Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Telomeeri /telomeraasin järjestelmä on hiljattain tunnustettu houkutteleva kohde syövän hoitoon. Telomerase inhibitio johtaa kasvaimen taantumiseen ja lisääntynyt herkkyys eri sytotoksiset lääkkeet. Kuitenkin, se ei ole täysin selvitetty vielä onko välittäjänä näiden vaikutusten on telomeraasin esto

sinänsä

tai telomere lyhentäminen johtuvat esto telomeraasiaktiivisuuden. Lisäksi ominaisuudet ja mekanismit herkistyminen sytotoksisten lääkkeiden aiheuttama telomeraasin eston ei ole selvitetty järjestelmällisesti.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkimuksessa ominaista suhteellinen merkitys telomeraasin estäminen verrattuna telomere lyhentäminen syöpäsoluissa. Herkistyminen syöpäsolujen sytotoksisille huumeiden päästiin telomere lyhentäminen pituus riippuvaisella tavalla eikä telomeraasin esto

sinänsä

. Meidän järjestelmässä tämä herkistyminen liittyi vaikutusmekanismia sytotoksista lääkettä. Lisäksi telomere lyheneminen vaikuttaa myös muiden syöpäsolujen toimintoja, kuten muuttoliike. Telomere lyhentäminen aiheuttama DNA vaurioita, joiden korjaaminen on heikentynyt antamisen jälkeen sisplatiini samalla doksorubisiinin tai vinkristiini ei vaikuttanut DNA: n korjaukseen. Nämä havainnot tarkistettiin myös

in vivo

hiirimallissa. Otaksutun selitys taustalla fenotyyppi aiheuttama telomere lyhenemistä saattaa liittyä muutoksia ilmaisun eri MikroRNA laukaisi telomeerivasta lyhentäminen.

Johtopäätökset /merkitys

parhaan tietomme tämä on ensimmäinen tutkimus tunnusomaiset suhteellinen vaikutus telomeraasi eston ja telomeerien lyhenemistä monilta osin syöpäsolun fenotyypin, koskien erityisesti herkkyyttä sytotoksisille lääkkeille ja sen otaksuttu mekanismeja. MicroRNA muutokset syöpäsoluissa upon telomere lyhentäminen ovat uusia tietoja. Nämä havainnot voivat helpottaa kehittämistä telomere perustuu lähestymistapoja syövän hoidossa.

Citation: Uziel O, Beery E, Dronichev V, Samocha K, Gryaznov S, Weiss L, et al. (2010) Telomeeri lyhentäminen herkistää syöpäsolut Valitut sytostaattien:

In vitro

ja

In vivo

Studies ja Otaksuttavat mekanismit. PLoS ONE 5 (2): e9132. doi: 10,1371 /journal.pone.0009132

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 syyskuu 2009; Hyväksytty: 06 joulukuu 2009; Julkaistu: 09 helmikuu 2010

Copyright: © 2010 Uziel et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tuettu tutkimuksen avustuksia Rabin Medical Center Research viranomaisen ja tutkimus- avustuksen Sackler School of Medicine, tietolii- Avivin yliopistossa, Israel. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Human telomeerit koostuvat yksijuosteisen TTAGGG toistoa ja vastaavat duplekseja tämän heksanukleotidialuk- sijaitsee molemmissa päissä lineaarisen kromosomi. Yhdessä niiden erityiset shelterin proteiinikompleksi ne tarjoavat vakautta koko genomin, peittämällä kromosomi päättyy kohdellaan DNA korjausmekanismit kaksinkertainen katkeamisen [1]. Telomeres vähitellen heikentää useimmissa somaattisissa soluissa kun jokainen kierros DNA-replikaation, kunnes ne saavuttavat kriittisen lyhyt pituus, joka lopulta aloittaa lopettaminen solujen kasvua kutsutaan cellular vanhenemista [2]. Syöpäsolut käyttävät entsyymiä telomeraasin kiertää telomeerien lyhenemistä, ja siten saavuttaa loputon replikatiivisia potentiaalia. Telomeraasi on ainutlaatuinen käänteistranskriptaasi ribonukleoproteiini kompleksi, joka ylläpitää vakaan tilan telomeeripituuden syntetisoimalla TTAGGG toistot päissä kromosomeja. Se on erittäin aktiivinen yli 90% kaikista pahanlaatuisia ja siksi pidetään tunnusmerkki syöpä [3]. Telomerase ei ilmaista useimmissa normaaleissa somaattisten solujen mutta säilyttää kohtalainen aktiivisuus proliferatiivisia kantasoluja ja vielä enemmän uros- iturataa soluja. Koska tämä spesifisyys ja välttämättömyyden rajattomaan elinikä syöpäsolujen, telomeraasin pidetään voimassa ja houkutteleva syöpälääkkeiden tavoite [4].

