Krooninen sairaus

tiivistelmä

syöpäsolujen vastustuskyky anoikis vetämänä poikkeava signalointi ylläpiti kasvain microenvironment antaa korkea invasiivisia potentiaali ja terapeuttisia vastus. Olemme hiljattain saanut uutta lyijy kinatsoliini-pohjainen Doxazosin® johdannainen, DZ-50, joka heikentää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden kautta anoikis. Genominlaajuisia analyysi ihmisen eturauhassyövän solulinjaa DU-145 tunnistaa ensisijainen vaimentua tavoitteista DZ-50, mukaan lukien geenit osallistuvat fokaalisen adheesion eheys (fibronektiini, integriini-α6 ja Talin), tiiviin liitoksen muodostuminen (klaudiini-11) sekä kuten insuliinin kasvutekijää sitova proteiini 3 (IGFBP-3) ja angiogeneesi modulaattorin trombospondiini 1 (TSP-1). Konfokaalimikroskopia osoitti rakenteellisia häiriöitä sekä paikallisessa tarttumisessa ja tiiviiden liitosten jonka downregulation näiden geenikohteet, mikä laski solujen eloonjäämistä, migraation ja adheesion soluväliaineen (ECM) komponenttien kaksi androgeeni-riippumaton ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, PC-3 ja DU-145. Vakauttaminen solu-ECM vuorovaikutuksia yliekspressiolla Talin-1 ja /tai altistamalla solut fibronektiiniä-rikas ympäristö lieventäneet DZ-50. Menetys ilmentymisen solunsisäisen fokaalisen adheesion signalointi efektoreita taliini-1 ja integriiniin sitoutuvan kinaasin (ILK) herkistettyjä ihmisen eturauhasen syövän anoikis. Tulosten perusteella näyttää, että DZ-50 kykenee sen antituumorivaikutus kohdistamalla avaimen toiminnallisia solujen välistä vuorovaikutusta, paikallisia tarttumista ja tiiviiden liitosten, tukevat terapeuttista merkitystä tämän aineen hoitoon edenneen eturauhassyövän.

Citation: Hensley PJ , Desiniotis A, Wang C, Strömberg A, Chen CS, Kyprianou N (2014) Novel Farmakologiset kohdentaminen tiiviiden liitosten ja paikallisia tarttumista eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 9 (1): e86238. doi: 10,1371 /journal.pone.0086238

Toimittaja: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat

vastaanotettu 4 marraskuuta 2013 Hyväksytty: 12 joulukuu 2013; Julkaistu: 31 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Hensley et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Institutes of Health, R01-GRANT00491815 ja National Center for Research Resources ja National Center for edistäminen Translational Sciences, UL1RR033173. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Huomaa, että kirjoittajat ovat ilmoittaneet seuraavat COI: Kuten vastaava kirjoittaja, Natasha Kyprianou toteaa, että hän toimii Academic toimittaja PLoS ONE toimitusneuvosto, mutta vahvistaa, että se ei vaikuta hänen noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, jotka on esitetty oppaassa tekijöille. Lisäksi on liittyvä patentti materiaalia asiaankuuluvia tässä artikkelissa, eli sukupolvi romaani lääkettä, DZ-50, tekijät Dr. Chen ja Dr. Kyprianou. He ilmoittavat tämä patentti, nimeltään: ”Novel antituumoriaineista ja menetelmät niiden kohdistamista eturauhassyöpä”, University of Kentucky /Ohio State University yhteinen Invention, US-patentti S.N. 12/323073. (Ching-Shih Chen ja Natasha Kyprianou, coinventors.) Kirjoittajat vahvistavat, että omistusoikeuden /keksintö tämän patentin ei muuta niiden noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, joista on yksityiskohtainen opas tekijöille.

Johdanto

eturauhassyöpä on toiseksi yleisin syöpä miehillä, joilla 206640 miesten diagnosoitu ja 28088 kuolevat eturauhassyöpä vuonna 2012 [1]. Kemoterapeuttiset kohdentaminen androgeenin signaloinnin akselin eturauhasen syöpä on vaikuttanut parhaan syövän eloonjääneitä miehillä. Kuitenkin potilasalaryhmässä tullut reagoivat huonosti androgeeniablaatio hoidon jättäessään apoptoosin ja etenee kastraatio kestävä eturauhassyövän (CRPC) [2]. Eturauhasen rauhas epiteelisolujen on luontainen tarve eloonjääntisignaaleja opetetaan solujen välisen ja soluväliaineen (ECM) vuorovaikutuksia. Paikallisessa tarttumisessa ovat elintärkeitä sekä normaali yhteyshenkilö riippuvaisen signaloinnin normaalit solut ja invaasio, muuttoliike ja etäpesäkkeiden pahanlaatuisten solujen.

