Krooninen sairaus

tiivistelmä

histonideasetylaasi estäjät (HDACi) ovat lupaavia terapeuttisia aineita, joita tällä hetkellä käytetään yhdessä kemoterapeuttisten aineiden kliinisissä tutkimuksissa syövän hoitoon sisältäen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Kuitenkin mekanismeista niiden kasvaimen vastainen toiminta pysyy hämäräksi. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että esto HDAC6 aiheuttaa DNA-vaurioita ja herkistää transformoitujen solujen kasvaimen vastaisen aineet, kuten etoposidi ja doksorubisiini. Täällä, osoitimme, että ehtyminen HDAC6 kahdessa NSCLC solulinjoissa, H292 ja A549, herkistyneet solut sisplatiini, yksi ensilinjan kemoterapeuttisen hoitoon käytetyt aineet NSCLC. Olemme ehdottaneet, että ehtyminen HDAC6 kasvoi sisplatiinin aiheuttaman sytotoksisuuden johtui parantamiseksi apoptoosin kautta aktivoimalla ATR /Chk1 kautta. Lisäksi osoitimme, että HDAC6 proteiini tasot korreloivat positiivisesti sisplatiinin IC

50 15 NSCLC solulinjoissa. Lopuksi ehtyminen HDAC6 vuonna H292 ksenografteissa sulatettu vähentynyt tuumorin paino ja tilavuus ja ilmeni kohonneita pohjapinta apoptoosin verrattuna valvonnan vierassiirrännänmallissa hiirimallissa. Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että HDAC6 on positiivisessa yhteydessä sisplatiinin vastus NSCLC ja paljastaa HDAC6 mahdollisena uusi terapeuttinen kohde platinan tulenkestävien NSCLC.

Citation: Wang L, Xiang S, Williams KA, Dong H, Bai W, Nicosia SV, et al. (2012) ehtyminen HDAC6 Parantaa Cisplatin aiheuttama DNA-vaurio ja apoptoosi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 7 (9): e44265. doi: 10,1371 /journal.pone.0044265

Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 4. toukokuuta 2012 Hyväksytty: 31 heinäkuu 2012; Julkaistu: 05 syyskuu 2012

Copyright: © Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain National Cancer Institute of National Institutes of Health alle Award Number R01CA164147, New tutkija apurahan (09KN-17) Florida James ja Esther kuningas Biomedical ohjelman Marsha Rivkin Foundation pilotti avustuksen Munasarjojen Cancer Research Fund (oCRF ), urakehitystä avustusta H. Lee Moffitt Cancer Center Keuhkosyöpä SPORE on XZ ja USF Graduate Student Success Diversity Fellowship KAW. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy syövän kuoleman miehillä ja naisilla Yhdysvalloissa, vaatii enemmän elää vuosittain yli kolmen seuraavan syövän syiden kuolema (rinta-, paksusuolen ja eturauhasen) yhdistetään [1 ]. NSCLC osuus on yli 80% kaikista keuhkosyövässä. Eloonjäämisasteesta potilaille NSCLC edelleen erittäin alhainen, sillä vain 16% potilaista elossa 5 vuotta jälkeen keuhkosyöpään diagnoosin. Vaikka tämä huono ennuste selittyy osittain suuri määrä potilaita, joilla esiintyy edenneen taudin, vaikka potilaat havaita varhaisessa vaiheessa kokemus korkea uusiutumisen huolimatta riittävän kirurginen resektio [2].

Useita laajassa, satunnaistetussa tutkimukset ovat osoittaneet vaatimattomia parannuksia pysyvyyttä adjuvantti sisplatiini-kemoterapian [3] – [6]. Pohjalta näiden tutkimusten adjuvanttihoitoa on tullut tavanomaista hoitoa potilaille, joilla on vaiheen II ja III NSCLC. Kun otetaan huomioon, että suhteellisen pieni väestö näyttää hyötyä kemoterapiaa, monet potilaat joutuvat myrkyllisiä hoitoa ilman kliinistä hyötyä. Parempi ymmärrys resistenssimekanismeihin platinapohjaisen kemoterapian vaaditaan ja strategioita tarvitaan tunnistaa potilaat todennäköisesti hyötyä hoidosta. Novel keinoja niiden ratkaisemiseksi platinaa vastus voidaan kohdistaa näissä populaatioissa.

