Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Celastrol on luonnollinen proteasomin estäjä, jolla on lupaava anti kasvaimen vaikutuksia ihmisen maligniteettien, erityisesti androgeeni-riippumaton eturauhassyöpä (AIPC) ja konstitutiivinen NF-KB: n aktivaation. Celastrol indusoi apoptoosin avulla proteasomin esto ja estää eturauhassyövän kasvua. Kuitenkin yksityiskohtainen vaikutusmekanismi on edelleen heikko. Nykyisessä tutkimuksessa, pyrimme testaamaan hypoteesia, jonka Celastrol vaimentaa AIPC progressiota estämällä konstitutiivista NF-KB-aktiivisuus sekä moduloimaan Bcl-2-perheen proteiinit.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tutkimme tehoa Celastrol sekä

in vitro

ja

in vivo

, ja arvioidaan rooli NF-KB: Celastrol välittämän AIPC regressio. Olemme havainneet, että Celastrol esti solujen proliferaatiota kaikissa kolmessa AIPC solulinjoissa (PC-3, DU145 ja CL1), jossa IC

50 alueella 1-2 uM. Celastrol myös tukahdutti solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Celastrol merkittävästi aiheuttaman apoptoosin osoituksena lisääntynyt Saharan G1 väestö, kaspaasin aktivaatio ja PARP pilkkominen. Lisäksi Celastrol edistää lohkaisu anti-apoptoottisen proteiinin Mcl-1 ja aktivoitu pro-apoptoottisen proteiinin Noxa. Lisäksi Celastrol nopeasti tukossa soluliman IκBα hajoamista ja tumaansiirtymiseen RelA. Samoin Celastrol esti ilmentyminen useiden NF-KB: n kohde-geenejä, jotka osallistuvat leviämisen, invaasio ja anti-apoptoosin. Celastrol tukahdutti AIPC kasvaimen etenemistä estämällä proliferaatiota, lisäämällä apoptoosin ja vähentää angiogeneesiä, PC-3 ksenograftimallia nude mouse. Lisäksi lisääntynyt solujen IκBα ja esti ilmentymistä eri NF-KB kohdegeenien havaittiin kasvaimen kudoksissa.

Johtopäätökset /merkitys

Tuloksemme viittaavat siihen, kautta kohdistettu proteasomin, Celastrol hillitsee, invaasio ja angiogeneesi indusoimalla apoptoottisen koneiston ja lieventävät konstitutiivista NF-KB aktiivisuutta AIPC sekä

in vitro

ja

in vivo

. Celastrol vaikuttavana aineena perinteisen kasviperäisten voisi näin ollen kehittää uutena terapeuttisena aineena hormonirefraktorisiksi eturauhassyöpä.

Citation: Dai Y, DeSano J, Tang W, Meng X, Meng Y, Burstein E , et ai. (2010) Natural Proteasome Inhibitor Celastrol vaimentaa androgeenin Independent Eturauhassyöpä Progression moduloimalla Apoptotic proteiinit ja NF-kappaB. PLoS ONE 5 (12): e14153. doi: 10,1371 /journal.pone.0014153

Editor: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10. heinäkuuta 2010 Hyväksytty: 10 marraskuu 2010; Julkaistu: 10 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Dai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain puolustusministeriön Eturauhassyöpä tutkimusohjelma [W81XWH-06-1-0010] ja National Institutes of Health (NIH) National Cancer Institute [R01 CA121830 (S1), R21 CA128220 ja R01 CA134655] ja LX, ja NIH kautta University of Michigan Cancer Centerin Support Grant [5 P30 CA46592]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

proteasomi on multicatalytic proteaasi monimutkainen vastuussa hajoamista useita solunsisäisiä proteiineja, jotka ovat osallisina solujen eri tapahtumiin, mukaan lukien DNA: n korjautumiseen, solusyklin, selviytymisen ja apoptoosin. Esimerkiksi P27, avainsäätelijä G1 S siirtymisen solusyklin, nopeasti ubikitinoitu ja hajottaa proteasomien johtavat p27: n lyhyt puoliintumisaika [1]. Myös useimmat Bcl-2-perheen proteiinit hajoavat ubikitiinipromoottori-proteasomin järjestelmä (UPS) [2], [3], [4]. Tumatekijä kappaB (NF-KB) on tärkeä pro-selviytymisen tekijä, joka on kääntyvästi säätelee proteasomin, koska se on hyvin tunnettua, että klassisen NF-KB-reitin, IκBα, The eristävät NF-KB: n, on hajota proteasomin, siis vapauttaen NF-KB: n aktivointia varten [5].

