Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen fosfatidyylietanoliamiini sitovan proteiinin 4 (hPEBP4) on uusi anti-apoptoosin molekyyli, joka liittyy vastustuskyky kasvainten apoptoottisille tekijöille. Tässä pyrimme roolin tutkimiseksi hPEBP4 on radioresistance peräsuolen syöpä. Immunohistokemia osoitti hPEBP4 ilmaistiin 27/33 ja peräsuolen syöpä yksilöitä, mutta vain 2/33 viereisten normaalin limakalvon. Vaimentaminen ilmaus hPEBP4 siRNA vähensi klonogeeniset selviytymisen ja tehostetun apoptoosin peräsuolen syöpä solujen säteilytys. Sen sijaan pakko yliekspressio hPEBP4 edisti sen selviytymisen ja vähensi apoptoosin. Western blot osoitti hPEBP4 voisi lisätä säteilyn aiheuttamista Akt aktivointi, jota varten reaktiivisen hapen yksilö (ROS) vaadittiin. Radioresistance vaikutus hPEBP4 oli päinvastainen jälkeen annettiin LY-294002 estämään Akt aktivointia tai antioksidantti lakkauttaa ROS tuotanto. Olemme myös vahvistaneet, että vaikutus hPEBP4 in vivo nude-hiirissä. Niinpä me päätellä, että hPEBP4 nimenomaan ilmaistu peräsuolen syövän soluissa, liittyy radioresistance peräsuolen syöpä, mikä tarkoittaa, että modulaatio hPEBP4 voi olla tärkeitä terapeuttisia vaikutuksia sädehoidon peräsuolen syöpä.

Citation: Qiu J, Yang G Lin A, Shen Z, Wang D, Ding L (2014) Human fosfatidyylietanoliamiinia-sitova proteiini 4 edisti Radioresistance of Human peräsuolen syöpä aktivoimalla Akt käytettäessä ROS-Dependent Way. PLoS ONE 9 (3): e90062. doi: 10,1371 /journal.pone.0090062

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 elokuu 2013; Hyväksytty: 28 tammikuu 2014; Julkaistu: 03 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Qiu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ sai taloudellista tukea National Natural Science Fund of China (hankkeen numero 81101876), Medical Research Fund Zhejiangin maakunnan Health Department (hanke numero 2011RCA035), ja Natural Science Fund of Zhejiang (hanke numero Y2110782) ja Medical Research Fund tieteen teknologian osasto Zhejiangin maakunnassa (hanke numero 2012C33SA100045). Edellä rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on yksi vallitseva syövät eri puolilla maailmaa. On arvioitu, että lähes 1,2 miljoonaa miestä ja naista, jotka asuvat Yhdysvalloissa joilla on aiemmin todettu paksusuolisyövän, ja lisäksi 143460 on diagnosoitu vuonna 2013 [1]. Niistä potilaista, paikalliset kehittyneet peräsuolen syöpä vastaa suuren osan niistä. Nykyään preoperative chemoradiation hoito on tullut olennainen osa hoidettaessa paikallisia kehittynyt peräsuolen syöpä, jonka uskotaan pystyä vähentämään riskiä paikallisen uusiutumisen ja lisäävät todennäköisyyttä sulkijalihaksen säilyttävää leikkaus [2]. Valitettavasti kaikki peräsuolen syövät ovat herkkiä sädehoito. Esimerkiksi, on arvioitu, että vain noin 20% potilaista saavuttaa täydellisen patologisia vasteita ennen leikkausta sädehoitoa [3]. Joten syventää ymmärrystä radioresistace voi auttaa meitä valitsemaan säteilylle peräsuolen syöpä potilaat voivat saada ennen leikkausta sädehoitoa, välttää viive leikkauksen radioresistance potilaille ja jopa voittaa radioresistance kanssa uusia säteilylle strategioihin.

hPEBP4 on uusi jäsen PEBP perhe [4]. Yli-ilmentävät monenlaisia ​​kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien rintasyöpä, munasarjasyöpä ja eturauhas- syöpä, hPEBP4 on osoitettu estävän apoptoosia syöpäsolujen säätelemällä hajoamista apoptoottisten molekyylien, kuten Bcl-2 /Bcl-X ja kaspaasi-3 [ ,,,0],5] – [8]. Ottaen huomioon, että kiertäminen apoptoosin on yksi tunnusmerkkejä ihmisen syövissä [9] ja sädehoidon indusoima sytotoksisuus välittyy, suuressa määrin, että apoptoosin induktio syöpäsoluissa [10], [11], spekuloida, että hPEBP4 voi osallistua vastus peräsuolen syövän preoperative sädehoitoa. Oikeastaan ​​meidän tuore tutkimus ei näytä hPEBP4 oli itsenäinen ennustava biomarkkeri vasteen peräsuolen syövän leikkausta edeltävän sädehoito, mikä viittaa siihen, että jopa säätelevä hPEBP4 voisi olla mahdollinen mekanismi, jolla peräsuolen syövän solut välttää tuhoavia vaikutuksia säteilytys [12]. Kuitenkin, ei ole vielä suoraa kokeellista näyttöä roolista hPEBP4 vuonna redioresistance peräsuolen syövän toistaiseksi.

Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmaus aseman hPEBP4 vuonna peräsuolen syöpä yksilöiden ja viereisen normaali limakalvo samoin immunohistokemiallisesti ja tutkitaan, onko hPEBP4 on rooli radioresistance ihmisen peräsuolen syövän soluja. Tuloksemme osoittavat hPEBP4 oli suhteellisesti ilmaistu peräsuolen syövän kudoksissa ja osallistui radioresisitance peräsuolen syöpä, joka oli Akt ja ROS riippuvainen. Tutkimuksemme merkitsee, että farmakologinen tai geneettinen modulaatio hPEBP4 voi olla tärkeitä terapeuttisia vaikutuksia parantamisessa parantava vaikutus preoperatiivisen sädehoitoon peräsuolisyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

kaikki eläimet nostettiin käyttäen protokollia, jotka oli hyväksytty eläinten hoidon ja käytön komitea kolmannen kansan sairaalan Hangzhoun, Kiina mukaan kansallisia ja kansainvälisiä ohjeita ja eläinten hoito ja käyttö komitea hyväksyi myös tämän tutkimuksen suorittamiseksi. Kirjallinen suostumus luovuttajalta saatiin käyttöön ihmiskudosten tässä tutkimuksessa, joka oli myös hyväksynyt Ethic komitean kolmannen Kansan sairaalan Hangzhoun.

Reagenssit ja Cell Culture

Lipofectamine reagenssi ja DCF-DA oli Invitrogen (Carlsbad, CA). Spesifisten vasta-aineiden fosfo-Akt (Ser473) ja yhteensä Akt olivat Cell Signaling Technology (Beverly, MA). PI-3-kinaasi-inhibiittorit, LY-294002 Calbiochem. N-asetyyli-Lcysteine ​​(NAC) antioksidanttia (Sigma) käytettiin estämään ROS. Kaikki ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA) ja pidettiin DMEM-väliaineessa (Gibco, USA), johon oli lisätty 10% (v /v) vasikan sikiön seerumia, 4,5 g /l D-glukoosia, ei-välttämättömiä aminohappoja (100 uM kutakin), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, ja 2 mM glutamiinia 37 ° C: ssa 5% CO2-ilmakehässä.

immunohistokemia Analyysi hPEBP4 Expression in Human peräsuolen syöpä

Kaikki patologisesti vahvistettu ihmisen peräsuolen syöpä ja viereisten syöpä kudokset saatiin radikaalisti resektoitiin kasvain yksilöt tietoisen suostumuksen jokaiselta potilaan laitoksella peräsuolen Kirurgian kolmannen kansan sairaalan Hangzhoun, Kiina. Näytteet fiksoitiin formaliinilla, upotettiin parafiiniin, ja immunovärjättiin anti-hPEBP4 vasta-aine [4] käyttämällä avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin menetelmä (Cybrdi, Xi’an, Shanxi, Kiina). Immunoreaktiivisuus arvioitiin perustuen prosenttia positiivisten-värjättyjen solujen. Intensiteetti on nimetty 0, kun kasvainsoluja ei tahraa (negatiivinen), 1, kun 10-20% soluista tahra (heikko värjäytyminen), 2 silloin, kun 20-50% soluista tahra (kohtalainen värjäytyminen), ja 3, kun enemmän kuin 50% solujen tahra (voimakas värjäytyminen). Tilastoanalyyseihin, kudokset pisteytys 2 ja 3 yhdistettiin positiiviseen ja kudosten pisteytys 0 ja 1 nimettiin negatiiviseksi.

Solun transfektio

hPEBP4 konstruoituun kuten aiemmin on kuvattu [4] transfektoitiin SW480-soluihin käyttäen Lipofectamine-reagenssia kanssa pcDNA3.1 /Myc-His (-) B mock ohjaus. 48 h transfektion jälkeen, solut seulottiin 0,8 mg /ml G418: aa (Merck, Darmstadt, Saksa) kolmen viikon ajan.

