Krooninen sairaus

tiivistelmä

huono ennuste maksasolusyövän (HCC) liittyy myöhäinen diagnosointi vaatii kehittämistä varhaisdiagnostiikan biomarkkereita. Olemme aiemmin rajattu maisemaa DNA metylaation HCC potilailla purkautuu merkitys promoottorin hypometylaatio aktivoitumiseen syöpää ja etäpesäkkeiden-ajo geenejä. Tarkoituksena tässä tutkimuksessa oli testata toteutettavuutta, että geenit, jotka hypometyloidut HCC voisivat olla ehdokkaana diagnostisia markkereita. Käytämme korkean resoluution sulamisanalyysikokeita (HRM) yksinkertaisena käännettävissä PCR-pohjainen menetelmä määrittää metylaatio valtioiden kliinisissä näytteissä. Testasimme seitsemän aluetta valitaan jatkoon geenien hypometyloidut HCC ja osoitti, että HRM analyysi useat niistä erottaa metylaatio valtioiden maksasyövän yksilöitä viereisistä normaaleista maksa- ja krooninen hepatiitti Shanghain alueella. Tällaiset alueet tunnistettiin sisällä edistäjiä hermosolujen membraaniglykoproteiinin M6-B (GPM6B) ja melanooma-antigeeni perhe A12 (MAGEA12) geenejä. Erot HRM in Immunoglobuliinisuperperheen Fc-reseptori (FCRL1) erotettu invasiivisia kasvaimia vähemmän invasiivisia HCC. Tunnistetut biomarkkereita eriytetty HCC kroonisesta hepatiitti toinen joukko näytteitä Dhaka. Vaikka pääpaino DNA: n metylaation diagnostiikan syövässä on hypermetyloitunut geenejä, tutkimuksemme ensimmäistä kertaa kuvataan mahdollinen käyttö hypometyloidut geenejä markkereina kiinteitä kasvaimia. Sen jälkeen lisävalidointia suuremmassa kohortin tunnistetut DNA hypometyloidut alueet voivat tulla tärkeä ehdokas biomarkkereita maksasyövän diagnoosi ja prognoosi, etenkin väestön korkea riski HCC kehittämiseen.

Citation: Stefanska B, Bouzelmat A, Huang J, Suderman M, Hallett M, Han ZG, et al. (2013) Discovery ja validointi DNA hypometylaatio biomarkkerit maksasyövän käyttäminen HRM-koettimia. PLoS ONE 8 (8): e68439. doi: 10,1371 /journal.pone.0068439

Editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu 18 maaliskuuta 2013 Hyväksytty: 29 toukokuu 2013; Julkaistu: 07 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Stefanska et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia Ministere du Developpement Economiquen, de l’Innovation et de l’Vienti (MDEIE) ohjelma hallituksen Quebec (nro 215004, MS), Kanadan Institute of Health Research (nro MOP-42411, MS) ja kansainvälinen keskus Ripulisairaudet Diseases Research, Bangladesh (icddr, b). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Aberrations in epigeneettiset muutokset, erityisesti DNA metylaation, on yhdistetty syöpään kehittymisen ja etenemisen monissa tutkimuksissa viime vuosikymmeninä [1], [2], [3]. Hypermetylaatiota tuumorisuppressorigeeneille liittyvät transkription hiljentämisen, globaali DNA demetylaatio liittyy genomin uudelleenjärjestelyjä ja epävakautta, ja viime aikoina on raportoitu promoottorin hypometylaatio liittyy aktivointi onkogeenien ja prometastatic geenit ovat tunnusmerkkejä lähes kaikkien syöpien [2], [3], [ ,,,0],4], [5]. DNA hypermetylaatiota tuumorisuppressorigeeneille on osoitettu olevan diagnostista potentiaalia useisiin syöpiin [6], [7], [8], mutta äskettäisestä purkautumista laaja soveltamisala hypometylaatio maksasyöpää ehdotti, että potentiaalisia biomarkkereita saattaa löytyä hypometyloidut geenejä, jotka on kriittinen rooli ajo syövän ja syövän etäpesäkkeiden [4]. Tunnistaminen luotettavasti biomarkkereihin HCC on erityisen tärkeää, koska myöhäinen kliinisten oireiden osuus on myöhäinen diagnosointi ja korkea kuolleisuus. On arvioitu, että varhainen havaitseminen HCC kasvaa paranemisasteella 5%: sta 80% [9].

