Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

siglitatsonia kuuluu tiatsolidiinidionien luokan diabeteslääkkeiden huumeiden perhe ja on korkean affiniteettiligandina peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptorin γ (PPARy). Sen lisäksi diabeteslääkkeet toimintaa, tämä molekyyli osoittaa antineoplastisia tehokkuutta lukuisissa syöpäsolulinjoissa.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käyttämällä RT4 (peräisin hyvin erilaistuneet luokan I papillaarinen kasvain) ja T24 (johdettu peräisin erilaistumaton luokka III karsinooma) virtsarakon syöpä soluja, tutkimme mahdollisuuksia siglitatsonia aiheuttavan apoptoottisen solukuoleman ja tunnettu molekyylitason mekanismeja. Vuonna RT4 soluissa lääkkeen aiheuttama G2 /M solukierron pysähtymisen ominaista yli-p53, p21

waf1 /CIP1 ja p27

Kip1 in samanaikaisuuden laskua oli sykliini B1. Päinvastoin, vuonna T24-soluissa, se laukaisee apoptoosin

kautta

ulkoisten ja sisäisten polkuja. Solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosin induktio tapahtui suurina pitoisuuksina kautta PPARy aktivointi-riippumattomia reittejä. Osoitamme, että

in vivo

hoidossa nude hiirissä siglitatsonia estää korkealuokkaisesta virtsarakon syövän ksenografti- kehitystä. Olemme tunnistaneet uuden mekanismin, jolla siglitatsonia tappaa syöpäsoluja. Siglitatsonia sääteli liukoinen ja kalvoon sitoutuneita TRAIL ja anna TRAIL kestävä T24 soluja vastaamaan reittiä läpi kaspaasin aktivaatio, kuolema signalointireitin agonisti ja Bid pilkkominen. Annoimme näyttöä siitä, että TRAIL: n indusoiman apoptoosin osittain ohjaavat siglitatsonia välittämä säätely alaspäin c-FLIP ja Surviviiniproteiini tasoilla proteasomin riippuvan hajoamisen mekanismi.

Johtopäätökset /merkitys

Siksi , siglitatsoni voisi olla kliinisesti merkittävää kuin chemopreventive tai terapeuttinen aine hoitoa varten TRAIL-tulenkestävä korkealuokkaisesta urothelial syöpiä.

Citation: Plissonnier ML, Fauconnet S, Bittard H, Lascombe I (2011) diabeteslääkkeen Drug siglitatsonia indusoi high Grade Virtsarakon syövän solut apoptoosin kautta Up-asetus TRAIL. PLoS ONE 6 (12): e28354. doi: 10,1371 /journal.pone.0028354

Editor: Laszlo Buday, Unkarin tiedeakatemian, Unkari

vastaanotettu: 16 elokuu 2011; Hyväksytty: 07 marraskuu 2011; Julkaistu: 12 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Plissonnier et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimuksen avustuksia Ligue Nationale Contre le Cancer (Comité du Doubs). M.L. Plissonnier tukivat apurahan päässä Cancéropôle du Grand-Est. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

urothelial rakkokarsinooman osuus -5% kaikista syöpäkuolemista ihmisillä. Valtaosa rakkokasvaimista (75%) ovat lihas-invasiivisia diagnoosi ja sen jälkeen paikallisen kirurgisen hoidon, on suuri riski toistumista ja taipumus edetä luokan tai vaiheessa [1]. Lihas invasiivisia kasvaimet (25%) on huonompi ennuste [2], koska 50%: lla potilaista uusiutumisen etäpesäkkeitä 2 vuoden kuluessa hoidon. Huolimatta edistysaskeleet kirurgian ja rakkoon immuno- ja kemoterapiaa potilaiden hoidossa ja vaikka uusien kemoterapeuttisten aineiden (tyrosiinikinaasin estäjät, antiangiogeeniset aineet …) käytetään, ei parannusta selviytyminen on havaittu. Siten kehittää uusia tehokkaita solunsalpaajahoitojen joilla on vähemmän sivuvaikutuksia ovat ehdottomasti tarpeen vähentää sairastuvuutta ja kuolleisuutta urothelial karsinooma.

Tiatsolidiinidioneja (TZD), kuten rosiglitatsonin, troglitazone, pioglitatsoni ja siglitatsoni ovat luokan insuliinia herkistäviä lääkkeitä. Lisäksi rosiglitatsoni ja pioglitatsoni hetkellä kliinisessä käytössä hoidettaessa tyypin II diabeteksen miljoonaa potilasta. Nämä TZD ovat korkean affiniteetin kemiallisesti syntetisoitu ligandeja Peroksisomien proliferaattoriaktivoidut Receptor γ (PPARy) [3], [4]. PPARy on ligandi-aktivoitujen transkriptiotekijän nukleaarihormonireseptorit superperheen. Sen lisäksi tunnetun roolin sääntelyn aineenvaihduntaa ja tulehdusta, PPARy on myös liitetty syövän synnyn perustuu tutkimuksiin, jotka osoittavat sen kyky moduloida solujen erilaistumista, lisääntymistä, ja apoptoosin. Sen lisäksi niiden diabeteslääkkeet toimintaa, TZD saada kasvua estäviä vaikutuksia