Yksittäiset G418-resistentit pesäkkeet jatkokloonattiin SW480 /hPEBP4 ja SW480 /Mock. HPEBP4 ilmentyminen määritettiin RT-PCR: llä ja Western blot -analyysillä.

hPEBP4 RNA Interference Pitoisuus

stabiili hiljentäminen hPEBP4 ilmentymisestä ihmisen peräsuolen syöpä HRT-18-solut, solut transfektoitiin hPEBP4-siRNA tai Neo-plasmidin käyttäen Lipofectamine-reagenssia, kuten aiemmin on kuvattu [5]. 48 h transfektion jälkeen, solut seulottiin 0,6 mg /ml G418: aa ja 25 päivää. Yksittäiset G418-resistentit pesäkkeet jatkokloonattiin HRT-18 /Mock ja HRT-18 /hPEBP4-siRNA, ja hiljentäminen tulos hPEBP4 määritettiin RT-PCR: llä ja Western blot -analyysillä.

RT-PCR For hPEBP4

RNA kerättiin TRIzolia (Invitrogen), ja cDNA syntetisoitiin 1 ug: lla kokonais-RNA käyttäen ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi kit-ReverTra Ace-α (Toyobo) 42 ja 99 ° C: ssa 20, ja 5 min, vastaavasti. PCR-reaktio suoritettiin 10 ul: n reaktiotilavuudessa, joka koostui ensimmäisen denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, ja monistuksen jälkeen 30 sykliä 95 ° C: ssa 5 sekuntia, 56 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Spesifisiä alukkeita hPEBP4 olivat 5′-GGGTTGGACAATGAGGCTG-3 ’(sense) ja 5′-TGTGCTTGGGCTCGCTGGC-3’ (antisense).

Apoptosis Assay

Solut pestiin, suspendoitiin uudelleen värjäyspuskuriin ja värjättiin anneksiini V /PI Apoptoosi (Invitrogen) tai R123 (R-302, Molecular Probes) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Värjätään solut analysoitiin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACScalibur, Becton Dickinson, Mountain View, CA) .Experiments toistettiin kolme kertaa.

Western blot -analyysi

BCA Protein Assay Reagent Kit ( Pierce) käytettiin mittaamaan proteiinipitoisuuteen. Näytteet, jotka sisälsivät yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin Protran nitroselluloosakalvoille. Blotit kanssa mainituilla vasta-aineilla asianmukaiset piparjuuriperoksidaasiin konjugoiduilla vasta-aineilla, kuten sekundäärisiä vasta-aineita (Cell Signaling Technology). SuperSignal West Femto Suurin herkkyys substraattia (Pierce) käytettiin kemiluminoivaa visualisointi proteiinien [5].

klonogeeninen eloonläämismääritys

eksponentiaalisesti kasvavia peräsuolen syövän solut yksikerrosviljelmässä säteilytettiin 100 mm petrimaljoille käyttäen 250-kVp röntgen (0,61 Gy /min) yksittäisinä säteilyaltistusta. Altistumisen jälkeen ionisoivaa säteilytystä, solut kerättiin klonogeeniset selviytymisen analyysiä. Survival jälkeen säteilyaltistus oli määritellä kyvyksi solujen säilyttää klonogeeniset kapasiteettia ja muodostaa pesäkkeitä. Lyhyesti, sen jälkeen, kun altistus säteilylle, solut trypsinoitiin, laskettiin ja ympättiin pesäkkeenmuodostusta varten 100 mm: n petrimaljoissa 500-1000 solua /malja. Inkuboinnin jälkeen välein 21 päivää, pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla ja lasketaan manuaalisesti. Koloniat, jotka koostuivat yli 50 solua, pisteytettiin, ja kolme rinnakkaista maljaa lasketaan jokaisen hoitoon. Kokeita tehtiin ainakin 3 kertaa kaikki datapisteet. Kokeelliset tulokset korjattiin aiheuttamia vaikutuksia ei-säteilytetyn ohjaus. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

Caspase aktivointi Pitoisuus

HRT /Mock ja HRT /siRNA-soluja maljattiin 96-kuoppaisille levyille (10000 solua per kuoppa) ja säteilytettiin (8Gy). Seuraavat 24 tunnin inkubaation, aktivoitumista solun kaspaasien 3/7 mitattiin fluorescencebased määrityksellä (Apo-ONE homogeeninen kaspaasi-3/7 määritys, Promega). Kuusi kuoppaa kohden hoidon edellytys käytettiin saamiseksi keskimääräistä fluoresenssin signaaleja ja normalisoidaan valekäsiteltiin ohjaus HRT soluja.

mittaus ROS

ROS sisällön analyysi, käsittelemätön ja IR-käsiteltyjen (8Gy ) adherentteja peräsuolen syöpä solut ensin määritettiin elinkelpoisuuden trypaanisinivärin syrjäytymisen ja inkuboitiin 4 uM DCF-DA 45 min ajan 37 ° C.Then solut analysoitiin virtaussytometrialla, kuten aiemmin on kuvattu [13]. Kokeita tehtiin ainakin 3 kertaa kaikki datapisteet.