HDAC, joukko entsyymejä, jotka poistavat asetyyliryhmiä peräisin ε-N-asetyyli lysiiniä aminohapon histones tai muita histoniproteiineista, tärkeitä rooleja solukasvun, apoptoosin, DNA-vaurio, jne nisäkkään HDAC on jaettu neljään luokkaan: luokka I (HDAC: t 1, 2, 3, ja 8), luokan II (HDAC: t 4, 5, 6, 7, 9, ja 10 ), luokka III (Sirts 1, 2, 3, 4, 5, 6, ja 7), ja luokka IV (HDAC11) [7], [8]. Luokka I HDAC paikallistaa pääasiassa tumassa ja löytyy sortava komplekseja kuten Sin3, Nurd, CoREST, PRC2, N-CoR ja SMRT komplekseja, jotka deasetyloida histonien ja muut ydin- proteiineja. Luokan II HDAC jaetaan edelleen ja Ilb alaluokkien, ja nämä jäsenet osoittavat kudosspesifistä ilmentymistä. Luokka III jäsenet ovat SIR2 liittyviä NAD

+ – riippuvaista deasetylaaseja. HDAC11 on ainoa jäsen, luokan IV perheen Vähäisen sekvenssin samankaltaisuus luokan I ja luokan II jäseniä.

HDAC6 kuuluu luokkaan II b HDAC: t. Se kloonattiin nisäkkään homologi hiivan hda1 hiiren ja ihmisen, vastaavasti [9], [10]. Ainutlaatuisen, HDAC6 sisältää kaksi funktionaalista tandem-deasetylaasin domeeneja, joita kutsutaan DAC1 ja DAC2 tai DD1 ja DD2, sekä ZnF-UBP domeeni, joka on sinkkisormen sisältävät alueen, joka on homologinen ei-katalyyttinen domeeni useita ubikitiinispesifinen proteaasien (yleispalveluntarjoajat) [11]. HDAC6 ZnF-UBP domeeni kykenee sitomaan mono- tai poly-ubikitiini sekä ubikitinoituja proteiinit [11] – [13]. Substraatteja HDAC6 ovat sytosolin proteiinit, kuten α-tubuliinin, hsp90, cortactin, jne [14] – [16]. HDAC6 toimii myös ubikitiini-riippuvainen autophagy antamalla käsittelyä tai proteiinin hajoamisen aggregaattien [17]. Lisäksi HDAC6 osallistuu väärin laskostuneen proteiinin aiheuttamaa solujen stressiä [18]. HDAC6 pidetään nyt mestari säätelijänä soluvasteen sytotoksisille hyökkäysten [19]. Tuoreessa raportissa on osoittanut, että HDAC6 on mukana DNA: ta vaurioittavien aineiden aiheuttamaa genotoksinen stressi [20]. Kuitenkin taustalla olevien mekanismien ovat kaikkea muuta kuin selvä.

HDAC ilmaisuja muuttuvat lukuisissa syövissä. Esimerkiksi yliekspressio HDAC1, HDAC2, HDAC3, ja HDAC6 on havaittu paksusuolen, rinta-, eturauhas-, kohdunkaulan ja syöpien [21] – [28]. Inhiboiva HDAC-entsyymien HDAC-inhibiittorit on tullut lupaava lähestymistapa hoitoon syöpien [29] – [31]. HDAC-inhibiittorit muuttavat asetylaatio tilan kromatiinin ja muiden ei-histoni-proteiinien, jolloin muutoksia geenien ilmentyminen, apoptoosin induktion, kasvun pysähtymisen, ja solujen terminaalista erilaistumista [31]. Erityisesti HDAC-inhibiittorit ovat lupaavia adjuvantti huumeita käytetään yhdessä platinapohjaisen kemoterapian useissa syövissä kuten keuhkosyövän [32].

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että HDAC6 antaa sisplatiini vastus NSCLC solulinjoissa. Knockdovvn HDAC6 tai estämiseksi HDAC6 aktiivisuuden HDAC6-spesifinen estäjä tubastatin A NSCLC solulinjoissa A549 ja H292 herkistyneet solut sisplatiinihoitoon. Lisäksi positiivinen ja merkittävä korrelaatio HDAC6 proteiinin tason ja IC

50 sisplatiinin löydettiin 15 NSCLC solulinjoissa. Lisäksi H292 ksenografteissa kanssa HDAC6 ehtyminen näkyy pienempi kasvaimen painon ja tilavuuden, sekä lisääntynyt tyvi apoptoosin verrattuna ohjaus ksenograftit. Kaikkiaan tulokset viittaavat siihen, että kehitys kliinisesti merkittäviä HDAC6-selektiivisiä hyödyttää voidaan käyttää yhdessä platinapohjaisen hoidon NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

10 mM kantaliuosta vorinostat (Selleck kemikaalit) valmistettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja laimennettiin sillä tarvittavat pitoisuudet soluviljelyalustassa. Tubastatin A ostettiin BioVision. 15 mM kantaliuos tubastatin A valmistettiin DMSO: hon. Sisplatiinin ja paklitakselin hankittiin Sigmalta. Sisplatiini valmistettiin 50 mM kantaliuosta dimetyyliformamidissa (DMF) ja paklitakselilla kuin 10 mM kantaliuoksesta DMSO: ssa. Vasta-aineita fosfory- histoni H2AX (γH2AX) (20E3), fosforyloitu ATR (Ser428) (# 2853), fosforyloitu Chk1 (Ser296) (# 2349), fosforyloitu p53 (Ser15) (16G8), anti-ATR (# 2790), anti-kaspaasi-3 (8G10), PARP-1 (# 9524S), ja α-tubuliinin (1h10) ostettiin Cell Signaling Technology, kun taas anti-asetyloitu tubuliinia ja anti-β-aktiini olivat Sigmalta. Anti-Chk1 (2G1D5), anti-p53 (DO-1) ja anti-HDAC6 (H-300) vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotechnology.

