Krooninen sairaus

​​

tiivistelmä

Background

Peräisin alkuitusoluista /gonocytes ja kehittää kautta esiasteleesio nimeltään syöpä

in situ

(CIS), sukusolujen Syövät (GCC) ovat yleisin syöpä nuorilla miehillä, osastoitu seminooma (SE) ja ei-seminoomasta (NS). Aikana fysiologisen sukusolujen muodostumista /kypsytys, epigeneettiset prosesseja vartija homeostaasin säätelemällä saavutettavuutta DNA helpottamiseksi transkriptio. Epigeneettiset sääntelyn kautta geneettisten ja ympäristötekijöiden parametrit (so genvironment) voivat häiritä alkion sukusolujen kehitystä, mikä johtaa viivästyneeseen tai tukossa kypsymistä. Tämä saattaa helpottaa muodostumista CIS ja eteneminen invasiivisia GCC. Siksi määritettäessä epigeneettiset ja toiminnallinen genomista maiseman GCC solulinjoissa voisi tarjota käsityksen patofysiologiaan ja etiologia GCC ja opastaa kohdennettuja toiminnallisia kokeita.

Tulokset

Tämän tutkimuksen tavoitteena on tunnistaa epigeneettiset jalanjäljet ​​SE ja EY solulinjoissa genominlaajuisten profiileja tutkimalla vuorovaikutusta geeniekspression DNA CpG metylaatio ja histonimodifikaation, ja niiden toiminta patofysiologiaan ja etiologiaa GCC. Kaksi hyvin tunnettu GCC solulinjat verrattiin, yksi edustaja SE (TCAM-2) ja toinen EY (NCCIT). Tiedot hankittiin käyttäen Illumina HumanHT-12-v4 (geenien ilmentyminen) ja HumanMethylation450 BeadChip (metylaatio) mikrosiruja sekä ChIP-sekvensointi (aktivoiva histonimodifikaation (H3K4me3, H3K27ac)). Tulokset osoittavat tunnettuja sukusolujen markkereita ei vain olla erotetaan toisistaan ​​SE ja NS ilmentymistaso, mutta myös epigeneettiset maisemaan.

Johtopäätös

Yleinen samankaltaisuus TCAM-2 /NCCIT tuki poistetuksi alkion sukusolujen pidätettiin varhain sukurauhasten kehitys yhteinen solu alkuperän vaikka tarkkaa kehitysvaihetta, josta kasvain solut ovat peräisin, voi vaihdella. Todellakin, hienovarainen ero (integroitu) epigeneettisellä ja ekspressioprofiileja osoittavat TCAM-2 näytteille entistä sukusolujen kaltaisia ​​profiilin, kun taas NCCIT näyttää enemmän pluripotentti fenotyyppi. Tulokset antavat käsityksen toiminnalliset genomiin GCC solulinjoissa.

Citation: van der Zwan YG, Rijlaarsdam MA, Rossello FJ, Notini AJ, de Boer S, Watkins DN, et al. (2014) seminoomasta ja alkiosyövät karsinooma Footprints Merkitty analyysi Integrated genominlaajuisten Epigeneettiset ja Expression profiilit sukusolujen Cancer Cell Lines. PLoS ONE 9 (6): e98330. doi: 10,1371 /journal.pone.0098330

Editor: Amr H. Sawalha, University of Michigan, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 30 huhtikuu 2014; Julkaistu: 02 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 van der Zwan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Array ja siru sekvenointitulosten on saatavilla Gene Expression Omnibus hakunumerolla GSE56454.

Rahoitus: Tätä työtä tukee rahoitusta Euroopan Society for Pediatric Endocrinology Research Fellowship (YZ). MR tukee Translational Grant, Erasmus MC. SB tukevat APA ja IMMATERIAALIOIKEUSJÄRJESTELMÄT stipendejä Monash University. Tätä työtä tukivat rahoituksella Monash University (SW). MIMR saa tukea Victorian hallituksen Operational Infrastructure Support Program. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tyyppi II (kivesten) itusolukasvaimet, tässä kutsutaan sukusolujen Syövät (GCC), ovat yleisimpiä maligniteetti valkoihoisilla nuorten ja nuorten aikuisten, ja niiden esiintyvyys on edelleen kasvussa [1] – [3 ]. GCC peräisin alkuitusoluista tai gonocytes, ja jaetaan seminomas (SE) ja ei-seminomas (NS), jossa syöpä