in vitro

syöpäsoluihin erilaisten kudosten alkuperää ja

in vivo

[5]. Harvat tutkimukset osoittavat, että pioglitatsoni tai troglitatsonista antiproliferatiivisia tai proapoptoottisten toimintaa vastaan ​​virtsarakon syöpä solulinjoja [6] – [9] ja rotan uroteeli [10]. Vain yksi tutkimus kertoo, että siglitatsonia näytteillä estävää vaikutusta solun numero sarjassa solulinjojen mallinnus metastaattinen siirtymäkauden solu rakkokarsinooman (TSU-Pr1, TSU-Pr1-B1 ja TSU-Pr1-B2) [6].

Apoptosis tapahtuu

kautta

kaksi erillistä mutta kytkeytyvät toisiinsa viestinvälitystekniikoita: ulkoista kuolema reseptorin aiheuttamaa reitin aktivoidaan proapoptoottiset reseptori signaalien solupinnalla, ja luontainen mitokondrioiden välittämää reitin aktivoidaan mitokondrioiden signaaleja sisällä solu [11]. Keskeisiä välittäjiä apoptoosin ovat kaspaasien, perheen kysteiiniproteaasien, jotka pilkkovat kriittinen joukon solun proteiinien kohteen erityisiä asparagiinihappotähteitä.

joukossa mahdollisia tehokkaita syöpähoitojen, TRAIL (TNFa-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi) on lupaava kasvainten vastaisen aineen, koska se indusoi apoptoosia syöpäsoluissa, jossa on vain vähäinen vaikutus normaaleihin soluihin [12]. TRAIL laukaisee kaspaasi Cascade

kautta

ulkoista apoptoottisen reitin vuorovaikutuksessa TRAIL-reagoiva kuolemareseptorien (DR), kuten DR4 ja DR5, johtaen kuoleman aiheuttavia signalointikompleksiin (DISC), rekrytointi ja nopea kaspaasi 8. tyypin I solujen TRAIL-R aiheuttama kaspaasin 8 aktivaation suoraan johtaa alavirtaan kaspaasin aktivaation ja apoptoosin, kun taas tyypin II soluissa kaspaasi 8 aktivointi on tehoton ja signaali on monistettava kautta caspase- 8-lohkaisu pro-apoptoottisen Bid-proteiinin ja aktivointi mitokondrion apoptoottisen reitin [13] kautta, kaspaasi 9 aktivaation. Sekä caspases 8 ja 9 aktivoi pyöveli kaspaasi 3, joka on ensisijainen aktivaattori apoptoottisten DNA: n fragmentoituminen ja johtaa syöpäsolun apoptoosin [14].

Surviviinispesifisiä ja solujen FLICE-estävä proteiini (c-FLIP) ovat myötävirtaan ja ylävirtaan anti-apoptoottisen säätelijöitä apoptoottisen signalointiryöpyn, vastaavasti.

Kuten muutkin inhibiittorit apoptoosin (IAP), surviviini toimii alavirtaan mitokondrioita estämiseksi käsittelyn tai aktivoitumista initiaattorin kaspaasi-9, mikä johtaa inhibitioon aktiivisuus efektori kaspaasien. Kuitenkin rooli surviviini ei rajoitu apoptoosin inhibition, mutta liittyy myös asetus solunjakautumisen [15]. C-FLIP on tärkeä proteiini, joka estää kaspaasi 8 välillä aktivaation kuolemareseptorien sitoutumalla Fas-liittyvä kuolema domain ja kaspaasin 8 klo DISC. Vaikka useita silmukointi-isoformeja c-FLIP mRNA on kuvattu, vain kaksi niistä, c-FLIP

S ja c-FLIP

L, on merkittävästi tutkittu proteiinin tasolla. Molemmat proteiinit voidaan rekrytoida kuolemaan aiheuttavia signalointikompleksiin ja estää kuoleman reseptorivälitteisistä apoptoosin [16]. Sekä C-FLIP

L ja C-FLIP

S ovat nopeasti liikevaihtoon proteiineja; näin, niiden tasot ovat annetussa asetuksessa ubikitiinipromoottori /proteasomin välittämää hajoaminen [17], [18].

tulokset prekliinisissä tutkimuksissa yhdistelmä-TRAIL ovat osoittaneet sen merkittävä kasvainten vastainen toiminta, mikä osoittaa potentiaalia hyödyntäen TRAIL syöpälääkkeenä [19]. Tästä huolimatta proapoptoottiset rooli TRAIL transformoiduissa soluissa, monet syövän solut kehittävät resistenssin kohti TRAIL-indusoitua apoptoosia. Siten on raportoitu, että virtsarakon syövän solulinjat, kuten T24 ja HT1376, ovat TRAIL-resistenttejä [20]. Tunnistetiedot lääkkeitä tai aineita, jotka voivat voittaa TRAIL vastuksen ja herkistää syöpäsolut kohti TRAIL: n indusoiman apoptoosin on siten ratkaisevan tärkeää kohdistamista TRAIL-resistenttejä syöpäsoluja. Yhdistelmä TRAIL säteilyn ja jotkut kemoterapeuttiset aineet [21], [22], on saatu niukasti menestystä, koska tämä yhdistelmä myös johti lisääntymiseen syöpymistä.