Solulinjat ja sukupolven Scramble ja HDAC6 knockdown H292 Cell linjat

NSCLC solulinjat ADLC, A549, EPLC, H23, H292, H358, H441, H460, H522, H661, H820, H1650, H1975, H2122 ja H2172 saatiin American Type Culture Collection (ATCC ). Soluja viljeltiin RPMI 1640 väliaineessa penisilliiniä (100 U /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml) ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. A549 HDAC6 taintumisen (A549-HD6KD) ja ohjaus (A549-Sup) stabiileja solulinjoja ystävällisesti Dr. Tso-Pang Yao kuten ovat kuvanneet Kawaguchi et al. [18]. H292 ryntäily ja HDAC6 pudotus stabiileja solulinjoja kloonaamalla valitsema 0,5 ug /ml puromysiiniä. Ensinnäkin H292-soluja transfektoitiin ohimenevästi kontrollivektorilla pRS (Cat. # TR20003) tai shRNA vektorin vastaan ​​HDAC6 (tunnistaa sekvenssin 5-AGGTCTACTGTGGTCGTTACATCAATGGC-3 ’, putki ID: TI349960, Origene). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut jaettiin päällekkäisiä levyjä 1:20 RPMI1640, joka sisälsi 0,5 ug /ml puromysiiniä. Puromysiinin täydennettiin 2 päivän välein ylläpitämään riittävää valinta paine. Hyvin eristetty yhden kloonit siirrettiin 24-kuoppaisille levyille. Knockdown vaikutus todennettiin Western blotting -tekniikalla analyysi käyttäen anti-HDAC6 aineita.

MTT Analyysit

Solun kasvun ja kannattavuuden arvioitiin MTT: llä. Lyhyesti, solut ympättiin sekstetti 96-kuoppaisille tasapohjaisille levyille tiheydellä 5 x 10

3 solua /kuoppa. Lääkkeet lisättiin ilmoitettuina pitoisuuksina 24 h ymppäyksen jälkeen, kun ajoneuvo lisättiin kontrollina. Ilmoitettuina päivinä, soluja inkuboitiin 3- (4, 5-dimethylthiszol-x-yyli) -2, 5-diphenytetrazolium bromidia (MTT) (Sigma) liuosta 4 h, sitten lisätty 100 ui DMSO: ta ja ravisteltiin 15 min. Absorbanssi sisplatiinin alttiina viljelmistä mitattiin käyttäen usean hyvin spektrofotometrillä 550 nm: ssä, jossa on 630 nm varten. Tulokset esitetään prosentteina absorbanssi suhteessa ajoneuvon kontrolliviljelmiin.

Cell Cycle Analysis

H292-solut kerättiin ja suspensoitiin varovasti uudelleen yksittäisiksi solususpensiota Fluoresenssi solulajittelu- (FACS) (PBS joka sisälsi 2% FBS: ää). Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja fiksoitiin kylmässä 70% etanolia yön yli. Sitten solut pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä jälleen, suspendoitiin uudelleen 50 ui PBS: ää plus 3,3 ui RNaasi A: liuosta (30 ug /ml) ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Suspensioon lisättiin 450 ui FACS-puskuria ja 25 ui propidiumjodidia (PI, 1 mg /ml), jota seurasi inkubointi 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sitten solut analysoitiin FACS kone välittömästi. Tulokset analysoitiin FlowJo v8.3.3 ohjelmiston.

Immunoblottaus analyysi

Koko-solu-uutteet valmistettiin lisäämällä RIPA-puskuria (25 mM Tris-HCI, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% NP -40, 1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, ja proteaasiestäjäseostabletit). Proteiinikonsentraatio kaikista näytteistä määritettiin Bradford-reagenssia (Bio-Rad). Proteiinit erotettiin 8% tai 12% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Kalvot testattiin primaarisilla vasta-aineilla ja piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoituja sekundäärisiä vasta-aineita (GE Healthcare). Lopuksi blotit visualisoitiin käyttäen Chemiluminescent Detection Kit (Pierce).