in situ

(CIS) kiveksen yhteisenä esiasteleesio [1], joka tunnetaan myös nimellä Intratubular Germ Cell neoplasiaa Unclassified (IGCNU) [3]. Toisin kuin CIS ja SE, kantasolu komponentti NS (ts, alkion karsinooma, EY) on ominaista pluripotenttien potentiaali [4]. EY voivat erilaistua somaattisten suvusta ja extra-alkiokudosten (teratoma vs ruskuaispussista kasvain ja choriocarcinoma, vastaavasti), kuten sukusolujen linjaa [4]. Erilaiset kliiniset, ympäristö- ja geneettiset riskitekijät GCC on tunnistettu, vaikka tarkkaa roolia näiden tekijöiden ei ole täysin selvä. Kliiniset riskitekijät muodostavat urologiset /Androloginen /sukupuolirauhasen poikkeamia [5] – [8], kun taas ympäristötekijät keskittyvät hormonaalisten haitta-aineiden ja androgeenin – estrogeeni tasapaino [9] – [11]. Geneettisiä riskitekijöitä kuuluu useita alttius yhden emäksen monimuotoisuus, todennäköisesti liittyvät varhaisen sukurauhasten kehitys [12] – [15] ja yhdessä familiaalinen alttius [16]. Somaattiset mutaatiot harvoin löytyy GCC [17]. On olemassa vahvoja viitteitä siitä, että mikro-ympäristö kehittää kives on huomattava merkitys patogeneesissä GCC. Potilaat, joilla Kivesten kehityshäiriö oireyhtymä (TDS) ja erityisiä muotoja Häiriöt Sex Development (DSD) tiedetään olevan suurentunut riski sairastua GCC epätavallisen sukurauhasten kehitys eli hypovirilization [18].

Epigeneettiset prosessit ovat selkeä rooli sekä aloittamisen ja suojaa pluripotenttisuuden [19]. Vapauttaminen näistä tiukasti kontrolloitua prosesseja tiedetään mukana muodostumista ja etenemistä eri syöpätyyppien [20] – [24], kuten GCC [25]. Aikana fysiologisen sukusolujen muodostumisen ja kypsymisen, epigeneettiset prosessit (esim. DNA: n metylaatio, histonimodifikaation) vartija homeostaasin säätämällä saavutettavuutta DNA helpottaa transkriptio [25], [26]. Epigenome on erittäin dynaaminen, ja tapahtuu muutoksia riippuen solutyypistä ja kehitysvaiheeseen, vaikutteita /heijastaa (mikro-) ympäristö. Tästä huolimatta tieto, tiedetään vähän roolista histonimodifikaation ja DNA: n metylaatio koskien geeniekspression GCC yleensä ja mahdolliset yhtäläisyydet ja erot SE ja EY [25], [27]. Epigeneettiset sääntelyn kautta geneettisten ja ympäristötekijöiden parametrien (kutsutaan genvironment) voivat häiritä fysiologisia alkion sukusolujen kehitystä, mikä voi johtaa viivästyneeseen tai tukossa kypsymistä, mikä helpottaa muodostumista CIS, ja mahdollisesti eteneminen invasiivisen GCC [25], [28] – [30]. Siksi määritettäessä epigeneettiset ja toiminnallinen genomista maiseman GCC solulinjoissa voisi tarjota käsityksen patofysiologiaan ja etiologiaa GCC. Tuloksia voitaisiin antaa ohjeita kohdennettua toiminnallista kokeita.

Tässä tutkimuksessa epigeneettiset jalanjäljet ​​SE ja EY solulinjoista tunnistettiin tutkimalla vuorovaikutusta geenien ilmentyminen, DNA: n metylaation ja histonimodifikaation. Kaksi hyvin tunnettu GCC johdettuja solulinjoja käytettiin, yksi edustaja SE (TCAM-2) [31], [32] ja toinen EY (NCCIT) [33]. Kahdenlaisia ​​epigenetic muutoksia tutkittiin ja liittyvät genomiin laaja ilmaisun analyysi: CpG DNA: n metylaation tila, ja rikastaminen aktivoimalla histonimerkkien (H3K4me3, H3K27ac).

Methods

Soluviljely

TCAM-2 [31], [32], [34] ja NCCIT [33]-soluja viljeltiin DMEM-alustassa (# 31966-021, Thermo Fisher Scientific /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (FCS, GE Healthcare Life Sciences, HyClone Laboratories, Utah, USA) T75- cm

2 pulloihin 75-90% konfluenssiin. RNA-valmisteen, lisättiin tuoretta väliainetta 24 tuntia ennen sadonkorjuuta. Solut pestiin kerran Hanksin tasapainotetulla suolaliuoksella (HBSS, # 14175-053, Thermo Fisher Scientific /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), ja hajotettiin 7 ml jääkylmää RNA-Bee (# Cs-105B, TEL -testi Inc, Friendswood, Texas, USA). Metylaation, geenien ilmentyminen (biologiset kaksoiskappaleet) ja siru-seq analyysit, eri soluviljelmät yhdestä lähteestä käytettiin (LEPO lab, Patologian osasto, Erasmus MC Rotterdam). Biologiset rinnakkaisnäytettä aloitti riippumattoman viljelmän eri päivinä ja käsitellään samalla tavalla.