Tässä tutkimuksessa raportoitiin vaikutuksia siglitatsonia on RT4 (johdettu hyvin erilaistuneet luokan I papillaarinen kasvain) ja T24 (johdettu erilaistumaton luokka III karsinooma) virtsarakon syöpä solulinjoja. Valinta näiden erityisen virtsarakon syöpä solulinjoissa on merkityksellinen, koska RT4 soluissa, P53 on villityypin ja mesenkymaaliset merkki N-kadheriinin ei ilmenny taas epiteelin merkki E-kadheriinin havaitaan. Kääntäen, in T24-soluissa, P53 on mutatoitunut ja E-kadheriinin on poissa ja korvattu N-kadheriinin [23]. Siten riippuen eriytetty tilasta solujen, osoitimme, että siglitatsonia yksilöllisen kohtelun aiheuttamaa G2 /M vaiheessa solukierron pysähtymisen vaan laukaisi apoptoosin ainoastaan ​​T24 korkealaatuista virtsarakon syövän solujen kautta PPARy aktivaation riippumattomia mekanismeja. Lisäksi ensimmäistä kertaa tietojemme mukaan hoitoon nude hiiriin siglitatsonia merkittävästi heikentää kasvua korkealaatuista virtsarakon tuumoriksenografteja vahvistaa meidän

in vitro

tuloksia. Mitä mielenkiintoisinta, yhdistelmä siglitatsonia ja TRAIL näytetään että siglitatsonia anna TRAIL tulenkestävä T24 soluja vastata TRAIL. Ensimmäistä kertaa vuonna virtsarakon syövän soluissa, me paljasti, että siglitatsonia välittämä lisäävä säätely TRAIL ja merkittävä lasku c-FLIP ja surviviiniin välittämän osittain läpi proteosomal huonontumisprosessi edistää siglitatsonia solukuolema sekä herkistävää vaikutusta tämän TZD on TRAIL: n indusoiman apoptoosin.

tulokset

siglitatsonia lohkot RT4 (huono laatu) ja T24 (korkea laatu) solut G2 /M vaiheessa mutta indusoi apoptoosia vain T24-soluissa kautta kaspaasi aktivointi

vaikutuksen tutkimiseksi siglitatsoni on RT4 ja T24 virtsarakon syövän solujen apoptoosin, soluja käsiteltiin vaihtelevilla pitoisuuksilla lääkkeen (5-60 uM) 24 tunnin ajan ja arvioitiin propidiumjodidilla värjätään DNA-pitoisuus käyttämällä virtaussytometria- analyysi. Kuten kuviossa 1A on esitetty, on RT4 soluissa lääkkeen aiheuttama annoksesta riippuvainen kasvua solujen G2 /M-vaiheen solusyklin yhdessä kasvua ilmentymisen taso p53, p21

CIP1 /Waf1 ja p27

Kip1 ja laskua sykliini B1-proteiinin taso (kuvio 1 B). Mutta ei ollut merkittävää kasvua sub-G1 väestön käsittelemättömään kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 1C), mikä osoittaa, että 24 h-siglitatsoni käsittely ei indusoinut apoptoosia näissä soluissa jopa korkean pitoisuuden 60 uM lääkkeen. Sen lisäksi, siglitatsoni ei indusoinut lohkaisu kaspaasi 3 ja sen alustan PARP (kuvio 1 D).

Soluja käsiteltiin 24 h ajan tai ilman siglitatsoni ilmoitettuina pitoisuuksina. (A) prosenttiosuus soluja osoittaa solusyklin jakautumisen. (C) Hypodiploid DNA-pitoisuus (sub-G1 peak). (B), (D) Käsittelyn jälkeen solut kerättiin ja koko proteiinin uutteet altistettiin immunoblottauksella havaitsemiseksi prokaspaasi 3, PARP, p53, p21