In vivo säteilyn tutkimuksissa

Male kateenkorvattomien nu /nu-hiiriä (4 vk ikäisiä) hankittiin Experimental Animal Center of Shanghai ja nostettiin käyttäen protokollia, jotka oli hyväksytty Institutional Animal Care ja käyttö komitea. 48 hiiret jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään. Hiirille injektoitiin subkutaanisesti 2 x 10

6 HRT-18 /Mock ja HRT-18 /siRNA solujen oikea jalka pad vastaavasti. Kun kasvaimet olivat noin ,5-,8 cm pisin halkaisija hiiret säteilytettiin 2 Gy Cs-säteilylähteen kolmen päivän välein kolme kertaa kuten aiemmin on kuvattu [14]. Kasvaimet seurataan ja mitataan kaavalla V = (a × b

2) /2 joka kolmas päivä. Havainnointi suljettiin, kun keskimääräinen tuumorin tilavuus mihinkään ryhmään oli noin 2,0 cm

3. Kaikki hiiret leikattiin 33 päivää sen jälkeen, kun säteilyaltistusta ja kasvaimen koko aika-käyrän sekä apoptoosin kasvainkudosnäytteet analysoitiin.

TUNEL Pitoisuus

Kasvaimet saadut kiinnitettiin 10% formaliinilla ja sulautettujen parafiiniin jälkeen hiirillä leikattiin. Jälkeen deparaffinization, kasvain näytteet on poistettu proteiinin inkubointi 20 mg /ml proteinaasi K: n (Sigma Chemical) ja 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. TUNEL värjäys suoritettiin käyttäen apoptoosin in situ havaitseminen kit (Roche) noudattamalla valmistajan protokollia. Tumat värjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI; sininen fluoresenssi), ja TUNEL-positiivisia soluja tarkasteltiin vihreän fluoresenssin. Yli 200 DAPI-positiivisia soluja tutkittiin 5 satunnaisesti aloilla kunkin ryhmän ja TUNEL-positiiviset solut laskettiin laskea in situ apoptoosin.

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistaan ​​keskiarvona arvot ± SD. Tilastollinen merkitys ryhmien välisiä eroja testattiin Studentin t-testiä tai yksisuuntaista ANOVA. Ero on hPEBP4 ilmaisun intensiteetin välillä ihmisen peräsuolen syövän kudosten ja viereiset normaalit peräsuolen kudosten analysoitiin Pearson chi-neliö testi. P-arvo on alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Lisääntynyt ilmentyminen hPEBP4 Human peräsuolisyövän

Valaistaan ​​ekspressiokuviota hPEBP4, ensin tutkittu ilmaus hPEBP4 sekä ihmisen peräsuolen syövän kudosten ja normaalin viereisen peräsuolen kudoksiin resektoidun näytteiden jälkeen radikaaleja käyttäen immunohistokemiallista analyysiä. hPEBP4 ilmentyminen oli läsnä hyvin suuri prosenttiosuus peräsuolen syövän kudoksen (78,8%, 26/33), verrattuna erittäin alhainen prosenttiosuudet vastaaviin normaaleihin peräsuolen kudosten (6,1%, 2/33, p 0,001, taulukko 1, kuvio 1A , B). Tulokset osoittavat ensisijaisen ekspressiokuviota hPEBP4 ihmisen peräsuolen syöpä kudoksiin. Toiminnan tutkimiseen ja hPEBP4 vasteena säteilyä ihmisen peräsuolen syöpä, ilmaus hPEBP4 kahden paksusuolen syövän solujen mallia tutkittiin, osoittaa hPEBP4 voimakkaasti ilmaistu HRT-18-soluissa, mutta hyvin lievästi ilmaistuna SW480-soluissa (kuvio 1 C) .