Comet määritykset

jälkeen sisplatiinihoitoon, H292-pRS ohjaus- tai HD6-KD-soluja säteilytettiin 10 Gy gammasäteilyä esitellä satunnainen single-säikeen katkoksia. Periaatteessa enemmän silloitukset käyttöön sisplatiini, sitä vähemmän yhden säikeen katkoksia havaitaan säteilytettyyn soluissa. Komeetta analyysit suoritettiin käyttäen OxiSelect ™ Comet Assay Kit (Cell Biolabs, Inc.) mukaan valmistajan protokollaa.

immunof- Microscopy

Solut viljeltiin kammio dioja (jaosto Slide System Laboratory TekII) pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 min ajan huoneenlämpötilassa. Kiinnitys lopetettiin PBS: llä, joka sisälsi 1% glysiiniä. Solut permeabilisoitiin 1% glysiini /0,5% Triton X-100-liuosta huoneen lämpötilassa 15 min ajan. Kun oli salvattu 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) 1 tunnin ajan, soluja inkuboitiin PBS: ssä, joka sisälsi 0,2% Triton X-100, 1% BSA: ta, ja anti-γH2AX-vasta-aine (20E3), yön yli 4 ° C: ssa. Solut pestiin sitten PBST: llä (PBS, joka sisältää 0,1% Tween), jota seurasi inkubointi sekundaarisen vasta-aineen (PBS: ssä, joka sisälsi 1% BSA) 45 minuutin ajan. Lopuksi solut pestiin PBS: llä, joka sisälsi 0,1% Tween ja sitten pelkkää PBS: ää. Levyjä kuivattiin ja asentaa Vectashield® asennus elatusainetta, joka sisälsi DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

Colony muodostumisen määritys

Lyhyesti, solut ympättiin kolmena rinnakkaisena (1000 solua per 60 mm kudosviljelymaljassa) ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa mahdollistaa solujen kiinnittyä ruokia. Soluja käsiteltiin sitten ajoneuvon ohjaus- tai sisplatiinia 8 päivää. Myöhemmin solut pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan, ja värjättiin kristallivioletilla (0,5% kristalliviolettia, 1% paraformaldehydiä ja 20% metanolia PBS: ssä) 30 minuutin ajan. Jokaisen levyn kasvupesäkkeiden laskettiin ja solujen eloonjäänti sen jälkeen, kun sisplatiinihoitoon ilmaistiin prosentteina elossa olevien pesäkkeiden määrä on kontrollilevyt.

Tumor Growth

Kaikki menettelyt hiirillä suoritettiin alla protokolla nimeltään: rooli HDAC6 Platinum resistanssi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, joka hyväksyttiin Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) on Division of Research ja yhdenmukaisuusohjelma yliopistossa South Florida 10.19.2011 (Protocol # R4064). 5- ja 6-viikkoisen naaras-kateenkorvattomia nude-hiiriä (Nu /Nu-hiiriä), joiden paino -20 g hankittiin National Cancer Institute (NCI). H292-pRS ohjaus soluja (5 x 10

6 solua /100 ui RPMI 1640 väliaineessa plus 50% matrigeeliä) injektoitiin ihon alle vasempaan kylkeen ja sama määrä H292-HD6KD solua injektoitiin oikeaan kylkeen. Kasvainten annettiin kasvaa kuusi viikkoa. Kasvainten koot kirjattiin viikoittain. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa V = (L x W

2) x 0,5 (V = tilavuus, L = pituus, W = leveys) [33]. Kasvaimen keskipaino laskettiin myös korjuun jälkeen kasvaimia.

immunohistokemiallinen värjäys

H292 ohjaus ja HDAC6 pudotus ksenograftit kerättiin ja kiinnitettiin formaliiniin, valettiin sitten parafiiniin ja leikattiin. Tissue microarray 12 ksenograftien of H292-PRS- ja H292-HD6KD paria valmistettiin Moffitt histologia ydin laitokseen käyttäen Beecher Instrument kudosta ryhmittäjällä. Objektilasit värjättiin käyttäen Ventana Discovery XT automatisoitu järjestelmä (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) kohti valmistajan protokollaa oma reagenssien. Lyhyesti, diat poistettiin parafiini on automatisoitu järjestelmä EZ Prep liuosta (Ventana). Lämmön aiheuttama antigeeni hakumenetelmä käytettiin Cell Conditioning 1 (Ventana). Kani primaarista vasta-ainetta, joka reagoi pilkottiin kaspaasi 3, (# 9661, Cell Signaling, Danvers, MA) tai Ki67 (# M3060, Spring Bioscience): tä käytettiin 1:400 tai 1:100 pitoisuus Dako-vasta-aine laimentimeen (Carpenteria, CA) ja inkuboitiin 60 min. Ventana anti-kani sekundääristä vasta-ainetta käytettiin 16 min. Käytetyn ilmaisinjärjestelmän oli Ventana OmniMap pakki, ja objektilasit sitten vastavärjät- hematoksyliinillä. Dioja Sitten kuivattu ja päällystettiin kohti normaalia laboratorion protokollaa.