CIP1 /Waf1, p27

Kip1 ja sykliini B1. β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. Esitetyt tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

havaittu RT4-solujen, oli annoksesta riippuva lisäys G2 /M osa T24-soluja (tuloksia ei ole esitetty), mutta toisin kuin RT4 solujen analyysi tuman DNA jakelun T24-soluissa osoitti annoksesta riippuvaa kasvua sub-G1 väestöstä -40% solukuolema 40 uM (kuvio 2A). Luonnehtia solukuolemareitin laukaisee siglitatsoni, lohkaisu kaspaasien 9, 8, 3, määritettiin western blotting -analyysi. Vuodesta 40 uM lääkeaineen pitoisuus, joka on huomattavasti parannettu käsittely sekä kaspaasi 9 ja kaspaasin 8 niiden aktiivisia fragmentteja havaittiin (kuvio 2B). Kaspaasi 3, joka edustaa klassista alavirtaan suorittamisen entsyymin kaspaasin 8 ja 9 pilkottiin aktiiviseen muotoonsa (20/18 kDa). Kaspaasi 3 vahvistettiin pilkkomalla pro-muodossa, PARP (116 kDa) on inaktiivisessa muodossa (85 kDa) (kuvio 2B). Kuten kuviossa 2C on esitetty, kun taas p53: n ja Bax: n ilmentymisen tasot olivat ennallaan, Bcl-2 on merkittävästi vähentynyt, ja Bid on katkaistu. Nämä tulokset osoittivat, että T24-soluissa voi lisätä apoptoottista signaalin mitokondrioita ja käyttäytyä kuten tyypin II soluissa, sen jälkeen siglitatsoni altistuksen.

Soluja altistettiin 24 h ajoneuvoon tai siglitatsoni ilmoitettuina pitoisuuksina. (A) solujen prosenttiosuus, joka esittää hypodiploid DNA-pitoisuuden (sub-G1-piikki) arvioitiin virtaussytometrialla analysointia. (B), (C) lohkaisu kaspaasien 9, 8, 3 ja PARP sekä ilmentymistä pro- ja anti-apoptoottiset proteiinit määritettiin western blotting -analyysi. (D,

jäljellä

) Soluja esi-inkuboitiin 1 h 50 uM kaspaasin 8 (Z-IETD-FMK) tai 9 (Z-LEHD-FMK) spesifinen estäjä ennen hoitoa 40 uM siglitatsonia 12 tuntia ja arviointi kaspaasien 8, 9, 3 ja Bid käsittelyä analysoitiin western-blottauksella. β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta; (D,

oikeus

) jälkeen osoitti hoitoja, solut värjättiin PI DNA fragmentaatioanalyysillä virtaussytometrialla. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD 3 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena. *

P

0,05, merkittäviä eroja verrattuna niihin soluihin; **

P

0,05, merkittäviä eroja verrattuna siglitatsonia käsiteltyjä soluja käyttämällä kaksisuuntaisia ​​parittomia Studentin

t

testiä.

kaspaasi cascade aktivointi on keskeinen tapahtuma apoptoottisen prosessin. Kuten odotettua, inkubointi kaspaasi 8: (Z-IETD-FMK) tai 9 (Z-LEHD-FMK) spesifiset inhibiittorit estetty kaspaasien 8 tai 9 käsittely (kuvio 2D, vasen paneeli), ja vähensi siglitatsoni: n indusoiman apoptoosin, kuten osoituksena huomattavasti pienempään osa-G1 väestöstä (kuvio 2D, oikea paneeli), joka liittyy vähemmän kaspaasi 3 pilkkominen (Kuva 2D, vasen paneeli). Nämä tiedot osoittavat, että RT4 ja T24-solujen ei ole samanlainen vaste siglitatsoni hoitoon. Todellakin, siglitatsoni: n indusoiman apoptoosin rajoitettu T24-soluissa, vaikka se estää T24 ja RT4 solut G2 /M-vaiheen solusyklin. Lisäksi kaksi apoptoottisten reittien, kuoleman reseptori ja mitokondrioiden polkuja, näyttävät aktivoidaan T24-soluissa.

siglitatsonia eivät toimineet PPARy transkription aktivaation

Voit selvittää PPARy transactivation oli tarvitaan siglitatsonia-edistänyt solusyklin pysähtymisen tai apoptoosin, RT4 ja T24-soluja käsiteltiin 24 tuntia 40 uM lääkkeellä yksin tai yhdessä 80 uM GW9662, irreversiibeli estäjä PPARy. Toiminta siglitatsonia on G2 /M solusyklin pysähtymisen RT4 soluissa ei inhiboinut (kuvio 3A, vasen paneeli). Kuten odotettua, lisääntynyt ekspressiotaso p27

Kip1, havaittiin siglitatsoni, ei vaikuttanut kun GW9662 liittyi huumeiden (kuvio 3A, oikea paneeli). Vaikutus siglitatsonia on T24 solukuolemaa (kuvio 3B, vasen paneeli) ja kaspaasi 3 pilkkominen (kuvio 3B, oikea paneeli) ei peruuteta läsnäollessa PPARy-antagonisti. Näin ollen, GW9662 ei ollut estävää vaikutusta, mutta silti se on ollut tehokasta koska T24-soluissa, se esti yli-ilmentyminen A-FABP PPARy tavoite, kun siglitatsoni hoitoa (kuvio 3C), kuten aiemmin on raportoitu [24]. Yhdessä tämä koesarja todennut, että T24 virtsarakon syövän solut, siglitatsoni aiheuttaman apoptoosin kautta PPARy aktivaation riippumaton signalointireitteihin.