Asennus todisteiden mukaan jatkuvia tai konstitutiivisen NF-KB myötävaikuttaa pahanlaatuiseen etenemisen ja terapeuttisia vastus useimmissa ihmisen syövissä [6]. Esimerkiksi eturauhassyövän, konstitutiivisesti aktiivinen NF-KB: n on osoitettu korreloivan käänteisesti kanssa androgeenireseptorin asema ja liittyy androgeeniriippumattomuuteen ja hoidon vastus [7]. Kohonnut NF-KB elossa signalointireitin in androgen riippumaton eturauhassyöpä (AIPC) näyttää korreloivan korkea proteasomiaktiivisuus, mitä heijastaa nopeampi liikevaihdon IκBα [8], [9]. Tämän perusteella näyttöä, kohdistaminen proteasomien saattaa vähentää NF-KB aktiivisuutta ja siten olla käyttökelpoinen strategia AIPC interventio. Itse asiassa, modulaatio proteasomaalisten toiminnon tarkat estäjien on jo osoittanut lupaavaksi hoitoon ihmisen eturauhassyövän. Bortetsomibi (Velcade, PS-341), ensimmäinen käyttää proteasomin estäjä kliinisessä sovellus on osoittanut antituumorivaikutuksen kun sitä käytetään yksin tai yhdistelmänä tavanomaisten hoitomuotojen hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä [10]. Prekliinisissä syöpä malleissa proteasomiestäjät aiheuttaa eturauhassyöpää apoptoosia sekä

in vitro

ja

in vivo

[11], [12], joka tarjoaa merkittävää näyttöä siitä, että proteasomiestäjät voidaan levittää terapeuttisen strategia AIPC.

Celastrol on luonnollinen proteasomin estäjä, joka on ilmoitettu osoittavan antiproliferatiivisia vaikutuksia ja apoptoosia useissa prekliinisissä syövän mallit [12], [13]. Mekanistisesti, NF-KB: n on osoitettu olevan keskeinen tavoite Celastrol [14]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat viitanneet siihen, että Celastrol voi parantaa apoptoosia ja estää joko konstitutiivisia tai indusoi NF-KB: n aktivaatio muiden terapeuttisten aineiden kanssa, kuten tuumorinekroositekijän [15], temotsolomidi [16] ja gambogic happo [17]. Lisäksi Celastrol ehdotetaan tukahduttaa ksenosiirrettyjä kasvaimen kasvun kautta kohdistaminen angiogeneesiä [18], [19]. Eturauhassyövän asetus, Celastrol yksin laukaisee apoptoosin avulla proteasomin esto ja estää eturauhassyövän kasvua [12]. Kuitenkin suora vaikutusmekanismi on edelleen heikko. Nykyisessä tutkimuksessa, pyrimme testaamaan hypoteesia, jonka Celastrol vaimentaa AIPC progressiota estämällä konstitutiivista NF-KB-aktiivisuus sekä moduloimaan Bcl-2-perheen proteiineja. Selvitimme tehoa Celastrol sekä

in vitro

ja

in vivo

, ja arvioidaan rooli NF-KB: Celastrol välittämän AIPC regressio.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja Cell Culture

Celastrol (puhtaus 98%) hankittiin Gaia Chemical (Gaylordsville, CT). Jauhe liuotettiin uudelleen dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja varastoidaan erinä (20 mM), -70 ° C: ssa. MG-132 ostettiin BIOMOL (Plymouth Meeting, PA). Proteaasiestäjäseostabletit saatiin Roche (Indianapolis, IN). Muut kemikaalit hankittiin Sigmalta, ellei toisin mainita. Ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa PC-3, DU145 ja LNCaP hankittiin American Type Culture Collection. Androgeenisäädellyn riippumaton eturauhassyöpäsolulinja CL1 johdettu androgeeniriippuvaisen LNCaP-solulinjasta [20], oli ystävällisesti tri Arie Belldegrun (University of California, Los Angeles, CA). Soluja ylläpidettiin RPMI-1640 (PC-3) tai DMEM (DU145, LNCaP ja CL1), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, ja inkuboitiin 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa.

Cell Proliferation and Cell Death

Solut ympättiin 96-kuoppaiselle levylle ja käsiteltiin Celastrol kolmena kappaleena. Jälkeen 4 päivää inkuboinnin elävät solut tunnistettiin käyttämällä solulaskennalla kit kanssa WST-8 (Dojindo, Rockville, MD) ja absorbanssi testattiin 450 nm kolorimetrisesti. Solujen elinkelpoisuus (%) oli absorbanssisuhde käsitellyn näytteen käsittelemätön kontrolli [21], [22]. Vaihtoehtoisesti, solut ympättiin 24-kuoppalevylle tiheydellä 2 x 10

5 solua /kuoppa ja käsiteltiin Celastrol rinnakkaiskoekuopissa. Liitteenä solut kerättiin ja laskettiin käyttäen Coulter solulaskijalla (Fullerton, CA) 24 tunnin välein 4 päivän ajan. Solukuolemaa testattiin trypaanisinieksluusiolla sekä kelluvien ja kiinnittyneet solut [21], [23]. Tulokset esitettiin graafisesti ja analysoitiin GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA). Viisikymmentä prosenttia estävät pitoisuudet (IC

50) laskettiin käyttäen sigmoidaalista annos-vaste epälineaarinen regressioanalyysi (Prism 5.0) [21], [22], [24].

