Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) on keskeinen rooli kasvainten synnyssä, joko tuumorisuppressorina tai onkogeenisessä miRNA riippuen eri kasvaintyypeille. Tähän mennessä tutkijat ovat saaneet huomattavan määrän tietoa osalta miRNA haimasyövän. Ilmaisulla ja toiminta miR-371-5p haimasyövän ei ole selkeästi selvitetty. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia rooleja miR-371-5p haimasyövän ja sen yhteys potilaiden selviytymiseen haimasyöpä.

Methods

ilmentyminen miR-371 -5p tutkittiin haiman kanava (PDAC) ja niiden viereisten normaalin haiman kudoksista (ANPT) tai haimasyövän solulinjoissa qRT-PCR. Yhdistys miR-371-5p ilmaisutapoja kokonaiselossaolo määritettiin. Lisääntymistä ja apoptoosia SW-1990 ja Panc-1-solut, jotka oli transfektoitu miR-371-5p jäljittelee tai estäjä, arvioitiin käyttäen MTT-määritystä ja virtaussytometria, vastaavasti. Tuumorigeenisyyden arvioitiin kautta hiirillä vierassiirrekokeissa. miR-371-5p promoottori vuorovaikutuksia analysoitiin kromatiinin immunopresipitaatiomäärityksiä (chip). Proteiinin ilmentyminen analysoitiin Western blot.

Tulokset

Ilmaisu taso miR-371-5p dramaattisesti yläreguloituja kliinisissä PDAC kudoksissa verrattuna ANPT. Potilaat, joilla on korkea miR-371-5p ilme oli huomattavasti lyhyempi selviytymisen kuin heikosti miR-371-5p ilme. In vitro ja in vivo osoitti, että yli-ilmentyminen miR-371-5p johti solujen lisääntymisen ja lisääntynyt kasvaimen kasvu, joka liittyi kasvuinhibiittorina 1 (ING1) downregulation. Kiinnostavaa kyllä, Huomasimme myös, että ING1 puolestaan ​​esti ilmentyminen miR-371-5p promoottorialueella.

Johtopäätökset

tutkimuksemme osoittaa uusi ING1-miR-371-5p sääntelyyn silmukka, joka voi olla kriittinen rooli PDAC. Näin miR-371-5p voi osoittautua uusi ennustetekijä ja terapeuttinen kohde haimasyövän hoitoon.

Citation: Hän D, Miao H, Xu Y, Xiong L, Wang Y, Xiang H, et ai . (2014) MiR-371-5p Helpottaa Haimasyöpä Cell Proliferation ja Vähentää Patient Survival. PLoS ONE 9 (11): e112930. doi: 10,1371 /journal.pone.0112930

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 10. heinäkuuta 2014; Hyväksytty 16. lokakuuta 2014; Julkaistu: 20 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 He et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksen Innovation of Science ja TechnologyCommission Shenzhen kunnan (nro JCYJ20140414103937769). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojenkeruuohjelmat ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

PDAC on erittäin pahanlaatuinen fenotyyppi ominaista nopea eteneminen, varhain etäpesäkkeitä, ja rajoitettu vaste sädehoidon ja kemoterapian. Huolimatta yli 10 vuotta FDA-hyväksyttyjä terapeuttisia hoito ja suuria parannuksia sairaanhoidon, ei ole merkittävää vaikutusta PDAC elossaololuku on havaittu [1]. Nyt se on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien Yhdysvalloissa 5% 5 vuoden pysyvyys vuosittain [2]. Siksi on kiireesti tunnistaa biomarkkerit joka edistää varhaista diagnosointia ja mahdollistaa yksilöllisten strategioita potilaiden riski on suuri PDAC.

kehittymistä ja etenemistä PDAC ovat monimutkainen prosessi, johon vapauttaminen useiden geenit, jotka ovat välttämättömiä solujen biologisia prosesseja. Transkriptiotekijät (TF: t) ja miRNA ovat näkyvästi sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen [3]. Viimeisten 10 vuoden aikana, miRNA ovat erityisen tärkeitä lähes kaikissa kasvainten kehittymiseen tutkimuksissa, koska ne voivat olla kohteita genomista vaurioita, joita ohjataan klassinen kasvain signaaleja, ja he itse läsnä luokan onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla [4]. Äskettäin miRNA on ehdotettu olla tiiviisti mukana PDAC tumorigeneesin [5].

miRNA ovat pieniä (21-24 nt) koodaamattomalla RNA-molekyylejä, jotka säätelevät geenien ilmentymistä sitoutumalla löyhästi täydentäviä sekvenssit 3 ’ -untranslated alue kohde mRNA: iden tukahduttamiseksi käännöksen tai aiheuttaa mRNA pilkkominen [6]. Löytö miRNA on tuonut uutta oivalluksia solujen jakautumisen, erilaistumisen, apoptoosin ja vanhenemista, ja on myös osaltaan potilaan hoito, kuten diagnosointia ja hoitoa [7].

Vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat selventäneet roolit monien miRNA haimasyövän [8], ei tutkimukset ovat käsitelleet rooli miR-371-5p. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että miR-371-5p oli merkittävästi kohonnut mahalaukun syövän (GC) potilailla ja säänneltyjä maksasolusyövän (HCC) solujen lisääntymistä nopeuttamalla G1 /S siirtyminen [9], [10]. Erityisesti lisävalidointia osoitti, että seerumin miR-371-5p, uutena biomarkkeri, oli voimakas potentiaalia erotteleva GC potilaiden terveiden verrokkien [9]. Siksi hypoteesina, että miR-371-5p voi myös olla uusi mekanismi, lisäten PDAC riski häiritsemällä solusyklin etenemisen kautta kohdistaminen solusyklin liittyviä geenejä. Tämän kysymyksen, vertasimme miR-371-5p ekspressioprofiileja välillä PDAC kudosten ja ANPT. Olemme tässä osoittavat, että miR-371-5p ilmentyminen oli merkittävästi yläreguloituja PDAC kudoksissa verrattuna ANPT, mikä johti solujen proliferaatio ja lisääntynyt kasvaimen kasvua. Siten miR-371-5p voi osoittautua uusi ennustetekijä ja terapeuttinen kohde haimasyövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

PDAC solulinjat SW-1990 ja Panc-1 saatiin Kiinan Center for Type Culture Collection (Shanghai, Kiina). Soluja ylläpidettiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ja antibiootteja (100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiinisulfaattia). Soluja kasvatettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, jota oli täydennetty 5% CO2.

soluproleferaatiomäärityksessä

MTT [3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2 , 5-diphenyltetrazoliumbr-omide] – määrityksessä suoritettiin vaikutusten arvioimiseksi miR-371-5p on PDAC solujen lisääntymisen. Solut ympättiin 96-kuoppalevyille (5000 solua /kuoppa 200 ul: ssa väliaineessa) ja inkuboitiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2. PDAC solut transfektoitiin miR-NC, miR-371-5p, miR-ohjaus, anti-miR-371-5p, NC-siRNA tai ING1-siRNA käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Life Technologies) ja 1, 2, 3 ja 4 päivää, vastaavasti, mukaan valmistajan ohjeiden. Soluja viljeltiin kanssa täydellistä elatusainetta käytettiin nollakoe. Lopussa kulttuurin, 20 ui 5 mg /ml MTT: tä (Sigma, USA) lisättiin kuoppaa kohti ja soluja inkuboitiin vielä 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Supernatantit poistettiin ja formatsaanikiteet liuotettiin 150 ul: aan dimetyylisulfoksidia (Sigma, USA). Lopuksi optinen tiheys määritettiin 490 nm: ssä käyttämällä multi-mikrolevyn testausjärjestelmän (Polarstar Optima, Saksa). Kussakin määrityksessä viisi rinnakkaista kuopat tehtiin, ja tulokset kerättiin keskiarvo yli kolmen erillisen kokeen. Lysaatit kerättiin western blot analyysiä.

Solusyklianalyysiä

analysoimiseksi solusykliä, DNA-pitoisuus per kahtena analysoitiin FACSort Cellquect ohjelmistoa (BD Biosciences, USA). PDAC Solut laitettiin 6-kuoppaisille levyille yön yli ja transfektoitiin miR-NC, miR-371-5p, miR-con, anti-miR-371-5p, NC-siRNA, tai ING1-siRNA 48 tuntia.

lopussa kulttuurin, solut kiinnitettiin 75% jääkylmällä etanolilla yön yli 4 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut värjättiin 50 ug /ml propidiumjodidia (PI), joka sisälsi 50 ug /ml RNaasi A: ta (DNaasia) 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä ja analysoitiin fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu (Becton Dickinson, USA). Soluja viritettiin 488 nm, ja emissio kerättiin 630 nm: n suodattimella. Kaikkiaan 20.000 solut kerättiin kustakin näytteestä. Solusyklin jakautumisen arvioitiin laskemalla solujen osuus on G0 /G1, S ja G2 /M-vaiheessa. Kussakin erillisellä kokeella, kolme rinnakkaista kuopat tehtiin, ja menettelyt suoritettiin kolmena kappaleena. Saadut tiedot esitetään keskiarvona ± SD.