RT4 ja T24-soluja käsiteltiin 24 tuntia 40 uM siglitatsonia yksin tai yhdistelmänä 80 uM GW9662, irreversiibeli estäjä PPARy. (A,

vasemmalle

) kertyminen RT4-solujen G2 /M-vaiheen solusyklin analysoitiin virtaussytometrialla analyysi; (A,

oikea

) hoidon jälkeen, kokosolulysaateille valmistettiin ja 20 ug kokonais-proteiinin uute tehtiin immunoblottaus havaitsemiseen p27

Kip1. (B,

vasemmalle

) solujen prosenttiosuus näytetään hypodiploid DNA-pitoisuus (sub-G1-piikki) arvioitiin virtaussytometrillä analyysi; (B,

oikea

) hoidon jälkeen, kokosolulysaateille valmistettiin ja 15 ug kokonais-proteiinin uute tehtiin immunoblottaus havaitsemiseen prokaspaasi 3 (C) Arviointi PPARy-antagonisti GW9662 tehokkuus on adiposyyttien-Fatty acid Binding Protein (A-FABP), tunnettu PPARy tavoite T24-soluissa western-blotting-analyysi. β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD 3 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena. *

P

0,05, merkittäviä eroja verrattuna niihin soluihin, jossa käytetään kaksisuuntaisia ​​parittomia Studentin

t

testiä.

siglitatsonia up-regulation liukeneva ja kalvoon sitoutuneiden TRAIL T24-soluissa

olivatko siglitatsonia voi ilmentymisen moduloimiseksi TRAIL T24 ja RT4 soluja. Kun 40 uM siglitatsoni altistuminen, havaitsimme kasvua TRAIL ligandin taso T24 kokosoluekstraktien arvioituna western-blottauksella, kasvua kalvoon sitoutunut TRAIL osoituksena virtaussytometrialla analyysi erityisiä PE-konjugoidulla TRAIL-vasta sekä kasvua TRAIL tason T24 soluravintoliuoksista määritettiin ELISA: lla (kuvio 4A). Toisaalta, siglitatsoni, jotka eivät aiheuttaneet apoptoosin RT4 soluissa, ei nostanut TRAIL kokosoluekstraktien sekä solun pinnalla ja elatusaineessa (kuva 4B). Olemme siis sitä mieltä, että ciglitzone voisi aiheuttaa apoptoosin korkealuokkaisesta T24 virtsarakon syövän solujen lisäämällä TRAIL ilme.

RT4 ja T24-soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan siglitatsonia 40 ja /tai 60 uM. In RT4 (A) ja T24 (B-solut), kokosolulysaateille määritettiin TRAIL ilmentyminen western blotting-analyysi. β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. Solut värjättiin anti-TRAIL-PE ja analysoitiin virtaussytometrialla. Jälkeen 40 uM siglitatsoni hoitoa 24 h, elatusaine kerättiin ja pitoisuus TRAIL mitattiin ELISA: lla. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD 2 itsenäisen kokeen suoritettiin neljänä rinnakkaisena. *

P

0,05, merkittäviä eroja verrattuna niihin soluihin, jossa käytetään kaksisuuntaisia ​​parittomia Studentin

t

testiä. (C) Soluproteiinit eristettiin T24-soluissa ja altistetaan immunoblottauksella havaitsemiseen DR4 ja DR5. β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. (D) T24-solut altistettiin 40 uM siglitatsoni 12 h, värjättiin anti-DR4-PE tai anti-DR5-PE ja analysoitiin virtaussytometrialla. (E) T24-soluja esi-inkuboitiin tai ei monoklonaalisten vasta-aineiden estää DR4 ja DR5-reseptoreihin (5 mg /ml) 1 h ja stimuloitiin 12 h 40 uM siglitatsoni tai 50 ng /ml TRAIL varten RT4-solujen (

lisää

). Solujen prosenttiosuus näytetään hypodiploid DNA-pitoisuus (sub-G1-piikki) arvioitiin virtaussytometrialla analysointia. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD 3 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena. *

P

0,05, merkittäviä eroja verrattuna niihin soluihin; **

P

0,05, merkittäviä eroja verrattuna siglitatsonia käsiteltyjä soluja käyttämällä kaksisuuntaisia ​​parittomia Studentin

t

testiä.

