Krooninen sairaus

tiivistelmä

repressori elementti hiljentäminen transkriptiotekijä (REST) ​​on koordinoida transkription ja epigeneettiset säädin, joka toimii tuumorisuppressorina tai onkogeeni riippuen solujen yhteydessä ja typistetty silmukointivariantti REST4 on linkitetty erityyppisiä syöpiä. Suoritimme kattava analyysi vaihtoehtoisen silmukoinnin (AS) on

REST

nopealla monistuksella cDNA-päiden ja PCR-monistus cDNA eri kudoksista ja solulinjoista kanssa alukkeita. Havaitsimme 8 uudenlainen vaihtoehtoinen eksonit lukien vaihtoehtoinen viime eksoni joka kaksinkertaistaa

REST

geeni rajan, sekä lukuisia 5 ’/3’ silmukointikohdista ja päättyy konstitutiivista eksonit. Yhdistelmällä eri liitos kaavoja (esim eksonin ohittaminen ja vaihtoehtoisten käyttö ensimmäisen ja viimeisen eksonit), jotka ovat ennustavia muuttunut jäännösaktiivisuus vähintään 45 vaihtoehtoisesti silmukoituneet muunnokset koodaus- ja ei-koodaavan mRNA ilmennetään laji- ja solujen tyyppinen /kudosspesifisiä tavalla yksilöllisiä eroja. Tutkimalla ohjelmistoon

REST

pre-mRNA 27 munuais-, maksa- ja keuhkosyövän, huomasimme, että kaikki potilaat poikkeuksetta osoitti ero ilmentymistä eri

REST

silmukoitumisvariantit välillä pariksi kasvain ja viereisten normaaleissa kudoksissa, silmiinpistävää solutyyppi /kudosten ja yksilöllisiä eroja. Lisäksi olemme paljasti, että eksonin 3 ohitus, joka ei aiheuta kehyssiirtymän mutta menetys verkkotunnuksen välttämätöntä tumaansiirtymiseen, vaikuttivat pioglitatsoni, erittäin selektiivinen aktivaattori peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptorin gamma (PPARy), joka edistää solun erilaistumista ja kasvaimen kehittymisen lisäksi sen aineenvaihduntaan. Näin ollen tämä tutkimus osoittaa laaja AS

REST

pre-mRNA, joka määrittelee

REST

geenin rajan ja rakenne, sekä yleisesti, mutta ero välinen yhteys

REST

pre- mRNA ja erityyppisiä syöpiä. Nämä havainnot lisää tietämystä monimutkaista, kontekstisidonnaisia ​​sääntelyn

REST

geenin ilmentymistä ja toimintaa, ja antaa mahdollisia biomarkkereita ja terapeuttisia kohteita syöpään.

Citation: Chen GL, Miller GM ( 2013) Laaja vaihtoehtoiset jatkaminen repressori Element hiljentäminen transkriptiotekijä Liittyy Cancer. PLoS ONE 8 (4): e62217. doi: 10,1371 /journal.pone.0062217

Editor: Emanuele Buratti, kansainvälinen keskus geeni- ja biotekniikan, Italia

vastaanotettu: 14 helmikuu 2013; Hyväksytty 18 maaliskuuta 2013 Julkaistu: 16 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Chen, Miller. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health myöntää DA025697 (GMM), DA030177 (GMM), ja OD11103 (NEPRC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

vaihtoehtoinen silmukointi (AS), prosessi differentiaalisesti linkki eksonit yhdessä esiaste mRNA (pre-mRNA) tuottamaan kahta tai useampaa erilaista kypsä mRNA: t, on merkittävä tekijä transcriptome ja Proteome moninaisuuden 90% ihmisen geenien käynnissä AS kudos- ja kehitysvaihespesifisiä erityisellä tavalla [1], [2]. Se on nyt tunnustettu, että kytkentä transkriptio ja liitos on erittäin tärkeää AS sääntelyä [3], [4] ja että eksoni-introniliitokset tai silmukointikohdista (SS) on määritelty epigeneettisellä muutokset riippuvat solujen yhteydessä [4], [ ,,,0],5]. Näin ollen, epigeneettinen muutokset eivät vaikuta ainoastaan ​​transkriptio, mutta myös yhdessä transkription silmukointi [6], [7]. Epigeneettiset sääntelyn valmiiksi mRNA, linjassa spatiotemporal valikoima SS, viittaavat siihen, että AS rajat keskusteluja ympäristön ärsykkeille edistää Sopeutumisreaktiot ja sairauksien patofysiologiaan. Kuten moduloidaan vuorokausirytmin kellon, psyykkinen stressi, ja lukuisat hormonit ja kemikaalit [8] – [10], kun taas arviolta 15-60% ihmisen geneettisiä sairauksia, jotka vaihtelevat neurologiset ja tuumorigeenisemmiksi ja aineenvaihdunnan häiriöt, liittyy liittämiseen mutaatioita [2], [11] – [14].