Työ tältä laboratoriolta tunnistettu uusi anti-kasvain toimintaa kohdistama lääkkeitä klassisesti käytetään hyvänlaatuisen eturauhasen liikakasvu (kinatsoliini-α

1-adrenoseptoriantagonistit) kautta induktion ulkoista apoptoosin cascade (kuolema reseptorin aktivoitumisen, kaspaasi-8 pilkkominen ja estämällä AKT selviytymisen signalointi) [3], [4], [5]. Rakenteellinen optimointi johti sukupolven uusia yhdisteitä, jotka kykenevät anoikis induktion ja angiogeneesin estäminen [6], [7]. Anoikis, apoptoottista solukuolemaa seurausta riittämätön solu-ECM vuorovaikutuksia, on kriittinen osa angiogeneesin ja metastaasin [8]. Aggressiivinen kasvainsolujen horjuttaa tätä mekanismia, säilyttäen selviytyminen levittämällä ja kylvö kaukaisissa elimissä [9]. Anoikis resistanssi liittyy läheisesti kasvoi metastaattisen potentiaalin monissa ihmisen maligniteettien, mukaan lukien eturauhassyöpä [10], munuaissolukarsinooma [11], rintasyöpä [12] sekä mesenkymaaliset kasvaimet [13].

etäpesäke edellyttää häiriintyminen solujen vuorovaikutus kasvain microenvironment, lisääntynyt muuttavien ja invaasio kapasiteetti ja kyky voittaa pro-apoptoottiset signaalit opetetaan vähentynyt solujen välisen ja solun ECM vuorovaikutuksia [14]. ECM käsittää monipuolinen verkosto sytokiinien vaikuttavat solujen kasvua, liikkuvuuteen ja angiogeneesiä, joka voidaan tehdä saatavilla solun käytettäväksi entsyymidigestiolla ja remontin [15]. Transmembraaniset integriinit on ominaista kaksisuuntainen signalointi. Oligomeroimalla integriinin proteiinien noin ECM alustan indusoi konformaatiomuutoksiin jotka ovat kautta solukalvon moduloimiseksi affiniteettia solunsisäisen signaloinnin efektorien on sytosolin integriini hännät [16]. Proteiini aggregaatit, joita yhdessä kutsutaan polttovälin tarttuvuus kompleksi (FAC), sisältävät aktiinia sitovia proteiineja (Talin-1, vinkuliini, vimentiinistä, paksilliini, filamiini, yms.), Joka vakauttaa solun tukirangan ja kinaasien (polttoväli adheesiokinaasi [FAK], integriini linkatun kinaasi [ILK], ja SRC ei-reseptori-tyrosiinikinaasin), jotka etenevät solunsisäisen signaloinnin tumaan. Tämä integriini-välitteinen ”ulkopuolella-in” signalointikaskadissa valvontaa käsittelee tärkeää solujen toiminnan ja kasvun solusyklin etenemisen ja erilaistuminen [17].

Koska aktiinisytoskeletonver- verkon läpi dynaaminen remodeling /organisaatio, integriini klusterointi indusoi ”nurinpäin” signalointi lisäämään affiniteettia integriinien ECM, tehokkaasti perustamalla fokaalisen adheesion [18]. Kun riittävästi integriini-ECM vuorovaikutuksia, solut downregulate jäsenet anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen ja upregulate Fas-ligandin (FasL), joka indusoi anoikis kautta ulkoista apoptoosireittiä [19], [20]. Talin-1 toiminnallisesti vaikuttaa anoikis kestävyys ja eturauhassyövän etäpesäkkeiden tehostamalla fokaalisen adheesion muodostumista ja Akt-eloonjäämisen signalointi. Olemme viime aikoina osoittaneet merkittävää korrelaatiota taliini-1 yli-ilmentymisen ja etäpesäkkeiden hiirimallissa eturauhasen kasvainten synnyssä ja ihmisen eturauhassyövän etenemiseen [10].

farmakologinen hyödyntämisen α1-adrenoreseptorin antagonisti doxazosin® on johtanut sukupolven uusia kinatsoliini-yhdisteitä, jossa johtoon agentti, DZ-50, jolla on voimakas anoikis aiheuttavia vaikutuksia vastaan ​​syöpäsoluja [6]. DZ-50 tukahduttaa kasvua ihmisen eturauhassyöpäksenografteista ja estää metastasoituneeseen potentiaali

in vivo

huonontamalla angiogeneesiä, muuttoliike ja invaasio [7] kautta kohdistettu fokaalisen adheesion signalointi akselilla [11]. Tässä tutkimuksessa selvitettiin solukohteita DZ-50 androgeeni-riippumaton ihmisen eturauhasen syöpäsolujen. Genominlaajuisia analyysi tunnistettu kriittiset efektoreita fokaalisen adheesion ja tiiviin liitoksen vuorovaikutuksia, jotka on kohdistettu romaani kinatsoliinin agentti.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