metylointi profilointi

DNA eristettiin käyttäen DNeasy mukaisen pakkauksen valmistajan ohjeiden (# 69504, QIAGEN, Hilden, Saksa). Bisulfiittikonversion (EZ DNA Metylointi Gold Kit, Zymo Research, Irvine, CA, USA) ja metylaation havaitsemiseen suoritettiin ServiceXS (ServiceXS B.V., Leiden, Alankomaat). Illumina n HumanMethylation450 BeadChip käytettiin (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA, käsittelyä ja hybridisaatio mukaisesti valmistajan ohjeita). Kuvankäsittely käytiin Iscan järjestelmän ja tietojen uutettiin käyttäen GenomeStudio käyttämällä oletus analyysi asetukset (mukaan lukien taustakorjausta ja normalisointi perustuvat sisäistä valvontaa) ja v 1.2 merkintä ilmeinen (https://support.illumina.com/downloads /humanmethylation450_15017482_v12.ilmn). Jatkojalostus toteutettiin R käyttäen LUMI (https://www.bioconductor.org/) paketti [35] jälkeen optimoitu ”Lumi: QN + BMIQ” putki [36] Tähän sisältyy syrjäytymisen Heikkojen antureista (p 0,01), väri säätö, kvantiili- normalisointi ja korjaus mittapäätyypin bias (Infinium I vs II) käyttäen BMIQ algoritmia [37]. Kaikki raaka ja käsitellyt tiedostoja toimitetaan kuten GEO SuperSeries ja pääsee GSE56454 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Differentiaalisesti metyloitu alueet tunnistettiin käyttämällä DMRforPairs algoritmia oletusasetuksilla [38]. DMRforPairs on saatavilla Bioconductor: (https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DMRforPairs.html). Lyhyesti, DMRforPairs määrittelee genomialuetta käyttämällä paikallisia koetin tiheys ja valinnaisesti funktionaalinen homogeenisuus (esim. Kaikki koettimien alueella olisi liittyvän geenin). Se määrällisesti, testejä ja visualisoi (ero) metylaation välinen ainutlaatuinen näytteitä. Erot laskettiin NCCIT versus TCAM-2.

geeniekspressioprofilointi

Noin 20 ug RNA: ta, käsiteltiin RNaasi-vapaa DNaseI (# 2238, Ambion, Ambion Inc., Austin, TX , USA) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja sen jälkeen puhdistettiin käyttämällä RNeasy mini kit (# 74104, Qiagen, Hilden, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Puhdas RNA eluoitiin 50 ul: aan vettä, ja kvantitoitiin käyttäen Nanodrop (Thermo Scientific). Laadunvalvonta, RNA merkintöjä, hybridisaatio- ja tiedon louhinta suoritettiin ServiceXS B.V. (Leiden, Alankomaat) mukaan niiden in-house-protokollaa. Biotinyloitu cRNA valmistettiin käyttäen Illumina TotalPrep RNA -monistustarvikesarjaa (# AMIL1791, Ambion Inc., Austin, TX, USA) mukaan valmistajan spesifikaatioiden kanssa tuloon 200 ng kokonais-RNA. Näytettä kohti, 750 ng biotinyloitua cRNA hybridisoitiin päälle Illumina HumanHT-12 v4 (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) mukaisesti Illumina Manual ”Suora -hvbridisaatioanalvvsi Guide”. Kuvankäsittely käytiin Iscan järjestelmän ja tietojen uutettiin käyttäen GenomeStudio (oletusasetukset). Jatkojalostus toteutettiin R käyttäen LUMI paketti (https://www.bioconductor.org/) [35]. Ohjeiden esitetty [39], vankka spline normalisointi levitettiin log2 muuttaneet voimakkuuden arvoja. Koettimet p

havaitseminen 0,05 50% näytteistä jätettiin pois analyysistä (n = 27964 ulos 47323). Keskimääräinen log2 voimakkuudet biologisten rinnakkaisnäytteiden ja kohti geeni arviointiin käytettiin ekspressiotasoja (GEO hakunumero GSE56454). Log2 suhde (R) keskimääräisestä intensiteettien kahdessa solulinjassa (NCCIT /TCAM-2) käytettiin tunnistamaan merkittävästi differentiaalisesti ilmentyvien geenien. Geenejä ekspressiotasot ulkopuolella 99%: n luottamusväli (CI) tämän tukin suhteen tunnistettiin ilmentyvät eri välillä NCCIT ja TCAM-2.

histonimodifikaation profilointi (H3K27ac, H3K4me3) B

ChIP määritys suoritettiin pieni solujen määrä ChIP protokollan Diagenode (Liege, Belgia), vähäisin muutoksin. Lyhyesti, 1 x 10