A, B

ilmaus hPEBP4 ihmisen peräsuolen syövän ja viereisten normaali peräsuolen kudoksiin immunohistokemia (x 200);

C

ilmaus hPEBP4 ihmisen peräsuolen syövän solulinjoissa mitattiin western blot.

hPEBP4 Edistänyt klonogeeninen Survival of peräsuolen syöpä solujen vastauksena Radiation

tutkia roolia hPEBP4 vuonna radioresistance peräsuolen syövän, me ensin vakaa transfektantit kaatamalla hPEBP4 ilmaisun ja yliekspressoivia hPEBP4 HRT-18 ja SW480-soluissa. Tehokkuutta yli-ilmentymisen tai hiljaisuuden hPEBP4 varmistettiin RT-PCR: llä (kuvio 2A). Sitten suoritettiin pesäkkeiden muodostumisen määritykset kahden solulinjojen vaikutuksen arvioimiseksi hPEBP4 solun selviytymisen säteilytyksen jälkeen. Huomasimme, että klonogeeniset selviytyminen HRT-18-solujen vasteen säteilyn merkittävästi vaarantunut jälkeen hPEBP4 hiljennettiin, kun taas yli-ilmentyminen hPEBP4 tehostetun sitä esitetään SW480-soluissa (kuvio 2B, C). Vahvista radioresistance vaikutuksen hPEBP4, me toistuva edellä kokeiluja HT-29 ja Lovo solujen geeni Knockdown ja yli-ilmentyminen mallit vastaavasti (kuvio 2D). Olemme havainneet, että klonogeenisten selviytyminen HT-29-solujen oli merkittävästi heikentynyt jälkeen hPEBP4 on vaiennettu, ja yli-ilmentyminen hPEBP4 tehosti selviytymistä Lovo solujen säteilytyksen jälkeen (kuvio 2E).

A,

RT-PCR vahvistaa vakaa yliekspressio hPEBP4 vuonna SW480-soluissa ja hiljaisuus hPEBP4 HRT-18-solut;

B, C,

vaikutus hPEBP4 on clogenical selviytymisen HRT-18 ja SW480-solut;

D

, Western blot vahvistaa vakaa hiljaisuus hPEBP4 HT-29-solujen ja yliekspressio hPEBP4 vuonna Lovo soluissa;

E

, vaikutus hPEBP4 on clogenical selviytymisen HT-29 ja Lovo soluissa hPEBP4 hiljaisuus ja yli-ilmentymisen vastaavasti. *, P 0,05.

hPEBP4 oli mukana Resistance Säteilyn aiheuttaman apoptoosin peräsuolen syöpä solujen

Kuten kuviossa. 3

, SW480 /mock solut olivat herkkiä säteilylle indusoiman apoptoosin. Kuitenkin SW480 /hPEBP4 solut yli-ilmentävät hPEBP4 olivat suhteellisen tulenkestävää säteilyn indusoiman apoptoosin, mikä osoittaa, että hPEBP4 antaa säteilyn resistanssi peräsuolen syöpä. Niinpä sen jälkeen kun hPEBP4 hiljennettiin, HRT-18-solut tulivat herkempiä säteilyn aiheuttaman apoptoosin verrattuna HRT-18 /mock-solut (Fig. 3

B

). Edellä vaikutus hPEBP4 toistettiin myös toisessa Knockdown ja yli-ilmentyminen kokeilla HT-29 ja Lovo soluja malleina (Fig. 3C), joka edelleen varmistaa vaikutus hPEBP4 säteilystä resistenssin peräsuolen syöpäsoluja. hPEBP4 voi estää säteilyn indusoiman apoptoosin hillitsemällä aktivointi caspase3 ja 7 (Fig. 3d). Ottaen huomioon, että sen jälkeen, kun kaspaasi cascade aktivointi, erityinen proteolyyttisen PARP-proteiini on tärkeä tapahtuma esiintymisen apoptoosin vaikutus hPEBP4 on PARP tutkittiin säteilytyksen jälkeen. Jossa hPEBP4 Äänenvaimennusjärjestelmä yhdistettynä säteilyn ilmeinen hajoamisen 116 kDa PARP osaksi 85 kDa pirstoutuminen proteiini havaittiin verrattiin säteilyllä vain (kuvio 3 E), joka vahvistaa, että hPEBP4 estää säteilyn aiheuttaman apoptoosin peräsuolen syöpä solujen, edustaa aktivointi kaspaasi-3 ja proteolyyttisen PARP pilkkominen.