lusiferaasireporttiterilla määrityksissä

Lyhyesti, fragmentit 3′-alueen (3′-UTR) ja ING1 mRNA, joka sisältää otaksutun (WT) oli monistettiin PCR: llä genomisesta DNA: sta, ja PCR-tuote subkloonattiin pGL3-kontrolli -vektoriin (Promega, USA) välittömästi alavirtaan lusiferaasigeenin. Jotta rakennettaisiin mutantti pGL3-ING1 (MU), QuickChange mutageneesillä (Stratagene) käytettiin indusoimaan kuusi pistemutaatioiden UTR-alueen WT-pGL3-ING1. Plasmidi-DNA sekvensoitiin aitouden.

lusiferaasireportteri määrityksessä solut kotransfektoitiin 300 ng pGL3-ING1-WT tai pGL3-ING1-Mut konstruktioita ja pcDNA3-miR-371-5p tai negatiivinen kontrolli käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Kukin näyte transfektoitiin 50 ng PRL-TK ekspressoivan plasmidin renilla lusiferaasi (Promega, USA). Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja analysoitiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA). Suhteellinen lusiferaasi mittaukset tehtiin 48 tuntia transfektion jälkeen käyttäen Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) käyttäen luminesenssilaskijaa. Transfektiot kahtena kappaleena ja toistettiin ainakin 3 kertaa itsenäisestä kokeesta. MiR-371-5p estäjä, siING1 ja niiden negatiiviset kontrollit (NC) ostettiin Panagene Inc (korea) ja Santa Cruz (USA) vastaavasti. Sekvenssit olivat seuraavat: miR-371-5p estäjä: 5′-TTTTAACATTGCACT-3 ’. Ad-ING1 adenovirus (Cat #: 1601) ja sen valvonta Ad-GFP adenovirus (Cat #: 1700) ostettiin Vector Biolabs (USA).

kvantitatiivinen RT-PCR

Yhteensä-RNA eristettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen, USA). 2 ug kokonais-RNA: t käänteistranskriptoitiin käyttäen miR-371-5p erityisiä käänteistranskriptioalukkeita (Ribobio, Kiina) käyttäen poly-A-polymeraasi, joka perustuu ensimmäisen-Strand Synthesis Kit (TaKaRa Bio, Japani) seuraten valmistajan protokollaa, ja suhteellinen ekspressio miR-371-5p määritettiin käyttämällä SYBR Esiseos Ex Taq (Takara, Kiina). U6 snRNA käytettiin normalisointia. Delta-Ct menetelmää käytettiin arvioimaan analyysit reaaliaikainen PCR-datan. Semi-kvantitatiivinen RT-PCR, lopussa PCR-tuotteet, kun tietty määrä syklejä ajettiin elektroforeesilla 2% agaroosigeeleillä, mitä seurasi värjäys etidiumbromidilla ja valokuvattiin UV-läpivalaisulla. Alukkeet miR-371-5p: RT-aluke, 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTGCC-3 ’; Eteenpäin, 5’-GTCGTATCCAGTGCAGCCG-CCACTCAAACTGTGGGG-3 ’. Alukkeet U6 snRNA: RT-aluke, 5’-GGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAAAT-ATGG-3 ’; Eteenpäin, 5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3 ’.

Kromatiini immuunisaostustesti (chip)

ING1 sitoutumaan edistäjä miR-371-5p testattiin käyttämällä ChIP analyysiä. ChIP-määritys suoritettiin käyttäen EZ-ChIP kit Millipore (Millipore, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, noin 3 x 10

6 Panc-1, tartunnan joko Ad-GFP-ING1 tai Ad-GFP adenoviruksia silloitettiin käyttäen 1% formaldehydiä (BIO-RAD, USA) 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solut kerättiin sammuttamisen jälkeen 0,125 M glysiiniä ja lyysattiin ChIP lyysipuskuria (150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM Tris (pH 8,0), 0,1% deoksikolaatti, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 ug /ml pepstatiinia, 1 ug /ml aprotiniini ja 1 ug /ml leupeptiiniä). Uutteet sonikoitiin kuusi kertaa 9 kumpikin s, ja lysaatit sentrifugoitiin sentrifugoimalla 14000 rpm: llä 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Tämän näytteen 150 ui käytettiin syötteenä. Supernatantit immunoprecipiated joko anti-ING1 tai hiiren IgG: tä (negatiivinen kontrolli) 4 ° C: ssa 4 h, jonka jälkeen proteiini-G-Sepharose (Sigma, USA) 2 tuntia 4 ° C: ssa. Immunosaostumat pestiin peräkkäin 1 ml: lla ChIP lyysipuskuria kaksi kertaa, ChIP hajotuspuskuria 500 mM NaCl kahdesti ja LiCl /pesuaineen liuosta (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 250 mM LiCl: a, 0,5% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 1 mM EDTA) kahdesti ja lopuksi TE-puskuria (10 mM Tris ja 1 mM EDTA, pH 8,0). Helmet eluoitiin käyttäen 1% SDS: ää ja 0,1 M natriumbikarbonaattiliuoksella. Tulo ja eluentti näytteet käänteisfaasi-silloitettu käyttäen NaCl 5 tunnin ajan 65 ° C: ssa. DNA-näytteistä eristettiin fenoli-kloroformilla, minkä jälkeen etanolisaostuksella. Promoottori sitoutuminen testattiin PCR: llä käyttäen alukkeita, jotka kattavat ylävirran alueiden miR-371-5p aloittaa sivustoja, alukesekvenssit: ChIP-ING1, F: 5′-AATGTTCACTGCCGCACTGT-3 ’; R: 5’-ACACCTATAATCCCTGC- TAC-3 ’; ChIP-neg-F: 5’-ACGGCCAACATGCTCAGG-3 ’; R: 5’- TGTTTGCAACTGCTGCGTTAG-3 ’.