6 soluja ristisilloitettu: ssa kahdeksan minuuttia lisäämällä formaldehydiä loppupitoisuuteen 1%, sen jälkeen neutraloidaan 1,25 M glysiiniä. Sitten solut hajotettiin, ja kromatiinin leikattiin ja ~500 bp fragmentit käyttäen Covaris sonikaattoria seuraavissa olosuhteissa; käyttömäärä 20%, huippu tapaus teho 200 wattia, sykliä /räjähtää 200, 5 min, lämpötila 4 ° C. Proteiini A-dynakuulia (# 10002D, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) inkuboitiin 7 ug seuraavilla vasta-aineilla: H3K4me3 (Diagenode pAb-003-050) tai H3K27ac (Ab4729, Abcam, Cambridge, UK). Helmet yhdistettiin kromatiinin 1 x 10

6 solua yön pyörivää rengasta. Immunohelmiä pestiin, ja DNA puhdistettiin käyttämällä iPure DNA-puhdistusvälinepakkausta (AL-100-0100, Diagenode, Liège, Belgia) valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA-fragmentit leikattiin toisen kerran käyttämällä Covaris sonikaattorilla (käyttömäärä 10%, huippu esiintyvyys teho 175 wattia, sykliä /räjähtää 200, aika 5 minuuttia, lämpötila 4 ° C). Massiivisesti rinnakkaisen sekvensointi siru DNA (chip Seq) suoritettiin käyttäen 5500xl Solid ™ sekvensointialustamme (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) on Monash Health Translation poliisiasemalle Medical Genomics Facility. Sekvensointigeelit kokeet olivat single-end 50 nt lukea pituus (300 nt keskiarvo palakooltaan). Sekvensointi lukee linjattu täydellisen hg19 ihmisen genomin (UCSC versio, helmikuu 2009) käyttäen LifeScope ™ Perimän Analysis Software v2.5 (https://www.lifetechnologies.com/lifescope). ChIP-Seq koenäytteiden normalisoituivat yhteensä 10

7 ainutlaatuisesti kartoitettu sekvensointi tunnisteita. Aineisto käsiteltiin HOMER ([40], https://homer.salk.edu/homer/chipseq/) havaitsemiseksi huiput ja motiivi rikastusta oletusasetuksia käyttäen (paitsi ”kertainen rikastus yli input” käytetyt 2; kynnystä p -arvo 0,01) (GEO-hakunumero GSE56454). Korkeuksien Homer korjattiin taustan (alin piikin korkeus havaittavissa). Heights sitten summataan per geeni (ΣP) kuin selityksin Homeroksen ja geenit ilman havaittavaa huippua asetettiin 0. Ero lasketaan yhteen piikkien korkeudet (ΔΣP = ΣP

TCAM-2-ΣP

NCCIT) käytettiin määrällisesti eroja solulinjoja. Geenit merkittävästi erilaiseen histonimodifikaation kuvioita havaittiin molempien merkkien erikseen (ulkopuolella 99%: n luottamusväli ΔΣP). Association of huipun TSS käytettiin selityksin Homer (1 kb vastavirtaan TSS – 100 emäsparia alavirtaan).

MLPA-DNaseI analyysi

MLPA alukkeet suunniteltiin seuraavat aiemmin kuvattu kriteerit [ ,,,0],41]. Perustuen erottava muuntelu malleja NCCIT ja TCAM-2 koettimet suunniteltiin seuraavat loci: NCCIT: CHR 3: 181425532-181425720, CHR5: 146699813-146699953, CHR3: 181577755-181577830, CHR6: 15240050-15240160, CHR 15: 93191596-93191696 , CHR3: 178908801-178908966, CHR5: 101550991-101551125, TCAM-2: chr11: 10613134-10613220, chr1: 201278163-201278251, CHR 12: 3091402-3091483, CHR 19: 13985162-13985322, CHR 2: 38323813-38323931, CHR 9: 843018 -843110, CHR5: 140762378-140762475. MLPA-DNaseI suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [42], vähäisin muutoksin. Lyhyesti, ytimet 1 x 10

6-solut eristettiin ja käsiteltiin eri DNaseI pitoisuudet (0, 2 ja 5 yksikköä). Digestoitu genominen DNA puhdistettiin, ja 50-100 ng ta käytettiin MLPA reaktiossa. PCR-monistuksen jälkeen ligatoitujen koettimien, tuotteet erotettiin ABI3700 DNA-sekvensserin. Tiedot analysoitiin kuten aiemmin on kuvattu, lasku 75% piikin korkeus pilkkoutumattomiin DNA käytettiin kynnykseksi määritellään DNaseI-yliherkkyys [43].