A

edustaja seurauksena FCM osoittaa vaikutuksen hPEBP4 säteilyttämistä aiheuttamaa apoptoosia SW480-solujen;

B,

edustaja seurauksena FCM osoittaa vaikutuksen hPEBP4 säteilyttämistä aiheuttamaa apoptoosia HRT-18-solut; C, Histogrammi tiivistää vaikutusta hPEBP4 säteilyttämistä aiheuttamaa apoptoosia HRT-18 (hPEBP4-siRNA), HT-29 (hPEBP4-siRNA), SW480 (hPEBP4 yli-ilmentymisen) ja Lovo soluja (hPEBP4 yliekspressio);

D,

vaikutus hPEBP4 säteilyttämistä aiheuttama capase3 /7 aktivointi peräsuolen syöpä HRT-18 solu;

E,

vaikutus hPEBP4 säteilyttämistä aiheuttaman PARP cleavge peräsuolen syövän HRT-18 soluihin. *, P 0,05; **, P 0,01.

hPEBP4 välittämä säteily-vastus peräsuolen syöpä solujen Akt ja ROS Riippuvainen

Akt aktivaation on osoitettu olevan mukana radioresistance lukuisia kasvaimia [15] – [17]. Niinpä selvitimme roolin Akt in hPEBP4 välittämää Säteilynsietotestin aiheuttamaa apoptoosia. Ensinnäkin tutkimme Akt aktivoinnin jälkeen säteilyä. Löysimme Akt dramaattisesti aktivoitu jälkeen säteilyn peräsuolen syövän solut, jotka edistivät hPEBP4 (kuvio 4A). Sen määrittämiseksi, onko hPEBP4-välitteisen radioresistance vaatii Akt aktivointia, me esi-inkuboidaan sitten peräsuolen syövän soluja, joilla on 20 uM LY-294002: ssa 1 tunti, ja käsiteltiin solut säteilyä. Olemme havainneet, että LY-294002 lähes käänteinen estävää vaikutusta hPEBP4 säteilyn indusoiman apoptoosin sekä HRT-18 ja SW480-solut (Fig. 4B). Koska reaktiivisten hapen lajien (ROS) on raportoitu olevan tärkeä rooli säteilyn indusoiman apoptoosin syöpäsolujen [18], vaikutus hPEBP4 on solunsisäisen redox tila arvioitiin myös. Kuten esitetään virtaussytometrianalyysin kanssa DCFH-DA, hPEBP4 yksinään ei ollut vaikutuksia solunsisäinen redox tilan. Kuitenkin altistus säteilylle aiheutti merkittävän kasvun kertyminen solunsisäisen peroksidien peräsuolen syövän soluissa. Mutta ei ollut merkittävää muutosta tason solunsisäisten peroksidien peräsuolen syöpäsoluissa jälkeen hPEBP4 hiljennettiin tai yli-ilmentyy (Fig4 C, D). Jopa niin, samanaikainen käyttö antioksidantin NAC (esikäsittely 4 h pitoisuus 5 mM) säteilyn lähes päinvastainen vaikutus hPEBP4 säteilyn aiheuttama apoptoosin peräsuolen syöpä solujen (kuvio 4E). Mielenkiintoista, samanaikaista käyttöä NAC ja säteilyn esti myös sääntelyä Akt mukaan hPEBP4 (kuvio 4F), joka ehdotti, että ROS edellytetään hPEBP4 moduloida Akt yhteydessä säteilyn aiheuttamista apoptoottisia tapahtumia. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että hPEBP4 edisti radioresistance peräsuolesta syöpäsolujen toimimalla keskellä ROS ja Akt signaalireitin, joka voi lisäksi aktivoida Kaspaasit laukaista apoptoosin.

A,

Western blot osoittaa vaikutuksen hPEBP4 aktivoinnista Akt säteilytyksen jälkeen HRT-18 ja SW480 peräsuolen syövän solut;

B,

anneksiini V /PI-värjäys osoittaa Akt aktivaatio vaaditaan radioresistance vaikutus hPEBP4 HTR-18 ja SW480-soluissa hPEBP4 hiljaisuus ja yli-ilmentyminen vastaavasti;

C

, edustaja ROS värjäys tulos osoittaa hPEBP4 ollut vaikutusta intrasellulaarista tasoa ROS HRT-18 peräsuolen syövän solut;

D

, Histogrammi osoittaa hPEBP4 ollut vaikutusta solunsisäinen taso ROS sekä HRT-18 ja SW480 peräsuolen syöpäsolujen hPEBP4 hiljaisuus ja yli-ilmentyminen vastaavasti;

E

, tulos anneksiini V /PI-värjäys osoittaa ROS vaadittiin vuonna radioresistance vaikutus hPEBP4;

F

, edustaja tuloksena Western blot osoittaa ROS tarvittiin aktivoinnissa Akt mukaan hPEBP4 säteilyttämisen jälkeen HRT-18 kuin tutkimusmalli. *, P 0,05.

