Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Potilaat, joilla on

KRAS

mutaatiot eivät reagoi kasvutekijän reseptorin (EGFR) estäjien ja jättää hyötyä adjuvanttihoitoa. Mutaatio analyysi

KRAS

tarvitaan ennen hoidon aloittamista monoklonaalisella anti-EGFR-vasta-aineita potilailla, joilla on metastasoitunut kolorektaalisyöpä (metastasoituneen kolorektaalisyövän). Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on kehittää multiplex alleelispesifinen PCR (MAS-PCR) määrityksessä havaitsemaan

KRAS

mutaatioita.

Methods

Olemme kehittäneet yksiputkinen MAS-PCR-määritys havaitsemiseksi seitsemän

KRAS

mutaatioita (G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, ja G13D). Suoritimme MAS-PCR-määritys analyysi

KRAS

on eristetty DNA 270 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) peräsuolen syövän kudoksiin. Sekvenssit kaikki 270 näytettä määritettiin pyrosekvensointi. Seitsemän tunnettu piste-mutaation DNA-näytteitä laimennetaan villityyppisen DNA analysoitiin määrittämään rajoittamisesta havaitsemisen ja toistettavuus MAS-PCR-määritys.

Tulokset

Kaiken kaikkiaan tulokset Mas- PCR-määritys olivat hyvässä yhdenmukaiset pyrosekvensointi, ja vain seitsemän discordant näytteen havaittiin. MAS-PCR-määritys toistettavasti havaittu 1-2% Mutanttialleelit. Yleisimmät mutaatiot olivat G13D kodonissa 13 (49.17%), G12D (25,83%) ja G12V (12,50%) kodonissa 12.

Johtopäätös

MAS-PCR-määritys tarjoaa nopean , kustannustehokas ja luotettava diagnostinen työkalu tarkka havaitseminen

KRAS

mutaatioita rutiini FFPE peräsuolen syöpä kudoksiin.

Citation: Seekhuntod S, Thavarungkul P, Chaichanawongsaroj N (2016) Validation of a Multiplex alleelispesifisen polymeraasiketjureaktio määritys havaitseminen

KRAS

geenimutaatioita Formaliinifiksoidusta, parafinoidut kudoksille peräsuolen syövän Potilaat. PLoS ONE 11 (1): e0147672. doi: 10,1371 /journal.pone.0147672

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 31 lokakuu 2015; Hyväksytty: 06 tammikuu 2016; Julkaistu 26. tammikuuta 2016

Copyright: © 2016 Seekhuntod et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: SS tukivat 90 vuotta Chulalongkorn University rahasto (Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, GCUGR1125572134), ja NC tukivat tiedekunnan Allied Health Sciences Fund 2014 (AHS-CU 58004). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yleisin syöpä ja kolmanneksi yleisin syöpäkuolemien syy maailmassa [1]. Thaimaassa, CRC on kolmanneksi yleisin syöpä miehillä ja viidenneksi yleisin naisten [2, 3]. Yksi tärkeimmistä molekyyli koulutusjaksojen CRC kehitys on induktio aktivoiva mutaatio esikasvaintekijän

KRAS

(Kirsten rat sarkooma viruksen onkogeenin) [4, 5].

KRAS

geeni on jäsen

RAS

geeniperheen ja koodaa 21 kDa: n RAS-proteiinin, joka on alavirtaan GTP-sitovaa proteiinia epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) signaalin transduktioreitin. Onkogeeninen muodot

KRAS

mutaatioita ekspressoivat konstitutiivisesti aktiivisen RAS-proteiinin mikä lisää solun jakautumisen, solujen lisääntymistä, ehkäisy apoptoosin prosessi, angiogeneesin induktio ja lisääntynyt metastaasin [6]. Viime aikoina syöpähoitojen on kehitetty käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita, kuten setuksimabi ja panitumumabi, kohdistaa EGFR [7, 8]. Nämä aineet on suunniteltu estämään ligandin indusoiman EGFR-tyrosiinikinaasi-aktivointi ja siten estävät alavirran signalointia [9]. Kuitenkin vain CRC villiin

KRAS

esikasvaintekijän reagoi anti-EGFR-vasta-aineita hoitoa, kun taas mitään hoitovasteen esiintyy CRC

KRAS

mutaatioita [9-11]. Eurooppalainen Society for Medical Oncology ja American Society of Clinical Oncology luoneet merkittäviä onkologian suuntaviivoja että nämä vasta-aineet on rajoitettava potilaille, joilla on

KRAS

villin tyypin ja peräsuolen syöpiä [12, 13]. Siksi havaitseminen

KRAS

geenimutaatioita on kriittinen kliinistä merkitystä yksilöllisten potilaalle hoitostrategioita [7].