Tissue Microarray (TMA) dia värjätään vastaan ​​katkaistun kaspaasi 3 on digitaalisesti skannattu Aperio ™ (Vista, CA) ScanScope XT kanssa 200x /0,75 NA objektiivilinssi nopeudella 4 minuuttia per slide kautta Basler tri-lineaarinen-array. Kuva-analyysi suoritettiin käyttäen optimoitua Aperio PositivePixelCount ® v9.0 algoritmia seuraavien optimoitu kynnysarvoja [HueValue = 0,1; HueWidth = 0,5; IWP (High) = 220; IWP (Low) /IP (High) = 175; Ip (Low) /ISP (High) = 100; ISP (Low) = 0; InP (High) = -1] segmentoida positiivinen pikseliä eri intensiteettiä. Prosenttiosuus positiivisuus on määrällisesti useissa solujen näytteille positiiviset tahra prosentteina koko kasvaimen solujen määrä. Värjäytymisintensiteettiä oli kynnysarvo kuten parametertized edellä negatiiviseksi (0), matala (1+), kohtalainen (2 +) ja vahva positiivinen (3+) keskiarvolla tahra tiheys (0-255 dynaaminen alue) kunkin TMA ydin. Koulutusta algoritmi kehitettiin sen laatu ohjaa harjoitellaan patologi.

Tilastollinen analyysi

Kaikki määritykset suoritettiin vähintään kolmen erillisen kokeen. Aineisto esitetään keskiarvona ± SEM, ja tilastollisessa vertailussa ryhmien välillä suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA seuraa Dunnet testi.

p

-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Spearmanin kertoimella ja

p

-arvon varten korrelaatio HDAC6 tasolla ja sisplatiinin IC

50 laskettiin SAS-ohjelmiston.

Tulokset

HDAC6 liittyy sisplatiiniannoksen aiheuttama Sytotoksisuus NSCLC Cell Lines

luonnehtivat roolin HDAC6 vuonna sisplatiinin vastarintaa, kaksi paria HDAC6 pudotus solulinjoja H292 ja A549 perustettiin (kuva 1A ja 1 D). Sytotoksisuus sisplatiinin valvonta- ja HDAC6 taintumisen paria (H292-HTJ ja H292-HD6KD, A549-Sup ja A549-HD6KD) mitattiin MTT määrityksissä. Kuten kuviossa 1B on esitetty ja 1E, A549 ja H292-soluissa köyhdytetty HDAC6 tehostunut sytotoksisuus sisplatiinin jälkeen hoidon 3 päivää, verrataan kontrollisolujen. Määrittää pitkän aikavälin vaikutus HDAC6 Knockdown solun selviytymisen, suoritimme pesäkemuodostusta määrityksiä. Kuten kuviossa 1G ja 1H, ehtyminen HDAC6 merkittävästi vähentynyt numerot pesäkkeenmuodostusta H292-soluissa, kun sisplatiinihoitoon. Mielenkiintoista, knockdovvn HDAC6 ei paranna paklitakseli aiheuttama sytotoksisuuden A549 ja H292-soluissa, mikä viittaa siihen, että lisääntynyt herkkyys sisplatiini ehtyminen HDAC6 oli lääkkeen erityinen (kuvio 1C ja 1F). Sen tutkimiseksi, onko loppuminen HDAC6 voidaan uudelleen herkistää sisplatiini resistentit solut, C13 solulinja, joka on sisplatiinin kestävä munasarjasyövän solulinja on peräisin OV2008 [34], oli stabiilisti transfektoitu valvontaa tai HDAC6 shRNA perustaa ohjaus ja HDAC6 pudotus solulinjat. Kuten kuviossa S1, ehtyminen HDAC6 vuonna C13 soluissa dramaattisesti vähentänyt sisplatiinin IC

50 verrattuna kontrolli soluihin. Jotta laajentaa havaintojen mittasimme HDAC6 tasolla ja sisplatiinin IC

50 15 NSCLC solulinjoissa. Kuten kuviossa 1I ja S2, HDAC6 proteiini taso korreloi positiivisesti sisplatiinin IC

50. Spearman kerroin (0,64875) ja

p

-arvo (0,0089) ehdotti, että tämä korrelaatio oli tilastollisesti merkitsevä. Me seuraavaksi kysytään ehtymiseen HDAC6 ei-transformoidut solut voivat herkistää soluja sisplatiinin. Kuten kuviossa S3, sisplatiini IC

50 oli merkittävästi vähentynyt HDAC6 knockout alkion fibroblasteja (MEF) verrattuna villityypin MEF. Kaiken tuloksemme osoittivat, että HDAC6 antaa sisplatiini resistenssin.