androgeenireseptorin riippumattaman ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa PC-3 ja DU-145 saatiin American Type Tissue Culture Collection ja sitä viljeltiin RPMI 1640: ssä (Invitrogen), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen) ja antibiootteja (PenicilinG /streptomysiiniä, 50 ug /ml). DU-145-solut transfektoitiin pEGFP tai taliini-1 plasmidit ja kloonattiin G418- selektion alaisuudessa (Life Technologies Bethesda Research Laboratories). Hiljentää taliini-1 ilmaisu, shRNA taliini-1-vektoriin (GIPZ shRNAmir taliini-1) käytettiin Open Biosystems (Hunsville, AL) ja shRNA talin1 DU-145 eturauhassyövän solut valittiin alla puromysiiniä. Polyklonaaliset populaatiot yhdistettiin alla valinta, ja stabiileja solulinjoja ominaista immunoblottauksella. PC-3-solut transfektoitiin stabiilisti pTRIPZ vektorilla, joka sisältää TRE-ILK shRNA (Thermo Scientific). PC-3 shILK solut indusoitiin 2 ug /ml doksisykliiniä (Enzo Life Sciences) kaksi päivää. DZ-50, joka on ensimmäisen sukupolven doksatsosiinia johdannainen (Shaw et al., 2004; Garrison et ai., 2007), käytettiin pitoisuutena 5 uM liuotettiin DMSO: hon kaikkien hoitoja. Steriiliä DMSO: ta käytettiin ohjaus /käsittelemättömien näytteiden.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin hoidon jälkeen 5 uM DZ-50 käyttäen kolorimetristä MTT: tä (3- [4,5-dimetyylitiatsol – 2-yyli] -2,5 difenyylitetrat-) määritys (1 mg /ml MTT: PBS: ssä), ja kvantitoitiin käyttäen spektrofotometrinen mittaus. Tilastollinen analyysi 3 riippumattomasta kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena, on ilmaistu suhteessa käsittelemätön kontrolli.

Cell migraatiokokeessa

haavoittaen oli aiheutettu käyttämällä steriiliä pipetin kärki konfluenteissa yksisolukerroksista 6- kuoppalevyille. Inkuboitiin 12-48 tuntia, kun läsnä on DZ-50 (5 uM), haavoittuneita alueet tutkittiin valomikroskoopilla (Axiovert 10, Zeiss). Solut siirryttäessä haavoittuneita alueille laskettiin mikroskoopilla. Muuttopotentiaalia määritettiin keskimäärin solujen kolmen random korkean tehon (400 x) -kentät /kuoppa. Numeeriset tiedot saadaan kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena ja on ilmaistu suhteessa käsittelemättömiin verrokkeihin.

Soluadheesiokoe

Cultures of PC-3 ja DU-145 alalinjoja käsiteltiin (24 h) DZ-50 (5 uM) ja korjattu. -Soluja (1 x 10

5 /kuoppa) lisättiin 6-kuoppaisille levyille päällystettiin fibronektiinillä (5 ug /ml, BD Biosciences) ja seuraavat 30 min inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, solut kiinnitettiin 100% ( v /v), kylmällä metanolilla ja alistettiin kuva-analyysi. Lukumäärä kiinnittynyt solujen laskettiin kolmella edustaja aloilla /kuoppa (400 x). Numeeriset tiedot ovat keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena ja on ilmaistu suhteessa käsittelemättömiin kontrolleihin.

Western blot -analyysi

Ihmisen eturauhasen syöpäsoluja, DU-145 ja PC-3, käsiteltiin DZ-50 (5 uM) peräkkäistä ajanjaksoina ja solulysaatit syntyy lyysipuskuriin (150 mmol /l NaCI: a, 50 mmol /l Tris (pH 8,0), 0,5% deoksikoolihappoa, 1% NP40, 1 mmol /L fenyyli metyyli-sulfonyylifluoridi, pH 7,4). Proteiini näytteet altistettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin Hybond-C kalvoja (Amersham Pharmacia Biotechnology). Kalvoja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa erityisen ensisijainen vasta: Akt (Cell Signaling Technology), fosforyloitu Akt Ser 473 (Cell Signaling Technology), GSK-3β (Cell Signaling Technology), fosforyloitu GSK Ser 9 (Cell Signaling Technology), ILK-1 (Cell Signaling Technology), ZO-1 (Invitrogen), Claudin-11 (Santa Cruz Biotechnology), Talin-1 (Millipore) tai Actin (Calbiochem). Inkuboinnin vastaavaan ensisijainen vasta-aine, kalvot altistettiin piparjuuriperoksidaasileimattua sekundääriset vasta-aineet ja signaali havaittiin SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce) ja paljaana röntgenfilmille. Densitometrinen analyysi suoritettiin käyttäen ImageJ ohjelmiston ja arvot on ilmaistu suhteessa kontrolleihin.