Cell Migration

Solun muuttoliikettä määritettiin ”haavan paranemista” määritys [25], [26]. Solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle ja kasvoi 48 h konfluentteja. Aukot luotu keinotekoisesti raaputtamalla yksisolukerrosta. Solumigraation kuvattiin 6 h, 24 h ja 48 h sen jälkeen, kun kukin alusta. Solut kulkeutuvat hiertyneelle alue pisteytettiin neljästä sattumanvaraisesti kentät.

Cell Invasion

Invasion testattiin TranswellTM (8 um huokosia) valmiiksi ladattu matrigeelin (BD Biosciences, San Diego, CA ). Soluja inkuboitiin kanssa tai ilman Celastrol (1 uM) kanssa seerumittomassa elatusaineessa ja ladattiin ylä- kammion (2 x 10

4 /insertti). Täydellinen väliaine (10% FBS) lisättiin alempaan kammioon tuottaa chemotractant. Kaksikymmentäneljä tuntia solun kylvö, insertit pyyhittiin pumpulipuikolla poistaa Matrigel, ja värjättiin kristallivioletilla (0,1%). Tunkeutuvat solut alapuolella suodattimen pisteytettiin kahdeksan satunnainen kentät.

Cell Cycle Analysis

Solut kiinnitettiin 70% etanolilla 4 ° C: ssa yön yli, ja sitten sitä käsiteltiin propidiumjodidilla ( PI, 50 ug /ml) ja RNaasi A: ta (1 ug /ml) 30 minuutin ajan. Näytteet analysoitiin virtaussytometrialla (FACScalibur, BD Biosciences). Sub-G1 väestön pisteytettiin välillä hypodiploid DNA sisällöstä [24], [27]. Aineisto analysoitiin WinMDI 2.8 ohjelmistoa (Purdue University Cytometry Laboratory).

Caspase aktivointi

Solut homogenoitiin lyysipuskuria (BioVision, Mountain View, CA), ja kokosolulysaateista (40 ug) inkuboitiin 20 uM fluorogeenisen substraatin LEHD-AFC tai DEVD-AFC reaktion puskuriin (BioVision), joka sisälsi 5 mM DTT: tä 37 ° C: ssa 1 h. Proteolytic vapautuminen AFC tarkkailtiin Aex = 405 nm ja Aem = 500 nm käyttäen fluoresenssi mikrolevylukijaa (BMG LABTECH, Cary, NC). Aktiivisuus ilmaistaan ​​”kertaiseksi”, ja lasketaan fluoresenssin suhteessa signaalin käsiteltyjen näytteiden käsittelemättömiin kontrollisoluihin.

Western Blot

Koko solulysaateista solujen tai kasvaimen kudokset tehtiin ja Western blot suoritettiin kokeita kuten aiemmin on kuvattu [26]. Vasta-aineita poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) (F-2), Mcl-1 (S-19), Bcl-2 (C-2), ubikitiini (P4D1), kaspaasi-3 (H-277), IκBα (C-15), RelA (F-6), tubuliinin (4G1) ja GAPDH (L-20) saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-Noxa-vasta-aine hankittiin Calbiochem (Gibbstown, NJ). Anti-β-aktiini (AC-74) vasta-aine saatiin Sigma (St. Louis, MO). Juovan tiheyden määrä määritettiin TotalLab ohjelmisto (Durham, NC).

Solunosafraktiointi

Sytosoliset ja ydin- fraktiot valmistettiin, kuten on aiemmin kuvattu [24], [25]. Lyhyesti, sytosolinen uute saatiin homogenoimalla solut hypotoniseen puskuriin [10 mM HEPES, 5 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2 ja 1 mM ditiotreitolia (DTT) ja proteaasiestäjäseostabletit], minkä jälkeen lisättiin Igepal CA- 630 (0,5%). Pelletit ratkaista hypertoninen puskurissa (20 mM HEPES, 50 mM KCI, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, ja proteaasi-inhibiittorit), jolloin saatiin tumauutteet. Subsellulaariset proteiinit kvantifioitiin Bradfordin määrityksellä ennen Western blot.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) B