repressori elementti hiljentäminen transkriptiotekijän (REST, joka tunnetaan myös nimellä NRSF ja neuroni-rajoittavia hiljentäminen tekijä), tunnistettiin alun perin repressorina neuronaalisen geenien ei- hermosoluissa [15], [16], on nyt tunnustettu koordinoida transkription ja epigeneettiset säädin että orchestrates matkapuhelinverkon epigenome sekä hermosolujen ja ei-neuronisoluissa [17]. REST sitoutuu laajalti genomisten säätelysekvenssejä, mukaan lukien repressori elementti-1 (RE1), jota DNA: ta sitovan domeenin (DBD), joka käsittää 8 sinkkisormen motiiveja (ZFMs), kun taas sen vaikutus geeni-ilmentymisen välittyy kahden riippumattoman tukahduttamisen domeenia ( RD1 ja RD2), jotka suoraan tai epäsuorasti rekrytoida lukuisia transkription ja epigeneettiset kofaktoreita. Lyhyesti, N-terminaalinen RD1 rekrytoi mSin3, tukirakenteena histonideasetylaaseja (HDAC: t), kun taas C-terminaalinen RD2 kumppanit muun corepressor (CoREST), joka lisäksi rekrytoi HDAC: t, metyyli-CpG: tä sitova proteiini 2 (MeCP2), histoni H3K4 lysiini demetylaasientsyymin (LSD1) ja H3K9 metyylitransferaasit (G9a) sekä komponenttina SWI /SNF chromatin remontin monimutkainen-Brg1. Rekrytoimalla lukuisia kofaktoreita kohdistaa geenilokukset, REST edistää dynaaminen, kontekstisidonnaisia ​​chromatin organisaatio ja tukahduttamisen /aktivoitumisen tuhansien geenien mukana monissa solun toiminnoissa kuten kasvainten synnyssä, jota varten se toimii tuumorisuppressorina tai onkogeeni riippuen solujen yhteydessä [ ,,,0],18], [19]. Monipuolinen, kontekstisidonnaisia ​​toiminto loppu on määritelty useita mekanismeja kuten proteasomaalisten hajoaminen, tumaansiirtymiseen ja pre-mRNA [20] – [23], sekä modulaatio ei-koodaavat RNA: t (ncRNAs) ja sitoutumisaffiniteetti loput monipuolinen RE1 ja ei-RE1 sivustoja [24], [25].

REST

ajoneuvot käsitellään AS, jossa on rajoitettu määrä silmukointivariantit jota ilmoitettiin, josta C-terminaaliset lyhennetyt variantti REST4, joka sisältää RD1 ja ZFMs 1-5, on hyvin dokumentoitu [20], [21]. Koska hallitseva negatiivinen, REST4 liittyy pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC), neuroblastooma ja rintasyövän [26] – [28], ja se edistää varhaisiin ohjelmointi stressivasteeseen, hermojen suojaaminen ja hormonaalinen säätely glutamiinia synthethase [ ,,,0],29] – [31]. Toiset kaksi -silmukointivariantteja REST1 jossa RD1 ja ZFMs 1-4 [16], ja REST-5FΔ kanssa poistetaan ZFM-5 [27], on myös dokumentoitu. Erityisesti, REST4 kanssa ZFM-5 kuljetetaan tumaan, kun taas REST1 ilman ZFM-5 ei ole [32], ja se on myöhemmin osoitettu, että ZFM-5 on välttämätöntä ydin- kohdentamiseen REST- [33].

tässä tutkimuksessa suoritimme kattavan analyysin AS on

REST

pre-mRNA ja tutkittiin sen merkitystä syövän. Osoitamme, että: 1)

REST

läpi laajan AS poikki geeni rajan nyt kaksinkertaistui uusi viimeisen eksonin (E

5), jossa on lukuisia koodaus ja ei-koodaavan mRNA: iden ollessa muodostettu laji- ja solutyyppi /kudosspesifinen ilmaisu; 2) lukuisat

REST

silmukoitumisvarianttia, jotka aiheutuvat eri pleissauksia kuvioita (esim eksonin ohittamisen ja vaihtoehtoisten käyttötapojen ensimmäisen ja viimeisen eksonia) ennustavia muuttuneen jäännösaktiivisuus, yleensä mutta differentiaalisesti liittyy erityyppisten syöpien ; ja 3) eksonin 3 (E

3) ohita, joka ei aiheuta kehyssiirtymän mutta menetys ZFM-5 olennaisia ​​tumaansiirtymiseen, on huomattavasti vaikuttaa pioglitatsonia, erittäin selektiivinen agonisti PPARy joka moduloi solujen erilaistumista ja kasvaimen kehittymisen lisäksi sen aineenvaihduntaan. Nämä havainnot lisää tietämystä monimutkaisuus

