Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keratiini 23 (KRT23) ilmentyy voimakkaasti paksusuolessa adenokarsinooman mutta poissa normaalissa paksusuolen limakalvolla. Array pohjainen metylaatio profilointi 40 paksusuolen näytteiden osoitti, että promoottori KRT23 metyloitiin normaalissa paksusuolen limakalvolla, kun taas hypometyloidut useimmissa adenokarsinooman. Promoottori metylaatio korreloi poissa ilme, kun taas lisääntynyt KRT23 ilmentymistä Tuumorinäytteissä korreloivat promoottori hypometylaatio, mikä vahvistetaan bisulfiitti sekvensoinnilla. Demetylaatio indusoi KRT23 ilmaisun

in vitro.

Expression profilointi shRNA välitteisen vakaa KRT23 knockdown paksusuolen syöpäsolulinjoissa osoitti, että KRT23 ehtyminen vaikuttaa molekyylien solusyklin ja DNA-replikaatioon, rekombinaation ja korjauksen.

In vitro

analyysit vahvistivat, että KRT23 ehtyminen vähensi solujen lisääntymisen SW948 ja LS1034-solut ja merkittävästi vähensi liittyvien geenien ekspressiota in DNA-vaurioita vastaus, pääasiassa molekyylien kahden juosteen murtuman korjautumisessa homologisen rekombinaation kautta. KRT23 Knockdown vähensi otteen ja proteiinin ilmentymistä avainmolekyylejä kuten esim. MRE11A, E2F1, RAD51 ja BRCA1. Knockdovvn KRT23 sulatettu koolonkarsinoomasoluissa herkempiä säteilytys ja vähentänyt leviämisen KRT23 köyhdytetyn solujen verrattuna säteilytettyä kontrollisoluihin.

Citation: Birkenkamp-Demtröder K, Hahn SA, Mansilla F, Thorsen K, Maghnouj A, Christensen R, et ai. (2013) Keratin23 (KRT23) Knockdown Vähennykset leviämisen ja Vaikuttaa DNA Damage Response of koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 8 (9): e73593. doi: 10,1371 /journal.pone.0073593

Editor: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Saksa

vastaanotettu: 20 marraskuu 2012; Hyväksytty: 25 heinäkuu 2013; Julkaistu: 09 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Birkenkamp-Demtröder et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat avustuksia John ja Birthe Meyer säätiö, Lundbeck Foundation, NOVO Nordisk Foundation ja Tanskan Research Council. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) kattaa noin 10% koko maailman syöpätapauksista kokonaispituudeltaan viisi vuotta selviytymisen noin 50% [1]. Varhainen diagnoosi ja parempaa hoitoa CRC edellyttää tunnistaakseen uusia biomarkkerit sekä oivalluksia molekyylimekanismeihin peräsuolen syövän synnyn.

Kaksi suurta molekyyli- alaryhmiä paksusuolensyöpä olemassa, mikrosatelliittien epävakaa (MSI) ja microsatellite vakaa (MSS ) [2], jossa MSI kasvaimet edustavat noin 15% koko esiintyvyys [3]. Mikrosatelliittimarkkereita instable kasvaimet osoittavat mutaatioiden tai epigeneettiset muutokset yhteensopimattomuuden korjauksen geenejä, jotka johtavat muutoksiin mikrosatelliitti DNA (lyhyt toistuva sekvenssit DNA). Lisääntyvä todistusaineisto viittaa siihen, että MSI kasvaimet ovat yhteydessä hyvään ennusteeseen [4] ja että potilaat, joilla MSI voi hyötyä fluorourasiilin kemoterapiaa liitännäishoitona [5] [6].

Useat epigeneettisellä poikkeavuuksia on kuvattu CRC [ ,,,0],7]. Poikkeava metylaatio paksusuolessa voidaan havaita jo varhaisessa syöpää edeltävät vauriot sekä kasvaimen vieressä normaali-näkymästä limakalvoa. Epigeneettiset geenin aktivointi perustuu DNA-demetylaation tai hypometylaatio promoottorialue on mukana taudin alkamisen ja etenemisen syövän [7].

keratiineja ovat väli- filamentin muodostava proteiineja epiteelisolujen. Tänään, 54 nisäkkäiden keratiineista tiedetään, 28 tyypin I (happamia) ja 26 tyypin II (perus-to-neutraali) keratiineista [8]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet aktiivista keratin osallisuudesta syöpäsolujen lisääntymistä, invaasiota ja etäpesäkkeiden sekä hoidossa reagointikykyä. Lisäksi on ehdotettu tutkimaan edelleen rooli keratiineista kuin monitoiminen säätelijöinä epiteelin tumorigeneesin [9].