Useat molekyylitason menetelmiä on kehitetty havaitsemiseksi

KRAS

mutaatioita. Näitä menetelmiä ovat suora sekvensointi [10], reaaliaikainen PCR [11], korkearesoluutioisia sulamisen (HRM) [14], vahvistus tulenkestävä mutaatio järjestelmä polymeraasiketjureaktio [15, 16], pyrosekvensointi [17, 18], co-vahvistus alemmilla denaturoitumislämpötila PCR [19], mutantti-rikastettu PCR [20], ja digitaalinen PCR [21]. Lisäksi useat kaupalliset molekyyli sarjat ovat yleisesti saatavilla

KRAS

mutaation havaitseminen, kuten Cobas

® KRAS Mutation Test [22], 3D-Gene

® KRAS mutaatiokokeessa kit, therascreen

® KRAS RGQ PCR Kit [23], EntroGen n KRAS Mutaatioanalyysi Kit Real-Time PCR [23], ja KRAS PyroMark Q96 V2.0 Kit [24]. Kuitenkin kaikki nämä menetelmät vaativat teknistä asiantuntemusta ja erikoistuneita laitteita ja välineitä, ja ovat liian kalliita prognostisia ja diagnostisia työkaluja syöpäpotilaiden kehitysmaissa. Sitä vastoin, Multiplex alleelispesifinen Polymerase Chain Reaction (MAS-PCR) on yksinkertainen, luotettava ja edullinen menetelmä havaitsemiseksi tunnettuja mutaatioita ja yhden nukleotidin polymorfismi [25, 26]. MAS-PCR on tunnusomaista alukkeita alleelispesifisen 3’että hybridisoituu spesifisesti mutatoidun tai villityypin DNA-templaatti vain [26, 27]. Villityypin ja alleelin alukkeilla tuottaa erikokoisia PCR-tuotteita mahdollistaa helpon havaitsemisen tunnetun geenin mutaatio.

Tässä tutkimuksessa kehitimme MAS-PCR määritys analyysi mutaatiostatuksesta tilasta

KRAS

kodonit 12 ja 13. Yhden nukleotidin pistemutaatioiden

KRAS

geeni esiintyy yleisimmin kodoneissa 12 ja 13 osuus 80 82%: iin ja 15 17% mutaatioista, vastaavasti [28-31 ]. Mutaatiot muissa tehtävissä, kuten kodonien 61, 117, 146 ja 154, ovat huomattavasti harvemmin määrä on noin 1% kaikista

KRAS

geenimutaatioita [17, 32]. Tässä tutkimuksessa, läsnäolo yleisin pistemutaatiot kodoneissa 12 ja 13, jotka ovat G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, ja G13D [18, 30, 32, 33], arvioitiin formaliinilla kiinnitetyt, parafinoidut kudosnäytteitä 270 CRC potilaista. Pyrosekvensointi, vankka ja herkkä menetelmä, käytettiin referenssinä tapa verrata herkkyyden MAS-PCR-määritys havaitsemiseksi

KRAS

Mutanttialleelit.

Materiaalit ja menetelmät

valmistaminen Kliininen näytteiden

Formaliinifiksoidusta, parafinoidut peräsuolen adenokarsinooman 270 potilasta, joilla CRC kerättiin Institute of Pathology, Ministry of Public Health, Bangkok, Thaimaa. Tutkimuksen hyväksyi eettisen komitean Institute of Pathology (silmänpainetta KM-R57-007). Eettisen toimikunnan luopua tarvetta suostumuksen koska tiedot kudosnäytteitä analysoitiin anonyymisti ja raportoitu. Kokenut patologi tarkistetaan ja merkitty adenokarsinooma alueet hematoksyliinillä ja eosiinilla värjätään dioja. Kasvaimet olivat manuaalisesti mikro-leikeltiin parafinoidut lohkot, ja 10 um: n paksuisia leikkeitä kerättiin 1,5 ml: n putkeen. Parafiini poistettiin kudosblokeista ksyleenillä, ja näytteet kuivattiin ilmassa. DNA uutettiin näytteistä ja puhdistettiin käyttäen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA-määrä määritettiin NanoDrop spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).