REST

geenisäätelyn ja toiminta, ja antaa mahdollisia biomarkkereita ja terapeuttisia kohteita syöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

käyttö ihmisen kudosten hyväksyi Harvard Institutional Review Board, ja siihen liittyvät hankkeet, joista makakien ja hiiret lopetettiin hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitean Harvard Medical School. Harvard Medical School eläinten hoito-ohjelma on akkreditoitu American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) ja täyttää National Institutes of Health standardien esitetty Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals (DHHS-julkaisu nro ( NIH) 85-23 Tarkistettu 1985). Toimielin hyväksyy myös pakollisina PHS valiokunnalle inhimillinen hoito ja käyttö Laboratory Eläimet awardee toimielinten ja NIH periaatteet hyödyntäminen ja hoidon käytettäviä selkärankaisia ​​Testing, Research, ja koulutus.

Eläimet (makakien ja hiiriä) mukana tässä tutkimuksessa hoidettiin noudattaen National Institutes of Health, US Department of Agriculture, ja Harvard Medical School suuntaviivoja eläinten tutkimukseen. Makakien olivat yhden majoitettu ja yritettiin vähentää epämukavuutta ja tarjota rikastamiseen mahdollisuuksia (esim vaihteli ravintolisät, ravinnon etsintää ja tehtävä suuntautuneita ruokintamenetelmiä, ja vuorovaikutus hoitajansa ja tutkimushenkilöstön). Erityisesti makakit ruokittiin kahdesti päivässä (AM ja PM) tasapainoisen kaupallisesti saatavilla Old World Primate Diet (esim Harlan Teklad 8714 Monkey Diet). Hedelmät ja /tai vihannesten lisiä toimitettiin kaikki eläimet päivittäin, ja juomavettä annettiin rajoittamattomasti automaattisten veden lixits tai muovi vesipulloja. Tissue kerättiin viidestä makakit jota oli käytetty muissa kokeissa, kun ne avataan. Makakien lopetettiin seuraavat parhaillaan nukutettiin ketamiini HCl suonensisäisellä pentobarbitaalin yliannostuksen, ja veri. Hiiret lopetettiin hiilidioksidilla kaasun hengitysteitse seuraa niskanmurrolla, ja kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen.

Ihmisen ja eläimen kudoksissa

cDNA näytteet peräisin aikuisen normaalin ihmisen kudoksissa (munuainen, maksa, keuhkot, aivolisäkkeen, hippokampuksessa, amygdala ja Pons, 1 kutakin) ostettiin BioChain® Institute, Inc (Newark, CA). 27 paria kasvain ja viereisten normaaleissa kudoksissa potilailta diagnosoitu kliinisesti munuais-, maksa- ja keuhkosyövässä (9 paria kutakin) saatiin UMass Cancer Center Tissue Bank (5 paria kunkin syöpää kudosta RNAlater) ja BioChain® Institute Inc (4 paria kunkin syöpää kokonais-RNA). Demografinen tieto potilaista lyhyesti esitetty taulukossa 1. Ihmisen perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC: t), jotka puhdistettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [34], ystävällisesti lahjakas Dr. Fred Wang Brigham Naisten sairaalassa. Myös kerääntyneet kudokset Reesusapinoilla ja hiiret lopetettiin muissa projekteissa.

Solulinjat ja lääkehoito

Yhteensä 18 solulinjojen peräisin ihmisen (HEK293, HEK293T-, HepG2, NCCIT, SH-SY5Y, A549, MCF7, K562, SK-N-MC, HeLa, Raji, TE671, Jurkat, Sup-T1 ja aiheuttama pluripotenttien kantasolujen (iPS)), muu kädellinen kuin ihminen (COS-7) ja jyrsijöiden (RN46A ja PC12) käytettiin tässä tutkimuksessa. Lukuun ottamatta RN46A ja iPS, kaikki muut 16 solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). RN46A solut ystävällisesti Dr. Scott Whittemore [35], kun taas iPS-solut ovat peräisin Dr. Stephen J. Haggarty [36]. Vaikutuksen tutkimiseksi pioglitatsonin on

REST

pre-mRNA, The NCCIT, HEK293T ja HepG2-soluja käsiteltiin joko 10 uM pioglitatsonin (Sigma-Aldrich), tai sovitetun liuottimen pitoisuus (0,04% DMSO ), ja solut kerättiin 48 tuntia käsittelyn jälkeen. Käsittelyt tehtiin kahtena kappaleena 3 riippumattomina ajankohtina.

RNA: n eristys ja cDNA-synteesi

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol® reagenssia (Invitrogen). Alikvootti kokonais-RNA käänteiskopioitiin cDNA käyttäen QuantiTect® Reverse Transcription Kit (Qiagen), kun taas toinen näyte, tehtiin käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen ankkuroitua oligo-dT (ankkuri sekvenssi esitetään taulukossa 2). Syntetisoitiin cDNA laimennettiin 50 ng /ul käytettäväksi.