, H292-solut transfektoitiin sekoituskoodin shRNA tai shRNA vastaan ​​HDAC6 tuottaa H292-pRS tai H292-HD6KD stabiili klooni, vastaavasti. HDAC6 ilmentymisen kontrolli (H292-, PRS) tai HDAC6 taintumisen (H292-HD6KD) soluissa havaittiin anti-HDAC6 Western blotting-analyysi (ylempi paneeli). Anti-β-aktiini Western blottaus suoritettiin tasapuolisen lastaus proteiinia (alempi kuva). B, knockdovvn HDAC6 herkistynyt H292 solujen sisplatiinihoitoon. MTT-analyysit suoritettiin käyttäen H292-pRS tai H292-HD6KD solut altistetaan ajoneuvon ohjaus (0 uM sisplatiinin) tai osoitetut pitoisuudet sisplatiinia 3 päivää. C, knockdovvn HDAC6 ei herkistää H292 soluja paklitakselihoidolla. MTT-analyysit suoritettiin käyttäen H292-pRS tai H292-HD6KD soluja käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (0 nM paklitakseli) tai osoitetut pitoisuudet paklitakselin 3 päivää. D, HDAC6 oli tehokkaasti köyhdytetty A549-soluja. HDAC6 ilmentymisen kontrolli (A549-Sup) tai HDAC6 pudotus soluja (A549-HD6KD) havaittiin anti-HDAC6 Western blotting-analyysi (ylempi paneeli). Anti-β-aktiini Western blotting-analyysi suoritettiin myös tasapuolisen lastaus (alempi kuva). E, knockdovvn HDAC6 herkistynyt A549 solut sisplatiinihoitoon. MTT-analyysit suoritettiin käyttäen A549-Sup tai A549-HD6KD käsiteltyjen solujen ajoneuvon hallintaan tai osoitetut pitoisuudet sisplatiinia 3 päivää. F, knockdovvn HDAC6 ei herkistää A549 soluja paklitakselihoidolla. MTT-analyysit suoritettiin käyttäen A549-Sup tai A549-HD6KD käsiteltyjen solujen ajoneuvon hallintaan tai osoitetut pitoisuudet paklitakselin 3 päivää. G, Pesäkkeenmuodostusta määritykset suoritettiin H292-pRS ja H292-HD6KD solujen 8päivä ajoneuvon ohjaus (0 uM sisplatiinin) tai osoitettu sisplatiinin. H, määrälliset tulokset saatiin laskemalla pesäkkeitä G.

Sarakkeet, tarkoittaa kolmesta tai kuudesta kaksoiskappaleet; baareja, SEM (*, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001)

. I, HDAC6 tasot positiivisesti korreloivat sisplatiinin IC

50 paneelia NSCLC solulinjoissa. HDAC6 proteiini tasot saatiin Western-blottauksella analyysit 15 NSCLC linjat (ADLC, A549, EPLC, H23, H292, H358, H441, H460, H522, H661, H820, H1650, H1975, H2122 ja H2172) ja kvantifioidaan Määrä One ohjelmisto. Sisplatiini IC

50 laskettiin MTT määrityksissä hoidon jälkeen näiden solujen 3 päivää. Korrelaatio HDAC6 proteiinin tason ja sisplatiinin IC

50 analysoitiin SAS-ohjelmiston. Pistekuvaajan käytettiin havainnollistamaan positiivinen korrelaatio HDAC6 tasolla ja sisplatiinin IC

50. Spearman kerroin oli 0,64875 ja

p

-arvo oli 0,0089.

ehtyminen HDAC6 täydentää Cisplatin aiheuttama apoptoosi

onko knockdovvn HDAC6 tehostetun sisplatiinin sytotoksisuus on johtuen apoptoosin, tarkastelimme PARP1 lohkaisu H292-HTJ ja H292-HD6KD paria. Kuten kuviossa 2A on esitetty, pilkottiin PARP1 kohosi H292-HD6KD soluja verrattuna, että H292-pRS soluissa, sen jälkeen 5 uM tai 10 uM sisplatiinin hoitoon. Lisäksi, kuten on esitetty kuviossa 2B, pilkotun PARP1 bändi esiintyi aiemmin (päivä 1) in H292-HD6KD soluissa verrattuna kontrollisoluihin (päivä 2). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös käyttämällä HDAC6 villityypin ja knockout MEF-pari (kuvio S4) ja A549-Sup ja A549-HD6KD pari (tuloksia ei ole esitetty). Vahvista tuloksemme, virtaussytometria analyysi käytettiin havaitsemaan apoptoottisten väestölle soluissa altistuu sisplatiinia. Kuten kuviossa 2C ja 2D, osa-G1 väestöstä, joka osoittaa apoptoottisten solujen [35], on dramaattisesti lisääntynyt H292-HD6KD soluissa verrattuna H292-pRS solut altistettiin 5 tai 10 uM sisplatiinia. Näin ollen, ehtyminen HDAC6 kasvoi sisplatiinin indusoiman apoptoosin. Tutkia, apoptoosin oli kaspaasi 3 riippuvainen, havaitsimme tasot pilkkoa kaspaasi 3 H292-pRS tai H292-HD6KD soluja altistetaan sisplatiinia. Kuten kuviossa 2E, tasot katkaistun kaspaasi 3 nostettiin HD6KD soluissa, kun se altistetaan 1, 5 tai 10 uM sisplatiinia verrattuna kontrollisoluihin. Kaiken tulokset viittaavat siihen, että ehtyminen HDAC6 lisää kaspaasi-riippuvaista apoptoosia, kun sisplatiinihoitoon NSCLC-soluja.