aiemmin käytetty genomin laajuista lähestymistapaa hahmotella DNA promoottorin metylaation profiilit HCC kasvaimia ja paljasti lähes 2000 geenejä, joiden promoottoria hypometyloidut kasvaimissa verrattuna Hyväksytty viereiseen normaaliin kudokseen [4]. Nämä geenit olivat mukana biologisissa prosesseissa ja väyliä ratkaisevia syövän kehityksen ja invaasio, mikä merkitsee merkittäviä toiminnallisia roolia havaittu muutoksia. Hypometylaatio oli nähtävissä useissa geeniperheistä poikki kromosomeja. Heräsi kysymys, onko se nimenomaan merkitä kasvaimia ja eriyttää kasvaimen näytteitä tervettä kudosta. Aiemmissa työssä olemme keskittyneet vertailun erot keskimääräisissä DNA: n metylaatio koko promoottori ja anti-korreloivat muutoksia geenien ilmentyminen. Analysoimme yksityiskohtaisesti 230 geeniä, jotka olivat hypometyloidut ja aiheutettiin HCC kasvaimia. Suurin osa näistä geeneistä joutui luokan promoottoreita korkea CpG sisältöä. Esillä olevassa tutkimuksessa DNA hypometylaatio biomarkkereita maksasyövän, ensin valitun geenin, joka oli raskaasti hypometyloidut HCC näytteissä verrattuna täsmäsi viereiseen normaaliin kudokseen (≥2-kertainen muutos promoottorin metylaation perustuu mikrosiruanalyysi,

P

10E-4). Tämä ryhmä geenejä seulottiin sitten kaikkein jatkuvasti hypometyloidut koetin (200-400 bp alueen, ≥1.5-kertainen muutos,

P

10E-3) koko potilaiden määrää mikrosiruanalyysillä. Jotta voitaisiin lisätä toiminnallista merkitystä mahdollisten biomarkkereiden, me myöhemmin rajattu tämän luettelon 47 geenejä, jotka aiheutettiin HCC kasvaimet mitattuna Affymetrix pakat (≥1.5-kertainen muutos,

P

0,05, taulukko S1 ). Ottaen huomioon muutokset promoottori metylaatio, ilmaisun, ja laajuus demetylaation ja koettimia, olemme valinneet seitsemän geenit osoittivat korkeimmat promoottori hypometylaatio, kaikkein hypometyloidut koestusjohtimia potilaiden ja suuren ekspression induktion. Lisäksi olemme rajoitettu listan geenit syöpään liittyviin toimintoihin perustuvat julkisesti saatavilla oleviin aineistoihin jäljempänä esitetyllä tavalla. Näiden seitsemän hypometyloidut geenit luetellaan taulukossa 1 valittiin tunnistamaan ja optimoimaan spesifisiä koettimia, joiden ero metylaatio olisi erottaa kasvaimia normaaleista kudoksista käyttäen High Resolution Sulamisanalyysi (HRM). HRM analyysi on yksinkertainen PCR-pohjainen menetelmä helposti käännettävissä kliinisiin puitteet havaitsemiseksi eroista DNA metylaation [10]. Tämä menetelmä vaatii hoitoa DNA bisulfiitin kanssa, joka muuntaa sytosiinitähteiden urasiileiksi jättäen 5-metyylisytosiinin jäämiä ennallaan. Sen jälkeen vahvistus, se johtaa muutoksiin DNA-sekvenssi, jossa urasiili muunnetaan tymidiini ja 5-methylcytosines pysyvät sytosiineja. Metyloitumattoman DNA amplikoni, joka sisältää tymidiinin sijasta sytosiinin sisällä CpG-sekvenssit ilmentää eri sulamis- ominaisuudet kuin metyloitua DNA: ta. Sen jälkeen pohjamaali optimointi, kolme koettimet vastaavat kolme geeniä

neuronaaliseen membraaniglykoproteiinin M6-B

(

GPM6B

),

melanooma-antigeeni perheen 12

(

MAGEA12

), ja

immunoglobuliinisuperperheen Fc-reseptorin

(

FCRL1

), havaittiin erottaa HCC viereisistä normaalia kudosta ja /tai invasiivisia kasvaimia ei-invasiivisen kasvaimet kiinalaisessa joukko näytteitä sekä HCC kroonisesta hepatiitti B-infektio (CHB) näytteissä Bangladeshista.

GPM6B

osallistuu hermoston kehittymistä ja sääntelyn luun muodostumisen [11], [12]. Tämän geenin ilmentyminen osoitettiin genomin laajuinen transcriptome profilointi toimia ennustaja aivokasvainten [13], [14] ja lymfaattisen leukemiat [15]. Korkea ilmaus

MAGEA12

, jäsen kasvaimia synnyttävän

MAGE

perhe, osoitettiin liittyvän rakkosyöpä- [16], melanooma [17], rintasyövän [18] ja suun levyepiteelisyöpä kohdunkaulan [19].