PCR-monistus ja DNA-sekvensoinnilla

touchdown PCR käytettiin tavallisiin ja sisäkkäisiä PCR: ää, ja monistukset suoritettiin MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cycler (GMI) kokonaistilavuudessa 20 ui, joka sisältää 1 ui templaattia (50 ng /ul cDNA vakio- tai 1

st askel PCR, 1:20 laimennettu tuote 1

st vaiheessa PCR: 2

toinen vaihe sisäkkäisiä PCR), 10 pmol kutakin aluketta (taulukko 2), ja 10 ui GoTaq® Green Master Mix (Promega). Ensimmäinen askel sisäkkäisiä PCR suoritettiin käyttäen cDNA tekemät ankkuroitu oligo-dT templaattina ja oligo-dT ankkuri pariksi E

1AF

2, E

1bF

2 ja E

1cF

2 kuin alukesarjat. Aikuisille normaaleissa ihmisen kudoksissa ilman cDNA tekemät ankkuroitu oligo-dT käytettävissä, oligo-dT ankkuri korvattiin E

4R

3 ja E

5R

2 (ulkopuolella E

4R

1 ja E

5R

1, tässä järjestyksessä). Alukkeet reesusmakaki ja jyrsijöiden muutettiin tarvittaessa. Monistusolosuhteita mukana aluksi 2,5 min denaturaatio 95 ° C: ssa, jota seurasi 28 (1

st vaihe sisäkkäisiä PCR) tai 40 (vakio tai 2

toinen vaihe sisäkkäisiä PCR) sykliä 30 s denaturoinnista 95 ° C, 30 s hehkutus (lämpötila alkaen 61 ° C: ssa ja laski 0,5 ° C /sykli alkuperäisen 12 sykliä, kiinnitettiin sitten 55 ° C: ssa), ja 60~180 s pidentäminen 72 ° C: ssa, jossa on lopullinen laajentaminen 5 minuuttia 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet ladattiin 2% agaroosigeelillä ja amplikoneja erillisten koko leikattiin, puhdistettiin ja sekvensoitiin. DNA sekvensointi suoritettiin kaupallisina palvelu toiminnallisilla Biosciences Inc (Madison, WI). PCR-tuotteet, joilla on huono laatu sekvenointitulosten kloonattiin pGEM®-T-vektoriin (Promega) edelleen sekvensoimalla.

5 ’/3’ Nopea cDNA-päiden monistamisen (RACE) B

Kokonais-RNA syntyy HEK293, HEK293T-, HepG2 ja SH-SY5Y käytettiin suorittamaan 5 ’ja 3’ RACE, jotka toteutettiin kahden kaupallisen sarjat, 5 ’/3’ RACE Kit (2

nd Generation) Roche ( Indianapolis, iN) ja GeneRacer® Invitrogen, jotka eroavat strategioita 5 ’RACE. 5 ’RACE kanssa GeneRacer® kit, RNA Oligo oli aluksi ligoitiin RNA, jota seurasi cDNA-synteesi käyttäen Oligo-dT ja nested PCR käyttämällä

REST

erityisiä käänteisalukkeet (esim E

4R

1 ja E

4R

2) pariksi GeneRacer® 5′-aluke (homologinen RNA Oligo). 5 ’RACE kanssa Rochen pakki, cDNA ensin syntetisoitiin kokonais-RNA käyttämällä

REST

erityisiä käänteisaluketta (esim E

4R

2, ulkopuolella), jota seurasi pyrstön kanssa dATP ja terminale transferaasi ja myöhemmät sisäkkäistä PCR: llä käyttäen ankkuroitu Oligo-dT tai ankkuri pohjamaalilla pariksi

REST

erityisiä käänteisaluketta (esim E

4R

1, sisällä). Suorittamaan 3 ’RACE cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA käyttäen ankkuroitu Oligo-dT, jonka jälkeen perättäisen PCR käyttämällä

REST

erityisiä eteenpäin alukkeiden (esim E

1AF

1 ja E

1AF

2) pariksi ankkuri pohjamaalilla.

Quantitative reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) määritys

Käyttämällä alukkeita lueteltu taulukossa 2, kehitimme SYBR Green I ja /tai hybridisaatio Probe qRT-PCR erityisiä eksoni-eksoniliitokset ja eksonin 2 (E

2, edustaa oletettavasti ilmaisee yleisesti koodaus mRNA: iden riippumatta ensimmäisen ja viimeisen eksonit), sekä taloudenhoito geeni

GAPDH

. QRT-PCR määritykset suoritettiin aiemmin kuvatulla on Rochen LightCyclerTM 2,0 järjestelmä [37], jossa kynnys (Ct) arvot työllistetään lauseketta muutos välillä pariksi kudoksia ja soluja, joita 2