siglitatsonia teki ei vaikuta DR4 ja DR5 ilmentymistä T24-soluissa

T24-soluissa, olemme osoittaneet kaspaasi 8 pilkkominen ja kasvu Trail siglitatsonia. Analysoida, siglitatsoni solukuolema on riippuvainen muutos syöttämällä reseptorin ilmentymisen, soluja käsiteltiin 40 tai 60 uM lääkettä 24 tunnin ajan. Olemme osoittaneet, että siglitatsoni ei muuttanut DR4 ja DR5 ilmentymisen tasolla arvioidaan kokosolulysaattien Western-blottauksella (kuvio 4C) sekä niiden ilmentyminen solun pinnalla osoituksena virtaussytometrialla analyysi erityisiä PE-konjugoiduilla vasta-aineilla (kuvio 4D). Sen tutkimiseksi, siglitatsoni laukaisema apoptoosin oli funktio kuoleman reseptori-signalointireitin vahvistus, DR4 ja DR5 stimulaation estettiin esi-inkuboimalla soluja estää anti-DR4 tai anti-DR5-vasta-aineita ennen lääkehoitoa. Inaktivoinnin Sekä DR4 ja DR5 vähensi siglitatsonia-edistänyt apoptoosin (kuvio 4E). Validoida kuoleman reseptori estävien vasta-aineiden tehokkuutta käytetyillä pitoisuuksilla, olemme alttiina TRAIL-herkkien RT4-solujen TRAIL positiivisena kontrollina (kuvio 4E, insertti). Kuten odotettua, inaktivoimalla kukin reseptorien estivät täysin TRAIL-indusoitua apoptoosia. Nämä tiedot näyttää, että siglitatsonia aktivoi ulkoista apoptoottisen reitin kautta DR4 ja DR5.

siglitatsonia estää virtsarakon -tuumoriksenografti kehitys nude-hiirissä

tutkimiseksi antituumorivaikutusta siglitatsonia

in vivo

(kuva 5), ​​T24 ja RT4 soluja samoin injektoidaan subkutaani- on 6 viikkoa vanha-naaras kateenkorvattomiin nude-hiiriin. Kun kouraantuntuva kasvaimet muodostettiin, hiiriä hoidettiin ajoneuvon tai siglitatsonia (15 mg /kg) nopeudella yksi injektio viikossa kolmen viikon ajan. Kasvaimen tilavuus mitattiin kahdesti viikossa, kunnes hiiret tapettiin. Kasvain ilmaantuvuus oli 100% kaikissa eläimissä. Tilavuus kasvainten T24-soluissa-oksastetut hiiret eivät kasvaa siglitatsoni-käsitellyissä eläimissä verrattuna apuaineella hoidettuihin kontrollieläimiin. Oli merkittävä ero kolmannen pääomasijoituksen siglitatsonia (

P

0,05) (kuvio 5A, vasen paneeli). In RT4 soluissa-oksastettu hiirissä kasvaimen tilavuus näyttivät kehittää vähemmän kuin verrokeilla hiiriin siglitatsonia hoitoa, mutta tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 5A, oikea paneeli). Voit selvittää, onko esto kasvaimen kehitystä siglitatsonia johtuu lisäkasvun estäminen, apoptoosin, tai molemmat, arvioimme Ki67 ilmaisun ja kaspaasi 3 aktivoinnin kasvainkudossektioista immunohistokemiallisella analyysillä. Lukumäärä Ki67-positiivisten solujen oli alhaisempi T24 ja RT4 solujen-ksenosiirrettyjä kasvain osastoja siglitatsonia hoidetuista eläimistä verrattuna tuumorisektioiden käsittelemättömien eläinten. Päinvastoin, ei ollut havaittavissa aktivoitu kaspaasi 3 RT4 soluissa-ksenosiirrettyjä tuumorisektioiden ja vahva aktivoitu kaspaasi 3 värjäytyminen T24-soluissa-ksenosiirrettyjä tuumorisektioiden peräisin siglitatsonia hoidetuista eläimistä verrataan tuumorisektioiden käsittelemättömien eläinten (kuvio 5B). Nämä tulokset osoittavat, että ensimmäistä kertaa tietomme että merkittävä väheneminen kasvaimen tilavuuden havaittu siglitatsonia saaneilla hiirillä (ksenosiirrettyjä kanssa T24 virtsarakon syövän solut) edellyttää lisäkasvun estäminen sekä apoptoosin.

Hiiret inokuloitiin subkutaanisti eksponentiaalisesti kasvava T24 ja RT4 virtsarakon syövän solut (5 x 10

6 solua). Kun kasvaimen koko saavutti 40 mm

3 tilavuudessa, hiiret jaettiin satunnaisesti kontrolli- ja käsitellyille ryhmille (n = 10). Vatsaontelonsisäisiä siglitatsoni oli viikoittain annoksena 15 mg /kg kolmen viikon ajan. Ohjaus eläimet saivat vain suolaliuosapuainetta jälkeen sama aikataulu. (A) kasvu kasvaimen käyrät määritettiin mittaamalla kasvaimen tilavuus. *

P

0,05, merkittäviä eroja suhteessa verrokkeihin, jossa käytetään kaksisuuntaista ANOVA-testi (arviointi kasvaimen kehitys ajan mittaan); **