Itse asiassa useat tutkimukset ovat osoittaneet, että telomeraasin inhibitio johtaa apoptoosin syöpäsoluissa, kutistuminen kasvainten kokeellisissa eläinmalleissa ja parannettu herkkyys kasvainsoluja eri syöpälääkkeiden tavoin [5]. Ei kuitenkaan ole selvää, ovatko nämä ”hyödyllisiä biologisesti toivottavia” vaikutukset ovat seurausta telomere lyhenemistä tai telomeraasin esto

sinänsä

. Lisäksi sitä ei ole vielä määritetty, jos lisälaite on herkkyys sytotoksisten huumeiden telomeraasin eston /telomere lyhentäminen on riippuvainen mekanismista tai luokka kemoterapeuttisen aineen.

Useimmat tiedot viittaavat siihen lyhenemiseen telomeres alle kriittisen rajan tärkeimpänä tavoite saavutetaan telomeraasin esto [6], [7], tukee käsitystä, jonka saavuttaa merkittävää telomere lyhentäminen johtaa anti syövän kliinisiä vaikutuksia. Kuitenkin useissa tutkimuksissa syyttämään muita ”ylitöitä” toimintaa telomeraasi jotka ovat riippumattomia telomeeripituuden sääntelyä. Esimerkiksi, telomeraasi on osoitettu olevan antiapoptoottisten ominaisuuksia [8], [9]. Lisäksi sen osallistuminen DNA-vaurioita vastaus [10] tai DNA suojaa ”kattoa” [11] määritettiin samoin. Telomerase myös osallisena geeniekspression valvontaa riippumatta telomeeripituuden ja panos kasvuun erilaisten hyvänlaatuinen [12] – [14] ja pahanlaatuisten [15], [16] soluja.

tavoitteena oli selvittää, miten tärkeää on telomeraasin eston

per

sellaisenaan verrattuna vaikutus telomere lyhenemistä syöpäsoluissa ja vaikutuksen arvioimiseksi näiden häiriöiden herkkyydestä solujen erilaisten sytotoksisten lääkkeiden kanssa eri toimintamekanismeja. Lisäksi meillä joilla pyritään kuvaavat mekanismeja, joilla solut lyhentää telomeeripituuden näytteille ero herkkyys näille lääkkeille.

Olemme havainneet, että telomeraasin esto

sinänsä

ei muuta herkkyyttä useiden pahanlaatuisten solulinjojen Jonkin huumeiden testattu. Pitkäaikainen telomeraasin eston, mikä johti telomeeri- lyhenemistä herkistyneet solut sisplatiini, DNA additiotuotteet muodostavan aineen eikä doksorubisiinille, kaksinkertainen katkeamisen tuottavan aineen tai vinkristiini, joka toimintatapa ei ole suorilla DNA-vaurioita. Nämä tulokset vahvistettiin eläinmallissa käytetään nude-hiirissä, joilla ksenografteja haiman karsinooman soluja, jotka olivat altistuneet telomeraasiestäjä ja sytotoksiset lääkkeet. Solut, joissa lyhyempi telomeres hankittu DNA vaurioita fenotyyppi jonka korjausta huononnetaan sen jälkeen sisplatiini vain ja ilmaisi miRNA, jotka liittyvät kasvun pysähtymisen syöpäsolujen. Nämä solut esitti myös hitaampi muuttoliike verrattuna niiden villityypin (WT) kollegansa. Ehdotamme, että telomere lyhentäminen syöpäsoluissa liittyy muutoksiin miRNA ilmaisun ja johtaa heikentyneeseen DNA korjaukseen altistumisen jälkeen sisplatiini erikseen.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

SK-N-MC (Ewingin sarkooma) noomasolulinjasta toimitti Dr. Gad Lavie (Sheba Medical Center, Ramat-Gan, Israel). MCF-7 (rintasyöpä) ja K562 (krooninen myelooinen leukemia)-soluja ylläpidettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10-15% lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia (FCS), glutamiinilla (2 mM), penisilliiniä ja streptomysiiniä (Beit Haemek, Israel ). Proliferaatiomääritykset, apoptoosin analyysit ja telomeraasiaktiivisuus määritykset suoritettiin kaikissa solulinjoissa. SK-N-MC line valittiin edelleen yksityiskohtaisen analyysin erilaisia ​​mekanismeja, jotka liittyvät vaikutus telomeraasin estoa herkkyys sisplatiini. Ohjaus solut pidettiin viljelmässä ilman telomeraasiestäjä, GRN163 rinnalla telomerase esti soluja.