-ΔΔCt lähestymistapa [ ,,,0],38]. PCR-reaktiot suoritettiin kahtena kappaleena. E

1 a /E

4 risteykseen, jota ilmennetään matalalla tasolla useimmissa tapauksissa vain SYBR Green I määritys on saatavilla, ja Ct-arvot todennäköisesti sekoitti alukedimeeristä muodostama liiallinen jäljellä alukkeita, joten teimme qRT -PCR tuotteen käytöstä on 1

st vaiheessa PCR templaattina. Johtuen korkea identtisyys välillä 3 ’päissä E

2 ja E

3, qRT-PCR-määritys on spesifinen E

2 /E

4 risteyksessä ollut saavutettavissa.

bioinformatiikan ja data-analyysi

Prediction avoimen lukukehyksen (ORF) erityisten

REST

variantit tehtiin käyttäen StarORF ohjelmaa (https://star.mit.edu/orf /runapp.html), ja epigeneettiset tiedot

REST

lokus noudetaan UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Vertailut qRT-PCR-testattiin ekspressiotasot spesifisten eksoni-eksoniliitokset välillä pariksi kudoksia tai soluja suorittaman 2

-ΔΔCt lähestymistapaa käyttäen sopivia viittaus, ja kaksijakoinen muutos pitää merkittävinä.

tulokset

tunnistaminen E

2 /E

3 ohita ilmaistu lajin riippuvaisesti

Me tehdään standardin ja sisäkkäisiä PCR cDNA näytteitä peräisin lukuisista ihmisen kudoksista (maksa, munuainen, keuhko, aivolisäkkeen, hippokampuksessa, amygdala ja aivosilta) ja solulinjoissa (HEK293, HEK293T-, HepG2, NCCIT, SH-SY5Y, A549, MCF7 ja iPS). Käyttäen käänteinen aluke E

4R

1 kohdistaminen proksimaalisessa eksonin 4 (E

4) pariksi eteenpäin alukkeiden E

1AF

1 ja E

2F

1 kohdistaminen eksonit 1a (E

1 a) ja 2 (E

2) (kuva 1A ja taulukko 2), tässä järjestyksessä, tunnistimme useita

REST

silmukoitumisvariantit E

2 ja /tai E

3 ohitetaan (kuvio 1 B ja 1 C). Variantti E

2 ohitetaan on runsaasti ilmaistaan ​​kaikissa testatuissa solulinjoissa ja kudoksissa paitsi amygdala, kun taas variantit, joissa on E

3 yksin tai plus E

2 ohitetaan ilmaistiin alhaisilla tasoilla osajoukko kudosten ja solulinjat. Erityisesti E

2 /E

3 ohitusta on pääosin liittyy E

1 a, mutta harvoin E

1 b ja E

1 c (kuvio 1 B). Lisäksi E

2 /E

3 ohitusta ei havaittu toisessa 7 ihmisen solulinjoissa ja perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC) (Kuva S1).

(A) Kuva selityksin

REST

eksonit ja sijainnit käytetyt alukkeet tunnistamiseksi

REST

silmukointimuunnokset. Konstitutiivinen eksonit (1 a, 2, 3 ja 4) ja vaihtoehtoisten eksonien (1b, 1c ja N) on esitetty avoimessa ja harmaa laatikot, vastaavasti, kun taas eteenpäin ja reverse-alukkeita on merkitty oikealle ja vasemmalle nuolet, vastaavasti. (B) havaitseminen E

2 /E

3 ohita ihmisen kudoksissa ja solulinjoissa nested PCR erityisiä alukesarjoilla. E

2 /E

3 ohita liittyy yleisesti E

1 a, mutta harvoin liittynyt E

1 b ja E

1 c. (C) Trace kromatogrammit eksoni-eksoniliitokset mukana E

2 /E

3 hyppimistä. (D) havaitseminen E

2 /E

3 sivuutan kudoksissa ja solulinjoissa peräisin muilla kädellisillä ja jyrsijöillä nested PCR. Lukuisista rhesus kudoksissa, E

2 ohita yksinään havaittiin vain amygdaaliöljy (a) ja käpymäinen (b).

Testasimme onko E

2 /E

3 ohita ilmentyy humaani kädellinen ja jyrsijöiden kudoksissa ja solulinjoissa. Kuten kuviossa 1D ohittaen E

2 yksinään havaittiin vain amygdala ja käpymäinen pois 17 kudosten saatu 1 reesusmakaki jättäen samalla molempien E

2 ja E

3 havaittiin ainoastaan makakit PBMC ja COS-7-solut (johdettu Afrikkalainen vihreä apinan munuaisen); kuitenkin, ohittaminen E

3 yksinään havaittiin useimmissa makaki kudoksissa ja COS-7-solulinja. Jyrsijöillä ohittaminen E

2 (yksin ja plus E

3) havaittiin RN46A muttei PC12-soluissa, kun taas ohittaminen E

2 yksinään havaittiin hippokampuksessa 2 4 testattujen hiirien, mikä viittaa yksilöiden väliset ero. Samoin yksittäisten eroa

REST

pre-mRNA havaittiin myös Pons ja raphe 4 makakit (kuva S2).