Western blot

Solut hajotettiin 1% RIPA Lysis Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0,150 mM natriumkloridi, 1 % NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% natriumdodekyylisulfaattia, 2 mM EDTA), joka sisälsi 1 x proteaasiestäjäseostabletit (Roche) 48 h transfektion jälkeen. Supernatantit kerättiin ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-Assay Kit (Pierce). Proteiini Näytteet erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin sitten PVDF-membraanille. Membraani blokattiin 5% rasvatonta maitoa, minkä jälkeen inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa osoitti ensisijaisen kani-vasta-aine. Kalvo pestiin kolme kertaa TBST: ssä ja sitten inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen. Lopuksi sitoutunut vasta-aine kemiluminesenssilla ECL Detection Reagent (Pierce). Data normalisoitiin GAPDH tai β-aktiini.

In vivo

haimasyöpä ksenograftimalli

Panc-1 solut kohtuullisesti erilaistunut PDAC transfektoitiin stabiilisti miR-371 -5p tai miR-NC-ohjattu plasmidi. Transfektoidut solut kerättiin, suspendoitiin 200 ul: aan PBS: ää (1 x 10

7-soluissa), ja injektoidaan subku- in 4 viikkoa vanhoja koiraspuolisia BALB /c-nude-hiiriin (

n

= 10 /ryhmä) . Hiiriä pidettiin tietyllä patogeenittomassa ympäristön 5 viikkoa ja lopetettiin sitten. Kasvaimen tilavuus

V

laskettiin sen pituus

L

ja leveys

W

, seuraavan yhtälön mukaisesti

V

= 0,4

LW

2. Käyttö nude-hiirten noudattanut Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals ja hyväksyi tutkimuksen Animal Care ja käyttö komitea Southern Medical University.

Potilaille ja tuumorikudoksia

yhteensä 60 ihmisen haimasyövän kudokset (PC) ja vastaaviin normaaleihin viereisten haiman kudoksista (NP) saatiin leikkauksen aikana Baoan Hospital (Shenzhen, Kiina) välillä tammikuussa 2008 ja joulukuussa 2010. diagnoosi perustui patologisia merkkejä. Lisäksi ylimääräinen 15 paria PDAC ja niiden ohjaus kerättiin potilailta kirurgisissa asemointia ja varastoitiin nestemäisessä typessä. Kaikki 75 potilasta edellyttäen kirjallinen lupa käyttöön kudoksiin ja tutkimussuunnitelman hyväksyi eettisen komitean Southern Medical University.

Tilastollinen

yhteenliittymät miR-371- 5p ilmaisu kliinisen patologisen ominaisuudet analysoitiin käyttämällä Chi-neliö tai Mann-Whitney testejä. Selviytymisen käyrä rakennettiin käyttäen Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin käyttäen log-rank-testi. Ryhmät verrattiin käyttäen Studentin

t

-testi. Korrelaatio analyysi suoritettiin käyttäen Spearmanin korrelaatiota analyysi. Kaikki todennäköisyys arvot analysoitiin käyttäen kaksisuuntaista testiä ja Tilastollinen merkittävyys päätökseen

* P 0,05,

** P 0,01,

*** P 0,001; # Edustaa ole tilastollista merkitystä. Analyysit tehtiin SPSS (versio 17.0) ohjelmisto (SPSS Inc., USA). Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (SD).