Telomerase esto

Solut altistettiin kahdesti viikossa telomeraasiestäjä GRN163, kohdistaminen mallin alue RNA alayksikön telomeraasin (hTR). Ohjaus solut pidettiin viljelmässä ilman telomeraasiestäjä rinnalla inhiboitu soluihin. Sillä

in vivo

esto telomeraasi, hiiriin injektoitiin GRN163L, palmitoyyli (C16) lipidejä kiinnitetty N3′-P5 ”fosforoamidaatti versio GRN163. Molemmat yhdisteet ystävällisesti Geron Corporation (Menlo Park, CA, USA) B

lääkehoito ja

In vitro

Koeprotokolla

Kaikkia solulinjoja altistettiin seuraavien lääkkeiden kolme päivää ennen leviämistä, solusyklin ja apoptoosin analyysit: sisplatiini, DNA additiotuotteet muodostava lääke, doksorubisiini, kaksinkertainen lanka rikkomatta ainetta ja vinkristiini, joka häiritsee muodostumista karan mikrotubulusten, mikä pysäyttää erottaminen kahdennettu kromosomien ja ehkäisee solunjakautumisen. Pitoisuus lääkeaineiden on kuvattu tulososiossa.

vaikutuksen arvioimiseksi telomeraasin estäminen verrattuna telomere lyhenemistä herkkyydestä solujen sytotoksinen huumeita me kehittäneet neljä koeolosuhteissa: 1. Telomerase estyi vuonna kolme solulinjojen kolme päivää luoda soluja ilman telomeraasiaktiivisuudelle ja ehjät (WT) telomeres. 2. Pitkäaikainen esto (kolmesta 16 kuukautta), luoden soluja ilman telomeraasiaktiivisuudelle ja lyhentää telomeres. 3. peruuttaminen telomeraasiestäjä soluissa lyhennetyin telomeres, luoda soluja lyhyt telomeres entistetään telomeraasiaktiivisuuteen. 4. Kontrollina käytimme ehjät villityypin soluista. Telomeeripituuden ja IC50 kolmen sytotoksisten lääkkeiden määritettiin sen jälkeen, kun 3 ja 16 kuukautta kaikissa kolmessa solulinjoissa.

proliferaatiotestillä

Adherentit solut (1 x 10

4 solut ml

-1 SK-N-MC: n ja MCF-7) ympättiin neljänä 24-kuoppaisilla levyillä. Eri lääkkeet lisättiin seuraavina pitoisuuksina alue: vinkristiini: 0-100 ng /ml, doksorubisiini: 0-1000 ng /ml ja sisplatiini: 0-10 ug /ml. 3 päivän kuluttua, proliferaatio määritettiin Sulphordamine B määritys [17]. Leviämisen tarttumattomat K562-soluja määritettiin WST-1 määritys, joka seuraa muuntaminen tetratsoliumsuolan osaksi formatsaanin väriaineen mitokondrioiden entsyymit mukaan valmistajan ohjeiden (Roche, Saksa) ja kuten aiemmin on kuvattu [17].

TRAP Pitoisuus

Solut (5 x 10

4 /ml) maljattiin 24-kuoppalevyille ja inkuboitiin, kun läsnä on GRN163 varten 1-3 päivää. Kukin käsittely suoritettiin kahtena kappaleena. Sen jälkeen, mittaus telomeraasiaktiivisuuden suoritettiin PCR-pohjainen TRAP määrityksessä käyttäen TRAP

EZE telomeraasin detektioreagenssipakkaus (Intergene, NY, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden ja kuten aikaisemmin on kuvattu [17]. Lyhyesti, solut hajotettiin jääkylmällä CHAPS lyysipuskuria) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja myöhemmin sentrifugoitiin 13000 rpm: llä 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sitten supernatantti kerättiin ja proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Proteiiniuutoksia (0,2 ug) analysoitiin TRAP analyysiä. Kukin reaktio suoritettiin 50 ul: n reaktioseoksessa, joka sisälsi 10 x TRAP-puskurissa, dNTP-seosta, TS aluke, TRAP nalliseoksesta ja Taq-polymeraasia. Reaktiot suoritettiin 30 ° C: ssa 30 minuutin ajan ja altistettiin sitten PCR-monistukseen 30 sykliä 94 ° C, 58 ° C ja 72 ° C: ssa 30 s kukin, ja erotettiin elektroforeesilla 12,5% polyakryyliamidigeeleillä (Akryyli /bis 19:1 liuos). Geelit värjättiin SYBER Green nukleiinihapon geeli tahra (Amresco, Ohio, USA). Kvantitatiivinen suoritettiin käyttäen Määrä-one-ohjelman Bio-Rad: n Image analyysijärjestelmät (Bio-Rad Laboratories, Israel). Telomeraasiaktiivisuus laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti: TPG = [(X-X

0) /C]: [(r-r

0) /Cr * 100], jossa TPG on koko tuotetusta tuotteesta, X tarkoittaa kunkin näytteen, C edustaa 36 emäsparin sisäinen PCR-kontrolli, r on TSR8 kvantifiointi ohjaus.