PCR-monistuksella ja pyrosekvensointi

pyrosekvensointi analysoimiseksi

KRAS

geenifragmentti ulottuu kodonit 12 ja 13 suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu joitakin muutoksia [18]. Alukkeiden sekvenssit olivat aiemmin kuvattu [18]. Reaktio-olosuhteet, 1 uM forward-aluketta (5′-GGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3 ’), biotinyloitua reverse-aluketta (5′-biotiini-TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’), ja 50-100 ng /ul DNA-templaattia tuotti 82-bp: n tuotteen. Reaktiot suoritettiin 1 x PCR-puskuria, joka sisälsi 2,5 mM MgCl

2, 0,2 mM dNTP: tä (Biolabs, Englanti), ja 0,625 U AmpliTaq Gold DNA-polymeraasia (Applied Biosystems, USA) 30 ul: n kokonaistilavuudessa. PCR-olosuhteet olivat denaturaatiovaihe 95 ° C: ssa 10 min, sitten 1 min 95 ° C: ssa, 1 min 55 ° C: ssa, 1 min 72 ° C: ssa 35 sykliä, ja jota seuraa 7 min 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet vahvistettiin 8% polyakryyliamidigeelielektroforeesilla 140 V: ssa 40 minuuttia, ja geelit värjättiin SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (1: 400, Lonza, USA) 30 minuutin ajan. PCR-tuotteet sekvensoitiin pyrosekvensointi käyttämällä PyroMark Gold Q96 reagenssia (Qiagen, Saksa). PCR-tuotteet 30 ui sekoitettiin 3 ui streptavidiini-konjugoitua Sepharose-helmiä (Streptavidin Sepharose HP, Amersham Biosciences AB, Ruotsi), 40 ui sitovaa puskuria ja 17 ui tislattua vettä, jonka jälkeen ravistelu 1400 rpm 10 minuutin ajan. Immobilisoituun biotinyloitua PCR-tuotteet: streptavidiiniin konjugoiduilla Sepharose helmiä komplekseja siepattiin käyttäen tyhjiö prep työkalu. Yksijuosteinen DNA: n puhdistus saatiin aikaan 1x pesemällä tyhjiö prep työkalun peräkkäin 70% etanolissa 5 s, denaturointiliuosta 5 s, ja pesupuskurilla 10 s. Biotinyloitu yksijuosteinen DNA: ta lisättiin 96-kuoppaiselle mikrotiitterilevylle, joka sisälsi 40 ui 0,4 uM sekvensointi PF1-aluketta (5′-TGTGGTAGTTGG AGCTG-3 ’) analyysiä varten nukleotidien 35 ja 38 kantoja, ja PF2-aluketta (5 ”-TGTGGTAGTTGGAGCT-3 ’) analyysiä varten nukleotidiin 34 kannasta [18]. Levyä inkuboitiin 80 ° C: ssa 2 minuutin ajan, minkä jälkeen se jäähdytettiin huoneen lämpötilassa 5 minuutin ajan, ja ladattiin PyroMark Q96 ID-järjestelmä (Qiagen, Saksa).

DNA Cloning

Perimän DNA kahdeksan kliinisistä näytteistä kätkeminen

KRAS

villin tyypin DNA ja seitsemän pistemutaatioiden

KRAS

kodoneja 12 ja 13 (G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, ja G13D) tehtiin PCR-monistus käyttäen yleistä

KRAS

alukkeita (K

ras

-codon 12/13-F 5′-CTG GTG GAG TAT TTG ATA GTG TAT T-3 ’ja K-

ras

-codon 12/13-R 5′-ATC TGT ATC AAA GAA TGG TCC TG-3 ’). Kaikki 259-bp: n PCR-tuotteet kloonattiin psc-A-amp /kan vektoriin ja transformoitiin kompetentteihin

Escherichia coli

soluihin käyttäen Strataclone PCR -kloonaustarvikesarjaa (Agilent Technologies, Yhdysvallat). Transformoidut bakteerit levitettiin selektiivinen LB-agar-maljoille (Oxoid, USA) kanssa ampisilliinia ja X-Gal (Promega, USA). Sen jälkeen kun oli inkuboitu yön yli 37 ° C: ssa, valkoiset pesäkkeet valittiin sattumanvaraisesti ja viljeltiin LB-alustassa, yön yli. Plasmidit uutettiin käyttäen Wizard

® genomista DNA puhdistustarvikepakkausta (Geneaid, Taipei, Taiwan) ja sen jälkeen seulottiin insertin fragmentti PCR. Positiivinen PCR-tuotteet sekvensoitiin Bioneer Corporation, Daejeon, Korean tasavalta.