Discovery of a novel viimeisen eksonin joka tuplaa ihmisen

REST

geenin rajan

suorittaa RACE määrittämiseksi 5 ’ja 3’ päissä ihmisen

REST

mRNA. Yllättäen olemme tunnistaneet uuden polyadenyloituina eksoni (E

5), joka etsii -30 kb myötävirtaan E

4 ja osittain päällekkäinen vastakkaiseen suuntaan eksonin 5 typpioksidin liittyvän-1 (

NOA1

) geenin (kuvio 2A), joka koodaa GTPaasia olennainen mitokondrioiden proteiinisynteesin [39]. Nested PCR käyttämällä E

5-erityisiä käänteisaluketta (E

5R

1) parina E

1AF

1 ja E

2F

1, tässä järjestyksessä, me todettu, että E

5 osallisuutta ajoittain yhdessä E

2 /E

3 ohita, ilmentyy useimmissa ihmisen kudoksissa ja solulinjoissa (kuvio 2B, 2C ja kuvio S1). Kuten E

2 /E

3 ohita, E

5 sisällyttäminen liittyy lähinnä E

1 a, mutta harvoin E

1 b ja E

1 c. Erityisesti emme löytäneet variantteja, jotka sisältävät sekä E

4 ja E

5, mikä viittaa siihen, että E

4 ja E

5 ovat toisensa poissulkevia ja että E

4, kuten asianlaita E

2 ja E

3, voidaan kokonaan ohittaa. Näin ollen uusi viimeinen eksoni E

5 tuplaa ihmisen

REST

geeni rajan välillä noin 28 kb ~59 kb (kuvio 3A). E

5 sisällyttäminen ei havaittu olevan muilla kädellisillä ja jyrsijöillä.

(A) sekvenssi E

5 ja sen osittainen (81 bp) päällekkäin

NOA1

geenin vastakkainen suunta. (B) havaitseminen E

5 sisällyttäminen ihmisen kudoksissa ja solulinjoissa nested PCR. (C) Trace kromatogrammit risteyksissä E

5 E

1 a, E

2 ja E

3. Huomaa, että 3′-päissä E

2 ja E

3 jakaa suuren identtisyys.

(A) Tunnistetut

REST-

eksonit ja niiden 5 ’/3 ”SS tai loppuu. UCSC geenit raita käytettiin lyhyesti osoittamaan kromosomaalinen sijainti

REST

lokuksessa kun genominen sekvenssi NG_029447 käytettiin referenssinä selventää tarkka kantoja eksonien. Major domeenit loput proteiinia (NP_005603) havainnollistettiin yhdensuuntainen vastaavan koodaavan alueen, jotta voidaan ennustaa seurauksia AS

REST

pre-mRNA: ta proteiinin tasolla. Konstitutiivinen ja vaihtoehtoiset eksonit, sekä niiden 5 ’/3’ SS tai loppuu, on värikoodattu kuten. Huomaa, että: 1) eksonin N kuvassa 1 on uudelleennimetty N

3 c täällä; 2) E

2k on jatkoa E

2 a ilman liittämiseen; ja 3) E

5 ja N4B eivät varsinaisesti esitetty NG_029447. (B) kuviot

REST

pre-mRNA ja tuloksena mRNA variantteja. Otaksuttu koodaus variantit ovat värikoodattu (blue-no aminohapon muutos ennusti, puna-katkaistu proteiini) tai varjostama (tappio ZFM-5). (C) ennustaminen C-terminaaliset lyhennetyt REST proteiinien spesifisten mRNA-variantteja. Eksoni-eksoniliitokset ja ennenaikaisen stop-kodonit on alleviivattu.

Laaja AS

REST

pre-mRNA

Tarkastelemalla edellä mainittujen kädellisten kudoksissa ja solulinjoissa sekä pariksi kasvain ja viereisten normaaleissa kudoksissa syöpäpotilaista jäljempänä mainittujen, me paljasti laajan AS

REST

pre-mRNA: ta. Kuten kuviossa 3A, paitsi E

5 ja aikaisemmin raportoitu eksonin N (nyt uudelleennimetty N

3 c) tunnistimme toinen 7 uudenlainen vaihtoehtoinen eksonit (N

1, N

2a, N

2 b, N

3a, N

3b, N

4a ja N

4b), sekä lukuisia 5 ’/3’ SS ja päättyy konstitutiivisen eksonit E

2 ja E

4. Riippumatta 5 ’/3’ päättyy E

2 ja E

4, vähintään 45 variantteja (S1-S45) muodostuvat eri liittämiseen kuvioita kuten eksonin ohitus, vaihtoehtoiset 5 ’/3’ SS, keskinäinen syrjäytyminen ja vaihtoehtoisten käyttötapojen ensimmäisen ja viimeisen eksonia (kuvio 3B). Sekvenssit romaanin variantteja on talletettu GenBank, joille on määrätty liittymistä numerot JX896957-JX896993 ja KC117262-KC117266.