TRF pituus

Terminal restriktiofragmentti (TRF) pituus, joka vastaa telomeeripituuden, mitattiin ei-radioaktiivinen Southern blot tekniikkaa. DNA-näytteet eristetään soluista, joita Genominen DNA-puhdistusvälinepakkausta (Gentra, Minneapolis, MN, USA) valmistajan ohjeiden, pilkottiin 16 h

HinfIII

ja

Rsal

ja erotettiin 0 · 8% agaroosigeeleillä. Siirron jälkeen positiivisesti varatulle nailonkalvolle, näytteet hybridisoitiin digoksigeniinillä-leimattu koetin (TTAGGG)

4 (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa) 16-18 tuntia. Kalvot altistettiin sitten kemiluminesenssin herkkiä elokuvia, ja keskimääräinen TRF pituudet laskettiin Versa Doc Imaging System, käyttäen Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad Laboratories).

Analyysit miR Allekirjoitus

RNA: n eristys.

RNA eristettiin käyttämällä EZ-RNA II kaupallista pakkausta (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) mukaan valmistajan ohjeita. Yleensä solut sen jälkeen, kun asiaa hoitoja lyysattiin lyysipuskuri sarjasta ja säilytettiin -70 ° C: ssa ennen RNA: n, joka on tehty kaikkiin soluihin kerralla ennen hybridisaatiota miRNA matriisia.

MicroRNA mikrosirujen.

Custom microRNA mikrosiruja on kuvattu aiemmin [18]. Lyhyesti, ~900 DNA oligonukleotidikoettimia edustavat microRNA (Sanger tietokannan versio 10 ja lisää MikroRNA ennusti ja vahvistanut Rosetta Genomics) nähtiin kominkertaisina päällystetylle mikrosirulla dioja (Nexterion® Slide E. Schott, Mainz, Saksa). Kukin RNA-näytettä (15 ug kokonais-RNA: ta) on merkitty ligatoimalla RNA-linkkeri, p-rCru-Cy /Dye (Dharmacon Lafayette, CO: Cy3 tai Cy5), 3′-päähän. Laseja inkuboitiin leimatulla RNA 12-16 tuntia 42 ° C: ssa ja pestiin sitten kahdesti. Arrays skannattiin resoluutio 10 um ja kuvat analysoitiin käyttämällä SpotReader ohjelmistoa (Niles Scientific Portola Valley, CA). Kahdenlaisia ​​positiivisia kontrolleja sisällytettiin koetta: (i) synteettisiä pieniä RNA: t piikki kuhunkin RNA-näytettä ennen merkintöjä tarkistaa merkintöjen tehokkuutta ja (ii) koettimia runsaasti pieniä RNA: t nähtiin vahvistamaan RNA laatua. Microarray täplät yhdistettiin ja signaalit normalisoidaan kuten aiemmin on kuvattu [18].

Tietojen analysointi.

Tiedot sisältyvät kaksi näytettä: SK-N-MC-soluja ehjä telomeres ja SK-N-MC solut lyhentää telomeres. Yhteensä 170 mikroRNA koettimien oli merkki siitä, että läpäissyt minimaalinen kynnys 300 ainakin yksi näytteistä. Jokaista näistä mikroRNA molekyylien laskimme signaalin kertainen muutos näytteiden välillä lyhyillä telomeres ja näytteen ehjä telomeerit.

Cell Cycle ja apoptoosi Analyysit

Solut (0,7-1 x 10

4 ml

-1) viljeltiin 3 päivää. Kelluvat ja kiinnittyneet solut yhdistettiin, pestiin PBS: llä ja ytimet valmistettiin 5 x 10

5-1 x 10

6-solujen virtaussytometria-analyysillä käyttäen pesuaine-trypsiini menetelmä seurasi värjäys propidiumjodidilla [19]. DNA-pitoisuus analysoitiin FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), käyttämällä ModFitLT solusyklin analyysi ohjelmisto (Verity Software House Inc., Topsham, ME, USA). Apoptoosi arvioitiin FACS-analyysillä, jonka solut pre-G1 vaiheessa solusyklin määriteltiin apoptoottisiksi.

