolujen kasvua. Olemme osoittaneet, että makrofagien johdettu IL1B edistää Wnt-signalointi paksusuolen syöpäsoluissa ja siten säätelee niiden kasvua ja selviytymistä [10], [13]. Puolestaan ​​syövän solut erittävät tekijöitä, jotka houkuttelevat ja aktivoivat myeloidisoluissa, ja näin ollen levittää itse vahvistava silmukka, joka ylläpitää kasvaimen kasvua. Kuitenkin paljon vähemmän tiedetään luonteesta kasvainperäinen tekijät tylppä sytotoksinen kyky makrofagien ja edistää niiden kasvain edistäviä ominaisuuksia. Kasvain- CCL2 edistää tulehdussolujen monosyyttien ja [25], ja tuumorista peräisin versikaani on osoitettu aktivoivan myeloidisoluissa kautta TLR2-riippuvaisen signaloinnin [26].

osoitti, että makrofagi-indusoitua aktivaatiota Wnt-signalointi koolonkarsinoomasoluissa edistää niiden kasvua ja selviytymistä, sopusoinnussa näkyvä rooli Wnt signaloinnin paksusuolen syöpä, ja toistuvia mutaatioita APC tai β-kateniinin useimmissa satunnaista koolonsyöpien [27]. Tässä tutkimuksessa osoitettiin, että aktivointi Wnt signaloinnin koolonkarsinoomasoluissa saa aikaan paitsi lukuisia solun sisäinen muutoksia epiteelisoluissa, mutta myös vaikuttaa siihen, kuinka epiteelisolujen kommunikoida makrofageissa. Inaktivointi MT β-kateniinin alleelin HCT116-soluissa merkittävästi muuttanut niiden vuorovaikutusta makrofaagien. Osoitimme, että makrofagit onnistunut edistämään Wnt signalointia ja suojella HCT116

WT solujen TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Tämä on sopusoinnussa aikaisemmassa raportissa, että ilmentyminen dnTCF4 kasvainsoluissa estää signaloinnin makrofagien ja kasvainsolujen [11], [13], ja vahvistaa, että hankinta onkogeenisiä mutaatioiden muuttaa vuorovaikutusta epiteelisolujen viereisen strooman.

Kuten IL1B, FGF19 on osoitettu moduloivan Wnt-signalointi HCT116-soluissa [28]. Kuitenkin, toisin kuin meidän havainto, FGF19 lisääntynyt β-kateniinin /TCF transkriptioaktiviteettia vain vanhempien HCT116-soluissa ja HCT116-soluissa, jotka säilytti WT β-kateniinin alleelin [28]. Yhdessä nämä tiedot korostettaisiin β-kateniinin mutaatiot vasteen kasvainsolujen autokriinisiä ja parakriinisiä signaaleja ja siten niiden vuorovaikutusta solujen kasvaimen mikroympäristössä. Meidän tiedot vahvistivat, että aktivointi onkogeenisten reittejä, kuten Wnt, ei vain laukaisee solun sisäinen muutoksia, mutta indusoi myös strooman muutoksia, joita tarvitaan kasvaimen etenemistä. Toisin kuin p-kateniinin mutaatioita, onkogeenisiä aktivointi KRAS suolen epiteelisolujen ei vaikuta välinen ylikuuluminen epiteelisolujen ja strooman.