Primer suunnittelu

Alleelispesifisiä (AS) alukkeet suunniteltiin kullekin seitsemän mutaatioiden ja mutaatio-epäspesifisiä alue käytettiin referenssinä amplikonin. 3’liitinpohjasta kutakin pohja- hyväksyttiin mukaan sen vastaavaan mutaatio. Monistusreaktiot suoritettiin tärkein

KRAS

alukkeena eteenpäin ja viisi alukkeina (G12R-F, G12C-F, G12D-F, G12A-F, ja G13D-F) jakaminen on yksi yhteinen antisense

KRAS

käänteisaluke-, ja reaktiot kaksi AS-alukkeita (G12S-R ja G12V-R) jakaminen on yksi järkeä

KRAS

forward-aluketta (kuvio 1). Alukkeiden sekvenssit, joita käytetään tässä tutkimuksessa on esitetty taulukossa 1. Kaikki alukkeet syntetisoitiin ja toimittaa Biodesign Co., Ltd. (Biodesign, Pathumthani, Thaimaa).

kannat alukkeet on esitetty. Alukkeina samaa forward-alukkeen tai käänteisaluketta. Solid nuolet osoittavat eteen- ja taaksepäin-alukkeita. 3’liitinpohjasta kunkin alukkeina sopeutettiin mukaan sen vastaava mutaatio, ja on lihavoitu ja alleviivattu. Kodonit ja mutatoitunut emäkset on alleviivattu.

Multiplex alleelispesifinen PCR (MAS-PCR) määritys

Yksi reaktio oli kaksi

KRAS

alukkeita ja seitsemän alukkeina kohdistaminen seitsemän mutatoitujen nukleotidin sisällä

KRAS

geeni. MAS-PCR-reaktio 50 ul: n kokonaistilavuudessa sisälsi 1 x PCR-puskuria, 2,5 mM MgCl

2, 0,2 mM dNTP: tä (Biolabs, England), 0,625 U AmpliTaq Gold DNA-polymeraasia (Applied Biosystems, USA), 50-100 ng /pl DNA-templaattia. Optimoitu pitoisuudet kutakin aluketta on esitetty taulukossa 1. Reaktioseosta monistettiin seuraavissa olosuhteissa: aluksi denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 10 sykliä 95 ° C: ssa 30 s, 60 ° C: ssa 45 s, 72 ° C: ssa 60 s, toinen vaihe, 20 sykliä 95 ° C: ssa 30 s, 64 ° C: ssa 45 s, 72 ° C: ssa 60 s, ja kolmasosa vaihe 20 sykliä 95 ° C: ssa 30 s, 55 ° C: ssa 45 s, 72 ° C: ssa 60 s, ja lopuksi 10 minuutin ajan 72 ° C: ssa. Monistuksen jälkeen amplikonien kanssa lastaus 20 ui analysoitiin 8% polyakryyliamidigeelielektroforeesilla 140 V: ssa 60 minuutin ajan, ja geelit värjättiin SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (1: 400, Lonza, USA) 30 min. Koska 3 ’jokaisen AS alukepareja vastaavien nukleotidin emästä mutantin sekvenssin

KRAS

geenin, alleelispesifinen fragmentti monistettiin, jolloin saatiin yksi 97-bp, 91 bp: n, 89- bp, 85 bp, 83 bp, 68 bp ja 64 emäsparin tuotteet (edusti G12C, G12D, G13D, G12R, G12A, G12V, ja G12S mutantit, vastaavasti) yhdessä positiivisen 113 bp kaistan sisäisenä ohjaus. Kun taas villityypin DNA tahansa seitsemästä kannat estää alleelispesifinen monistus johtaa vastaavan puuttuu band (kuvio 2).

määritys erottaa villityypin

KRAS

geenin kodonit 12 ja 13 eri mutanttien avulla alukkeina. Kaista M: Pienmolekylaarinen DNA tikkaat; Kaista 1: negatiivinen kontrolli; Kaista 2: villityyppinen; Kaista 3: G12S mutantti; Kaista 4: G12R-mutantti; Kaista 5: G12C mutantti; Kaista 6: G12D mutantti; Kaista 7: G12A mutantti; Kaista 8: G12V mutantti; Kaista 9: G13D mutantti.