havaitseminen γH2AX Foci

Solut maljattiin kansi liukuu ja altistetaan lääkkeet 24, kiinteän ja käsitellään kuten aikaisemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, pestiin kolme kertaa PBS: llä, ja läpäiseviksi 5% Triton X 10 min. Kolmen pesun jälkeen PBS: llä, solut estettiin 10%: lla normaalia aasi seerumia ja 1% BSA: ta, pestiin uudelleen PBS: llä ja inkuboitiin γH2AX-vasta-aineen liuosta (1:350, Upstate Biotechnology, NY, USA) 16 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Toinen vasta-aine CY2 konjugoitu anti-hiiri (Jackson Immuno Research Laboratories, PA, USA), lisättiin kolmen pestään PBS: llä. Kansi liukuu värjättiin DAPI ja asennus ratkaisu. γH2AX pesäkkeitä visualisoitiin alla fluoresenssimikroskoopissa (Applied Spectral Imaging, Migdal Haemek, Israel). 50 tumat laskettiin jokaisesta näytteestä.

Comet määritys

DNA-vaurioita tasoja soluissa eri telomeerien pituuksia ja aineellisia vahinkoja altistumisen jälkeen lääkkeitä arvioitiin komeetta määritys, kuten on kuvattu [21 ]. Tämä määritys seuraa hauraus taso DNA arvioimalla DNA-fragmentteja muuttoliike (tuotteita yhden ja /tai kahden säikeen katkoksia) alkaen ydin ydin muodostaa komeetta muotoaan joutuessaan elektroforeettisen kenttään. Värjäyksen jälkeen etidiumbromidilla, laajuus komeetta voidaan seurata ja mitata. Periaatteessa solususpensiota sekoitettiin 0,65% matalassa lämpötilassa sulavaa agaroosia ja levitä Tähti-pakkasta objektilasille, esipäällystetty 0,65% normaalin sulamispisteen agaroosia. Kolmas kerros, joka sisälsi 0,65% matalan sulamispisteen agaroosia päälle ja solut hajotettiin sen jälkeen upottamalla objektilasit yön yli juuri valmistettua lyysausliuosta (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100 , 10% DMSO: ta, pH 10,0) 4 ° C: ssa. Hajotuksen jälkeen, levyt pestiin kolme kertaa kylmällä vedellä ja asetettiin vaakasuoraan geelielektroforeesilla laite, joka sisältää juuri valmistettua elektroforeesin-puskuria (1 mM EDTA, 300 mM NaOH, pH = 13,0) 20 minuutin ajan, jotta DNA: n purkautumisen. Elektroforeesi jälkeen suoritettiin 20 V: ssa ja käynnistysvirta 300 mA: ssa 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Tämän jälkeen objektilasit neutraloitiin kolme pesua 0,4 M Tris, pH = 7,5, kuivattu etanolilla ja kuivattiin. Objektilasit värjättiin 20 ug /ml etidiumbromidia liuosta ja tarkasteltiin fluoresoivan valaistuksen käyttäen 530-550 nm: n virityssuodatin ja 590 nm sulkusuodin (U-MNG kuutio, Olympus, Saksa). Kaikki vaiheet suoritettiin pimeässä estää lisä-DNA-vaurioita. Arvioida komeetta parametreja, dioja tutkittiin rinnakkain käyttäen Viscomet kuva-analyysi-ohjelmisto. Yhteensä 150 satunnaisesti valitun soluja kolmena diat tutkittiin kullekin näytteelle (50 solua per slide). Kuva-analyysi suoritettiin x 200 suurennus. Solu kuvat oli projisoitu korkean resoluution Heper-OLI ™ (Sony, Japani) CCD-kamera (8 bittiä [Applitec, Israel, LIS-700]) ja analysoitiin Viscomet kuva-analyysi-ohjelmisto käyttämällä MV Delta kuvankäsittelykorttien (Matrix Vision , Saksa). DNA-vaurioita mitattiin käyttäen seuraavia parametreja: komeetta määrin (etäisyys johtavan pään reunasta takareunaan hännän), prosentuaalinen hännän DNA (prosenttiosuus DNA tail), ja hännän laajuus hetki (hännän pituus X prosenttiosuus hännän DNA ). Dioja koodattiin ja yhden tutkijan analysoidaan kaikki diat minimoimiseksi pisteytys vaihtelu.

Migration Analyysit

Migration solujen arvioitiin kahdessa kokeessa: haavan paranemista määritys ja muunnetun Boyden kammion määritys (transwell -määritys).

haavan paranemista määritys suoritettiin viite [22]. Solut ympättiin tiheydellä 0,2 x 10

6 solua /kuoppa kuuteen-kuoppaisille viljelylevyille ja annettiin muodostaa yksisolukerroksena. Kerros Solujen sitten raaputetaan P200 pipetin kärki luoda haava ~ 1 mm leveä. Kuvia haavat tallennettiin

t

= 0 ja 24 tuntia x 40 suurennus ja haava-alueen määritettiin käyttäen Scion Image for Windows alfa 4.0.3.2 ohjelmisto. Kyky solujen sulkea haava, joka on niiden liikkuvuus, arvioitiin määrittämällä parantunut alueella. Prosenttiosuus Parantuneiden alue laskettiin seuraavasti: (haavan alue

t

= 0-haava-alueella

t

= 22) /haavan alue

t

= 0) x 100. Levyt merkitty varmistaa yhdenmukainen valokuva-asiakirjat.