Gene (qRT-PCR) analyysi

RNA eristää solulysaateista käyttäen TRIzol reagenssia (Ambion) ja Pure Link RNA Mini Kit (Invitrogen) valmistajan mukaan. Homogenisoinnin jälkeen ja faasien erottumisen sentrifugoimalla (12000 g, 4 ° C), RNA saostettiin isopropanolilla. Näytteet sentrifugoitiin (12000 g, 4 ° C), ja cDNA syntetisoitiin käyttämällä RNA: ta (1 ug) ja Reverse Transcription System (Promega). DNA erilaisia ​​analyysi tehtiin Kentuckyn yliopistosta Microarray Core Facility käyttäen Affymetrix GeneChip- Technology. Transkriptit arvioitiin ABI 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems Inc.); Kunkin käsittelyn (5 uM DZ-50, 9 tuntia) suoritettiin kolmena kappaleena.

RT-PCR-analyysi RNA (1 ug) altistettiin käänteistranskriptio käyttäen Reverse Transcription System (Promega). Seuraavat alukkeet suunniteltiin (Sigma) SYBR Green kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) järjestelmä: fibronektiinin-1 (F: 5′-TCATGAGGCAACGTGTTATGATG-3 ’, R: 5′-CGAGATATTCCTTCTGCCACTGT-3′), TALIN- 1, (F: 5’-GCAGAAGGGAGAGCGTAAGATC-3 ’, R: 5′-TGAGAGAACGGGCTAGCTTCA-3′), integriini-α6 (F: 5’-CAGAAAGTGTGCATGGAGGAAA-3 ’, R: 5′-TGGGAATGGGACGCAGTT-3′), ja ZO-1 (F: 5’-GGAGCTGCGCTTACCACACT-3 ’, R: 5′-TTTGCTCCAACGAGATAATTTGG-3’). Seuraavia alukkeita, jotka on saatu TaqMan qRT-PCR-järjestelmä (Invitrogen): 18 s ribosomi-RNA: ta (rRNA), Trombospondiinin-1, IGF-BP3, Claudin-11, Snail. cDNA käytettiin qRT-PCR-analyysi mukaan kunkin SYBR Green ja TaqMan-protokollia (Bio-Rad). Jotta qRT-PCR kokeissa kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena ja saadut tiedot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta. Numeeriset tiedot transkriptipitoisuuksissa normalisoitiin 18 s rRNA kontrolleissa ja ilmaistu suhteessa käsittelemättömiin verrokkeihin.

Immunofluoresenssianalyysi

Solut levytettiin 4-Kaivokammio dioja päällystetty fibronektiini (5 ug /ml , BD Biosciences) altistettiin DZ-50 hoitoa (5 uM) 12 tunnin ajan. Solut kiinnitettiin sitten 100% (v /v) metanolia, ja sen jälkeen estää 4 ° C: ssa (5% NGS, 0,3% Triton X), altistettiin primääristä vasta-ainetta (4 ° C, yön yli). Seuraavat erityiset vasta-aineita käytettiin: ILK-1 (Cell Signaling Technology), ZO-1 (Invitrogen), Claudin-11 (Santa Cruz Biotechnology), Etana (Cell Signaling Technology), Talin (Millipore). Sitten soluja inkuboitiin fluorokromilla konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Invitrogen) (2 tuntia, huoneen lämpötila) ja alistettiin konfokaalimikroskopialla käyttäen Olympus FV1000 konfokaalimikroskoopilla v1.21. ja ohjelmistoversion FV10-ASW 3.1.

Microarray Analysis

shTalin tai vektorin DU-145 ihmisen eturauhassyövän soluja käsiteltiin DZ-50. RNA-näytteet soluista ennen tai jälkeen (9 tuntia) käsittely jätettiin Kentuckyn yliopistosta Microarray ytimen järjestely analyysiä Affymetrix Human Gene 1.0 ST paneelit (Affymetrix, Santa Clara, CA). Koe kunkin ehdon suoritettiin kahtena.

Tilastollinen analyysi

Microarray data normalisoitiin käyttämällä RMA ja analysoitiin käyttämällä kaksisuuntaista varianssianalyysi (ANOVA) malleja, joissa genotyyppi (shTalin tai vektori) ja hoito (ennen tai jälkeen), koska kaksi tekijää. Kontrastit luotiin muutosten arvioimiseksi mRNA ilmaisun välillä käsiteltyjen versus käsittelemättömien vektori soluissa. False löytö määrä (FDR) ja siihen liittyvä q-arvot laskettiin käyttäen menetelmää REF. Ilmentyvät eri geenit määritettiin perustuen FDR 20% ja taita muutos 1.5. Tilastolliset analyysit tietojen kaikista muista kokeet suoritettiin perustuen yhden otoksen tai kahden otoksen t-testejä tarvittaessa. P 0,05 arvoja pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Novel Kinatsoliini DZ-50 indusoi Eturauhassyöpä Cell Anoikis