FCRL1

on solun pinnan membraaniproteiini ilmentyy B-solujen säätelemällä B-solujen aktivaation ja erilaistumisen [20]. Korkea tämän geenin ilmentyminen havaittiin metastaattisen ihosyövän [21], ja erilaisten leukemioiden [20]. Mikään näistä geeneistä tai niiden tilan metylaation oli aikaisemmin liitetty HCC.

MAGEA12

osoitettiin ennen olevan tukahdutettu normaaleissa soluissa promoottori metylaation ja aktivoitua syöpäsoluissa demetyloimalla [22], [23], kun taas rooli

GPM6B

ja

FCRL1

metylaation promoottorin aktiivisuutta ei aiemmin testattu. Nykyinen tutkimus vahvistaa ensimmäisen kerran yli-ilmentyminen

GPM6B

,

MAGEA12

ja

FCRL1

HCC: lla potilaista verrattuna normaaliin kudokseen, ja tutkii DNA: n metylaatio niiden promoottorien mahdollisena diagnostinen markkeri maksasyövän. Koska varhainen diagnosointi HCC kasvattaa paranemisasteella ja selviytymistä, tunnistetut epigeneettiset ehdokas biomarkkerit voivat vaikuttaa maksasyövän hoidon tulos, kun validointi suuremmassa kohortin.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka selvitys

Kaikki potilaat kunhan kirjallinen lupa, ja eettinen komitea on huolissaan toimielinten (Chinese National Human Genome Centerin Shanghai, Kiina ja Bangabandhu Sheikh Mujib Medical University (BSMMU), Dhaka, Bangladesh) hyväksyi tutkimuksen .

potilaiden ja kudosnäytteiden

syöpä ja normaalin viereisen kudosnäytteitä saatiin 12 potilasta, joilla HCC ja 1 potilas tulehduksellinen pseudotumor (kontrolli potilas) Kiinan National Human Genome Center Shanghai, Kiina (Dr. Ze-Guang Han) (taulukko 2). Bangladeshin kohortti koostui 4 HCC potilaista ja 4 CHB potilasta Bangabandhu Sheikh Mujib Medical University (BSMMU), Dhaka, Bangladesh (taulukko 2). HCC näytteet saatiin at ultrasonogram ohjattu hieno neula pyrkimys, kun taas CHB näytteet saadaan per-ihon maksabiopsian käyttämällä Tru-cut biopsianeulaa. Molemmissa tapauksissa paikallispuudutuksessa käytettiin.

DNA eristys ja vetysulfiittikäsittely DNA

DNA syöpä, normaali viereinen, ja CHB näytteet eristettiin käyttäen standardi fenoli-kloroformiuutolla tekniikalla. Bisulfiittikonversion suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, 2 ug DNA: ta linearisoitiin EcoRI: lla ja inkuboitiin 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa jota seurasi puhdistus käyttämällä Quick Clean PCR Purification Kit (GenScript) mukaan valmistajan protokollaa. Puhdistettu DNA denaturoitiin sitten 3M NaOH: lla ja inkuboitiin 15 minuuttia 37 ° C: ssa. Vasta valmistettu 3.6M natriumbisulfiitti /1 mM hydrokinoni seosta (pH 5,0) lisättiin denaturoitua DNA: ta ja inkuboitiin 2 minuutin ajan 95 ° C: ssa ja sen jälkeen 8 tuntia 55 ° C: ssa ja sen jälkeen 2 minuuttia 95 ° C: ssa ja 2 tuntia 55 ° C ° C. DNA-näytteet olivat sitten poistettu suola ja puhdistettu (Quick Clean PCR Purification Kit, GenScript). Puhdistettu DNA uudelleen denaturoitu 3M NaOH: lla ja inkuboitiin 15 minuuttia 37 ° C: ssa. Liuos neutraloitiin lisäämällä ammoniumasetaatin loppupitoisuuteen 10M ja DNA saostettiin 95% etanolilla ja suspendoitiin uudelleen 50 ul: aan tislattua vettä.

PCR-monistus bisulfiitin muunnetun DNA

Monistusreaktiot sisälsi 25 ug ui bisulfiittikäsiteltyä genomista DNA: ta, 0,4 uM eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita taulukossa S2, 10 ui 10 x Light Cycler 480 SybrGreen I Master (Roche) lopullisessa tilavuudessa 20 ui. Monistus suoritettiin termosyklerissä käyttäen seuraavia olosuhteita: denaturaatio 95 ° C: ssa 10 min, vahvistus 40 sykliä 95 ° C 1 min, pariutuminen lämpötilassa 2 min 30 s, 72 ° C 1 min, ja viimeinen laajennus 72 ° C: ssa 5 min. Kuten on esitetty taulukossa S2, ulkopuolella ja sisäkkäisiä alukesarjoja käytettiin useiden koettimien parantamiseksi monistamisen tehokkuudessa. Monistettu DNA käsiteltiin sitten korkean resoluution sulamisen (HRM).