Modified Boyden kammio suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [23]. Solut ympättiin kolmena rinnakkaisena on polykarbonaattisuodattimille 8 um huokosia sijoitettu ylempään osastoon 24-kuoppaisen transwell kammiot (Costar, Cambridge, Mass, USA). Alapinta Transvvell- kammiot päällystettiin fibronektiinillä (5 ug /suodatin). Viljelyalustaa lisättiin alempaan osastoon. Solujen annettiin kulkeutua 18 tuntia 37 ° C: ssa ja sitten suodattimet fiksattiin metanolilla ja värjättiin Giemsa-värjäys. Solut yläpinnalla suodattimen poistettiin pumpulipuikolla. Lopuksi, solut, jotka ovat siirtyneet alapuolen suodattimen valokuvattiin ja laskettiin mikroskoopilla.

Eläimet

Kateenkorvattomiin nainen tai mies BALB /c

nu /nu

hiiriä, 5-6 viikkoa vanhoja, hankittiin Harlan Ltd (Jerusalem, Israel). Hiiret majoitettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa huippu suodatetaan häkeissä ja ruokitaan säännöllisesti ruokavaliota. Kaikki toimenpiteet suoritettiin käyttäen tilat ja protokollia hyväksymät Animal Care ja käyttö komitean Hadassah-heprealainen yliopiston lääketieteellisessä.

Human Vieraslajisiirteen hiirimallissa

CRL 1867 soluja (ihmisen haima karsinooma) kerättiin trypsinoimalla confluent viljelmät, pestiin, ja suspendoitiin uudelleen 1,0 x 10

8 solua /ml kasvualustaa. Hiiret inokuloitiin CRL 1687 soluja 100 ui väliaineessa alle selkäpuolen ihon seuraavana päivänä koko kehon säteilytys 400 cGy, toimittaman lineaarikiihdyttimellä (Varian Climac 6 x), jonka lähde ihon etäisyys 80 cm, ja annosnopeuteen 170 cGy /min. Hiiriä käsiteltiin 30 mg /kg i.p. GRN 163L 3 kertaa viikossa useiden viikkojen ajan, alkaen yhden päivän kuluttua kasvaimen injektion jälkeen. Kontrolliryhmä injektoitiin PBS: ää (0,2 ml i.p.). Kasvaimen kasvua seurattiin joka 6-8 päivä mittaharppimittauksilla kahden kohtisuoran halkaisijan ksenograftien (D

1, suurempi halkaisija ja D

2, pienempi halkaisija). Kasvaimen tilavuus mitattiin käyttämällä kaavaa: n /6 (D

1 × D

2), ja ilmaistaan ​​keskiarvona kasvaimen ± SE (mm

3). Klo 41-55 päivää sen jälkeen, kun solu injektion ajankohtana tappaminen, kasvaimet irrotettiin vapaa sidekudoksen painotettuna ja puolet jäädytettiin nestemäisessä typessä. Toinen puoli on käytetty telomeeripituuden määrittämiseksi ja patologiset parametrit.

Histologia

lopussa kokeiden, hiiret tapettiin ja kasvaimen, haima, ja keuhkokudoksesta poistettiin. Kudokset kiinnitettiin 10% formaliinilla, upotettiin parafiiniin, värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla, ja arvioitiin valomikroskoopilla.

Tulokset

In vitro

Studies

telomerase inhibitioastetta GRN163 lyhentää telomeerit.

hallinto GRN163 johti 70-90%: n esto telomeraasin (Fig. 1a). Tämä inhibitio jatkui jopa 72 tuntia, ja toistettujen mittausten koko 16 kuukautta kokeen todennettujen jatkuvan inhibition telomeraasi tällä alueella (ei esitetty). Kaikissa solulinjoissa telomeerit lyhennettiin on alueella 20-30% ja 40%, kun 3 ja 16 kuukautta, vastaavasti (Fig. 1 b).