anoikis indusoiva vaikutus johtoon quanazoline yhdiste DZ -50 tutkittiin ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa vaihtelevasti ilmentävät FAC proteiineja, taliini-1 ja ILK. Vakaa transfektointi DU-145-soluissa johti knockdovvn Talin (DU-145 shTalin) ja yliekspressio Talin (DU-145 Talin +) (kuva 1, paneeli A). PC-3-solut ilmentävät indusoitavissa shILK vektori osoitti tehokasta downregulation ILK indusoitaessa doksisykliini 48 tuntia (kuva 1, paneeli A). Oli aika riippuva vähentää solujen elinkelpoisuutta vastauksena DZ-50 (kuva 1, paneeli B). Menetys ILK ja Talin ilmentymistä PC-3 ja DU-145 eturauhassyövän soluissa johti suurempi herkkyys DZ-50, kun taas Talin yliekspressio tukahdutetaan anoikis. Tiedot paneeli C (Fig. 1) osoittavat, että vastauksena DZ-50, eturauhassyöpä ell muuttoliike lisääntyy merkittävästi. Menetys joko ILK (PC-3-solut), tai Talin (DU-145-solut), estivät solujen vaeltamiseen, kun taas edelleen parantaa vaikutusta DZ-50. Menetys joko ILK tai Talin itsenäisesti johtaneet huomattavaan vähenemiseen solun tarttumisen fibronektiiniin (kuva 1, paneeli D).

paneeli A, oikea, Western blot paljastaen että shILK transfektanttiyhdistelmän PC-3-soluilla kokonaishäviö ILK-1-proteiinin ilmentymisen suhteen vektorisäätö solujen induktion doksysykliinillä (48 tuntia). Vasemmalla, DU-145-solut, joissa Talin on hiljaisuus (shTalin) tai yli-ilmentyy (Talin +), havaittiin merkittävää vähentämistä tai merkityt yli-ilmentyminen Talin proteiinin tasot vastaavasti suhteessa vanhempien DU-145-soluja. Paneeli B, DZ-50 hoito johtaa laski merkittävästi eturauhasen syöpäsolun elinkelpoisuuden ajasta riippuva tavalla. Menetys ILK1 parantaa DZ-50 aiheuttama menetys solujen elinkelpoisuuden; toisin Talin yliekspression antaa vastustuskyvyn DZ-50 solukuolema. Paneeli C, DZ-50 vähentää merkittävästi eturauhassyövän solujen vaeltamiseen. Menetys Talin johtaa merkittävään vähentämiseen eturauhassyövän solumigraation verrattuna lapsilukon DU-145-soluja. Vastauksena DZ-50, Talin yliekspressio palauttaa solun muuttavien kyky tasot käsittelemättömien solujen. Paneeli D, toiminnallinen menetys ILK PC-3 eturauhasen syöpäsolujen ja menetys taliini DU-145-soluja merkittävästi heikentää kykyä kunkin eturauhasen syöpäsolujen noudattaa fibronektiiniin (ECM). Talin yliekspressio tehostaa merkittävästi eturauhassyövän solun tarttumisen fibronektiiniin verrattuna vanhempien DU-145 ja DU-145 shTalin soluissa. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin * p 0,05.

tunnistaminen Molecular kohderyhmä Lead Kinatsoliini

Genominlaajuiset analyysi geenien ilmentymistä ihmisen eturauhassyövän solulinjaa DU-145 oli käytetään tunnistamaan Ensisijaisia ​​DZ-50 (Fig. 2). Lämpö kartta geenistä erilaisia ​​analyysi jälkeen eturauhassyövän hoitoon solujen DZ-50 (9 tuntia) näkyy kuvassa 2 (paneeli A). DZ-50 johti merkittävään downregulation geenejä, jotka koodaavat solukalvon liittyviä proteiineja, kuten sääntelyviranomaisten ECM (

fibronektiiniä

ja

integriini-α

6

), ja tiukka liittymissä (

klaudiini-11

), insuliinin kasvutekijää sitova proteiini 3 (

IGFBP-3

), samoin kuin angiogeneesin välittäjänä trombospondiini 1 (

TSP-1

). Validoida paneeli ehdokas geenikohteet tunnistetaan geenijärjestelyillä molekyyli profilointia, me myöhemmin suoritettiin kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) analyysi (Fig. 2, paneeli B). Altistuminen DU-145 solujen DZ-50 (3 ja 9 tuntia) johti merkitsevän eston lausekkeen valitun geenin allekirjoituksen tunnistanut erilaisia ​​analyysi (kuva 2, paneeli A), mukaan lukien geenit, jotka koodaavat keskeisiä fokaalisen adheesion signalointi efektorit , solun (Talin) ja solun (fibronektiini) ja tiiviin liitoksen proteiinit (Claudin-11 ja ZO-1). Transkriptionaalinen välittäjäaine EMT,