herkkyys MAS-PCR-määritys

Kahdeksan plasmidiklooneille on

KRAS

villin tyypin ja seitsemän

KRAS

mutantit (G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, tai G13D) uutettiin. Kukin mutatoitu plasmidi-DNA sekoitettiin villityypin plasmidi-DNA: yhteensä 100 ng. Osuus mutantti-DNA alennettiin asteittain, jolloin saatiin vähentämällä suhde mutantin villityypin DNA: 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2%, 1% ja 0,1%. Tarkkuus ja toistettavuus määritettiin neljässä toistuvaa ajaa analysoimalla seosten välillä alimman toteamisrajan jotka osoitettiin MAS-PCR.

Tietojen analysointi

saadut tulokset MAS-PCR ja pyrosekvensointi verrattiin 270 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut näytteet ja arvioitiin merkitystä käyttäen Kappa tilastoja. Arvo k 0,81 pidettiin merkittävä ja osoittaa, että molemmat menetelmät tarjoavat lähes täydellisen tuloksen. Positiiviset ja negatiiviset sopimus varmoja aikavälein määritettiin MAS-PCR-tuloksiin. Erot kategorisen muuttujien kuten ikä, sukupuoli, histologinen ja Kasvainimplan- potilaiden välillä ja

KRAS

mutaatioita arvioitiin merkityksellistä chi-neliö testi. Tilastolliset testit olivat kaksipuolisia, ja p 0,05 pidettiin merkittävänä. Tilastot suoritettiin SPSS (versio 11.5).

Tulokset

pyrosekvensointi analyysi

KRAS

geenimutaatioita CRC yksilöiden

kaksisataaseitsemänkymmentä kliiniset näytteet analysoitiin en- pyrosekvensointi 6 eri pistemutaatioiden kodonissa 12 (G12S, G12R, G12C, G12D, G12A, ja G12V) ja yksi pistemutaatio kodonissa 13 (G13D) on

KRAS

geenin. Mutaatiot valittiin tähän tutkimukseen ovat yleisimmin löytyy peräsuolen syöpäpotilailla. Niistä 270 kudosnäytteet, sekvensointi tulokset paljastivat, että 120 tapauksessa (44,44%) oli mutaatio joko kodonien 12 tai 13

KRAS

geeniä, kun taas 150 tapausta (55.55%) määriteltiin

KRAS

villityypin (taulukko 2). 120 tapausta, joiden

KRAS

mutaatio, 61 (50,83%) potilaista oli kodonin 12 mutaatio. Yleisimpiä kodoni 12 mutaatio oli G12D klo 25.83%, jonka jälkeen G12V klo 12.50%. Ilmaantuvuus G12A, G12S ja G12C mutaatiot olivat 6-3%, kun taas G12R oli alin 1%. Kodoni 13-mutaatio G13D löydetty 49,17% oli yleisempää kuin mikään kodonin 12 mutaatiota. Potilailla oli joko yksi tai ei yhtään havaittavissa mutaatiota.

MAS-PCR-analyysi

KRAS

geenimutaatioita CRC kliinisissä näytteissä

MAS-PCR-määritys, suoritettiin 270 CRC kudosnäytteet havaitsemiseksi

KRAS

kodonissa 12 ja kodonin 13 mutaatiota, saatu tuloksia, läheisesti sovittu niiden kanssa pyrosekvensointi. Kuten esitetään taulukossa 2, 113 (41.85%) tapauksista

KRAS

mutaatio kodoneissa 12 ja 13 ja 157 tapausta (58,15%) on

KRAS

villityypin tunnistettiin MAS-PCR . Niistä 113 mutatoitunut tapauksissa 47.79% oli mutaatio kodonissa 12. Lisäksi viitaten pyrosekvensointi tuloksia, seitsemän mutatoitunut tapausta (kolme G12D, yksi G12R, ja kolme G12A) ei havaitse MAS-PCR. Kuitenkin kaikki kodonin 13 mutaatiota tunnistettiin oikein, kuten pyrosekvensointi tuloksia.

korrelaatio potilaiden ominaisuuksien osalta

KRAS

kodonissa 12 ja 13 mutaatioiden

Potilaiden mediaani-ikä oli 62 vuotta vaihtelee 27-90 vuotta vanha. Suurin osa potilaista oli 60 ja 79-vuotiaita (55,19%). Miesten ja naisten suhde oli 1,55: 1. Hallitseva histologinen tyyppi klo 64.81% (175/270) oli kohtalaisen eriytetty, ja 88,52%: ssa tapauksista (239/270) oli peräsuolen primaarikasvainten (taulukko 3). Mahdollinen korrelaatio potilaiden demografiset ominaisuudet ja havaittu