qPCR suoritettiin sen määrittämiseksi, NF-KB: n kohdegeenin ilmentymistä [28]. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA saatiin käänteiskopioinnilla 1 ug kokonais-RNA: sta käyttäen TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). SYBR Green käytettiin kvantitatiivista PCR. Sekvenssit geenin alukkeet on lueteltu taulukossa S1. Reaktiot TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems) suoritettiin sen Mastercycler

realplex

2 S-järjestelmä (Eppendorf, Westbury, NY). mRNA-tasot kohdegeenien normalisoitiin GAPDH kaavalla: [2∧- (C

T kohde-C

T Actin)] x 100%, jossa C

T on kynnys aikana [27] . mRNA: n ilmentymisen on esitetty ”kertaiseksi” ja laskettiin jakamalla normalisoitu kohdegeenin ilmentymisen käsitellyn näytteen käsittelemätön kontrolli soluihin.

Animal Study

nainen kateenkorvattomiin nu /nu-hiiriä (5 viikkoa) rokotettiin ihonalaisesti (sc) PC-3-solut (3 x 10

6) molemmin puolin alaselän. Kun kasvaimet kasvoivat 100 mm

3, hiiret satunnaistettiin ja käsiteltiin päivittäin suun kautta letkulla (p.o.) ajoneuvon ohjaus [12], tai Celastrol annoksella 1 mg /kg ja 5 päivää viikossa 3 viikkoa. Tuumorin koko mitattiin viimeisen annostuksen Celastrol (päivä 18). Tuumorin tilavuus laskettiin (pituus x leveys

2) /2. Kasvaimen näytteet kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja sisäänsä parafiinia. Immunohistokemiallista analyysiä suoritettiin Ki67, pääte deoksinukleotidyylitransferaasilla biotiini-dUTP nick end merkinnät (TUNEL), ja CD31 värjäys havaitsemiseksi leviämisen, apoptoosin ja angiogeneesin, vastaavasti, kuten aiemmin on kuvattu [22], [23], [26] . Kaikki eläinkokeet suoritettiin protokollien mukaisesti hyväksynyt University of Michigan suuntaviivat käytön ja hoidon Animals.

Tilastollinen analyysi

Kaksi-tailed Opiskelijan

t

-testi was käytetään analysoimalla sekä

in vitro

ja

in vivo

tietoja. Kaikki analyysi suoritettiin GraphPad Prism 5.0. Kynnys

P

0,05 määriteltiin tilastollisesti merkittäviä.

Tulokset

Celastrol Estää Eturauhassyöpä Cell Proliferation

Celastrol on ilmoitettu osoittavan antituumorivaikutuksen ihmisen eturauhasen syöpäsolujen [12]. Tutkimuksessamme olemme vahvistaneet, että Celastrol vähensi solujen elinkelpoisuuden sekä androgeeniriippuvaisissa (LNCaP) ja androgeenista riippumaton (PC-3, DU145, CL1) eturauhasen syöpäsoluja, joiden IC

50 sytotoksisuuden vähemmän kuin 2 uM ( kuva 1A). PC-3-solut, Celastrol esti lisääntymistä annosvasteisesti (Fig. 1 B), jossa on 65% kasvua eston IC

50 annosta (~ 1 uM) päivänä 3. 2 uM, Celastrol täysin esti solukasvun testatuissa solulinjoissa. Nämä tiedot osoittavat, että Celastrol vähenee johdonmukaisesti AIPC soluproliferaation ja elinkelpoisuuden pitoisuuksina 2 uM.

(A):-soluja käsiteltiin eri annoksilla Celastrol ja solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. IC

50 osoitettiin laskettuna Prism 5.0. Tiedot ovat keskiarvo ± SD (n = 3). (B): PC-3-soluja käsiteltiin eri annoksilla Celastrol (Cel). Liitteenä solut kerättiin ja laskettiin päivittäin 4 päivän ajan. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± SD (n = 6).

Celastrol vaimentaa Migration and Invasion

Koska suurempaa Celastrol oli sytotoksinen (Fig. 1), arvioimme vaikutus of Celastrol solun muuttoliikettä ja invaasiota käyttäen myrkytöntä annosta ( 1 uM). Celastrol esti PC-3 soluvaelluksen sekä annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (Kuva. 2A). Joissa pitoisuudet (0,5 uM), joka vaikuttaa hyvin vähän leviämisen, Celastrol esti soluliikkuvuus 24 tuntia hoidon jälkeen (

P

0,001, Fig. 2B). Lisäksi DU145 soluinvaasiota estyi 70% 1 uM Celastrol (

P

0,001, Fig. 2C ja D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Celastrol estää AIPC Solujen migraation ja invaasion on subcytotoxic pitoisuuksina.