Snail,

vähentää myös DZ-50. Kemiallinen rakenne kinatsoliini-pohjainen yhdiste DZ-50, on esitetty paneeli C (Fig. 2).

paneeli A, Heat kartta differentiaalisesti ilmentyvien geenien DU-145 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen ennen ja jälkeen hoidon DZ-50 (9 tuntia). Havaitsimme 17 merkittävästi vaimentua geenejä hoidon jälkeen DZ-50 (9 tuntia), mukaan lukien geenit, jotka koodaavat ECM sääntelyviranomaisten

fibronektiiniä

ja

integriinin α6

, tiiviin liitoksen sovittelija

Claudin-11

ja angiogeneesissä signalointi efektori

trombospondii- 1

. (Kertainen muutos 1,5, vääriä löytö korko 20%). Paneeli B, validointi geenin ilmentymisen käyttäen qRT-PCR jälkeen DZ-50 eturauhassyövän hoitoon soluja (5 uM) 3 ja 9 tunnin ajan. Merkittävä väheneminen mRNA suhteessa käsittelemättömiin soluihin havaittiin varten osallistuvien geenien ECM-fokaalisen adheesion signalointi komponentit

(fibronektiini

,

integriini-α6

ja

Talin

), tiukka liittymissä (

klaudiini-11

), angiogeneesin (

trombospondiini-1

) ja EMT (

Snail

). * Tarkoittaa merkitsevää eroa arvolla p 0,05. Paneeli C, molekyylirakenne Doxazosin © johdannainen, DZ-50.

DZ-50 Tavoitteet Vital Cellular Interactions eturauhassyöpäsoluissa

luonnehtivat vaikutuksen DZ-50 tiiviiden liitosten (TJ) kolokalisaation ZO-1 ja Claudin-11, kaksi proteiinia välttämättömiä solujen väliset vuorovaikutukset, arvioitiin käyttäen fluoresoivaa konfokaalimikroskopialla kahdessa eri ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, PC-3 ja DU-145 (kuvio . 3 kentät A ja B). Hoito DZ-50 (12 tuntia) huomattavasti vähentynyt Claudin-11 lauseke (punainen) kummassakin vanhempien solulinjoissa, johtaen tuntuva heikentyvän TJ muodostumista. Solunosasijaintia ZO-1 (vihreä) on solukalvon johti vastauksena DZ-50. Solut, jotka ilmentävät menettänyt polttopisteen adheesioproteiineja ILK (PC-3 shILK) ja Talin (DU-145 shTalin) säilytetään joitakin Claudin-11 ilmentyminen hoidosta huolimatta DZ-50 nähden vastaavien vanhempien solulinjoja (valkoiset nuolet). Tämä ilmaus Claudin-11 komplekseja ZO-1: n solukalvon huonosti määritelty, pistemäinen TJ kompleksit on esitetty kuvassa 3 (komposiitti kuvia, paneelit A ja B). Vastauksena DZ-50, oli aika-riippuva säätelyyn ylöspäin ZO-1-proteiinin tasoja. ZO-1-ekspressio korreloi käänteisesti ilmentymisen fokaalisen adheesion proteiinin ILK (Fig. 3, paneelit C ja D). Western blot-analyysi osoitti, että Talin yli-ilmentymisen DU-145-soluissa johti vähensi ZO-1-proteiinin tasot, kun taas downregulation Talin liittyi lisääntynyt ZO-1 (Fig. 3, paneelit E, F).

Ominaisuus konfokaalimikroskopialla kuvia PC-3-soluja (paneeli A) ja DU-145-soluja (paneeli B). Hoito DZ-50 (12 tuntia, 5 uM) pienenee Claudin-11 ilmentyminen ja estää tiiviin liitoksen muodostumisen. Tiukka liittymissä kompleksit (nuolet), tunnettu rinnakkaispaikantumisen tiukan liitoksen proteiinit Claudin-11 (punainen) ja ZO-1) (vihreä) on täysin kumonnut DZ-50. PC-3 shILK ja DU-145shTalin solut on heikko muodostuminen TJ kompleksien (nuolenpäät), vastauksena DZ-50. DAPI (sininen) käytetään ydin- havaitsemiseen (paneelit A ja B). Suurennus x100. Paneelit C-F, Western-blotit ja vastaavat densitometrinen analyysi paljastaa ilmentymisen TJ proteiinin ZO-1 vastauksena DZ-50 PC-3 (paneelit C ja D) ja DU-145 (Paneelit E ja F) eturauhassyövän solulinjoissa .