Ohjelmisto

Analyysit tehtiin R 3.0.1 (Windows 7 × 64) ja 2.15.2 (Redhat Linux × 64). Verkkojen /rikastamiseen analyysit tehtiin IPA (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Genominen kannat raportoitu tässä käsikirjoitus perustuvat GRch37 /hg19 kokoonpano.

Tulokset

Tutkitaan epigeneettisellä ominaisuuksia SE ja EY sekä niiden suhdetta geeniekspressiota, genominlaajuisten histonimodifikaation ja DNA metylaatiovyöhykkeiden tutkittiin solulinjoissa TCAM-2 (SE) ja NCCIT (EC), ja sovitetaan geeniekspressioprofiilit. Erot kahden solulinjan osalta histonimodifikaation ja DNA: n metylaatio tila ensin tutkittu erikseen. Sen jälkeen saatu aineistot yhdistettiin tunnistamiseksi (kohde) geenejä, joilla on vahva suhde pohjustettu DNA konfigurointi ja korkeampi ekspressiotasoja.

histonimodifikaation

histonimodifikaation kuvioita arvioitiin käyttäen kromatiinin immunosaostus yhdessä suurikapasiteettisten sekvensointi (chip kohdat). Data-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät osassa. Muutokset H3K4me3 ja H3K27ac tutkittiin, jotka ovat merkkiaineita, jotka liittyvät promoottoriaktivoinnilla (transkription aloituskohdasta (TSS), H3K4me3 ja H3K27ac) ja edistäjän aktivointi (lähinnä H3K27ac) [44], [45]. Sen lisäksi, että analysoitiin (ero) modifikaatiomalleja, aihe rikastuminen modifioidun alueiden tutkittiin ja verrattiin solulinjojen.

H3K4me3 ja H3K27ac eivät näytä ero rikastamista lähellä transkription aloituspaikkoja ja niiden piikkien korkeudet korreloivat sisällä geenejä.

riippuen solulinjasta, 10,2 /11,3%: n H3K27ac rikastetun loci sijaitsivat 1 kb TSS vastaan ​​vertailukelpoinen 14,7 /16,8% H3K4me3 loci (TCAM-2 /NCCIT) . Tämä on linjassa havaintojen muissa solutyypeissä, jotka osoittavat, vaikka H3K4me3 liittyy suoraan promoottoriaktivoinnilla suuri enemmistö H3K4me3 loci sijaitsevat distaalisesti TSS [46]. H3K27ac ole mitään raportoitu hakeutuvan TSS [47]. Taso summataan huippujen per geeni (ΣP, katso menetelmät) käytettiin vertaamaan histonimodifikaation kuvioita kahden histonimerkkien. Siellä oli merkittävä korrelaatio molemmissa solulinjoissa huippuarvo tasolle geenejä, jossa molemmat olivat läsnä (ρ

TCAM-2 = 0,62, p

TCAM-2 0,001, n

TCAM-2 = 1837; ρ

NCCIT = 0,37, p

NCCIT 0,001, n

NCCIT = 746; Spearmanin ρ). Tämä on sopusoinnussa niiden päällekkäinen toiminta: avoin kromatiinin kokoonpano liittyy molempien merkkien [19], [22] ja antanut meille mahdollisuuden yhdistää histonimodifikaation tulokset myöhempää analyysiä.

H3K4me3 ja H3K27ac rikastamiseen kuvioita TCAM-2 ja NCCIT ovat sopusoinnussa tunnettujen sE /EY markkereita spesifisyyden.

aiemmin osoitti, että aktiivinen chromatin muutos kaavoja

SOX17

ja

Sox2

solulinjoissa TCAM-2 ja NCCIT vastaa odotettua mallia, joka perustuu geenin ja proteiinin ilmentymiseen ja histologiset perustuslaki (

SOX17

aktiivinen TCAM-2,

Sox2

aktiivinen NCCIT) [25]. Tämän mukaisesti,

SOX17

ja

Sox2

oli differentiaalisesti rikastettu sekä H3K4me3 ja H3K27ac TCAM-2 ja NCCIT (kuvio 1).

Oct3 /4

osoitti väkevöimättömien sisällä koodaavan sekvenssin, mutta siellä oli rikastuminen molempien markkereita lähellä TSS vuonna NCCIT ja TCAM-2. Tämä on sopusoinnussa tunnettujen Oct3 /4-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen molemmissa solulinjoissa [31], [48]. Nanog oli rikastettu sekä merkkiaineiden TCAM-2 mukaisesti eroja ilmaisun tasolla (katso jäljempänä).

Nuolet osoittavat suunnan transkription. Vihreät laatikot osoittavat spesifisiä markkereita histologisen alatyypin edustaa solulinjan. Mustat laatikot = eroa solulinjat; punaiset laatikot = ei markkeri joka solutyypin. Huomaa eri valikoimia y-akselin H3K4me3 ja H3K27ac.