osoitti, että makrofagi-johdettuja tekijöitä vakauttamiseksi Snail paksusuolen syöpäsoluissa [13], joka säätelee epiteelin mesenkymaalitransitioon ja siten edistää stemness syöpäsolujen ja niiden kyky metastasoineeseen kylvö [29], [30]. Snail on Wnt kohdegeenin [15], [16], joka puolestaan ​​on vuorovaikutuksessa β-kateniinin, ja näin ollen yhteistyössä säätelee ilmentymistä Wnt kohdegeenien [17]. Toisin kuin vanhempien HCT116-solut, makrofagi-johdettu tekijät eivät vakauttamiseksi Snailin HCT116-solut poistetaan MT β-kateniinin alleelin (kuvio. 5C). Olemme osoittaneet, että kyky makrofagien ja IL1B estämään TRAIL-indusoitua apoptoosia ja edistää klonogeenisten kasvainsolujen kasvun myös esti tuumorisoluissa vaiennetaan Snail ilmaisun [13], jotka osoittavat, että Snail säätelee useita vaiheita paksusuolen syövän etenemiseen ja osoittaa keskeinen rooli Snailin välinen ylikuuluminen kasvaimen solut ja makrofagit. Tässä osoitamme, että aktiivinen Wnt signalointia paksusuolen syöpäsoluissa, ja Wnt-riippuvainen vakauttaminen Snail erityisesti vaaditaan kasvainsolujen stimuloida makrofageja tuottamaan IL1B (Fig. 6). Samoin viimeaikaiset havainnot osoittivat, että Snail ylössäätelee proinflammatoristen välittäjäaineiden suun keratinosyyteissä, kuten IL6, IL8, CXCL1 ja IL1B [31]. Tämä on johdonmukainen havainto, että makrofagi-johdettu tekijät suojaavat paksusuolen syövän soluja TRAIL-indusoitua apoptoosia stabiloimalla Snail [13]. Näin ollen, ei ole Snail vakauttamiseen HCT116-solujen inaktivoidun MT β-kateniinin alleelin taustalla kyvyttömyys makrofagien suojata näitä soluja TRAIL-indusoitua apoptoosia. Nämä tiedot vahvistivat, että aktivointi Wnt signalointia ja myöhemmin vakauttamiseen Snailin koolonkarsinoomasoluissa merkittävästi vaikuttaa niiden vuorovaikutusta makrofaagien, ja ehdottaa keskeinen rooli Snailin välinen ylikuuluminen koolonkarsinoomasoluissa ja makrofagit.

Yhdessä meidän aineisto viittaa vahvasti siihen, että kasvaimen solut stimuloivat makrofageja kautta Wnt-riippuvaisen tekijän. Tämä on johdonmukainen toteamisesta HCT116-solut ilmentävät dnTCF4 jättänyt stimuloida IL1B makrofageissa (Fig. 6) ja siten niillä häirityn ylikuuluminen makrofageihin [13]. Todellakin osoitimme, että HCT116-solut, jotka ilmentävät dnTCF4 ovat lisääntyneet vasteena TRAIL, ja että makrofagit eivät suojaa näitä soluja TRAIL-indusoidun apoptoosin [13]. Kokeet ovat meneillään tunnistaa kasvain- tekijöitä, jotka stimuloivat makrofageja, ja määrittää, onko ilmentymisen Toll-Like reseptorit (TLR: t) makrofageissa vaaditaan välinen ylikuuluminen paksusuolen syövän solut ja makrofagit (kuvio 7).

Ihmisen paksusuolen kasvaimet näyttää heterogeeninen tasolla Wnt toimintaa [32], ja se on osoitettu, että ainoastaan ​​solut, joilla on korkea Wnt signaloinnin näytön paksusuolen syövän kantasoluja (CSC) ominaisuudet [33], [34]. Itse asiassa, hiljentämisen β-kateniinin HCT116-soluissa on osoitettu vähentävän määrän colonospheres, jotka ovat hyvin rikastettuja CSCS [35]. Tämän mukaisesti, HCT116

WT-solut eivät pallosten muodostamiseksi, kun päällystetty matalan seerumin olosuhteissa [9]. Olemme osoittaneet, että makrofagien ja IL1B parannettu Wnt signalointia ja stabiloidaan Snail kasvainsoluissa [13], joka on osoitettu antaa solujen kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia [18], mikä viittaa siihen, että macrophage- johdettu tekijät vaikuttavat heterogeenisuus paksusuolen kasvainten laajentamalla osa kasvainsolujen, jotka ovat syövän kantasolujen ominaisuuksia. Samoin myofibroblastin johdettuja tekijöitä on osoitettu määrätä CSC fenotyyppi edistämällä Wnt-signalointi kasvainsoluissa [34] ja periostin, komponentti soluväliaineen, edistää stemness syöpäsolujen ja lisää niiden kyky muodostaa etäpesäkkeitä säätelemällä Wnt signalointi [36].