Keratiini 23 (

KRT23

) kuuluu hapan tyypin I keratiineista [10] . KRT23 transkripti havaittiin indusoituvan voimakkaasti ihmisen haimasyövän solulinja AsPC-1 käsittelemällä histonideasetylaasi- inhibiittori (HDACi) [11]. Lisäksi K23 tunnistettiin kasvaimeen liittyvä antigeeni potilaiden seerumeista kanssa maksasyövän [12]. Aiemmissa tutkimuksissa me tunnistaa KRT23 otteen ja K23 proteiinin voimakkaasti yliaktiivista paksusuolen adenokarsinoomien verrattuna normaaliin limakalvoon [13] [14]. Kumpikaan KRT23 transkriptin eikä K23-proteiinin on osoitettu olevan prognostinen markkeri paksusuolen syöpä; kuitenkin, havaitsimme suuntaus, että potilailla, joilla on vaiheen II paksusuolen adenokarsinooman korkean KRT23 transkriptipitoisuuksissa näytti olevan alhaisempi toistumisen määrä. Fosfoproteiinia K23 kertynyt Golgin useimpien MSS kasvaimia, kun taas suurin osa MSI kasvainten osoittivat pieniä sytoplasmista ekspressiota tai olivat täysin negatiivisia K23 proteiinin ilmentyminen [14]. Yli-ilmentyminen KRT23 vähensi solujen elinkelpoisuuden MSI solulinjojen vaikka sillä ei ollut mitään merkittävää toiminnallista vaikutusta MSS solulinjoissa [14]. Promoottori sitova analyysi tunnistettu useita geenejä korreloivat KRT23 ilmaisun adenokarsinooman. Äskettäin Smad4 indusoituvan K23-proteiini tunnistettiin vuorovaikutuksessa keratiineista K8 ja K18, lämpösokkiproteiinit 60 ja 70, plectin 1, sekä 14-3-3epsilon ja gamma [15], mikä viittaa merkittävä rooli K23 in sääntelyprosesseista . Sääntelytehtäviin voidaan myös tukevat hyvin viimeaikaisten havaintojen Starman ym tunnistaa KRT23 mahdollisena biomarkkeri rasvamaksatulehdus [16].

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa sääntelyn mekanismi KRT23 ilme. Lisäksi meidän tarkoituksena on tunnistaa alavirran kohdegeenejä ja niihin liittyviä reittejä päälle KRT23 Knockdown, valaista vaikutuksia KRT23 heikentymisen molekyyli- ja solutason toimintoihin syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

tietoisen kirjallisen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja kaikki tutkimukset hyväksynyt Keski-Jyllanti valiokuntaistunnot Biomedical Research Ethics.

koko genomin metylointianalyysi

Perimän DNA Sarjapäätteeltä kryoleikkeet uutettiin käyttäen Puregene DNA: n puhdistus kit (Gentra Systems, Plymouth, MN). Tarvittaessa, kasvaimen koepalat makroskooppisesti leikataan rikastuttaa osa neoplastisten solujen vähintään 60%: iin ennen DNA: n eristämistä. Mediaani syöpäsolun prosenttiosuus oli 80%. Yksi mikrogramma DNA bisulfiitin muunnettu EpiTect bisulfiittimodifiointi Kit (Qiagen, Kööpenhamina, Tanska) käyttäen EZ-96 DNA Metylointi D5004 (Zymo Research, Orange, CA) mikrosiruja ja bisulfiitti sekvensointi. Bisulfiitti modifioitu DNA oli koko genomin monistettiin ja hybridisoitiin Infinium HumanMethylation27 BeadChips (Illumina, San Diego, CA) yli yön, kuten valmistaja on kuvannut. BeadChips skannattiin kanssa BeadXpress Reader väline (Illumina) ja tiedot analysoidaan Helmet Studio Metylointi Module Software (Illumina) kuten kuvattu yksityiskohtaisesti [17]. Metylaatiotasoilla tarjottiin beta-arvojen, jonka beta-arvo 0 vastaa ei metylaatio, ja 1 vastaa täydellistä metylaatio. Vertailussa metylaatiostatus verrattuna ilmentymisen tietojen log2 ilmaisu intensiteetit saatiin microarray ilmentymisen profilointi samoista näytteistä, näytteet normalisoitiin RMA ja transkripti intensiteetit log2 5 pidettiin ”ei ilmaista”.