hPEBP4 mukana rakentamassa radioresistance peräsuolesta Syövät vivo

voit selvittää hPEBP4 voi myös välittää radioresistance kolorektaalisyövän vivo, tutkimme säteilyn vaikutusta yksin, hPEBP4 vaiennetaan yksin tai yhdessä kasvuun ihonalaisen HRT-18 ksenografti peräsuolen kasvaimia nude-hiirissä (kuvio 5A). Vuodesta viidentenätoista päivänä, tuumorin tilavuus yhdistetyssä hoitoryhmässä oli merkittävästi pienempi kuin säteilyn ainoa ryhmä. Kasvun viivästyminen jälkeen yhdistetty hoito oli enemmän kuin aiheuttama joko muiden hoitojen (kuvio 5B). Edustavia kuvia kasvaimen tilavuuden viidentenätoista päivänä on havainnollistettu kuvassa 5C. Havaitsimme myös apoptoosin kasvainsolujen in situ, mikä osoitti, että oli dramaattinen korkeampi apoptoosin indeksi HRT /hPEBP4-RNAi-ryhmässä kuin HRT /Mock ryhmä (kuvio 5D, E).

A,

vuokaavio in vivo kokeet;

B,

kasvukäyrä vaikutuksen hPEBP4 on siirrettyjen ihmisen peräsuolen kasvaimen in vivo säteilytyksen jälkeen;

C,

edustava kuva siirrettyjen peräsuolen kasvain jalkatyynyyn nude-hiirten kunkin ryhmän 15 päivää säteilytyksen;

D,

edustaja TUNEL kuva osoittaa in situ apopatosis siirretyn peräsuolen kasvaimia kunkin ryhmän jälkeen hiiret tapettiin;

E

, In vivo apoptoosin Yhteenvetona säteilytyksen jälkeen kunkin gourp hiirillä.

Keskustelu

tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää vaikutus hPEBP4 annetun radioherkkyyttä kolorektaalisyövän. Tuloksemme viittaavat siihen, että hPEBP4 parantaa radioresistance paksusuolisyövän soluja sekä in vitro että in vivo, joka oli välittämä edistämällä ROS-riippuvaisen aktivaation Akt.