(A): PC-3 yksikerrossoluissa oli naarmuuntunut ja käsiteltiin Celastrol 0,5 ja 1 uM. ”Haavan paranemista” testattiin 6 h, 24 h ja 48 h post-alusta. Alkuperäinen suurennus, × 100. (B): määrällinen soluvaelluksen A 4 random kenttien kahtena näytteitä.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, SD (n = 8). ***,

P

0,001. (C): DU145-solut käsiteltiin tai ei 1 uM Celastrol ympättiin Matrigel päällystetty Transwell-irto-(2 x 10

4 /insert) 24 tuntia. Solujen alapuolella suodattimen värjättiin. Alkuperäinen suurennos, × 200. (D): tunkeutuvat solut (C) pisteytettiin 8 satunnainen kenttiä.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, SD (n = 8). ***,

P

0,001.

Celastrol indusoi apoptoosia ja säätelee Mcl-1

tutkimme seuraavaksi apoptoosi Celastrol sytotoksisuus . Celastrol todellakin aiheuttama kromatiinin tiivistyminen ja DNA pirstoutuminen AIPC soluissa. PC-3, käsiteltiin 2 uM Celastrol 24 h tuotti 8-kertainen osa-G

1 väestöstä (Fig. 3A). Lisäksi Celastrol aiheuttama G

2 /M pidätys (Fig. 3A), joka oli yhdenmukainen aikaisemman raportin [29], mikä myös osoittaa Celastrol vaikutuksesta solusyklin pysähtymiseen. Celastrol myös paranee dramaattisesti entsymaattista aktiivisuutta sekä kaspaasi-9 ja kaspaasi-3 DU145, vahvin aktivointi (2,9 ± 0,4-kertaisesti kaspaasi-9 ja 22,3 ± 3,5-kertaisesti kaspaasi-3: lla,

P

0,001) 8 h jälkikäsittelyä (Fig. 3B), joka osoittaa vahvistus kaspaasin kaskadin luontainen apoptoottisen reitin. Celastrol aiheuttama PARP pilkkominen, joka voitaisiin kumota yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä zVAD, osoittaa apoptoosin on kaspaasiriippuvaisen (Fig. 3C). Mielenkiintoista on, Celastrol osoitettiin samanaikaisesti kerätä ja katkaisevat anti-apoptoottisen proteiinin Mcl-1 varhaisessa (4 h) kuin myöhäisessä vaiheessa (24 h) PC-3 (Fig. 3C). Tällainen havainto oli yhdenmukainen ilmaus solunsisäisen ubikitiinipromoottori (Fig. 3C), mikä viittaa siihen, nopea ja monimutkainen säätely Mcl-1 proteasomin-estäjä. Vuonna DU145, samanlainen ilmiö havaittiin. MCL-1 pilkkominen, joka tapahtui alkuvaiheessa (4-8 h) (Fig. 3d) korreloi kaspaasi aktivaation (Fig. 3B). Lisäksi induktio pilkkoa Mcl-1 purettiin zVAD (Fig. 3C), mikä osoittaa, että tällainen hajoamista välittävät kaspaaseja. Sitä vastoin vähän muutosta havaittiin Bcl-2 (Fig. 3C), Bcl-xL: n tai XIAP (tietoja ei esitetä), mikä viittaa siihen, että yksi anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen proteiinit, Mcl-1 näyttää olevan tärkeä kohde ja Celastrol että testatut solulinjat.

(A): PC-3-soluja käsiteltiin Celastrol 24 h ja solukierron testattiin. Solupopulaatio jokaisessa solusyklin faasi numeerisesti kuvattu. Tulokset edustavat yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta. (B): DU145-soluja käsiteltiin Celastrol (2 uM) halutun ajankohtina. Entsyymiaktiivisuus kaspaasin 9 ja kaspaasi-3 määritettiin fluorometrisesti.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, SD (n = 3). (C): PC-3-soluja käsiteltiin Celastrol kanssa tai ilman sitä 1 tunnin esikäsittely pan-capsase inhibiittori zVAD (2 uM) ja Western blot-analyysi. Aktiini käytettiin latauskontrollina. Solukuolemaa havaittiin trypaanisinieksluusiolla. (D): DU145-soluja käsiteltiin Celastrol (2 uM) ja Western blot. Aktiini on latauskontrollina.

Celastrol indusoi apoptoosia aktivoimalla Noxa

On osoitettu, että Noxa, BH3-vasta pro-apoptoottista proteiinia, voidaan merkittävästi indusoi bortetsomibilla [ ,,,0],30]. Nykyisessä tutkimuksessa, tutkimme Noxa voidaan myös aktivoida Celastrol. Todellakin, Celastrol aiheuttama Noxa lauseke, joka oli yhdenmukainen kaspaasi-3 aktivaation, PARP pilkkominen ja ubikitiinipromoottori kertymistä annoksesta riippuen in CL1 soluissa (Kuva. 4A) ja PC-3-solut (Fig. 4B). Lisäksi Noxa induktio tapahtui jo 2 tuntia hoidon jälkeen, paljon nopeammin kuin kaspaasi-3 aktivointi ja PARP lohkaisu CL1 (Fig. 4C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että Noxa voimakkaasti ja nopeasti aktivoida Celastrol, joka voi olla vastuussa pro-apoptoottinen vaikutus AIPC soluissa.