29 45 silmukointivarianteista liittyy kokonaan tai osittain ohitus E

2 jossa kääntäminen vihittyjen, kuten että ne voivat toimia ncRNAs puutteesta translaation aloituspaikasta (TSS), paitsi että useita muunnelmia (S16, S19 ja S28), jonka TSS säilyi ennustavat N terminaalisella katkaistulla REST proteiini-isoformit. Samoin osittainen tai täydellinen ohitus E

4, joka liittyy usein E

2 ohita ja /tai E

5 osallisuutta, tuottaa lukuisia ncRNAs tai koodaus mRNA: t ennustavat typistetyn REST- proteiini-isoformit. Sen sijaan, ohita on 84-emäsparin E

3 (S4 ja S34) ei aiheuta kehyssiirtymän mutta menetys ZFM-5. Erityisesti variantit ehjillä E

2 (tai plus E

3) ja sen jälkeen vaihtoehto eksonit (mutta ei E

4) ennustetaan koodaamaan C-terminaaliset lyhennetyt REST proteiineja, joista 8 vaihtoehtoja E

3 koodata REST4 (S3 ja S12) tai REST4 kaltainen (S2, S21, S31, S33, S39 ja S41) proteiinien kanssa RD1 ja ZFMs 1-5, kun taas toinen 4 vaihtoehtoja (S34, S39-S41), jossa E

3 ohitetaan koodaavat REST1 kanssa RD1 ja ZFMs 1-4 (kuvio 3C).

Suurin osa 45 silmukointivarianteista ilmaistaan ​​matalalla tasolla soluun-tyyppi /kudosspesifisellä tavalla; kuitenkin vähintään yksi variantti havaittiin kaikissa testatuista kudoksista ja solulinjoissa (kuvio 1, 2 ja kuvio S3).

Yhteys

REST

pre-mRNA: n silmukoinnin ja syövän

Vertasimme spesifisten liitos malleja ja variantit välillä pariksi kasvain (T) ja viereisen normaali (N) kudoksissa 27 munuais- (Ki), maksassa (Li) ja keuhkojen (Lu) syöpiä (9 paria kutakin syöpä, taulukko 1) nested PCR ja qRT-PCR-määrityksissä, jossa keskitytään E

2 /E

3 sivuutan ja vaihtoehtoisten käyttötapojen ensimmäisen ja viimeisen eksonia. QRT-PCR-määritykset suunniteltiin kohdentamalla erityisiä eksoni-eksoniliitokset (kuvio 4A), ja ilmentyminen muuttuu spesifisten liitos välillä T ja N on esitetty taittuu (T yli N) jokaiselle koehenkilölle (kuvio 4B). Lukuun ottamatta E

1 a /E

3 ja E

1 a /E

4, joka edustaa S5 ja S6 variantit vastaavasti eksoni-eksoniliitokset eivät välttämättä edusta yhden tietyn silmukointivariantti , joka kuitenkin voidaan havaita nested-PCR: ää (kuvio 4C). Vastaavasti molemmat qRT-PCR ja nested PCR-määrityksissä otettiin huomioon vertailussa

REST

pre-mRNA profiilin välillä pariksi T ja N kudoksiin. Vaikka laaja ilmaus E

2 /E

3 sivuutan ja E

5 sisällyttäminen ihmisen edelleen validoitu, huomasimme, että kaikki 27 potilasta poikkeuksetta osoitti ero ilmentymistä lukuisia

REST

silmukointivariantit aiheuttama erityinen liitos malleja välillä pariksi T ja N kudosten silmiinpistävää kudostyypin ja yksittäisten ero.

(A) strategia suunnittelussa qRT-PCR-määritystä varten erityisiä eksoni-eksoniliitokset. (B) Expression muutokset (T yli N, taitettavissa) erityisten eksonin-eksoniliitokset määritettiin qRT-PCR; (C) spesifisten

REST

silmukointivariantit havaita perättäisen PCR. Eteenpäin ja reverse-alukkeita on merkitty oikealle ja vasemmalle nuolet, vastaavasti. Parilliset T ja N kudokset kerättiin 27 munuais- (Ki), maksassa (Li) ja keuhkojen (Lu), ja perus diagnoosi on esitetty taulukossa 1 oli lyhyesti annettiin sen alkuperäinen 3 kirjainta kullekin potilaalle. Expression muutokset (T yli N, taitettavissa) erityisten varianttien tai liitos (esim eksoni-eksoniliitokset) analysoitiin qRT-PCR ja laskema 2

-ΔΔCt lähestymistapaa käyttäen E

2 ohjearvon. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. qRT-PCR-määritys ei ole saavutettavissa E

3 ohita vain (eli E

2 /E

4 risteyksessä), mutta ilmeinen muutoksia välillä voidaan havaita T ja N kudosten useimpien kohteiden kuvaamiseen nested PCR käyttämällä E

2F

1 /E

4R

1 alukesarjaa.