Koska aktiivinen Wnt signalointi on allekirjoitus paksusuolen syövän kantasoluja, on mahdollista, että syöpä kantasoluilla on yksinomainen kyky olla vuorovaikutuksessa solujen kasvaimen mikroympäristössä. Tämän mukaisesti, syöpään liittyvä fibroblastit edistää invasiivisuus on CD133

+ paksusuolensyöpä kantasoluja tehokkaammin kuin CD133

– soluja [37]. Tämä on omiaan edistämään ainutlaatuinen kyky syövän kantasoluja levittämään kasvaimen kasvua ja resistenssiä hoitomenetelmät.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja yhteistyön kulttuurin kokeiluja

HCT116 ja HKE-3 kolorektaalikarsinoomasolulinjaa linjat, jotka eroavat toisistaan ​​vain läsnäolo mutantti k-Ras-alleeli [19], viljeltiin MEM, johon oli lisätty 10% FCS: ää. HCT116 kanssa häiritsi WT tai MT β-kateniinin alleelin toimittivat Kenneth Kinzler [8]. Ihmisen monosyyttisen, THP1, viljeltiin RPMI. Normaali ihmisen monosyyteissä, 90% CD14 ja CD11 c positiivisia ja alle 1% anti T solureseptoripositiivisissa, ostettiin

Astarte Biologics

(Redmond, WA). Kasvainsolut ja monosyytit /makrofagit olivat yhdessä viljelty erotettu Transwell-irto-polykarbonaattimembraanille 0,4 uM huokoskoko, jotka estävät suoran solu-solu-kontakti, mutta voidaan vaihtaa liukoisen tekijät (Corning Incorporated, Lowell, MA).

klonogeenisten määrityksissä, HCT116 ja HKE-3-soluja siirrostettiin tiheydellä 200 solua kuoppaa kohti kuuden kuoppalevyllä yksinään tai yhdessä perifeerisen veren monosyyttejä 7 päivää, kuten aiemmin on kuvattu [10], [11]. Pesäkkeet kiinnitettiin ja värjättiin 6% glutaraldehydiä ja 0,5% kristalliviolettia ja laskettiin käyttäen Yhteensä Lab 1.1 ohjelmisto (Nonlinear Dynamics, Durham, NC, USA).

apoptoosimäärityksessä

Soluja käsiteltiin rekombinantti TRAIL (50 ng /ml, optimaalinen pitoisuuden apoptoosin induktio HCT116-solut) yksin tai, kun läsnä on makrofagien, IL1B (5 ng /ml) tai TNFa (10 ng /ml) 7 tuntia. Solut suspendoitiin uudelleen hypotoniseen puskuriin (0,1% Triton X-100, 0,1% natriumsitraatti) ja värjättiin propidiumjodidilla (50 ug /ml) 4 tunnin ajan 4 ° C: ssa, kuten on kuvattu [38]. Näytteet analysoitiin virtaussytometrialla, ja solusyklin jakautuminen ja laajuus apoptoosin (solujen kanssa subG1 DNA-pitoisuus) analysoitiin

Modfit

ohjelmisto. Soluja käsiteltiin trail -7 tuntia ja kerättiin arviointia perustuu morfologisiin kriteereihin. Olemme vahvisti apoptoottisten luonne solujen biokemiallisten analyysi solulysaateista. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen paritonta t-testiä, jossa arvot 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Transient transfektion ja reportterigeenimäärityksessä

HCT116 ja HKE-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti kanssa ylhäältä FLASH-plasmidin (joka kantaa TCF promoottori) tai TOP-FOP plasmidi (kontrollina kantavan plasmidin mutatoidun promoottorin) käyttäen kalsiumfosfaattimenetelmää. Transfektiotehokkuutta normalisoitiin kotransfektion PTK-Renilla ja lusiferaasiaktiivisuus määräytyy myyjän protokollan (Dual lusiferaasireporttiterilla määritys, Promega, Madison, WI).

Immunofluoresenssikoe

subsellulaariseen havaitseminen β-kateniinin immunofluoresenssilla, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 30 minuutin ajan. Soluja inkuboitiin anti-β-kateniinin-vasta-ainetta (BD Biosciences, San Jose, CA, 1:100) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja johdetun anti-kani-vasta-aine konjugoitu FITC: llä 45 minuuttia 37 ° C: ssa. Kuvat otettiin kanssa SPOT CCD-kamera ja analysoitiin SPOT ohjelmisto.

Western Blot

Western blotit suoritettiin käyttäen standardimenetelmiä. Membraanit blokattiin 5% maitoa TBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä, ja niitä inkuboitiin vasta-aineiden kanssa, jotka ovat spesifisiä kaspaasin 8 (Abcam), kaspaasi 9, PARP ja Snail (Cell Signaling Technology), pGSK3 (Millipore, Billerica, MA), yhteensä β kateniinin (BD Biosciences, San Jose, CA), ja β-aktiini (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Immunoreaktiivisia kaistoja visualisoitiin kemiluminesenssin (Amersham ECL

TM Western blotting detektioreagenssipakkaus, Piscataway, NJ).