(A): CL1 soluja käsiteltiin Celastrol 16 tuntia. (B): PC-3-soluja käsiteltiin Celastrol (2 uM) ja ilmoitettuina ajankohtina. (C): CL1 soluja käsiteltiin Celastrol (2 uM) 16 tunnin ajan. Kokosolulysaateista analysoitiin Western blot, jossa Actin latauskontrollina.

Celastrol estää perustamisasiakirjan NF-KB Activity

On hyvin tunnettua, että proteasomin inhibiittorit, kuten Celastrol, voi estää NF-KB: n aktiivisuutta ihmisen eri syövissä [15]. Tutkimuksessamme testasimme onko samanlainen tulos voitiin saada AIPC soluissa. PC-3-solut, Celastrol estetty sytosolin IκBα hajoamista, sekä tumaansiirtymiseen NF-KB-proteiinin RelA /p65, joka osoittaa vaikutuksia, jotka ylittivät MG132, joka on laajalti käytetty proteasomin estäjä, joka on osoitettu estävän NF-KB: n signaloinnin [31] ( kuva 5A). Samoin Celastrol annosriippuvaisesti aiheuttanut subsellulaariseen uudelleenjako NF-KB: DU145 soluissa (kuvio. 5B). Lisäksi, aivan kuten MG132, Celastrol esti ilmentymistä erilaisten NF-KB: n kohdegeenien, jotka ovat mukana useita vaiheita syövän etenemisen, mukaan lukien proliferaatiota (CXCL1, c-Myc, ja sykliini-D1), adheesio (ICAM-1), muuttoliike ( CXCL1), invaasiota (MMP-9), ja anti-apoptoosin (BIRC2 /4/5, Bcl-2 ja Bcl-x L) (taulukko. 1). Inhiboivaa vaikutusta NF-KB: n aktivaatio Celastrol vahvistettiin edelleen lusiferaasireportterigeenin määritys (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot osoittavat, että Celastrol voi estää AIPC etenemistä estämällä konstitutiivista NF-KB: n aktiivisuutta.

(A): PC-3-soluja käsiteltiin Celastrol (2 uM) tai MG132 (10 uM) 30 minuutin ajan. (B): DU145-soluja käsiteltiin Celastrol (1 ja 2 uM) 30 minuutin ajan. Sekä (A) ja (B), solut prosessoitiin subsellulaarifraktiointikokeet. Sytosoliset uute (CE) seulottiin varten IκBα ja tumauutteesta (NE) seulottiin varten RelA. Tubuliinia ja PARP käytetään merkki ja latauskontrollina CE ja NE, vastaavasti.

Anti-kasvain vaikutus Celastrol Koskee NF-KB vaimennus PC-3 ksenoqraftit

sen määrittämiseksi, NF-KB tukahduttaminen edistäisi kasvaimen taantumiseen

in vivo

, arvioimme Celastrol tehoa perustettu PC-3 ksenosiirrettyjä mallia, kuten on kuvattu aiemmin [26]. Treatment of Celastrol (1 mg /kg) 3 viikkoa esti PC-3 kasvaimen kasvua (

P

0,05) (Fig. 6A), jossa on minimaalinen systeeminen toksisuus [26]. Histologinen analyysi osoitti, että Celastrol vähensi Ki67-positiivisten solujen ja CD31-positiiviset mikro- suonten ja lisääntynyt TUNEL-positiivisia soluja (kuvio. 6B), mikä viittaa siihen, että Celastrol vähenee leviämisen ja angiogeneesin, ja indusoi apoptoosia tuumorikudoksissa. Lisäksi koko IκBα osoitettiin on kertynyt hoidon jälkeen (Fig. 6C). Lisäksi, ekspressiota NF-KB: n kohde-geenejä, jotka osallistuvat leviämisen (CXCL1), angiogeneesin (IL-8) ja anti-apoptoosin (BIRC2 ja BIRC3) estyi Celastrol kasvaimissa (

P

0,01 for CXCL1 ja BIRC2;

P

0,001 muille geenien) (Fig. 6D). Nämä tiedot osoittavat, että vaimennus NF-KB: n korreloi PC-3 kasvaimen regressio, jonka Celastrol

in vivo

.