a. SK-N-MC, MCF-7 ja K562 altistettiin 5 um ja GRN163. Telomeraasiaktiivisuuteen arvioitiin TRAP määrityksen jälkeen 24 tuntia. C- ohjaus käsittelemättömät solut, M- epäsuhta epäspesifinen salattu oligo, I-telomeraasiestäjä GRN163. R8- vakio TRAP ohjaus, N- negatiivinen kontrolli ilman solu-uutteita, IC- sisäinen PCR-kontrolli. Laajuus telomeraasin eston merkitään prosentteina alapuolella kaistaa. b. SK-N-MC-soluja altistuu jatkuvasti 5 uM ja GRN163. Telomeeripituuden mitattiin Southern blot. C- ohjaus käsittelemättömät solut, Ia telomeeripituuden altistettujen solujen telomeraasiestäjä kolme kuukautta, Ib- telomeeripituuden altistettujen solujen telomeraasiestäjä ja 16 kuukautta, M molekyyli- koko merkki. Tarkoittaa telomeeripituuden on merkitty alla kunkin kaistan, ja prosenttia telomere lyhentäminen on esitetty samoin. c. Graafinen esitys laajuudesta telomere lyhenemistä jälkeen altistuminen SK-N-MC-solujen GRN163 1 vuosi mitattuna Southern blot.

Telomeeri lyhentää mutta ei telomeraasin estoa

sinänsä

herkistää solut spesifisesti sisplatiini.

Kuten kuviossa. 2 ja taulukko 1 telomeerien lyhenemistä lisääntynyt herkkyys kolme solulinjojen sisplatiini pituudelta riippuvaisella tavalla. Telomerase esto

sinänsä

ollut itsenäistä vaikutusta solujen herkkyyttä sisplatiini. IC

50 sisplatiini laski 0.13μg /ml 0.07μg /ml 16 kuukauden. Telomere lyhentäminen ei vaikuttanut merkittävästi solujen herkkyyttä doksorubisiinin ja vinkristiinin. Taulukossa 1 esitetään yhteenveto näistä tuloksista ja Fig. 2 esittää yksityiskohtaisesti muutokset herkkyyden SK-N-MC-solujen sisplatiini. Koska kaikki solulinjat käyttäytyivät samalla tässä suhteessa, valitsimme SK-N-MC-soluja mallina edelleen luonnehdinta mekanismeista telomere lyhentäminen aiheuttama herkistyminen syöpäsolujen kemoterapiaa ja ero herkkyyttä sisplatiini.

a. Solujen lisääntymisen kanssa lyhentää telomeres alttiina sisplatiini. SK-N-MC-soluja jatkuvasti alttiina GRN163. Herkkyys solujen sisplatiini arvioitiin kolmen ja 16 kuukauden telomeraasin eston. Numerot osoittavat IC

50 lääkkeen näissä ajankohtina (jälkeen 22% ja 40% vähennys telomeeripituuden). P-arvo viittaa eroa WT ja lyhyt p-16 kuukautta. b. Solusyklin tilan SK-N-MC-soluja lyhentää telomeres altistunut 0.13μg /ml sisplatiinia. SK-N-MC-soluja lyhennettyjä telomeres altistettiin sisplatiini ja solusyklin tilan arvioitiin FACS. + Tai – tarkoittaa altistumista sisplatiini. C. apoptoottinen indeksi SK-N-MC-soluja lyhentää telomeres alttiina sisplatiini. Samat solut analysoitiin FACS: lla niiden apoptoottisen indeksi, kuten on esitetty heidän preG1 tilan. Numerot osoittavat LD

50 sisplatiini soluissa ehjät tai lyhentää telomeerit.

Telomeeri lyhentäminen ei vaikuta solusyklin tilan jälkeen altistus sytotoksisille lääkkeille.

Telomeeri lyhentäminen ei vaikuta solusyklin tilan solujen (palkit A ja C kuviossa. 2b). Altistuminen solut sisplatiini johti lasku G0 /G1 ja lisäys G2 /M-vaiheen solusyklin. Nämä muutokset eivät vaikuta lyheneminen telomeerit (kuva 2b). Myös telomere lyheneminen teki lisätä apoptoottista nopeus solujen johtuu kemoterapian (Fig. 2c).

Telomeeri lyhentämällä hitaampi migraatio syöpäsoluja.