On genomin laajuisesti, 29428 H3K4me3 rikastettu loci tunnistettiin TCAM-2 ja 19015 in NCCIT. 25-41% enemmän rikastettua loci kartoitettiin H3K27ac kuin H3K4me3 (n

TCAM-2 = 41569, n

NCCIT = 23763). Geenit, joilla on merkittäviä eroja tiivistää huipun korkeus per geeni (ΔΣP, katso menetelmät) valittiin lisäanalyysiä. For TCAM-2, geenit osoittavat ero histonimodifikaation olivat suuremmat numero H3K27ac (n

TCAM-2 = 433, N

NCCIT = 28). Sillä NCCIT oli huomattavasti enemmän geenejä valittiin H3K4me3 verrattuna H3K27ac (n

TCAM-2 = 215, N

NCCIT = 325). Molempien tavaramerkkien 86/11 geenit päällekkäin ylä- eriyttää luetteloja TCAM-2 ja NCCIT vastaavasti. Näitä olivat SE merkki

SOX17

TCAM-2 ja n merkki

Sox2

vuonna NCCIT (kuva S1, taulukko S1). Toiminnallisesti geeni luettelot molempien solulinjojen osoitti merkittävää rikastumista varten (alkion) kantasolujen huolto /pluripotenttisuuden (taulukko S2). Rikastaminen biologisia toimintoja TCAM-2 osoitti samankaltaisuutta kypsempiä sukusolut, joka puuttuu luetteloon NCCIT (GO luokat TCAM-2 mukana tavanomaisista kiveksen morfologia ja sukusolujen ylläpito). Lisäksi kaksi sukusolujen erityisiä kanoninen väyliä IGF1- signalointia (log

p = 3,42) ja sukusolujen-Sertolin solujen Junction Signaling (log

p = 2,11)) osoitti rikastumista. TCAM-2, kaksi toiminnallista verkostoja tunnistettiin sisältävän AR polku ja rasva-aineenvaihdunnan (taulukko S2).

Sukusolujen markers AP-2α ja AP-2γ ovat top rikastunut motiivien TCAM-2, kun taas alkion kantasoluja soluspesifinen kuviot Sox2 /Oct4 /TCF /Nanog rikastetaan molemmissa solulinjoissa.

Merkittävästi rikastettu motiiveja tunnistettiin kustakin solulinjasta ja Histonimerkki (HOMER työkalu, katso menetelmät). Siellä oli vahva päällekkäisiä ansiokkaimmille rikastettu motiiveja NCCIT ja TCAM-2. Tämä päti sekä aktivoimalla markkereita. Esimerkiksi H3K4me3 alkuun rikastettu motiivi oli MAZ sekä TCAM-2 ja NCCIT, transkriptiotekijä liittyy MYC (sitoutuu kahteen sivustoja sen promoottori) ja tiedetään olevan osallisena transkription aloittamisen sekä päättymisestä [49] ( Kuva 2A, B; taulukko S3).

Kaikki motiiveja olivat merkittävästi rikastuneet kohde taustaan ​​sekvenssit (p 0,01). Kertainen rikastaminen on merkitty suhteessa tausta. (A, B) Top ranking motiiveja molemmissa solulinjoissa osoitti vahvaa päällekkäisyys (top 10). (C, D) Motiivit, jotka poikkeavat toisistaan ​​voimakkaasti välillä solulinjojen osalta niiden rikastusta valittiin. Motiivi arvioitiin myönteisesti jos sen sijoitus oli korkea (≤20) yhden solulinjan ja matala toinen solulinja (tai oli poissa muiden luetteloon rikastetun motiivien). Pisteet: Ero ranking arvioitiin perustuu eron suhteellisen aseman listassa (| 1- (r

TCAM-2 /n

TCAM-2) -1 (r

NCCIT /n

NCCIT) | ≥15%, n = nr rikastetun motiiveja, r on listalla tietyn motiivin luetteloon rikastetun motiiveja joko solulinja).

rajoitettu määrä markkereita osoitti eroja rikastamiseen välillä solulinjoista (kuvio 2C, D, taulukko S3). Sillä H3K4me3 viisi motiiveja tunnistettiin joka osoitti riittävää eroa. Neljä olivat korkeammat sijoittuu TCAM-2 ja yksi korkeampi NCCIT. Top sijoittui TCAM-2 motiivit esitellään tässä erottamaan luettelossa olivat EBF1 (osa kehitysprosesseissa), AP-2α ja AP-2γ (tunnetaan sukusolujen markkereita) ja Oct4 /Sox2 /TCF /Nanog (pluripotenttisuuden motiivi). Sillä NCCIT, E2F1 (solusyklikontrollin, toiminta tuumorisuppressorin proteiinien, solujen lisääntymistä) sijoittui korkeammalle. Sillä H3K27ac oli neljä erottaa motiiveja, joista kolme sijoitettu korkeammalle TCAM-2 ja yksi korkeampi NCCIT. Oct4 /Sox2 /TCF /Nanog motiivi oli kaikkein merkittävästi rikastettu motiivi H3K27ac vuonna NCCIT (sijalla 20 TCAM-2). Tämä motiivi tiedetään pääasiallisesti rikastettu alkion kantasoluja (ES-solut) [50] sekä alkion itusolujen, joka on sopusoinnussa kantasolun kaltainen alkuperä (EY) jälkeen NCCIT ja sukusolujen kaltainen alkuperä TCAM -2 vastaavasti. Lisäksi sillä H3K27ac, AP-2α ja AP-2γ sijoittuivat 3