korkea resoluutio sulamisanalyysikokeita (HRM) B

monistettu DNA siirrettiin Light Cycler 480 QPCR väline (Roche), joka mahdollistaa HRM. Näytteitä lämmitetään asteittain 40 ° C: ssa 1 min 60 ° C: ssa 15 s ja lopuksi DNA sulatettiin 95 ° C: ssa 15 s. Sulaminen PCR-tuotteen indusoi väheneminen fluoresenssissa SybrGreen koska SybrGreen kuin DNA-interkalatoivaa väriainetta vapautuu kaksijuosteisen DNA: n dissosiaatio. Fluoresenssin signaali hankitaan aikana sulamisvaiheessa ja analysoitiin Light Cycler 480 ohjelmisto. Lämpötila sulamishuippu DNA-amplikonin määritellään keskipiste sulassa, jossa määrä muutoksia fluoresenssin on suurin. Tämä sulamispiste riippuu sekvenssi ja pituus amplikonin ja on kunkin tuotteen. Kuten bisulfiittikonversion jälkeen metyloitua DNA monistuksen jälkeen sisältää CG emäsparia, sulamislämpötila metyloimattoman versio, joka sisältää TA emäsparia on erilainen. Metyloidut amplikoni sulaa korkeammassa lämpötilassa kuin silloin, kun metyloitumattoman ja näytteitä eri metylaatiotila voidaan erottaa vertaamalla sulamiskäyrää huiput. Käyttämällä 0% ja 100% metyloitua kontrolli-DNA, osoitimme, että testatuista koettimet osoittavat selviä eroja metyloitumattomien ja täysin metyloitu DNA. 0% metyloitua ohjaus luotiin käyttäen koko genomin monistamisen Kit (Sigma), kun taas 100% kontrolli luotiin

in vitro

metylaatio katalysoi SSSI metyylitransferaasin läsnä ollessa metyylin luovuttajana S-adenosyyli-L metioniini ( SAM). Sulamiskäyräanalyysi huiput HCC kasvaimia verrattuna keskimääräiseen sulamispiikkien normaalissa viereisten kudosten 7 yksilöiden ei-invasiivisia HCC. Tämä keskimääräinen käyrä kutsuttiin tänne normaalisti vierekkäisten viitearvojen (NorAdjRef).

pyrosekvensointi

Erityisiä bisulfiitti konvertoidaan promoottorisekvenssejä monistettiin Hotstar Taq DNA-polymeraasia (Qiagen) käyttämällä biotinyloitua alukkeita taulukossa S2. Biotinyloidun DNA-säikeet olivat pyrosequenced on PyroMarkTMQ24 välineen (Biotage, Qiagen) kuten aiemmin on kuvattu [25]. Aineisto analysoitiin PyroMarkTMQ24 ohjelmistoa.

RNA ja Quantitative real-time PCR (QPCR) B

Yhteensä-RNA eristettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) mukaan valmistajan protokollaa. 1 ug kokonais-RNA toimi templaattina cDNA-synteesi käyttäen 20 U AMV-käänteistranskriptaasia (Roche Diagnostics), kuten valmistajan suosittelema. QPCR Reaktio suoritettiin Light Cycler 480 koneen (Roche) käyttäen 2 ui cDNA, 400 nM eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita taulukossa S2 ja 10 ui Light Cycler 480 SybrGreen I Master (Roche) lopullisessa tilavuudessa 20 ui . Monistus suoritettiin käyttäen seuraavia olosuhteita: denaturaatio 95 ° C: ssa 10 min, vahvistus 60 sykliä 95 ° C: ssa 10 s, pariutuminen lämpötilassa 10 s, 72 ° C: ssa 10 s, ja lopullinen pidentäminen 72 ° C: ssa 10 min. Kvantifiointi suoritettiin käyttäen standardikäyrää, ja analysoitiin Roche LightCycler 480 ohjelmisto.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen paritonta kaksipuolista

t

-testi tai Mann -Whitney

U

testi. Mann-Whitney

U

testiä käytettiin vertailuissa kahden ryhmissä, joissa näytekokoa olivat pieniä ja sen vuoksi oli vaikeaa tarkistaa jakautumisen oletuksiin. Kussakin tapauksessa testi on mukana Sirontakuvaajan näkyvät kaikki arvot testissä käytettyä. Keskiarvot on annettu ± S.D. Tarvittaessa

P

-arvot on säädetty useille testeissä käytetään Bonferroni korjausta. Vertailtaessa neljä vs. neljä näytettä (Bangladeshin kohortti), myös käytetty permutaation testi, jossa tietoja sekoitetaan 10000 kertaa ja testin tilastollinen laskettiin uudelleen kullekin shuffle. R ohjelmisto ympäristö tilastollinen laskenta käytettiin kaikissa tilastollisia analyysejä paitsi permutaatio testi, jossa Resampling Tilastot Add-in for Excel ohjelmistoa käytettiin (Stan Blank, Charles Seiter, Peter Bruce ja Resampling tilastot, Inc. 2000 Tilastoinstituutin Education, USA).