KRAS

mutaatioita tutkittiin kuten taulukossa 3. Niistä tutkittiin potilailla,

KRAS

muuntunut syöpä, ei havaittu merkittäviä eroja iän suhteen , sukupuoli, histologinen ja kasvainpaikkaa. Mutaatiot kodoneissa 12 ja 13 olivat melko ja tasaisesti jakautunut ryhmien sisällä ovat lähellä 1: 1-suhteen riippumatta ominaisuus.

vertailu MAS-PCR ja pyrosekvensointi

Tulokset 270 FFPE näytteet altistettiin sopimuksen analysoidaan, ja MAS-PCR havainnot verrattiin että pyrosekvensointi menetelmällä (taulukko 4). Yhtäpitävät tulokset 263 ulos 270 näytteet osoittivat, että molemmat menetelmät olisivat täydellisiä tuloksia (p 0,05) ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa määritykset (k = 0,947, 95% CI = 0,909-0,986). 7 tapauksissa ristiriitainen tuloksia saatiin, lähinnä koskien kodonin 12 mutaatiota, jotka olivat havaittavissa pyrosekvensointi ja Sangerin suoralla sekvensoinnilla mutta ei MAS-PCR. Positiivinen sopimus ja negatiiviset sopimus oli 94% ja 100%, vastaavasti.

Herkkyys, tarkkuus ja toistettavuus MAS-PCR

KRAS

mutaatio

arvioida herkkyyttä MAS-PCR-määritys, plasmidi-DNA jokaisesta seitsemästä

KRAS

mutanttiklooneissa laimennettiin erillisissä monistusreaktioissa, jossa plasmidi-DNA villityypin

KRAS

klooni. Osuus mutantti-DNA alennettiin asteittain, jolloin saatiin vähentämällä suhde mutantin villityypin DNA: ta. MAS-PCR-määritys havaitsee Mutanttialleelit alas 1%, että G12S mutantti, ja 2% G12R, G12C, G12D, G12A, G12V, ja G13D mutantteja. Edustaja esimerkki MAS-PCR-määritys alin havaitsemisraja on esitetty kuvassa 3. testata tarkkuus ja toistettavuus meidän MAS-PCR-määritys, me määrällisesti

KRAS

mutaatioita DNA sisältäviä seoksia kuhunkin seitsemän mutantti

KRAS

DNA: n ja villityypin DNA: ta eri suhteissa (10%, 5%, 2%, 1%, 0,1% ja 0,01%) neljän toistettiin kulkee. Tulokset olivat tarkkoja ja toistettavia, jonka sama pienin määrä

KRAS

Mutanttialleelit havaittiin kaikki toistuvat kulkee.

edustaja geeli on esitetty. Laimennokset G12R plasmidimutantti ja villityypin plasmidi-DNA (100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2%, 1% ja 0,1% mutatoituja alleeleja) Kaista M: Alhaisen molekyylipainon DNA Ladder; Kaista 1: negatiivinen kontrolli; Lane 2-9: vastasi PCR-tuotteet 100%: sta 0,1%.

Keskustelu

Useat tutkimukset ovat tarkastelleet yhdistyksen

KRAS

mutaatioiden kanssa CRC [ ,,,0],8, 33-37].

KRAS

mutaatioita CRC potilailla korreloi vastustuskykyä EGFR hoito, kuten setuksimabi tai panitumumabipitoisuus [7]. Siksi tarkka ennustaminen terapeuttisen vaikutuksen säästän potilaita tarpeetonta hoitoa kun keskitytään yksilöllisempiä tehokas hoito. Laaja valikoima menetelmiä on kehitetty, ja useita kaupallisia molekyy- sarjat ovat yleisesti saatavilla havaitsemiseksi

KRAS

mutaatioita [10, 11, 14, 17, 20, 23]. Kullakin tekniikalla on omat ongelmansa ja kysymyksiä. Esimerkiksi suora sekvensointi on yleisimmin käytetty lähestymistapa seulomiseksi