, H292-pRS tai H292-HD6KD soluja käsiteltiin osoitetulla sisplatiinin 24 tuntia. Anti-PARP1 ja anti-β-aktiini Western blotting analyysit tehtiin. B, H292-HTJ ja H292-HD6KD soluja käsiteltiin 5 uM sisplatiinin ilmoitettuihin päiviin. Anti-PARP1 ja anti-β-aktiini Western blotting-analyysit suoritettiin. C, Sub-G1 väestön määritettiin H292-pRS tai H292-HD6KD soluissa vehikkeliä (0 uM sisplatiini) tai sisplatiinia FACS-analyysillä. CDDP edustaa sisplatiinia. D, kvantitatiivinen esitys prosenttiosuuksien Saharan G1 faasisoluja C. E, H292-pRS tai H292-HD6KD soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella sisplatiini, ja anti-lohkaistiin kaspaasi 3 ja anti-β-aktiini Western blotting analyysit olivat suoritettu.

knockdovvn HDAC6 pahentaa Cisplatin aiheuttama DNA Damage

Tutkiakseen toimintojen HDAC6 in sisplatiinin aiheuttaman DNA-vaurioita, H292-HTJ ja H292-HD6KD solut tutkittiin yhden solun comet, standardi tekniikka arvioida DNA-vaurioita. Sen jälkeen sisplatiinihoitoon, molemmat solut altistettiin 10 Gy ionisoivan säteilyn aiheuttamaan satunnainen yhden säikeen katkoksia (merkitty komeetta hännät). Sisplatiinin tehoa aiheuttama silloittuminen osoitettiin lyhentämällä komeetta hännät [36]. Kuten kuviossa 3A on esitetty, vasemmalla kaksi paneelia, säteilytyksen jälkeen vastaavia erillisiä komeettoja havaittiin sekä ohjaus- ja HD6KD solut altistetaan ajoneuvon hallinnan. Kuitenkin kun sisplatiinihoitoon, enemmän lyhennetty hännät havaittiin HD6KD soluissa verrattuna ohjaus soluja (kuvio 3A, oikealla kaksi paneelia), mikä viittaa siihen, että ehtyminen HDAC6 herkistynyt H292 soluja sisplatiinin aiheuttama DNA-vaurioita. Kvantitatiivinen analyysi komeetta määritys on esitetty kuviossa 3B. Sisplatiini voi myös stimuloida H2AX fosforylaatio seriinillä 139 (γH2AX) jonka pesäkkeitä muodostumista voidaan analysoida DNA-vaurioita [37] – [39]. Siksi käytetään immunofluoresenssivärjäyksen määrittämään γH2AX pesäkkeitä muodostumista. Sen jälkeen sisplatiinihoitoon, lisää γH2AX pesäkkeitä tunnistettiin H292-HD6KD soluissa verrattuna ohjaus soluja (kuvio 3C). Pesäkkeet tumassa luokiteltiin kolmeen ryhmään: Foci 20, Foci = 1~20 ja Foci = 0. solujen prosenttiosuus kuulu edellä mainittuihin kolmeen ryhmään kvantitoitiin. Kuten on esitetty kuviossa 3D, korkeammat prosenttiosuudet sisplatiinin käsiteltyjen HD6KD solujen kuului Foci 20 ryhmä, kuten verrataan kontrollisolujen, viittaa siihen, että ehtyminen HDAC6 stimuloitujen sisplatiinin aiheuttaman DNA-vaurion. Vastaavasti, A549-Sup ja HD6KD tai C13-pRS ja HD6KD paria, enemmän pesäkkeitä 20 ryhmän havaittiin HDAC6 knockdown-soluja (tietoja ei esitetty). Johdonmukaisesti, Western blot-analyysi osoitti, että tasot γH2AX kun 5 tai 10 uM sisplatiinin hoidot olivat korkeammat H292-HD6KD soluissa verrattuna H292-pRS kontrollisolut (kuvio 3E). Lisäksi γH2AX tasot olivat korkeammat H292 HDAC6 knockdown-soluja altistettiin 5 uM sisplatiinia 1, 2 ja 3 päivää verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 3F). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös A549-ohjaus ja A549 HDAC6 pudotus parin (kuvio S5). Seuraavaksi me käytetään farmakologisia estäjät, kuten vorinostat (pan-HDAC estäjä) ja tubastatin A (HDAC6-estäjä) vahvistaa, että tukahduttaminen HDAC6 toiminta nostaa sisplatiinin aiheuttama DNA-vaurioita NSCLC soluissa. Kuten kuviossa 4A ja 4B, co-hoito vorinostat ja sisplatiinin voimakkaasti kohonneet tasot γH2AX A549 tai H292-soluissa verrattuna käsiteltyjen solujen sisplatiinia tai vorinostat yksin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös A549 ja H292-soluissa käyttäen tubastatin A, jolla korvataan vorinostat (kuvio 4C ja 4D). Sekä vorinostat ja tubastain A voi merkittävästi lisätä tasoja asetyloitu tubuliinin, mikä viittaa siihen, että HDAC6 toiminta estettiin tehokkaasti. Mielenkiintoista on, että apoptoosin tunnistettiin, kuten on pilkottu PARP1 on H292-soluissa, joita käsiteltiin sisplatiinin ja vorinostat yhdistelmänä tai sisplatiinin ja tubastatin A yhdistettynä, mutta ei A549-soluja (kuvio 4). Nämä tiedot viittaavat siihen, että H292-solut ovat herkempiä näille lääkkeille kuin A549-soluja. HDAC6 proteiini tasoilla ei vaikuttanut lääkehoidon (kuva 4). Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että inhibitio HDAC6 aktiivisuuden herkistää sisplatiinin aiheuttaman DNA-vaurion.