fluoresenssimikroskopialla käytettiin vaikutuksen tutkimiseksi DZ-50 fokaalisen adheesion dynamiikan kaksi erilaista ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa PC-3 (Fig. 4) ja DU-145 (Fig. 5). Tulokset kuviossa 4 osoittavat, että vastauksena DZ-50 (12 tuntia), oli merkittävä väheneminen Talin (punainen) ja ILK (vihreä) proteiinin ilmentymisen, vaarantamatta fokaalisen adheesion eheys (komposiitti kuvien Fig. 4, paneeli A ; DAPI-blue tumavärjäystä). Määrittää vaikutus ECM soluvasteen DZ-50, PC-3-soluja viljeltiin, kun läsnä fibronektiinin. Läsnä fibronektiinin helpottaa fokaalisen adheesion vakauttamiseen ja jatkuvaa ilmentymistä taliini ja ILK, pelastamiseen eturauhassyövän solut anoikis vaikutus DZ-50 (komposiitti kuvien Fig. 4, paneelit A ja B). Toiminnallinen tappio ILK PC-3-solut (Fig. 4, paneeli B) johti FAC epävakautta samanaikaisen downregulation Talin suhteessa vanhempien PC-3-solut (Fig. 4, paneeli A). Hoito shILK solujen DZ-50 johti täydelliseen kumoamisen FAC signaloinnin, ilmiö, joka on osittain pelastettiin läsnä fibronektiinin.

PC-3 eturauhasen syöpäsolujen ja PC-3 shILK -solut menetys ILK (paneelit A ja B, vastaavasti) käsiteltiin DZ-50 (12 tuntia, 5 uM) poissa tai läsnä fibronektiinin-ECM. Fluoresenssikuvia paljastavat kolokalisaation fokaalisen adheesion sääntelyviranomaisten Talin (punainen) ja ILK (vihreä) häiriintyä DZ-50 hoitoa, verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. DAPI (sininen) käytetään ydin- havaitsemiseen. Hiljentäminen ILK: n ilmentymistä johtaa vähentyneeseen havaitsemiseen ensisijaisen alkupään kumppani, Talin ja myöhempää rikkomista paikallisessa tarttumisessa (paneeli B), verrattuna vanhempien PC-3-solut (paneeli A, komposiitti, paikallisia tarttumista tunnistettu keltainen). Eturauhassyövän soluja kasvatettu fibronektiiniä päällystetyn alustan (ECM eheys) vakauttaa polttovälin tarttuvuus monimutkainen ja vähentävät kohdistaminen kyky DZ-50 seuraavilla alustoille sekä PC-3 vanhempien ja PC-shILK soluissa. Suurennus x100.

DU-145 (paneeli A) ja DU-145 shTalin (paneeli B) viljeltiin poissa tai läsnä fibronektiinin-pinnoite ja käsiteltiin DZ-50; solut altistetaan seuraavaksi -konfokaalimikroskoopilla havaitsemiseen taliini (punainen), ILK (vihreä), ja paikallisia tarttumista (keltainen). Tumat havaitaan DAPI-värjäyksellä (sininen). DZ-50 väheni fokaalisen adheesion muodostumisen kohdentamista Talin ja ILK. Tämä vaikutukset kumottiin läsnäolo fibronektiinin-ECM, jolla annettiin vastustuskykyä DZ-50 (paneeli A). Menetys Talin johti pienentyneeseen kolokalisaation kanssa ILK ja katoaminen paikallisia tarttumista DU-145 shTalin soluissa (paneeli B). Suurennus x100. Paneelit C-E, Western blot ja määrällinen analyysi ajasta riippuva vaikutus DZ-50 loppupään solujen selviytymistä signalointi. DZ-50 johtaa defosforylointia säilyminen signalointi efektorien AKT (paneeli D) ja GSK-3β (paneeli E). Talin yli-ilmentyminen antaa resistenssin DZ-50 anoikis vaikutus ylläpitämisessä aktivoinnin /fosforylaatiota AKT ja GSK-3β signalointi.

jälkeen tutkittiin seuraukset Talin alennus eturauhasen syöpäsolun fokaalisen adheesion eheys ja niiden herkkyys ja DZ-50. Konfokaalimikroskopia kuvien esitetty kuviossa 5, osoittavat, että läsnäolo fibronektiinin antagonisoivat anoikis Lääkkeen vaikutuksen kohdistaminen keskeisille kiinnikkeistä DU-145-soluja (kuvio. 5, paneeli A) toiminnallinen Talin tasoilla. Hiljentäminen Talin eturauhassyöpäsoluissa kuitenkin johti polttopiste tarttuvuus kompleksin muodostumisen lakkautetaan vaikka läsnä fibronektiinin (Fig. 5, paneeli B). Ei ollut niin merkittäviä eroja paikallisessa tarttumisessa että DU-145shTalin soluissa.