KRAS

mutaatiot, mutta herkkyys havaita mutantti-DNA on alhainen ja vaatii vähintään 10% -30% mutatoitujen alleelien villityypin tausta [ ,,,0],14, 18, 38]. HRM on nopea menetelmä, joka mahdollistaa korkea-seulontaan

KRAS

mutaatioita kohtuullisella analyyttisen herkkyyden 5%: sta 6%: [14], mutta sen tärkein rajoitus on kyvyttömyys tunnistaa, joka kodonin on mutantti. HRM tulokset on varmistettava, ja tunnistaminen spesifisiä mutaatioita vaatii toinen tekniikka, kuten suora sekvensointi [39]. Pyrosekvensointi on tarkka, toteutettavissa ja on ylivoimainen analyyttinen herkkyys on noin 5% mutantti alleeli [14, 18]. Kuitenkin tämä määritys edellyttää kalliita väline, ja kalliiden reagenssien ja tarvikkeiden, joten se kalliiksi kehitysmaiden käyttöön. Kaupalliset molekyyli sarjat ovat erilaisia ​​etuja, kuten suuri herkkyys (ts detektioraja noin 1%: sta alle 5%), nopeus, helppo tietojen tulkinta, ja lukuisat havaittavissa sijainnit

KRAS

mutaatioita, mutta tämä määritys edellyttää myös kallis väline, kalliiden reagenssien, ja sillä on suhteellisen korkea hinta per näyte [40]. Näin ollen on olemassa tarve kehittää tarkka, yksinkertainen ja kustannustehokas menetelmä havaita

KRAS

mutaatioita, joiden tiedetään liittyvän CRC, jota voidaan käyttää kehitysmaissa.

Tässä tutkimuksessa olemme menestyksekkäästi kehittänyt erittäin herkkä ja spesifinen MAS-PCR-määritys, kohdistaminen seitsemän (eli G12S, G12R, G12C, G12D, G12A, G12V, ja G13D) yleisimmät mutaatiot kodoneissa 12 ja 13

KRAS

geenin. Suunnittelimme spesifisiä alukkeita kunkin mutaation, ja mutaatio-epäspesifinen alueella käytettiin viite amplikonin. 3′-pääte pohjan kunkin pohja- hyväksyttiin mukaan sen vastaavaan mutaatio. MAS-PCR-määritys optimoitiin kutakin aluketta kannalta alukekonsentraatio ja Monistusparamctrit. MAS-PCR-määritys raportoimme tässä on ensimmäinen kehittämistä multiplex alleelin-PCR käyttämällä standardi PCR-menetelmällä, joka voisi havaita seitsemän yleisintä

KRAS

geenimutaatioita. Menetelmää voitaisiin yksinkertaisesti suorittaa vähän resursseja laboratorioissa. Lisätutkimuksia on matkalla kehittää yksinkertainen, nopea ja käyttäjäystävällinen Nucleic Acid Lateral Flow (NALF) immunoassay [41] käyttäen biotinyloitua alukkeita perustuen alukkeita kehitetty tässä tutkimuksessa. Lisäksi anturi-pohjainen reaaliaikainen PCR voitaisiin perustaa käyttämällä MAS-PCR asetetaan tunnistamaan

KRAS

mutaatioita. Molemmat menetelmät voivat olla edullisia estettiin ylikuulumisen näytteiden välillä ja /tai ympäristön saastumista aikana suorittaa kokeilujen.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että tiheys

KRAS

onkogeenimutaatiot kodoneissa 12 ja 13 270 näytettä paksusuolen syövän Thai potilaista oli 44,44%. Samanlaisia ​​taajuuksilla, jotka vaihtelevat 20-50%, on kuvattu aikaisemmin [28, 30, 33]. Löysimme määrien mutaatioiden kodonissa 12 ja Kodonit 13 olivat 50.83% ja 49.17%: lla, jotka olivat korkeampia kuin raportoitu muissa tutkimuksissa (kodoni 12: 70-90%, kodonissa 13: 10-30%) [28 , 30, 31, 33]. Kuitenkin meidän tulokset antoivat samanlaisia ​​taajuuksilla (kodoni 12: 52,62% (10/19), kodonissa 13: 42.12% (8/19)) on raportoinut Poehlmann et al [17]. Usein löytyi G13D, G12D, ja G12V mutaatiot tunnistettu tässä tutkimuksessa olivat yleisin

KRAS

mutaatioita, suostumuksella muissa tutkimuksissa [17, 28, 33]. Tuloksemme osoittivat, että mitään merkittävää yhdistyksen välillä