tulokset

testaus ja tunnistaminen ehdokas hypometyloidut alueiden HCC HRM analyysi

päämääränä oli selvittää ja optimoida hypometyloidut alueiden HCC joka voisi erottaa HCC normaalista kudoksesta käyttäen HRM. Käytimme useita kriteerejä, ennustimme lisäävät todennäköisyyttä, että koettimet kaikkialle differentiaalisesti metyloitavaa HCC. Ensin valitaan seitsemän geenit (lueteltu taulukossa 1), jotka määriteltiin edellisessä näytön hypometyloidut geenien maksasyövän käyttäen metyloitua DNA immunosaostuksella (MeDIP) ja hybridisoimalla genominlaajuisten promoottori oligonukleotidisirujen. Toiseksi, geenin promoottorit sisältyvät koettimet, joiden keskimääräinen kertainen väheneminen metylaation välinen HCC ja normaalissa maksassa korkeampi kuin tai yhtä kuin 2 ja ne olivat tilastollisesti erittäin merkitsevä (

P

10E-4). Kolmanneksi hypometylaatio niiden promoottorien liittyi myös yli-ilmentymisen lähes kaikki potilaat, jotka tutkittiin viittaa kestävyyttä ja toiminnallista merkitystä näiden DNA-demetylaatio muutokset HCC (kuvio 1A-C). Neljänneksi, analyysi niiden toiminnot perustuvat julkisesti saatavilla aineistoja kuten Gene ontologia (GO), Kegg, ja NCBI paljastaa biologisia prosesseja ja polkuja, jotka ovat ratkaisevia syövän synnyn kuten sääntely solukierron, soluadheesion, solu-solu signalointi, lisääntymistä ja erilaistumista (taulukko 1). Viidenneksi geenit olivat aiemmin liittynyt ihmisen syövissä, erityisesti

MAGEA12

[16], [17], [18], [19] mutta vain

LAUTASET SUURI (Drosophila) homologin liittyvä proteiini 5

(

DLGAP5

) ja

MATRIX metallopeptidaasi 1

(

MMP-1

) on aiemmin raportoitu olevan säädellään ylöspäin HCC kasvaimissa [26], [27] . Kuudes käyttäen julkisesti saatavilla olevaa ilmaisua microarray data (Oncomine), osoitamme, että kolme geenejä, jotka sisälsivät koettimia optimoitu HRM analyysiä (katso jäljempänä oleva kohta) osoittavat voimistunutta ilmentymistä monissa eri syöpätyyppejä, kuten leukemia, munasarjasyöpä ja haimasyöpä (

GPM6B

ja

FCRL1

), munuaisten ja peräsuolen syöpä (

GPM6B

ja

MAGEA12

), HCC ja rintasyöpä (

MAGEA12

ja

FCRL1

), kivessyöpä ja melanooma (merkittävä yli-ilmentyminen

GPM6B

sekä syöpien ja

MAGEA12

melanooman) (Kuva 1D-F). Tiedot ovat yhdenmukaisia ​​yleisen roolin näiden proteiinien monissa eri syöpätyyppien ja ehdottaa niiden keskeinen rooli syövän etenemiseen ja /tai etäpesäkkeitä.

(A) heatmap osoittaa log

2 ero metylaatio ( M) ja lauseke (E) koetin intensiteetit ilmoitettu seitsemän geenien jokaisessa HCC potilasnäytteistä mitattuna mikrosiruja. (B, C) Rasiakuvaajat näistä metylaation (B) ja lauseke (C) erot HCC potilailla (log

2 [syöpää normaali]). Negatiiviset metylaatio erot osoittavat hypometylaatio HCC ja positiivisen ilmaisun erot selittyvät suurempi ekspressio Tuumorinäytteissä verrattuna Hyväksytty viereiseen normaaliin kudokseen. (D, E, F) Cancer geeniekspressiotasot saatu microarray tiedot

GPM6B

(D),

MAGEA12

(E), ja

FCRL1

(F). Normaali verrattuna kasvaimen geeniekspression tiedot saatiin Oncomine ja esitetään log

2-transformoidut mediaani keskitetty ryhmää kohti, ja SD-normalisoitu 1 ryhmää kohti. Kaikki esitetyt muutokset ovat tilastollisesti merkitsevä (

P

0,05) paitsi

MAGEA12

vuonna kivessyöpä ja

FCRL1

vuonna kivessyöpä ja melanooma. (G, H, I) sulaminen käyrät ja sulamiskäyrää huippuja 0% ja 100% metyloitua ohjaus DNA monistettiin