A, H292-pRS tai H292-HD6KD soluja käsiteltiin ajoneuvon (0 uM sisplatiinia) tai sisplatiinia 24 tunnin ajan, sitten säteilytetään 10 Gy gammasäteilyä esitellä satunnainen single-säikeen katkoksia. Comet määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu menetelmät. B, uncrosslinked DNA tekee High Capacity Sides Analysis System (HCSA: han) ohjelmisto (Coats Associates, Inc.).

Sarakkeet, merkitse 40 yksittäisistä soluista; baareja, SE (***, P 0,001).

C, immunofluoresenssi γH2AX pesäkkeitä in H292-pRS tai H292-HD6KD soluissa vehikkeliä (0 uM sisplatiini) tai sisplatiinia kuten. D, kvantitatiivinen edustus γH2AX pesäkkeitä yllä soluissa.

Sarakkeet, tarkoittaa 600-soluja.

E, H292-pRS ja H292-HD6KD soluja käsiteltiin osoitetuilla sisplatiinin 24 tunnin ajan, ja anti-γH2AX ja anti-β-aktiini Western blot analyysit olivat sitten suoritetaan. F, Edellä mainitut solut käsiteltiin ajoneuvon tai 5 uM sisplatiinin ilmoitettu päivää ja anti-γH2AX ja anti-β-aktiini Western blotting-analyysit suoritettiin.

, A549-soluja käsiteltiin ajoneuvon ohjaus sisplatiini yksin, vorinostat yksin tai sisplatiinin ja vorinostat yhdistelmänä 24 tunnin ajan, sitten anti-γH2AX, anti-asetyloitu tubuliinin, anti-PARP1, anti-HDAC6, ja anti-β-aktiini Western blotting-analyysit suoritettiin. B, H292-soluja käsiteltiin ajoneuvon hallinnan, sisplatiini yksin, vorinostat yksin tai sisplatiinin ja vorinostat yhdistelmänä 24 tunnin ajan, sitten anti-γH2AX, anti-asetyloitu tubuliinin, anti-PARP1, anti-HDAC6, ja anti-β-aktiini Western blotting-analyysit suoritettiin. Nuolenpäätä osoitti katkaistun PARP1 bändi. C, A549-soluja käsiteltiin ajoneuvon hallinnan, sisplatiini yksin, tubastatin yksin tai sisplatiinin ja tubastatin A yhdistettynä 24 tunnin ajan, sitten anti-γH2AX, anti-asetyloitu tubuliinin, anti-PARP1, anti-HDAC6 ja anti-β-aktiini Western blotting-analyysit suoritettiin. D, H292-soluja käsiteltiin ajoneuvon hallinnan, sisplatiini yksin, tubastatin yksin tai sisplatiinin ja tubastatin A yhdistettynä 24 tunnin ajan, ja anti-γH2AX, anti-asetyloitu tubuliinin, anti-PARP1, anti-HDAC6 ja anti-β-aktiini Western blotting-analyysit suoritettiin. Nuolenpäätä osoitti halkaistut PARP1 bändi.

knockdovvn HDAC6 Korotukset fosforylaatio DNA Damage Signaling Proteiinit Upon sisplatiinihoitoon

Suurin molekyylitason sensorit DNA-vaurion kuuluvat ATM (ataksia telangiektasian mutatoitunut) ja ATR (ataksia teleangiektasia ja Rad3 liittyvä) [40], [41]. Vastauksena DNA vaurioita, nämä kinaasien rekrytoi ja aktivoi muita signalointia proteiinien, kuten Chk1 ja Chk2 aiheuttaen solusyklin pysähtymisen tai apoptoosin. Kaikki nämä kinaasit, ATM, ATR, Chk1 ja Chk2 voivat fosforyloida ja aktivoida p53, joka johtaa apoptoosin alaisten solujen seuraavat DNA-vaurioita. Sen määrittämiseksi, ovatko HDAC6 vähentäminen voisi lisätä DNA-vaurioita signalointi jälkeen sisplatiinihoitoon, avain proteiinit testattiin. H292-HTJ ja H292-HD6KD soluja käsiteltiin ajoneuvo (0 uM sisplatiini) tai sisplatiinia 24 tunnin ajan.