P

0,05, merkittäviä eroja ohjaus ja käsiteltyjen hiirten jokaisen siirron jälkeen aikaa käyttämällä kaksisuuntaisia ​​parittomia Studentin

t

testiä. (B) immunohistokemiallinen värjäys edustavan parafiiniin upotetut leikkeet kasvainten käsittelemättömien tai siglitatsoni-käsitellyissä hiirissä. Leikkeet kiinnittää ja värjätä Ki-67 ja aktiivisen kaspaasin 3. Kukin paneeli edustaa 5 jakso kutakin kymmenen kasvainten kontrollista ja siglitatsonia käsitellyillä hiirillä. Alkuperäinen suurennos, × 20.

siglitatsonia ja TRAIL yhdistetty hoito indusoi synergistisiä apoptoosin kuoleman kautta signalointireitin agonisti, kaspaasin aktivaatio ja Bid pilkkominen

T24 solujen tiedetään olevan erittäin vastustuskykyisiä TRAIL altistuksen jälkeen kasvavia pitoisuuksia eksogeenistä liukoista rekombinanttia ihmisen TRAIL vaihtelevat 10-200 ng /ml [25]. Saamiemme tulosten osoittavat, että siglitatsonia up-regulation TRAIL ilmaisua, me olettaisi, että siglitatsonia tappaa T24 soluja palauttamalla niiden herkkyyttä TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Vahvistaa tämän hypoteesin, soluja käsiteltiin ajoneuvon tai 40 uM siglitatsoni 24 h tai 50 ng /ml rekombinanttia TRAIL viimeisten 12 h yksinään tai yhdistelmänä. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, osoitimme myös, että T24-soluja refraktaarisia TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Enemmän kiinnostavaa, oli merkittävä lisäys solukuoleman siglitatsonia ja TRAIL-cotreated solujen verrattuna siglitatsonia yksin käsiteltyjä soluja (kuvio 6A, ylhäällä). TRAIL-herkistävä toiminta siglitatsonia johti prokaspaasia 8 ja 3 käsittelyä ja PARP proteolyysi mutta mukana myös mitokondriot vahvistus silmukka kuten kaspaasi 9 ja Bid pilkkominen (Kuva 6A, alhaalla). Läsnäollessa kaspaasin 8 (Z-IETD-FMK) tai kaspaasi 9 (Z-LEHD-FMK) erityisiä estäjät, havaitsimme inhibitio joko kaspaasin 8 tai kaspaasi 9 käsittely ja puuttuminen Bid pilkkominen sekä vuonna siglitatsoni ja TRAIL cotreated soluja (kuvio 6B, alhaalla). Tämä oli liittynyt alentunut solukuoleman läsnä kaspaasin estäjät osoituksena merkittävä lasku DNA pirstoutuminen (kuvio 6B, ylhäällä). Vahvista osallistuminen syöttämällä reseptorin aktivoitumisen, DR4 ja DR5 stimulaatio, estettiin esi-inkuboimalla soluja estää anti-DR4 tai anti-DR5-vasta-aineita ennen käsittelyä (kuvio 6C). Inaktivoimalla kukin reseptorit TRAIL ja siglitatsonia yhteiskäsittely tehokkaasti estetty solukuoleman vahvistetaan, että apoptoosin välittyvät erityisiä vuorovaikutuksia TRAIL ja sen reseptoreihin.

T24 soluja käsiteltiin tai ei 40 uM siglitatsonia 24 h tai ihmisen rekombinanttia TRAIL (50 ng /ml) 12 tuntia tai cotreated kanssa siglitatsonia ja TRAIL (tähän lisätään viimeisen 12 h). (A,

Top) solujen prosenttiosuus näytetään hypodiploid DNA-pitoisuus (sub-G1-piikki) arvioitiin virtaussytometrialla analysointia. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD 3 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena. *

P

0,05, merkittäviä eroja verrattuna niihin soluihin; **

P

0,05, merkittäviä eroja verrattuna yksilöllistä-altistetuissa soluissa käyttämällä kaksisuuntaisia ​​parittomia Studentin

t

testi; (A,

alhaalla

) immunoblottausmääritys havaitseminen caspases 8, 9 ja 3, PARP ja Bid. (B) Soluja esi-inkuboitiin 1 h 50 uM kaspaasi 8: (Z-IETD-FMK) tai 9 (Z-LEHD-FMK) spesifinen estäjä ennen osoitettu hoito;