DZ-50 heikentää Loppupään Solunsisäiset Survival Signaling

tutkimiseksi seuraukset DZ-50 solusisäiseen signalointi alavirtaan polttoväli tarttuvuus monimutkainen ja tiukka liittymissä, AKT ja GSK3p profiloitiin välituotteena eloonjäämisen signalointi effektorit [11], [21]. Kuten esitetään kuviossa 6 kohdentamiseen näiden solujen vuorovaikutuksia DZ-50 johtaa merkittävään vähentämiseen fosforylaation Sekä AKT ja GSK3p 3-6 tunnin hoidon (paneelit B ja C). N yli-ilmentyminen Talin eturauhassyöpäsoluissa aiheuttama fosforylaation Akt ja GSK-3β, mikä johtaa tehostetun selviytymisen ja kestävyys toiminnan DZ-50. Sen sijaan, DU-145-soluja, joilla on alennettu taliini tasolla, esillä laski Akt ja GSK3p-fosforylaation (kuvio. 6, paneeli C).

DZ-50 tavoitteet solu-solu-vuorovaikutuksia (tiiviiden liitosten) ja solu-ECM vuorovaikutukset (paikallisessa tarttumisessa) laskevan solunsisäisiä eloonjääntisignaaleja ja häiritä aktiinisytoskeletonver- eheyden aikaansaamiseksi anoikis. Vakauttaminen fokaalisen adheesion monimutkainen signalointi ECM komponenttien ja kohonnut Talin, parantaa kaksisuuntainen integriini signalointi, jolloin solujen vastustuskykyä anoikis (oikealla). DZ-50 tavoitteiden solunulkoista, solujen väliset ja solunsisäiset kiinnikkeistä ja molekyylejä aiheuttavan anoikis (vasemmalla).

Keskustelu

Genominlaajuiset analyysi geeniekspression DU-145 ihmisen eturauhassyövän solut paljasti downregulation lupaava anti-kasvain tavoitteensa romaani kinatsoliinijohdannainen DZ-50, kuten EMT liittyvien geenien (integriini-α6, fibronektiini ja Talin), angiogeneesi liittyy geenien (TSP-1), liittyviä geenejä solujen väliset TJs (claudin- 11 ja 14) samoin kuin seriini treoniinikinaasi 31 (TSK31) ja insuliinin kasvutekijää sitova proteiini 3 (IGFBP-3). Konfokaalimikroskopia tutkimus vahvisti, että DZ-50 tavoitteiden kriittinen proteiinit mukana muodostumista sekä TJs ja paikallisia tarttumista, heikentäen solunulkoinen vuorovaikutusta, Aktiinisytoskeletonin eheys ja pro-eloonjäämisen solunsisäinen signalointi. Olemme aiemmin perustaneet

in vivo

antitumor toiminta DZ-50 kahden ihmisen androgeenista riippumaton eturauhassyöpävieraslajisiirteissä, PC-3 ja DU-145 [7]. Viimeaikaiset todisteet ehdotti, että Talin antaa anoikis resistenssin eturauhassyövän soluissa kohti etäpesäkkeitä, kautta sen kyvystä vakauttaa paikallisia tarttumista ja levittää polttovälin tarttuvuus monimutkainen signalointi kautta Akt selviytymisen signalointi [10]. Esillä olevassa tutkimuksessa, jossa käytetään kahta eri androgeenista riippumaton ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja DU-145 ja PC-3, kuten

in vitro

koejärjestelmissä, olemme osoittaneet, että kaksi erillistä solunsisäistä fokaalisen adheesion monimutkaisia ​​osia, taliini ja ILK, on ​​kohdistettu johtoon kinatsoliini DZ-50 (Fig. 6). Talin yli-ilmentyminen antaa sieto DZ-50, kun taas tappio Talin vähensi kasvainten solujen eloonjäämistä, migraation ja adheesion, herkistävä eturauhassyöpä solujen anoikis vaikutusta DZ-50. Fenotyypin muutosten ja lisääntynyt herkkyys DZ-50 havaittiin DU-145-soluja matalalla Talin ilme, ja PC-3-solujen kätkeminen menetys ILK toiminnon tukea säätelyroolia näiden kahden kriittisten komponenttien fokaalisen adheesion monimutkainen syöpäsolun anoikis vastus. Kuvio 6 esittää mekanistinen skeema DZ-50 välitteisen anoikis signalointia. Tiukka risteykset sijaitsevat apicobasal solukalvon muodostaen valikoivasti läpäisevä este välttämättömiä neste- ja elektrolyyttitasapainon. Claudins ovat transmembraani- adheesioproteiineja, jotka kattavat solujen väliseen tilaan, jolloin muodostuu homo- tai heterodimeerejä vastakkaisilla soluihin [22]. Soluliman pyrstöt claudins vuorovaikutuksessa aktiini vakauttavan proteiineja, Zonula occludins (ZO) [23]. Klaudiini-1 säätelyä liittyy peräsuolen syövän etenemisen kautta anoikis vastus, näyttöä yhdistää anoikis tiukka liittymissä vaikutti Bcl-2 ja AKT selviytymistä signalointi [24].

kohdentaminen kriittinen sisäisissä ja ulkoisissa fokaalisen adheesion komponenttien