Preoperatiivisen sädehoito on tullut vakiintunut osa kokonaisvaltaista hoitoa paikallisesti edennyt peräsuolen syöpä. Kuitenkin monet potilaat on peräsuolen syöpä ovat todella vastustuskykyisiä sädehoidon takia heterogeenisuus peräsuolen syövän säteilytys vastausta. Niille potilaille, ennen leikkausta sädehoitoa ei vain viivästyttää välittömät toimenpiteet leikkaus, mutta myös voi aiheuttaa vakavia toksisuuksia, kuten anastomoottisia vuoto, välilihan haava infektio, ja vaikuttaa haitallisesti peräaukon sulkijalihaksen toiminnon jälkeen sulkijalihaksen säästävien leikkaus [19], [20]. Joten etsintä mekanismin radioresistance peräsuolen syöpä on erittäin tärkeää parantaa hoidon tehokkuutta. On osoitettu, että säteily-indusoitua apoptoosia on tärkeä mekanismi radioherkkyyttä paneelissa syöpäsoluja, mukaan lukien peräsuolen syöpä [21], [22]. Siten aine, joka voi parantaa säteilyn aiheuttama kasvainsolujen apoptoosin voi olla potentiaalia kehittyä sädeherkistävä ainetta. hPEBP4 on uusi jäsen phosphatidylethanolaminebinding proteiinin perheen, tunnistettu ihmisen luuytimen stroomasolut [4]. Yliekspressio hPEBP4 rinta-, eturauhas- ja munasarjasyövät on osoitettu estävän apoptoosin syöpäsoluissa [4] – [8]. Kysyimme, onko hPEBP4 rooli vasteen peräsuolen syövän sädehoidon. Oikeastaan ​​tuoreessa työssä, olimme osoittaneet, että hPEBP4 ilmaisun esikäsittely- biopsianäyte itsenäisenä ennustaja reagointia preoperatiivisen sädehoitoa potilailla, joilla peräsuolen syöpä ja löysimme dramaattinen voimistumista hPEBP4 ilmentymisen peräsuolen syövän kudoksissa jälkeen preoperative sädehoidon comprared kanssa Ohutsuolikoepala aikana kolonoskopia tutkimus viittaa siihen, että hPEBP4 voisi olla rooli radioresistance peräsuolen syövän, vaikka suora yhteys hPEBP4 ja radioresistance ei tarjottu tuolloin [12]. Nyt esillä työhön, me tunnusomaista suhteellisen erityinen ilmaisu hPEBP4 vuonna peräsuolen syöpiin verrattuna viereiseen normaaliin peräsuolen kudosten ja edellyttäen, että suora kokeellinen todiste siitä radioresistance vaikutuksesta hPEBP4 vuonna peräsuolen syöpä. Olemme myös hahmoteltu taustalla mekanismi vastaavasti, mihin olisi suuntauduttava kohti ROS-Akt signaalireitin. Emme kuitenkaan tiedä tarkkaa signaali tapahtuma alaspäin ROS, jonka kautta hPEBP4 aktivoituu Akt edistää radioresistance peräsuolen kitystä. Säteilyn matalan energiansiirtokyvyn, yleisimmin käytetty sädehoidossa peräsuolen syöpä nykyään, happi ja sen johdannaiset, kuten vapaita radikaaleja ja reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ovat erittäin tärkeitä kasvainsolujen tappamista sijaan suora hyökkäys DNA radioaktiivinen säteily [23]. Mutta rooli ROS vuonna sädehoidon kasvain on hieman monimutkainen. Toisaalta ROS on kriittinen välittäjiä ionisoivan säteilyn aiheuttamista solujen tuhoutuminen, ja toisella kädellä ROS voi tarjota kasvainsolujen mahdollisuudet säilyä normaali kollegansa vaikeissa kunnossa. Itse asiassa ROS ovat tärkeitä solunsisäisiä molekyylejä säätelevät tasapainoa selviytymisen ja solukuolemaa [18], [24] – [26]. AKT näytti olevan kriittinen tekijä radioresistance mukaan apoptoosin säätelyyn, solujen kasvua, glukoosin soluunottoa ja käyttöä, ja proteiinisynteesiä, kuten Bcl-2-perheen jäsentä, kaspaasi-3/9 FKHRL1, vapauttamaan sytokromi c mitokondrioista [27 ] – [30]. Välinen ylikuuluminen ROS ja Akt signaalireitin on osoitettu esiintyvän paljon kasvainsoluissa. Ionisoivan säteilyn terapeuttisia annoksia voi aiheuttaa palautuvaa mitokondrion läpäisevyys siirtymistä ja kannustaa ohimenevää solujen sukupolvi ROS, joka voi sitten toimia toisiolähetteinä signaalinsiirrossa [31] – [32]. Nykyinen tutkimus osoitti, että aktivointi Akt jonka hPEBP4 in peräsuolen syöpä solujen säteilytys lopetettiin sen jälkeen, kun antioksidantti on annettu inhiboimaan ROS, mutta hPEBP4 ei ollut vaikutusta solunsisäisen tason ROS, viittaa siihen, että hPEBP4 nimenomaan edistää aktivointi Akt ROS säteilytyksen jälkeen peräsuolen syöpäsoluja. Oikeastaan, sekä selviytymisen ja apoptoottinen vaikutus voi myös olla, että Akt signaalireitin jälkeen aktivoituu ROS [33] – [36]. Tietojen perusteella saimme tästä tutkimuksesta, uskomme, että hPEBP4 saattavat edustaa eloonjäämissignaalin molekyylin aktivoimalla ROS-Akt signaalireitin yhteydessä sädehoidon peräsuolen syöpä. Erityisesti yli-ilmennetään syöpäsolujen hPEBP4 auttaa syöpäsolut vino vastustaa säteilyn aiheuttamien tappamista selektiivisesti vahvistamalla eloonjäämisen signaalin alavirtaan ROS sädehoidon jälkeen. Voimme jopa tehdä rohkean spekuloitu, että Src voi olla väli- tukirakenteen vuorovaikutusta hPEBP4, ROS ja Akt koska olemme toimittaneet suoria todisteita yhdistyksen välillä hPEBP4 ja Src toiseen työtä rintasyövän solujen ja Src oli osoitettu että tarvitaan aktivointiin Akt ROS aiemmin [32], [37].

Yhteenvetona se on aivan ensimmäinen raportti viittaa roolin hPEBP4 vuonna radioresistance peräsuolen syövän ja olemme myös alustavasti seurataan ulos molekyylimekanismi vastaavasti. Plus ennustearvo hPEBP4 vuonna radioresistance peräsuolen syövän kliinisen kasvainnäytteestä meidän tuoreessa raportissa [12], uskomme hPEBP4 voi olla potentiaalinen kohde parantaa herkkyyttä sädehoitoon peräsuolisyövässä. Lisätyötä tarvitaan tehokkuuden osoittamiseksi hPEBP4-täsmähoitoihin edistämisessä sädehoidon eläinmalleissa peräsuolen syöpä ja paljastaa musta laatikko signaalin tapahtuman välillä ROS ja Akt, johon hPEBP4 integroituu tehtävänsä.

Kiitokset

Kiitämme professori Wang Fan hänen hyödyllisiä keskustelun ja Miss Yu hänen tukea työaikajärjestelmän.