(A): tuumorin tilavuus mitattiin, kun oli Celastrol hoidon. Hiirten lukumäärä kussakin ryhmässä on esitetty. *,

P

0,05. (B): kasvaimen osat käsiteltiin anti-Ki67, TUNEL ja anti-hiiri-CD31-värjäyksellä. Alkuperäinen suurennos, × 400. (C): kokosolulysaateista (50 ug) kasvaimen kudokset koetettiin anti-IκBα vasta-aine. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Expression kertainen oli suhde IκBα ilmaisun Celastrol ryhmässä vehikkelikontrollieläimiin. (D): qPCR analyysi NF-KB: n kohdegeenin ilmentyminen kasvaimissa. Kokonais-RNA kasvainkudoksista uutettiin käänteistranskriptioon. Gene alukkeita sekoitettiin cDNA ja SyberGreen varten qPCR.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, SD (n = 3). **,

P

0,01; ***,

P

0,001.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme havainneet, että Celastrol, luonnollinen proteasomin estäjä, estää AIPC etenemisen moduloiva kaksi väyliä. Ensimmäinen, Celastrol indusoi kaspaasi-riippuvaista apoptoosia säätelemällä anti-apoptoottisen proteiinin Mcl-1 ja aktivoimalla pro-apoptoottisen proteiinin Noxa. Toiseksi ehkäisemällä IκBα hajoaminen, Celastrol vaimentaa konstitutiiviset NF-KB aktiivisuutta ja siten kumoaa estävää vaikutusta NF-KB: n apoptoosiin sekä edistäminen leviämisen, angiogeneesin, muuttoliike ja invaasiota (Fig. 7). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot valaisevat mahdollisista tehoa ja mekanismi Celastrol hoidettaessa AIPC kautta kohdistaminen proteasomin.

Celastrol lohkot proteasomin toiminto, jolloin Mcl-1 liikevaihdon ja noxa induktio joka laukaisee apoptoosin. Samanaikaisesti Celastrol estää IκBα hajoamista, joka johtaa NF-KB: n tukahduttaminen. Kaiken Celastrol häiritsee AIPC solujen lisääntymistä, muuttoliike, invaasio ja angiogeneesi, ja indusoi apoptoosin rajoittaa olennaisesti konstitutiiviset NF-KB: n aktiivisuutta.

On osoitettu, että säädeltyyn proteasomin toiminto korreloivat kasvaimen etenemistä ja hoito resistenssin ihmisen syövissä [32]. Hyperactivation NF-KB korreloi fenotyypin androgeeniriippumattomuuteen ja hoito vastarinnan AIPC [7], [33]. PC-3-solut, korkea konstitutiivinen NF-KB-aktiivisuus on, ainakin osittain, seurausta korkean tason proteasomiaktiivisuuden [34]. Nykyisessä tutkimuksessa raportoimme että Celastrol paitsi estää voimakkaasti PC-3 kasvu, muuttoliike, invaasio ja angiogeneesi, mutta myös indusoi apoptoosia, joka liittyy NF-KB vaimennus sekä

in vitro

ja

in vivo

. Tämä havainto viittaa siihen, että AIPC, tukahduttaa NF-KB kohdistamalla proteasomin sovelletaan häiritsevät syövän etenemiseen, mukaan lukien ensisijainen kasvu ja etäpesäke. Vaikka enemmän todisteita tarvitaan hahmotella rooliin NF-KB: Celastrol välittämän kasvaimen regressio, nykyinen tutkimus osoittaa, että Celastrol estää useita NF-KB-ajettu geeniekspressiota, joka on osallisena AIPC kasvua ja etäpesäkkeiden. Tutkimuksemme sopusoinnussa muiden kanssa [35], [36], osoittavat, että NF-KB on keskeinen välittäjäaine AIPC etenemisen, ja Celastrol, toimii aktiivisena luonnollinen proteasomin estäjä, voi merkittävästi heikentää AIPC etenemistä.