GPM6B

(G),

MAGEA12

(H) ja

FCRL1

(I) yhdessä kartan promoottorit testattujen geenien reunustavat koettimet valitaan HRM analyysiä. Vaaka- suorat nuolet osoittavat asemaa varten käytetyt alukkeet HRM. HRM 0% ja 100% metyloituja kontrolli-DNA on esitetty. CpG sivustoja, jotka sijaitsevat monistettu koetin ovat kiersi ja numeroitu. Oletetun transkriptiotekijän sitoutumiskohdat on merkitty ennustaa Transfac.

kolme koettimia vastaavan

GPM6B

,

MAGEA12

, ja

FCRL1

optimoitu HRM analyysi ero metylaation HCC

Useat metylaatiospe- riippumaton alukesarjoista alistettiin optimointi HRM analyysiä (katso alukesekvenssit taulukossa S2). Kontrolli-DNA, joka on metyloitu 0% ja 100% (standardit) monistettiin alukkeilla ja sulatetaan reaaliajassa. Sulaminen kuvio amplikoneista perustettiin ja analysoitiin. Sulamiskäyriä molempia standardeja piirrettiin samassa kaaviossa ja esillä eri lämpötiloissa sulamispiikkien (kuva 1G-H). Sitten seulotaan 12 HCC ja 12 normaali maksan näytteet Shanghai kohortin metylaation valtion sisällä kaikki 7 koettimia käyttäen suunniteltu alukkeita. Neljä antureista näytteillä korkea heterogeenisuus metylaatiokuvion kasvaimissa, mikä näkyi useita sulamispiikkien HRM analyysi yhden näytteen. Kolme muista antureista varten

GPM6B

,

MAGEA12

, ja

FCRL1

osoitti selvästi yhden piikin sulamisen malli ja käytettiin jatkotutkimuksiin ehdokkaaksi DNA: n metylaatio markkereita. Yliekspressio näistä geeneistä on esitetty muiden syöpien, esimerkiksi korkeampi ilmentyminen

GPM6B

liittyi aivokasvainten [13], [14] ja lymfaattisen leukemiat [15],

MAGEA12

kasvoi -regulated virtsarakon karsinooma [16], melanooma [17], rintasyöpä [18] ja suun okasolusyöpä [19] avulla

FCRL1

induktio havaittiin metastaattisen ihosyövän [21] ja eri of leukemiat [20].

Differential HRM rakenteessa amplikonien

GPM6B

,

MAGEA12

, ja

FCRL1

erottelee HCC normaalista maksasta

HRM analyysi kasvain (n = 12) ja viereisen normaaleissa kudoksissa (n = 12) suoritettiin. Sulamiskäyrät piirrettiin ja lämpötila sulamishuippu laskettiin, kuten on kuvattu menetelmissä. Koska metyloitua DNA amplikonin sulaa korkeammassa lämpötilassa kuin amplikoneihin päässä metyloitumattoman bisulfiitti konvertoidaan DNA, näytteitä eri metylaatio valtioiden voidaan erottaa vertaamalla sulamiskäyrää huiput. Se on yleinen käytäntö verrata kasvainten patologisesti normaali viereinen kudos samasta potilaasta. Se voi kuitenkin aiheuttaa vääriä negatiivisia tuloksia, koska niin sanottu normaali maksan voidaan jo muuttaneet molekyylirakennetta ja näkyvät muuttuneessa DNA metylaation osoittamatta muutoksia histopatologia, erityisesti potilailla, joilla erittäin invasiivisia kasvaimia. Viisi potilasta otantajoukon diagnosoitiin invasiivisia HCC jossa porttilaskimon kasvain Veritulppa (PvTT) havaittiin. Oletimme, että normaali viereinen maksa voidaan jo muuttunut näillä potilailla. Siksi luoneet normaali viite käyrä (NorAdjRef) määrittämällä keskiarvo sulamiskäyrät kaikkien viereisten normaaleissa kudoksissa ilman potilailla, joilla PvTT. Ehdotamme, että tällainen viittaus käyrä voitaisiin parantaa sisällyttämällä HRM tulokset suuri otos ei-syöpä maksakudosta ja voidaan käyttää yleisenä standardi vertailua varten uusia tapauksia erityisesti silloin, kun invaasio viereisiin kudoksiin epäillään. Itse asiassa, metylaatio

GPM6B

koetin kasvaimen näytteen potilaasta 5 oli sama kuin sen viereisen normaalin kudoksen, mutta se oli erilainen NorAdjRef vahvistaa käyttämällä keskimäärin normaalia standardina vertailu (kuvio 2A , kuvio 3A). Potilaat 1-6 PvTT oli samat metylaatiotila sisällä

FCRL1

koetin kun niiden kasvaimet verrattiin niiden Hyväksytty viereiseen normaaliin kudokseen mutta jälleen HRM profiilit erosivat NorAdjRef (kuvio 2C). Siten käyttämällä keskimäärin normaalin pystyimme soittamaan näiden otosten HCC, mikä olisi ollut mahdotonta, jos käytimme viereiseen kudokseen referenssinä.