KRAS

mutaatioita ja ikä, sukupuoli, histologinen tai kasvainpaikkaa. Kuitenkin jotkut aiemmissa raporteissa havaittu, että korko

KRAS

mutaatiot olivat korkeampia naisilla kuin miehillä [10, 42], joka oli vastapäätä tutkimuksen Poehlmann et al [17].

tiedot osoittivat ylivoimainen johdonmukaisuus MAS-PCR ja pyrosekvensointi (k = 0,947). Seitsemän diskordansseja havaittiin mukaan pyrosekvensointi tuloksia. Suora sekvensointi ja pyrosekvensointi paljasti saman Mutanttialleelit, joka koostui 3 tapausta G12D, 3 tapausta G12A, ja 1 tapauksessa G12R. Yksi mahdollinen lopputulos on muodostumista rajat dimeerien välinen alukkeiden johtaa vääristyneisiin vahvistus, joka voi vähentää herkkyyttä MAS-PCR-määritys [43]. Lisäksi, FFPE kudosnäytteet voi olla huonontunut nukleiinihappoja johtuen fiksaatioprosessi, ja vaikutus silloitusaineen fixatives nukleiini- happojen on haitallista aiheuttaa PCR-inhibition [44, 45]. Mielenkiintoista on, että meidän MAS-PCR-määritys osoitti korkean analyyttinen herkkyys havaita, noin 1-2% mutantti alleeli havaitaan perustuen DNA sekoittamalla kokeita käyttäen genomista DNA: ta, eristettiin plasmidista kloonatusta DNA: sta. Tällainen herkkyys voi vaikuttaa harkittaessa kliiniset näytteet, jotka ovat yleensä monimutkaista läsnäolo PCR häiritsevien komponenttien näytteistä. Kuitenkin suurin häiritseviä komponentteja voitaisiin eliminoida DNA: n puhdistus käyttämällä FFPE kudosta sarjat kuten käytetty tässä tutkimuksessa ja kuten aikaisemmin on kuvattu [46, 47]. Lisäksi MAS-PCR-määritys, että olemme kehittäneet on suurempi herkkyys kuin mitä on raportoitu suoraan sekvensointiin ja HRM (eli 5%: sta 20%), ja vastaa, että raportoitu pyrosekvensointi ja kaupallisten molekyylitason sarjat (eli 1% 5%) [14, 18, 38]. Lisäksi löysimme hyvä tarkkuus ja toistettavuus kehittyi määrityksen, koska neljä toistuvaa ajaa tuotti samat tulokset. Lisäksi MAS-PCR on nopea määritys vaatii vain 4 h loppuun määritys (ilman DNA-eristys); se on edullinen, maksaa noin $ 8 prosenttia testiä. Lisäksi määritys työllistää vain PCR väline, eikä vaadi korkeaa teknistä osaamista ja erikoistuneita laitteita.

Johtopäätökset

Yhteenvetona kehitimme MAS-PCR-määritys toteamiseen seitsemän yleisintä mutaatiot kodoneissa 12 ja 13

KRAS

geeni. MAS-PCR-määritys on DNA-pohjainen protokolla, joka oli helppo suorittaa, on nopea, kustannustehokas, erittäin herkkä ja erittäin spesifinen. Määritystä näiden ominaisuuksien on tärkeää analysointi kliinisistä näytteistä, kuten FFPE kudoksissa, erityisesti auttamaan kliinikot ennustaa kliinistä monoklonaalinen anti-EGFR-vasta-hoitoa metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaista.

Kiitokset

kirjoittajat kiittää tohtori Chupong Ittiwut ja tohtori Rungnapa Ittiwut (osaamiskeskus lääketieteellisen genetiikan, Chulalongkorn University) niiden neuvoja pyrosekvensointi tekniikoita. Haluamme kiittää Department of Medical Services, Institute of Pathology, Ministry of Public Health tarjota CRC kudosnäytteet ja pyrosekvensointi väline. Haluamme ilmaista kiitollisuutemme professori Kathleen L. McCoy (Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, Virginia Commonwealth University), joka tukee taloudellisesti apurahan ulkomaisten tutkijoiden ja tutkijoita lisätä julkaissut artikkeleita kansainvälisissä lehtien kautta Chulalongkorn University Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund 2015 hänen kriittinen lukema käsikirjoituksen. Haluamme myös tunnustaa Assoc. Dr. Pornpimol Rongnoparut oikoluettavaksi apua.