Tulokset

lisääntymisen merkkejä miR-371-5p haimasyövän kudoksissa liittyy selviytymisen

määrittämiseksi ekspressiotasot miR-371-5p haiman syöpäpotilailla, miR-371-5p havaittiin kaikissa 15 paria haimasyövän kudosten ja niiden yhteensovitettujen noncancerous haiman kudoksista käyttäen qRT-PCR-menetelmällä. Kuten esitetään 1A, PC kudosten osoitti merkittävästi korkeampi ilmentyminen miR-371-5p verrattuna kuin NP kudosten (

P

0,05). Lisäksi Kapan-Meier selviytymisen analyysi paljasti, että potilaalla on miR-371-5p positiivinen ilmaisu (kuvio 1 B) oli merkittävästi huonompi ennuste kuin ne, joilla on negatiivinen ilmaus (1C). Monimuuttuja Coxin regressioanalyysiä osoitti, että miR-371-5p lauseke (vaarojen suhde [HR] = 2,748, 95% luottamusväli [CI] = 1,211-5,914, P = 0,03), oli riippumaton ennustavat tekijät kokonaiselossaolo.

(A) Keskimääräinen ilmentymistaso miR-371-5p ihmisen PDAC yksilöt (

n

= 15) ja normaalin haiman kudoksista (

n

= 15). miRNA runsaus arvioitiin qRT-PCR ja normalisoitu U6-RNA. Arvot esitetään keskiarvona ± S.D. (B ja C) miR-371-5p ekspressiotasot ja kokonaiseloonjääminen seuraava resektio haimasyövän kanssa miR-371-5p -negatiivinen versus miR-371-5p -positiivisille ryhmiä. MIR-371-5p – positiivisia oli merkittävästi lyhyempi selviytymisen kuin miR-371-5p – negatiivinen (n = 30 /ryhmä,

P

= 0,021).

MiR-371-5p edistänyt solujen lisääntymistä sekä

in vitro

ja

in vivo

tutkia vaikutuksen miR-371-5p haiman syöpäsoluja kasvun PDAC solulinjoja, joilla on eri laadut SW-1990 ja Panc-1 transfektoitiin väliaikaisesti, jossa on miR-317-5p matkivat tai inhibiittori (anti-miR-371-5p) ja niiden NCS. QRT-PCR-analyysi osoitti, että miR-371-5p jäljittelee aiheutti 14,42 ja 6,47-kertaiseksi miR-371-5p ilmentymisen PANC-1 ja SW-1990-soluissa, vastaavasti (2A). Samaan aikaan anti-miR-371-5p vähensi miR-371-5p ilmentyminen 3,14 ja 3,28 taittuu PANC-1 ja SW-1990-soluissa, verrattuna kontrolliin solulinjoilla (kuvio 2B). MTT lisääntymisen määritys suoritettiin SW-1990, ja Panc-1-solut, jotka oli ohimenevästi transfektoitu miR-371-5p matkivat tai inhibiittori. Tulokset osoittivat, että miR-371-5p -mimics edistää kasvainsolujen kasvua, kun taas anti-miR-371-5p inhiboi kasvainsolujen kasvua (P 0,01, kuvio 2C ja D) tutkimiseksi, jolla anti-asennuspalveli- 371-5 inhiboi solujen proliferaatiota, olemme analysoineet solusyklin jakautumisen Panc-1 ja SW-1990-solut, jotka transfektoitiin anti miR-371-5p ja valvontaa. Suurempi osuus transfektoitujen solujen anti- miR-371-5p kertynyt G1 vaiheessa, kun taas S-vaiheessa väestö vähentynyt (Fig.2E). Kuitenkin päinvastainen tulos havaittiin soluissa, jotka oli transfektoitu miR-371-5p (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että proliferatiivisen esto anti miR-371-5p johtui osittain G1-vaiheen pysähtymisen kahden haimasyövän solulinjoissa.

(A ja B) Ilmaisu taso miR-371 -5p testattiin 48 h haimasyövän transfektoiduissa soluissa miR-371-5p jäljittelee, anti-miR-371-5p ja niiden ohjaus (NC, 40 nM) by qRT-PCR. (C ja D) lisääntyminen PDAC solulinjat transfektoitiin väliaikaisesti miR-371-5p jäljittelee, miR-371-5p tai kontrollia analysoitiin MTT lisääntymisen määritys. (E) Anti-miR-371-5p kasvattaa osuutta solujen G1 arvioima käyttämällä virtaussytometria (vasen paneeli, **

P

0,01, n = 4). Ja edustaja solukierron histographs (anti-miR-NC vs anti-miR-371-5p) esitetään (oikea paneeli). (F) Nude-hiiriä inokuloitiin subkutaanisesti Panc-1-solut transfektoitiin miR-371-5p plasmidiin tai miR-NC-ohjattu plasmidi, niiden kyljissä. Kuva edustaa kasvainten muodostuu 10 hiirtä. (G) kasvukäyrät kasvainten. Käyrä edustaa kasvaimen kasvua, 5 viikkoa ymppäyksen jälkeen. Kasvaimen tilavuus laskettiin, ja kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. (

n

= 10).