rd ja 4

th eniten rikastettua motiivi TCAM-2 (verrattuna 29

th ja 31

st in NCCIT) mikä niiden (alkion) itusolusta (kuvio 2C, D). ES-solujen rikastamisen rankingissa nämä kaksi motiivia olivat 87

th ja 105

th [50]. Nämä havainnot sopivat ehdotettua eriytetympää (sukusolujen linjaa) solu on peräisin SE verrattuna EY [28], ja ne ovat sopusoinnussa havaintojen liittyvien histoni huiput (ks Keskustelu kohta).

tarkastaminen n H3K4me3 H3K27ac rikastukseen pohjainen avoimen chromatin kokoonpano oli itsenäisesti varmistettiin käyttäen DNaseI-yliherkkyyttä.

Koska tutkittujen chromatin markkaa (H3K4me3 H3K27ac) katsotaan liittyvän aktiivinen chromatin tutkimme, niiden läsnäolo on liitetty toiseen ominaista aktiivinen chromatin: DNaseI-yliherkkyys [51]. Käyttämällä DNaseI-MLPA lähestymistapa [43] suunnattiin 14 alueilla, jotka osoittivat suurimmat erot joko H3K4me3 ja /tai H3K27ac rikastamiseen kahden saman solulinjat. Kuusi seitsemästä rikastettu alueiden NCCIT (Kuva S2A: N1, N2, N3, N4, N6, N7), ja viisi seitsemästä rikastettu alueiden TCAM-2 (Kuva S2B: S1, S2, S5, S6, S7), osoitti merkittäviä DNaseI-yliherkkyys vastaavissa solulinjoissa. Sitä vastoin, vain yksi H3K27ac-negatiivinen lokukseen NCCIT (kuvio S2A, S1), eikä H3K27ac-negatiivisia lokusten TCAM-2 (kuvio S2B), osoitti DNaseI-yliherkkyyttä.

CpG Metylointi

DMRforPairs algoritmia käytettiin tunnistamaan erilaisesti metyloidut alueet (DMR) [38]. Algoritmi asetettiin havaita suuria eroja, eli käyttäen tiukkoja asetuksia. Alueilla, jotka sisältävät vähintään neljä koettimien 200 bp päässä toisistaan ​​pidettiin lisäanalyysiä varten (n = 30306). Alueet, joissa mediaani metylaatiotasoilla (M-arvot) näytteiden välillä poikkesivat ainakin | 1,4 | (N = 5139) testattiin tilastollista merkittävyyttä (merkitsevä: p 0,05; Bonferronin säädetty, Wilcoxonin-rank-sum test, n = 143) (Output DMRforPairs: File S1).

metylaation at DMRs ovat sopusoinnussa merkki positiivisuuden SE ja EY.

Koska aktivoivan histonimodifikaation tutkittu, keskityimme hypo- tai puuttumisesta DNA: n metylaatio. Global metylaatiotasoilla olivat linjassa hyper- ja hypometyloidut globaali asema NS ja SE vastaavasti, ja aiemmin osoittaneet välituotestatuksen TCAM-2 (kuva S3) [52], [53]. Sen jälkeen DMR tunnistaminen käyttäen DMRforPairs, yhteensä 99 DMRs (merkitsemiseksi 170 ainutlaatuinen geeni symbolit) oli hypometyloidut TCAM-2, verrattuna 44 NCCIT (merkitsemiseksi 64 ainutlaatuinen geeni symbolia) (taulukko S1). Mukaisesti histonimodifikaation (katso edellä),

Sox2

promoottorialue havaittiin voimakkaasti hypometyloidut vuonna NCCIT (kuvio 3A).