(A-C) sulamiskäyrää huiput

GPM6B

(A),

MAGEA12

(B) ja

FCRL1

(C) amplikonien 12 tuumorinäytteissä ja 12 sovitettu viereisten normaaleissa kudoksissa. Huiput HCC kanssa PvTT (PvTT-HCC), HCC ilman PvTT (non-PvTT-HCC), ja pseudotumor koehenkilöille verrattuna keskimääräiseen normaalien viereisten kudosten ei-PvTT potilasta (NorAdjRef). Toisessa paneelissa sulamispiikkejä kasvaimen näytteitä HCC potilaalla on PvTT piirrettiin yhdessä keskiarvoa sovitetun viereisten normaaleissa kudoksissa näistä potilaista, kun taas viides paneeli esittää keskiarvon HCC kanssa PvTT ja HCC ilman PvTT verrattuna NorAdjRef. Lämpötila-arvot sulamispiikkejä jokainen potilas on esitetty sirontakuvaajiin ja taulukossa 3.

(A-C) sulamiskäyrää huiput

GPM6B

(A),

MAGEA12

(B) ja

FCRL1

(C) amplikonien tuumorinäytteissä verrattuna täsmäsi viereiseen normaaliin kudokseen samasta potilaasta. (D) pyrosekvensointi on

GPM6B

alue potilaan 9 (HCC) ja potilaan 13 (pseudotumor). Katettu alue on päällekkäinen sekvenssi analysoitiin HRM.

Olemme optimoineet kolme erityistä 150 emäsparin DNA-alueita, jotka voivat erottaa HCC transformoimattomista kudoksesta käyttäen HRM. A-alueen sisällä

GPM6B

promoottori hypometyloidut tuumoreissa kaikilla potilailla verrattuna NorAdjRef (kuvio 2A). Kaikki kasvaimet erottuivat selvästi ja tunnistaa HCC perustuu lämpötila-arvot sulamispiikkien (taulukko 3,

P

= 3.97E-5, säädettiin

P

= 1.17E-4, Mann-Whitney

U

testi). Potilaat, joilla on ei-invasiivisia HCC (non-PvTT) olivat hypometyloidut verrattuna invasiivisia kasvaimissa ero sulamispiikkejä syövän ja NorAdjRef osoittaa. Siten amplikoni voi erottaa myös HCC ilman PvTT päässä HCC kanssa PvTT, ainakin pienessä määrässä tapauksia tutkitaan here (taulukko 3, kuva 2A-kaavioita 3 ja 5,

P

= 0,03, oikaistu

P

= 0,06, Mann-Whitney

U

testi). HRM analyysi alueen sisällä

MAGEA12

promoottori eriytetty kaikki HCC ilman PvTT ja 2 ulos 5 HCC kanssa PvTT alkaen NorAdjRef (kuvio 2B, kuvio 3B,

P

= 1.7E-4, oikaistu

P

= 5.1E-4, Mann-Whitney

U

testi). Kasvain näytteitä potilaista 5, 6, ja 7, joilla oli diagnosoitu PvTT oli samat metylaation tasolla kuin niiden vastaaviin normaaleihin vieruskudos (kuvio 2B-kaavio 2, kuvio 3B) eikä niitä erottaa joko NorAdjRef (kuvio 2B-kaavio 1) . Keskimääräinen Sulamispiikki lämpötila arvon HCC ilman PvTT oli alhaisempi kuin keskimääräinen HCC kanssa PvTT osoittaa hypometylaatio sisällä

MAGEA12

koetin ei-invasiivisia kasvaimia (taulukko 3, kuvio 2B-kaavio 5), vaikka muutos ei ollut tilastollisesti merkitsevä meidän joukko näytteitä (

P

= 0,64, Mann-Whitney

U

testi). HRM varten

FCRL1

anturi erottelee HCC kanssa PvTT alkaen NorAdjRef (

P

= 2.5E-3, säädettiin

P

= 7.5E-3, Mann-Whitney

U

testi), mutta ei HCC ilman PvTT alkaen NorAdjRef (

P

= 0,11, Mann-Whitney

U

testi) (kuvio 2C-kaavio 1).