mcl-1 on anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2-perheen, joka hajoaa nopeasti, että proteasomin, ja siksi on lyhyt puoliintumisaika ( 3 h) [37]. Kasvava määrä tutkimuksia ehdottaa, että proteasomin inhibiittorit pystyvät kääntämään Mcl-1 n kautta lohkaisemalla sen alkuperäisen molekyylin kaspaasien tuottaa lyhyen muodon (26~28 kDa), joka on pro-apoptoottisten riippumatta suora vakauttamiseen koko pituudeltaan MCL-1 [38], [39]. Tällainen nopea vaihtuvuus Mcl-1 korostaa nopean vasteen syöpäsoluja kun he kohtaavat proteasomin stressi, vaihtamalla fenotyyppi solusta selviytymisen ohjelmoidun solukuoleman. Yhdenmukainen bortetsomibiin [38], [40], huomaamme, että AIPC, Celastrol myös merkittävästi säätelee Mcl-1 varhaisessa vaiheessa paradoksaalisesti keräämällä antiapoptoottinen alkuperäisessä muodossaan, kun se myös muodostaa proapoptoottisten katkaistun muodon. Koska solut apoptoosin lopulta, on kohtuullista olettaa, että pilkotaan Mcl-1 voi olla tärkeämpää valvoa solukäyttäytyminen kuin aiemmin raportoitu [41]. Tämä johtuu siitä, Mcl-1 pilkkominen tapahtuu pitkin kanssa kaspaasin aktivaatio ja ennen PARP pilkkominen, kun taas lisääntynyt ehjä Mcl-1 on vain ohimenevä tapahtuma vastauksena proteasomin esto. Induktio pilkkoa Mcl-1 voidaan osittain vaimentaa kaspaasiestäjä, mikä viittaa siihen, että tällainen induktio on kaspaasiriippuvaisen. Mielenkiintoista, halkaistut Mcl-1 tasojen lasku myöhemmässä vaiheessa, joka on sopusoinnussa ehjä Mcl-1. Tämä viittaa siihen, että senkin jälkeen katkaisun caspases, Mcl-1-fragmentti on edelleen säätelee proteasomien. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että AIPC soluissa, Mcl-1 on keskeinen tavoite Celastrol joka esittelee monimutkainen vastausta proteasomin esto.

Aivan kuten Mcl-1, Noxa on toinen Bcl-2-perheen proteiini, joka on voimakkaasti kasvanut proteasomin esto eri syövissä, mukaan lukien melanooma [30], [42] ja useita myelooma [39], [43]. Toisin kuin Mcl-1, Noxa ei ole suoraa alustan proteasomeja [44]. Sen sijaan, Noxa mRNA transkriptionaalisesti parantaa proteasomin estäjä [44], [45]. Noxa on BH3-ainoastaan ​​pro-apoptoottisen proteiinin toiminta mitokondrioiden apoptoosin [4], [22]. Kun stressi, Noxa voidaan aktivoida p53-riippuvaisella tavalla ja vuorovaikutuksessa anti-apoptoottisia proteiineja, poisti siten niiden negatiivinen vaikutus apoptoosiin [46]. Tuloksemme viittaavat siihen, että Noxa ilmaisu tapahtuu jo ennen aktivointia initiaattorin kaspaasi-9, mikä osoittaa, että se on varhainen välittäjä Celastrol indusoiman apoptoosin. Kiinnostavaa, yksikään kolmesta AIPC solulinjat on toimiva p53 (PC-3 ja CL1: p53-tyhjä, DU145: p53-mutantti). Siten Noxa induktio Celastrol on p53-riippumatonta. Miten Noxa säätää positiivisesti p53-puutteellinen skenaario on epäselvä. Kuitenkin, kuten Noxa induktio korreloi Mcl-1 kertymistä, ja koska Mcl-1 /Noxa kompleksin on raportoitu korotetaan bortetsomibiin [39], nykyinen tulokset osoittavat, että mahdollinen toiminta aiheuttama Noxa voidaan vuorovaikutuksessa kertynyt Mcl- 1 ja neutraloivat sen anti-apoptoottinen vaikutus. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että sekä Mcl-1 ja Noxa näytteille nopea ja monitahoinen liikevaihdon tapahtumien yhteydessä proteasomin esto, ja Celastrol n koordinointi näiden kahden Bcl-2-perheen jäsentä johtaa apoptoosin kautta aloittamisen kaspaasin kaskadi AIPC.

Yhteenvetona tietomme hahmotella voimakas anti-kasvain vaikutuksia perinteisen luonnon proteasomin estäjä Celastrol on androgeenista riippumaton eturauhassyöpä. Kaksoisrooli Celastrol, muuttaakseen sekä apoptoottiset proteiinit ja NF-KB: n, takaa sen käsittely potentiaaliseksi terapeuttiseksi ehdokas hoidettaessa hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä potilaalla on konstitutiivisesti aktiivinen NF-KB.

tukeminen Information

Supplemental Taulukko S1 ..

pohjustajat reaaliaikainen PCR (ihmisen).

doi: 10,1371 /journal.pone.0014153.s001

(0,01 MB PDF) B

Kiitokset

Haluamme kiittää Susan Harris apua käsikirjoituksen; Dr. Arie Belldegrun Kalifornian yliopistossa – Los Angeles varten ystävällisesti tarjota CL1 solulinja; Michiganin yliopiston Kattava Cancer Center (UMCCC) Histologia Core apua kanssa immunohistologialla tutkimus; UMCCC yksikkö Laboratory Animal Medicine (Ulam) auttavat eläinkokeita, ja UMCCC virtaussytometria Core virtaussytometriseen analyysiin.