Sox2

oli osittain metyloituja TCAM-2 mukaisesti havaintojen kuvaa, että TCAM-2 voi erilaistua ja tulla

Sox2

positiivinen jälkeen extra-sukurauhasakselin injektio hiirillä [54]. 220 emäsparin alue suoraan ylävirtaan TSS on

Sox2

(CHR 3: 181429712) on aiemmin osoitettu olevan täysin hypometyloidut TCAM-2 [55]. Tämä on linjassa havainnot johdonmukaisesti hypometyloidut alue (CHR 3: 181429233-181430485) esitetään suoraan ylävirtaan TSS kun 652 emäsparin DMR (CHR 3: 181428046-181428697) välinen NCCIT ja TCAM-2 havaitaan DMRforPairs vuonna alue ca. 800 bp ylävirtaan alueen sekvensoitiin Nettersheim et al.

SOX17

eivät osoittaneet merkittävää ero metylaatiokuvion, mikä osoittaa, että se on periaatteessa saatavilla transkriptio molemmissa solutyypeissä (kuvio 3B). Itse asiassa,

SOX17

ilmentyminen voidaan indusoida NCCIT (julkaisematon havainto). Sopusoinnussa tunnettujen geenien ilmentyminen molemmissa solulinjoissa,

Oct3 /4

osoitti epäjohdonmukainen, mutta ei-ero metylaatiokuvion (kuvio 3C). TSS on

Nanog

oli hypometyloidut molemmissa solulinjoissa (kuvio 3D), mukaisesti ekspressiotietojen ja aiemmissa raporteissa [56]. Luettelosta alkuun DMRs, MIR-371/2/3 cluster erottui merkittävät ero hypermetylaation in NCCIT (kuvio 3E). Promoottorialueen

GATA4

merkittävästi hypermetyloitunut TCAM-2 (kuvio 3F). Yleisesti, 33% (47/143) DMRs oli lisätty huomautusta TSSs (File S1, mukaan Illumina n ilmeinen), joka on samanlainen kuin osa TSS liittyvien alueiden tunnistetaan DMRforPairs (12652/30306). Toiminnallisesti DMR luettelo molemmissa solulinjoissa osoitti rikastumista varten (alkion) kantasolujen huolto /pluripotenttisuuden. Biologisia toimintoja osoittaa samankaltaisuutta kypsempiä sukusoluissa rikastuneet TCAM-2 (taulukko S2).

Dots kuvaavat yksittäisten CpG: t ja mustat laatikot merkitsevät DMRs tunnistaa DMRforPairs. Prosenttiosuudet Alla olevan keskimääräistä CG tiheys piirretty alueilla (lasketaan Repitools R paketti, gcContentCalc toiminto (https://www.bioconductor.org/)). (A)

Sox2

[44%], (B)

SOX17

[46%], (C)

Oct3 /4

(

POU5F1

), [52%] (D)

Nanog

, [44%] (E)

miR-371/2/3

klusteri, [49%] (F)

GATA4

[53%].

DMRs merkittävästi rikastettu painettu geenejä, ja 59% (51/86) oli painettu geenit osoittivat menetys metylaation ympärillä TSS yhdessä tai molemmissa solulinjoissa .

Valitse luettelosta todennettujen painettu Ihmisgeenejä (n = 88 noudetaan geneimprint.com), 82 myös selityksineen vuonna Illumina manifesti (yhteensä 21243 ainutlaatuinen geeni symboleja selityksin) ja 10 oli läsnä alkuun DMRs välillä TCAM-2 ja NCCIT. Tämä yliedustus painettu geenien luettelossa DMRs oli merkitsevä (p 0,0001, χ

2 -testi). Tutkiessaan ympäröivällä alueella TSS on 86 painettu geenit, joiden tiedetään olevan genomi-lokalisointi, 14 osoitti ero tilan välillä solulinjojen (8/6 hypometyloidut in NCCIT ja TCAM-2 vastaavasti). Yhteensä 37 painettu geenit muotoutuneet hypometyloidut asema molemmissa solulinjoissa, verrattuna 12 hypermetyloitunut geenien (kuvio 4). Yhteenvetona, nämä tulokset osoittavat yleisesti poistetaan tilan painettu alueiden molemmissa solulinjoissa. Mitä geenit, joiden ero metylaatiostatuksen, ei ole selkeää eroa määrä hypermetyloitunut geenejä, jotka osoittaisivat eron kypsymisen tilan tai ympäristön häiriöitä.

lokalisaatio TSS oli noudetaan Ensembl ja käsin korjataan geenien useita selostukset valita alueen edustaja lähetyksenä Illumina BeadChip (n

antureista vaihteli geenien: mediaani = 10, välinen kvartiili alue 6-21). Promoottorialueen määriteltiin TSS-1000-TSS + 100 (tai vastakkainen käänteisjuoste). Geenejä 0,25 eron mediaani β ja johdonmukainen (vakaa) metylaatiokuvion tunnistettiin differentiaalisesti metyloitu TSS kahden solulinjoista. Mediaani metylointi 25% sekä solulinjoissa tulkittiin hypometyloidut tila molemmissa solulinjassa. Mediaani metylointi 75% tulkittiin hypermetylaation.