Koska

in vitro

migraatio syöpäsolujen pidetään voimassa edustus metastasoituneeseen potentiaalia, arvioimme vaikutus telomere lyhenemistä tätä ominaisuutta samoin. Siirtyminen arvioitiin transwell kalvon (Boyden chamber) (Fig. 3a, b) ja haavan paranemista (Fig. 3c, d) määritykset. Kuten on esitetty kuviossa. 3, joka transwell kalvon määrityksessä solut lyhentää telomeres siirtynyt huomattavasti hitaampaa kuin kontrolli soluja. Haavanparantamislaite määritys osoitti myös taipumusta hitaampi maahanmuuttoa, mutta tulokset eivät saavuttaneet tilastollista merkittävyyttä.

migraatio solujen lyhentää telomeres arvioitiin Transvvell- ja haavan paranemista määrityksissä. a. Transvvell- kalvo määrityksessä. Solut ehjiä tai lyhentää telomeerit annettiin kulkeutua membraanin läpi 16 tunnin ajan, Gimza värjätään ja lasketaan. Edustava kuva näkyy. b. Graafinen osoitus keskimääräinen solumäärä neljästä itsenäisestä kokeesta. c. Haavan paranemista määrityksessä. Solut lyhennettyjä telomeres maljattiin petrimaljoille, ja viljelmää ”naarmuuntunut” ja seurattiin 24 tunnin ajan. Mittausten keskimääräisen solun vapaan aukot tehtiin. Edustava esimerkki esitetään. d. Graafinen osoitus keskimääräinen solumäärä neljästä itsenäisestä kokeesta.

Seuraavat tutkimukset suoritettiin selventämiseksi mahdolliset mekanismit fenotyypin muutosten aiheuttama telomeerivasta lyhentäminen.

Telomeeri lyhentäminen liittyy lisääntynyt DNA-vaurioita ja heikentynyt DNA korjaukseen kyky arvioituna comet. Sisplatiini edelleen heikentää DNA: n korjautumista solujen lyhentää telomeerit.

Telomeres lyhentäminen voi lisätä DNA-vaurioita vastaus menettämisen vuoksi sen suojaavan tehtävän. Arvioidaan taso DNA-vaurioita soluissa lyhyempiä telomeres käytimme komeetan määrityksessä. Kuten on esitetty kuviossa. 4a, b telomere lyheneminen liittyy DNA-vaurioita soluissa. Tail määrin hetkellä parametri (mikä hännän pituus X prosenttiosuus hännän DNA: ta, kun taas hännän pituus on etäisyys um pään keskeltä päähän hännän) oli 30% suurempi solujen lyhyempi telomeerit. Arviointi kaikkien muiden komeetta testiparametreja paljasti samanlaisia ​​tuloksia, ja yleinen komeetta intensiteettiä kasvoi noin 16% näissä soluissa.

a. Periaate komeetan määrityksen. Solut tumat altistettiin elektroforeesilla ja värjättiin etidiumbromidilla. Broken DNA siirtyy pois ytimien ja muodostaa komeetta. Kolme astetta DNA-vaurion näkyvät: ohjaus ytimet ehjän DNA: n (eli DNA-vaurioita soluissa ehjillä telomeres, # 1), välitila soluissa, joissa on osittain rikki DNA (eli solut, joilla on lievä telomere lyhentäminen, # 2) ja solujen Lyhennetty telomeres kätkeminen vahingoittunut rikki DNA (eli solujen lyhentää telomeres, # 3). b. Kvantitointi laajuudesta DNA-vaurion aseman solujen lyhentää telomeres, suoritetaan seulomalla 50 kuvaa per näyte nelinkertaistaa. On vasemman Tail määrin hetki parametri, sen hiiren koko komeetta intensiteettiä. c. Kvantitointi laajuus kyky soluja korjaamaan DNA vaurio Doksorubisiini- (oikea paneeli) tai sisplatiini (vasen paneeli) 2 ja 4 tuntia lääkkeen aiheuttama vaurio. Analyysi suoritettiin seulomalla 50 kuvaa per näyte neljän hengen. DNA vaurioita tila määritettiin laskemalla häntää määrin hetki.

ymmärtää, miksi solujen lyhyemmät telomeerit ovat herkempiä sisplatiini kuin doksorubisiinille, solut altistettiin näitä lääkkeitä yhden tunnin sen jälkeen muuttuvat keskipitkällä tai keskipitkällä ilman lääkettä. DNA-vaurioita tasot arvioitiin 2 ja 4 tuntia lääkealtistuksen käyttäen komeetta määritystä. Kuten on esitetty kuviossa. 4c, molemmat lääkkeet aiheuttama DNA-vaurioita, mutta solut lyhentää telomeres ei korjata DNA-vaurioita aiheuttamia sisplatiini, kun doksorubisiinin aiheuttamaa vahinkoa korjattiin samalla tavalla soluista sekä ehjänä ja lyhentää telomeerit.

telomere lyhentäminen liittyy muodostumiseen telomere aiheuttaman vaurion pesäkkeitä (TIF), jonka korjaus on heikentynyt solujen lyhentää telomeres. Sisplatiini edelleen heikentää puhdistumaan TIFs seuraavista telomeerivasta lyhenemistä.

DNA-vaurioita vastetta telomeres ilmenevät ulkonäkö TIF sisältävien γH2AX. a. b. c. Kuva.