edelleen selvittää miR-371-5p oli mukana tuumorigeneesiä, vakaa miR-371-5p -overexpression solulinjaa ja kontrolli solulinjaa ihonalaisesti injektoitiin nude-hiiriin, ja puolestaan ​​kasvaimen kasvua mitattiin. Kun kasvaimet kerättiin, keskimääräinen kasvainten tilavuus peräisin miR-371-5p ryhmässä oli suurempi verrattuna kontrolliryhmään (Fig.2F ja G,

P

0,05). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​vaikutuksia miR-371-5p yli-ilmentyminen in vitro ja viittaavat vahvasti siihen, että miR-371-5p voisi edistää proliferaatiota PDAC soluja.

ING1 on välittömänä kohteena miR-371-5p ja mukana miR-371-5p asiakkuutta edistäminen PDAC solujen lisääntymistä

tutkia mahdollinen kohde, jonka kautta miR-371-5p edistää leviämisen haimasyöpäsoluissa, me käytti bioinformatiikan ennustaa otaksuttu miR-371-5p tavoitteita. Sekä Target Scan ja Miranda järjestelmien ennusti ING1, avain kasvain vaimennin, on otaksuttu kohteena miR-371-5p. Voit tarkistaa, onko miR-371-5p suoraan kohdistettu miR-371-5p mRNA PDAC kasvaimia ja solulinjoissa in vitro ja in silico analyysi tehtiin. Ensinnäkin, anti- miR-371-5p tai kontrolli transfektoitiin SW-1990 ja Panc-1-soluissa, ja huomasimme, että esti ilmentyminen miR-371-5p kasvoi ING1 proteiinin tasot molemmissa linjoissa (Fig. 3A). Sitten miR-371-5p matkivat tai valvontaa transfektoitiin edellä 2 solulinjat. Huomasimme, että pakko ilmentyminen miR-371-5p laski ING1 proteiinin tasot molemmissa solulinjoissa johdonmukaisesti (Fig. 3A). Nämä tulokset osoittivat, että miR-371-5p voitaisiin edistää leviämisen PDAC solujen supistuvat ING1 ilmaisun in vitro.

(A) ING1 ilmentyminen SW-1990 ja Panc-1-solujen transfektion jälkeen anti- miR -371-5p tai miR-371-5p jäljittelee tai valvonta havaitsee western blottauksella. (B-I) ING1 havaittiin qRTPCR 50 haimasyövän (PC) kudoksiin ja sen sovitettu viereisen noncancerous haiman kudoksista (NP). ING1 runsaus normalisoitui vastaan ​​GAPDH. (B-II) välinen suhde ING1 ja miR-371-5p ilmentyminen selvittävät Spearmanin korrelaatiota 50 PDAC kudoksissa. ING1 ilmentyminen korreloi negatiivisesti miR-371-5p 50 PDAC tuumorikudoksissa. (C) Ennustettu välillisten parinmuodostus kohde 3′-UTR alue ING1 (villin tyypin tai mutantit) ja miR-371-5p kypsän sekvenssin. Lusiferaasiaktiivisuus läsnäolo sekä villityypin ING1 3′-UTR tai mutantin ja miR-371-5p verrattiin kontrolliin. (D) Western blot suoritettiin analysoida ING1 ilmaisun si ING1 transfektoiduissa Pancin-1-soluissa. β-aktiini käytettiin sisäisenä kvantitatiivinen valvontaa. (E) vaikutus siING1 soluproliferaatioon mitattiin MTS-määritys. (F) Panc-1-solut transfektoitiin NC, miR-371-5p estäjän tai miR-371-5p estäjän ja siING1, ja sitten MTS-määritys suoritettiin.

varmistamiseksi edelleen sääntely suhdetta välillä miR-371-5p ja ING1, tutkimme ilmentymistä ING1 in PDAC näytteistä (PC) ja niiden vastaavat normaalit kudokset (NP). Käyttämällä qRT-PCR, huomasimme, että keskimääräinen taso ING1 ilmentyminen oli merkitsevästi alhaisempi PC kudoksissa verrattuna NP kudosten (Fig. 3B-I). Merkittävä käänteinen korrelaatio ei havaittu ING1 ja miR-371-5p ilmaisuja haimasyövän kudoksissa (Spearmanin korrelaatiota, r = -0,4802) ja viereisten noncancerous kudoksissa (r = -0,4103, tuloksia ei ole esitetty) (Fig. 3B-II).

arvioimiseksi kyky miR-371-5p sitoutumisen 3’UTR ING1, teimme lusiferaasireportteri- määrityksessä ja havaittiin merkittävä lasku lusiferaasiaktiivisuuden, kun läsnä on miR-371-5p – ING1 SW-1990 solu, kontrolleihin verrattuna (Kuva. 3C). Kun haluat varmistaa, ING1 oli välittömänä kohteena miR-371-5p, me mutatoitunut MIR-371-5p sitoutumiskohdat 3’UTR ING1 ja havaitut menetys tukahduttamisen (Fig. 3C). Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että ING1 oli välittömänä kohteena miR-371-5p.