Kuten kuviossa 4B ja 4C, variantteja E

2 /E

3 ohitetaan oli ilmennetty eri välillä pariksi T ja N kudosten useimmille potilaille. Varianttien käyttämällä E

4 viimeisenä eksonia, S6 (molemmat E

2 ja E

3 ohitetaan) osoitti silmiinpistävän differentiaalikaavojen kaikille potilaille lukuunottamatta Lu # 4 ja 7. Erityisesti 7, 5 ja 1 munuais-, maksa- ja keuhkosyövän, vastaavasti, osoittivat lisääntynyttä S6 ilmaisu, kun taas 2, 4 ja 6 munuais-, maksa- ja keuhkosyövän, vastaavasti, esillä vähentynyt S6 ilme. Vaikka qRT-PCR-määritys E

3 ohita vain (eli E

2 /E

4 risteyksessä) ei ole saavutettavissa, sisäkkäisiä PCR E

2F

1 /E

4R

1 osoitti ilmeisesti erilaiseen ekspressioon S4 välillä pariksi T ja N osan potilaista. Samaan aikaan, tasauspyörästö ilmentyminen E

2-ohitettua variantit S5 ja S15 välillä pariksi T ja N joistakin potilaista osoitettiin qRT-PCR ja perättäisen PCR, vastaavasti. Lisäksi joitakin muita variantteja (esim. S14, S16 ja S17), jossa E

1b ensimmäinen eksoni ja E

2 osittain ohitetaan oli ilmennetty eri välillä pariksi T ja N muutaman potilaille. Esimerkiksi S14 ja S16 oli havaittu vain T kudoksissa 4 potilasta (Ki # 5, 6 S14 ja Ki # 4, Lu # 9 S16, vastaavasti). Samoin muunnelmia käyttämällä E

5 viimeisenä eksonia, S34 (E

3 ohitetaan), S35 (E

2 ohitetaan) ja S38 (molemmat E

2 ja E

3 ohitetaan ) osoitti ilmeisesti differentiaalikaavojen välillä pariksi T ja N kuten nested PCR E

1AF

1 /E

5R

1 ja E

2F

1 /E

5R

1. Niinpä E

2 /E

3 (erityisesti E

3) ohita on yleensä, mutta eri tavoin sidoksissa eri syöpätyyppien silmiinpistävää solutyyppi /kudosten ja yksilölliset erot.

kuviossa 4C, lukuun ottamatta 3 potilasta (Li # 5, 6 ja Lu # 6) ilman havaittavaa ilmentymistä E

5 osallisuus, kaikki muut potilaat osoittivat ero ilmentyminen E

5-mukana variantit välillä pariksi T ja N kudoksiin. Erityisesti ilmaus S33 /S39 ilman E

2 /E

3 sivuutan saavutettiin ja hävisi T kudoksissa 6 (Ki # 2, 9, Li # 1, 3, 7 ja Lu # 3) ja 4 (Ki # 1, 4, 7, 8 ja Lu # 1) potilaat, vastaavasti. Erityisesti sisäkkäisiä PCR E

2F

1 /E

5R

1 osoitti, että kaikki 9 munuaisten syöpäpotilaat ilmaistuna E

5 niiden N kudoksissa, joista 3 (Ki # 1, 7, 8) menetti E

5 ilmaus heidän T kudoksissa. Sitä vastoin kaikki 9 maksasyöpäpotilailla ei osoittanut E

5 ilmentymisen niiden N kudoksissa, ja niistä, 4 (Li # 1, 2, 3, 7) saadut E

5 ilmaus heidän T kudoksissa. Differentiaalinen ilmentyminen E

5-mukana variantit välillä pariksi T ja N kudosten osoittama perättäisen PCR tukivat qRT-PCR-määritys E

3 /E

5 risteykseen (kuva 4B).

lisäksi, variantin S18, joka käyttää E

1c ensimmäinen eksoni on ilmennetty eri välillä pariksi T ja N kudoksissa useimmissa (22/27) potilailla, joilla 12 ja 10 potilaalla oli lisääntynyt ja vähentynyt ilmentyminen, vastaavasti (kuvio 4B ja 4C). Samaan aikaan qRT-PCR-määritys osoitti, että variantit S1 ja S11, jotka käyttävät E

1 a ja E

1b ensimmäinen eksoni, vastaavasti, osoittivat yli 2-kertainen ilmentyminen muuttuu välillä pariksi T ja N kudosten joillekin potilaille (kuvio 4B).