FCRL1

koetin hypometyloidut in invasiivisia verrattuna ei-invasiivisia kasvaimia (taulukko 3, kuvio 2C-kaavio 5,

P

= 2.5E-3, säädettiin

P

= 7.5E-3, Mann-Whitney

U

testi) ja lisäksi erottaa nämä kaksi erilaista kasvaimia. Mielenkiintoista, vaikka hienosti erottaa HRM PvTT näytteitä NorAdjRef, ei ollut merkittäviä eroja, kun verrataan

FCRL1

metylaatiotila jokaisessa PvTT kasvaimen näyte sovitetun viereiseen normaaliin kudokseen samasta potilaasta paitsi potilaalla 7 (taulukko 3, kuvio 2C-kaavio 2, kuvio 3C). Tämä viittaa siihen, että DNA: n metylaation muutoksia tapahtunut jo viereiseen kudokseen näiden maksa. Potilas 13 joka oli diagnosoitu maksan pseudotumor ei todettu eroa HRM sulamisprofiili oma viereiseen kudokseen ja NorAdjRef kaikissa kolmessa antureista (taulukko 3, kuvio 2-kaavioita 4,

P

0,05). Olemme vahvistaneet tämän havainnon pyrosekvensointi on

GPM6B

alueen HCC aihe 9 ja pseudotumor potilaan kuvan 3D.

Yhteenvetona yhdistelmä näistä kolmesta HRM optimoitu antureista erottaisivat kasvaimia ei-kasvaimista (käyttäen

GPM6B

koetin ja

MAGEA12

yhdistettynä

GPM6B

) ja HCC kanssa PvTT ei-PvTT HCC (käyttäen

FCRL1

koetin).

Validation Kartoitettujen epigeneettiset biologisten merkkiaineiden Bangladeshin biopsianäytteistä päässä HCC ja krooninen hepatiitti B (CHB) potilaat

kriittinen kysymys diagnoosi HCC on tunnistaa varhain muuntaminen CHB kohteeseen HCC. Siksi kysytään, onko identifioitu antureista voisi erottaa HCC ja CHB riippumattomalla joukko aiheita. Testasimme 4 henkilöillä, joilla HCC ja 4 potilaalla on CHB (taulukko 2 kliinisten ominaisuudet).

GPM6B

koetin, joka erottaa kaikki HCC alkaen NorAdjRef Shanghain potilaiden ryhmässä osoitti myös erilaisia ​​sulamisen kuviot HCC ja Chohung paitsi yksi potilas, jolla HCC joka oli ryhmitetty CHB perustuu sulamispiikkianalyysejä lämpötila (taulukko 3, Kuva 4A,

P

= 0,028, säädetty

P

= 0,084, Mann-Whitney

U

testi;

P

0,0001, permutation testi) . Metylaatiotila sisällä

MAGEA12

koetin erottaa kaikki HCC tapausta CHB kuten alemmat sulamislämpötila (taulukko 3, kuvio 4B,

P

= 0,028, säädetty

P

= 0,084 , Mann-Whitney

U

testi;

P

= 0,02, permutaatio testi). HCC potilailla, olemme selvästi havaittavissa kaksi sulamispiikeistä osoittaa kahden populaation soluja, joilla on alhainen ja korkea

MAGEA12

metylaatio tasolla. Koetin sisällä

FCRL1

oli hypometyloidut kaikissa kasvaimissa verrattuna keskimääräiseen kaikkien CHB potilaista (taulukko 3, kuvio 4C,

P

= 0,028, säädetty

P

= 0,084, Mann-Whitney

U

testi;

P

0,0001, permutaatio testi). Kun ryhmitelty sulamispiikkianalyysejä lämpötila-arvot kaikille HCC näytteet ja kaikki viereiset normaalit ja CHB näytteiden mediaani kutakin testattua koetin oli pienempi syövän kuin normaalissa osoittaa hypometylaatio syövän (kuvio 4D). Erot olivat tilastollisesti erittäin merkittäviä

GPM6B

ja

MAGEA12

antureista (

P

0,001, säädetty

P

0,003, Mann-Whitney

U

testi) sekä

FCRL1

mutta poissulkemisen jälkeen HCC näytteitä ilman PvTT (

P

0,01, säädettiin

P

0,03 , Mann-Whitney

U

testi). Expression testatuista geenien mitattuna QPCR Bangladeshin ryhmässä oli keskimäärin korkeampi HCC kuin CHB henkilöillä (katso kuva 4E tarkka arvot jokaiselle potilaalle) kanssa tärkeimmät muutokset havaittiin

FCRL1

(kuva 4E,

P

= 0,028, säädetty

P

= 0,084, Mann-Whitney

U

testi;

P

= 0,028, permutaatio testi).

sulamiskäyrää huiput

GPM6B (A) B,

MAGEA12

(B) ja

FCRL1

(C) amplikonien 4 HCC ja 4 CHB potilasta Bangladeshissa.