Valaistaan ​​onko kasvua edistävää vaikutusta miR-371-5p välitti tukahduttamisen ING1 vuonna PDAC soluissa vaikutus ING1 solujen kasvuun tutkittiin. Ensimmäinen, Panc-1-solut transfektoitiin siRNA vastaan ​​ING1 tai sen valvonnassa, ja sitten tutkittiin solujen kasvua MTT: llä (Fig. 3d). MTT-analyysi Tulokset osoittivat, että geenien ja ING1 edistänyt soluproliferaatiota Pancin-1-solut (Fig.3E). Lisäksi inhiboiva vaikutus miR-371-5p estäjä solun kasvuun oli päinvastainen, kun ING1 ilmentyminen oli pudotus (Fig.3F). Yhdessä nämä havainnot osoittivat, että ING1 on toiminnallisesti tärkeä tavoite miR-371-5p joka on osallisena leviämisen PDAC soluja.

ING1b säätelee miR-371-5p ilmaisu

ING perhe tyypin II tuumorisuppressoreilla toimivat sekä epigeneettiset ’lukijoiden ja kohdistaa histoni asetyyli transferaasin (HAT) ja histonideasetylaasi (HDAC)’ kirjoittajien ja epigeneettiset histoni koodi [11]. ING1 proteiini on myös liitetty säädellään miRNA tasoilla [12]. Sen selvittämiseksi, onko ING1 säätelee miR-371-5p ilmaisu, Panc-1-solut infektoitiin adenoviruksella ilmentämään GFP yksin tai adenovirusta, joka ekspressoi sekä GFP- ING1. MiR-371-5p vahvistettiin vähenevän merkittävästi ja toistettavasti vastauksena ING1 yli-ilmentymisen (4A). Lisäksi, kuten on esitetty 4B, suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA), histonideasetylaasiaktiivisuuden (HDAC) estäjä, miR-371-5p ilmentymisen merkittävästi Panc-1-soluissa, mikä on sopusoinnussa epigeneettisiä asetuksessa ING1 osana HDAC1 ja HDAC2 komplekseja. Kuitenkin, SAHA ei muuttanut ING1 ilmaisua. ChIP-analyysi ING1 osoitti, että ING1 sidottu promoottori-alue miR-371-5p (4C), mikä osoittaa, että ING1 suoraan säätelee miR-371-5p ilmentymistä. Siten ING1 epigeneettiseltä säätelee miR-371-5p ilmaisun PDAC.

(A) ilmentyminen miR-371-5p in Pancin-1-solujen vastauksena ING1 yli-ilmentymisen 48 hs, määritettiin kvantitatiivisen real -aika PCR-määrityksissä (ylempi paneeli. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD (**

P

0,01, n = 5). (alempi paneeli) Western blot suoritettiin analysoida ING1 ilmentymistä. (B) miR -371-5p taso määritettiin käyttäen reaaliaikaista RT-PCR Pancin-1 solujen hoitovasteen kanssa HDAC estäjä suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA). Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD (ylempi paneeli, *

P

0,05, n = 5). (alempi paneeli) Western blot suoritettiin analysoida ING1 ilmaisua. (C) Solut infektoitu GFP adenoviruksen tai sama virus myös koodaavat ING1 kerättiin 24 tuntia myöhemmin ja valmistettu siru analyysin avulla ohjaus tai ING1 aineita. PCR immunosaostus tuotteiden osoitti, että ING1 sidottu ylävirran alueelta miR-371-5p.

keskustelu

täydellinen ymmärrys molekyylitason mekanismeista haiman kasvain taudin alkamisen ja etenemisen on tärkeä uusi prognostisia ja hoitomenetelmät, joilla pyritään parantamaan tulosten syöpäpotilailla. Viime vuosina, miRNA ovat nousemassa uuden luokan geenin sääntelyviranomaisten mukana erilaisissa kasvaimissa [13]. Täällä tarjoamme ensimmäiset todisteet että miR-371-5p on kriittinen rooli haiman kasvainten synnyssä. Se on usein yliaktiivista PDAC. Johdonmukaisesti, miR-371-5p yliekspressio selvästi liittyy haitallisia potilaiden eloonjäämisen, mikä viittaa siihen, että se on huono ennustetekijä. Positiivinen suhde miR-371-5p tasolle leviämisen tukee käsitystä, että se toimii onkopsykologista miRNA.