Top, solujen prosenttiosuus näytetään hypodiploid DNA-pitoisuus arvioitiin virtaussytometrialla analyysi;

pohja

, kaspaaseiksi 8, 9, 3 ja Bid pilkkominen analysoitiin western-blotting-analyysi. (C) Soluja esi-inkuboitiin tai ei monoklonaalisten vasta-aineiden estää DR4 ja DR5 reseptorit 1 h ja stimuloitiin, kuten on ilmoitettu. Solujen prosenttiosuus näytetään hypodiploid DNA-pitoisuus arvioitiin virtaussytometrialla analysointia. (D) Immunoblottaus havaitseminen c-FLIP ja surviviiniperäisten alkaen T24 kokosolulysaateista. (E) Soluja esikäsiteltiin 25 uM proteasomin inhibiittoria MG132: ssa 30 minuuttia ja stimuloitiin 40 uM siglitatsoni 12 h;

Top, solujen prosenttiosuus näytetään hypodiploid DNA-pitoisuus arvioitiin virtaussytometrialla analyysi;

pohja

, immunoblottauksella havaita c-FLIP ja surviviiniin. β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. (B, C, E) Tiedot ovat keskiarvoja ± SD 2 toisistaan ​​riippumatonta koetta suoritettiin kolmena rinnakkaisena. *

P

0,05, merkittäviä eroja verrattuna niihin soluihin; **,

P

0,05, merkittäviä eroja verrattuna siglitatsonia ja TRAIL cotreated soluja käyttämällä kaksisuuntaisia ​​parittomia Studentin

t

testiä.

siglitatsonia down-regulation c-FLIP ja surviviiniperäisten kautta proteasomin riippuvan hajoamisen

tutki tarkemmin vaikutusta siglitatsonia ja yhdistyksen siglitatsonia TRAILin kanssa ilmenemistä apoptoosin estäjiä, kuten surviviiniperäistä ja c-FLIP tiedetään olla mukana säätää sekä ulkoisen ja sisäisen apoptoottisia reittejä. Kuten esitetty kuvassa 6D, siglitatsoni, yksittäisinä hoito tai yhdessä TRAIL, vähensi sekä c-FLIP

S ja Surviviiniproteiini tasolla samassa määrin ja dramaattisesti alassäädetty c-FLIP

L. Päinvastoin, TRAIL yksittäinen hoito ei vaikuttanut merkittävästi c-FLIP ja Surviviiniproteiini tasolla. Nämä havainnot osoittavat, että säätely alaspäin c-FLIP ja surviviini todennäköisesti edistää siglitatsonia laukaisema apoptoosin ja siglitatsonia välittämää herkistymiseen TRAIL: n indusoiman apoptoosin.

ubikitiini-proteasomireitillä polku on keskeinen rooli sääntelyn solusyklin kontrolli ja apoptoosin [26]. Useita antiapoptooppinen proteiineja, kuten c-FLIP ja surviviiniperäisten edustavat näkyvä tavoitteita proteasomin. Sen määrittämiseksi, oliko siglitatsonia aiheuttama säätely alaspäin tällaisten apoptoosin alipaineensäätöventtiileillä välittyy läpi tämän prosessin, tutkimme vaikutuksia proteasomin estäjä MG132. MG132 palautti tasot surviviinin ja c-FLIP (kuvio 6E, alhaalla) osoittaa, että säätely alaspäin Molempien apoptoosin estäjiä oli proteasomin riippuvainen. Kuten esitetään kuviossa 6E (top) sub-G1 solupopulaation tasolla cotreated soluissa merkittävästi vähentynyt läsnäollessa MG132. Siten elpyminen c-FLIP ja surviviiniperäisten, joka merkittävästi heikennettyjä siglitatsonia ja TRAIL yhdistelmä indusoiman apoptoosin, oli tarpeen mutta ei riittävä voittamaan yhteiskäsittely-edistänyt apoptoosin T24-soluissa.

Keskustelu

Tässä raportissa osoitetaan, että siglitatsonia indusoi solujen kasvun estäminen läpi solusyklin kurssi ohjaus tai apoptoosin induktio mukaan kasvaimen virtsarakon syövän johdettujen urothelial soluissa. Apoptotic ilmaantuivat korkeina pitoisuuksina (40-60 uM) riippumatta PPARy aktivoinnin kuten jo raportoitu muissa solun malleja [27]. Useita mahdollisia PPARy-aktivaation riippumattomien mekanismien, jotka voivat aiheuttaa apoptoosin on ehdotettu. Ne sisältävät reaktiivisten hapen lajien [28], induktio solun asidoosin [29], osallistuminen varhaisen kasvun vaste-1 ja NSAID-aktivoitu-geenin 1 paksusuolen syöpä [30].

ensimmäistä kertaa pahanlaatuisten urothelial soluissa, esitämme näyttöä siitä, että siglitatsonia indusoi G2 /M solukierron pysähtymisen ja muutoksia solujen lukiertosäätelijöistä. Suurimmat säätelijä G2 M siirtyminen on MPF ​​(M-vaihe edistäjänä), joka käsittää katalyyttinen alayksikkö Cdc2 ja sääntely-alayksikköä sykliini B1. Useat havainnot viittaavat siihen, että p21

CIP1 /Waf1 tärkeä rooli G2 /M tarkastuspiste ohjaus.