bisulfiittimodifiointi Sequencing

bisulfiittimodifiointi muunnettu DNA monistettiin käyttämällä alukkeita suunniteltu MethPrimer (https://www.urogene.org/methprimer/index1.html). PCR-tuotteet geelipuhdistettiin ja kloonattiin käyttäen TOPO TA Cloning ® Kit Sequencing (Invitrogen, Taastrup, Tanska). PCR-monistus ja sekvensointi suoritettiin suoraan pesäkkeet M13-alukkeita (DNA Technology, Risskov, Tanska) ja TEMPase-DNA-polymeraasia (Amplicon, Skovlunde, Tanska). Kunkin geenin, 10 kloonia satunnaisesti valittua ja sekvensoitiin käyttämällä BigDye Terminator cycle sequencing kit ja 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Yksityiskohtaisesti, analysoitiin sekvenssi, joka käsittää 253 bp limittäin transkription alusta (1) ja ensimmäisen KRT23 eksoni. Genominen DNA eristettiin kaksi erilaista, 23 Tuumorinäytteiden potilaan näytettä (4 normaali limakalvo, 3 adenoomia, 5 MSI ja 12 MSS), ja soluja AZA käsiteltyjen HCT116-solut edellä kuvatulla tavalla käyttämällä Gentra Puregene-DNA Purification Kit (Qiagen). DNA oli vetysulfiitilla muunnettava MethylEasy DNA bisulfiittimodifikaatio Kit (Diagenode).

253 bp KRT23 amplikoni monistettiin PCR: llä TEMPase Hot Start DNA-polymeraasia (Amplicon) käyttämällä yhdistelmää, joka sisälsi alukkeita F1 (C): 5 ’ – GTGGTTTTCGTTTTTAGATTGTTT-3 ’ja F1 (T) 5′- GTGGTTTTTGTTTTTAGATTGTTT ja R1:5′- TCAAAACCAAACAACCCTAACCTA-3’. Amplikonien puhdistettiin geelissä (Gel 11Band Purification Kit, GE Healthcare) ja subkloonattiin pCR4-TOPO-vektoriin (Invitrogen) oli 12-16 kloonia kustakin kokeessa sekvensoitiin käyttämällä M13-forward- alukkeita. Sillä visualisointi metylaatiostatuksen, käytimme seuraavat ohjelmistot: https://quma.cdb.riken.jp/.

Colon Solulinjat

Saatiin American Type Culture Collection (ATCC-LGC standardit, Borås, Ruotsi) tai saatu Hahn lab valittiin uudelleen todennettu kautta STR analyysi [18] käyttämällä Cell-ID-järjestelmä (G9500, Promega, Nacka, Ruotsi), analysoitiin Applied-Biosystems3130 Genetic Analyzer. Ei mykoplasmakontaminaation havaittiin käyttäen sisäkkäisiä PCR-pohjainen mykoplasma havaitsemiseen. Koolonsyöpäsolulinjaa tässä tutkimuksessa olivat HCT116 (MSI), DLD1 (MSI), SW480 (MSS, p53 mutatoitu), SW948 (MSS, Dukes C-tyypin, luokka III, tuumorigeenisia, p53 mutatoitunut), LS1034 (MSS, Dukes C mutaatiot p53 (G245S), APC (E1309fs * 4) ja KRAS (A146T). ihmisen sikiön munuaisen solulinjan HEK293 käytetään E2F1 yli-ilmentymisen on myös uudelleen todennettu kautta STR-analyysi.

Solut kerättiin kaavinta pullot 1 ml lyysipuskuria ja kokonais-RNA uutettiin käyttäen GenElute Nisäkkäiden Yhteensä RNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, luett RTN350) mukaan valmistajan ohjeiden ja RNA eheyttä arvioitiin jonka Bioanalyzer (RIN = 9,9). RNA analysoitiin U133plus2.0 tai ExonST1.0 pakat (Affymetrix), vertailu analyysi suoritettiin käyttäen MAS5.0 ohjelmistoa. Probes liitettävä Inc /joulukuu puhelu ja log2 suhde