ominaisuudet potilailla, joilla PDAC ovat toisteta hiiren ksenograftimalleissa. MiR-371-5p-yli-ilmentävät solut kehittävät suuria kasvaimia, jotka on palautunut injektiot tietyn inhibiittorin sitä vastaan. Vastakkainen käyttäytyminen havaitaan miR-371-5p low-ilmentäviä soluja ja injektio vastaavaa matkivat RNA. Tähän mennessä miR-371-5p on osoitettu olevan mukana vain maksasolukarsinoomat, mikä osoittaa, että sen yliekspressio liittyy aggressiivisempia kasvaimia ja huonompi tulos [14], kanssa saadut tiedot PDAC. Kuitenkin osuus miR-371-5p tätä prosessia on lisätutkimuksiin.

tietoa biologisista toiminnoista miRNA vetoaa tunnistamista asiaa kohdegeenien. Kuitenkin ennustaminen miRNA tavoitteista on edelleen haastava tutkimusalue. Suurin osa miRNA-kohdesekvenssi matching perustuu epätäydellinen täydentävyys miRNA kanssa 3′-UTR kohde mRNA: iden. Vaatimus täydentävät toisiaan vain seitsemän tai kahdeksan nukleotidin voi aiheuttaa satoja mahdollisia tavoitteita [15]. Toistaiseksi hyvin harvat kohdegeenien miR-371-5p on vahvistettu erilaisissa biologisissa järjestelmissä.

Tässä me vahvistaa ING1 kuin välitön toiminnallinen tavoite miR-371-5p in PDAC, lisäämällä tietoa aiemmin raportoitiin solutyypit [16]. ING perhe tyypin II tuumorisuppressoreilla edistää kasvua erilaisten kasvainten [17]. Tämä perhe on hyvin konservoitunut ja sisältää viisi geeniä. Niistä

ing1

on parhaiten karakterisoitu jäsen ja koodaa neljä proteiini-isoformit [18]. ING perhe tuumorisuppressoreilla toimii lukijat ja kirjoittajat histoni epigeneettiset koodia, jotka vaikuttavat DNA korjaus, kromatiinin remodeling, solu Vanheneminen, solusyklin säätelyssä ja apoptoosin [18]. Yliekspressio ING1 aiheuttaman solukierron pysähtymisen G1 vaiheeseen seurannut apoptoosin, kun taas tukahduttaminen sen ilmaisun kasvoi pesäkkeiden tarkennuksen ja kasvua

in vitro

ja kasvainten muodostumisen

in vivo

[19]. Kuitenkin yksityiskohtaiset molekyylitason mekanismeja, joilla ING1 toimii tuumorisuppressorina pysyvät epätäydellisesti määritelty.

ING1 säätelee geenin ilmentymistä kautta säädellään histoni asetylaatio ja metylaatio [20]. ING1 on tärkeä kohde on HDAC-inhibiittori SAHA, ja näyttää ensisijaisesti säädellä kromatiinin tiivistyminen ja sen jälkeen, ilmaus osajoukkojen geenien kautta epigenetic mekanismeja. Lisäksi monet miRNA on raportoitu säätelevän epigeneettisellä mekanismien [21]. Siksi me kysyttiin miR-371-5p säädellään ING1. Nykyisessä tutkimuksessa osoitamme, että ilmaus miR-371-5p on epigeneettiseltä säätelee ING1 ja että miR-371-5p kumoaa merkittävä osa estäviä vaikutuksia ING1 soluproliferaatioon. Lisäksi, muutokset ING1 ilmentyminen vaikuttaa solujen proliferaatiota ja apoptoosia, lisääntymään käänteinen tilassa vaikutuksia, jotka johtuvat miR-371-5p, kuten osoitettiin edelleen tuumorinäytteissä. Vastavuoroisesti ja käänteinen muunnelmia ING1 tasoille miR-371-5p modulaatio osoittavat selvästi, että ne ovat mekaanisesti toisiinsa. Tiukka vuorovaikutus ING1 ja miR-371-5p edelleen todistettu niiden samanaikainen hiljentäminen: ING1 Knockdown täysin kääntää vaikutukset soluproliferaatioon ja apoptoosiin vuoksi miR-371-5p esto, tunnisti sen merkittävä alavirtavaikuttajainhibiittorit tämän miRNA.