Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Micro-RNA: t ovat pieniä, ei-koodaus, yksijuosteisia RNA: t, jotka negatiivisesti säädellä geeniekspressiota at transkription jälkeisellä tasolla. Koska miR-143 todettiin alassäädetty eturauhassyöpäsoluissa, halusimme tutkia sen ilmentymistä ihmisen eturauhasen syöpä, ja testata kykyä miR-43 pidättämään eturauhasen syöpäsolun kasvua in vitro ja in vivo.

tulokset

Expression of miR-143 analysoitiin ihmisen eturauhasen syövissä kvantitatiivisen PCR ja in situ -hybridisaatiolla. miR-143 esiteltiin syöpäsoluja in vivo elektroporaatiolla. Bioinformatiikan analyysi ja lusiferaasia perustuvissa määrityksissä käytettiin määrittämään miR-143 tavoitteet. Osoitamme tässä tutkimuksessa, että miR-143 tasot ovat käänteisesti verrannollisia pitkälle edennyt eturauhassyöpä. Pelastaminen miR-143 ilmentymistä syöpäsoluissa johtaa pidätykseen solujen lisääntymistä ja kumota kasvaimen kasvua hiirissä. Lisäksi osoitamme, että vaikutukset miR-143 välittyvät ainakin osittain estämällä solun ulkopuolisen signaalin säännelty kinaasi-5 (ERK5) aktiivisuus. Osoitamme tässä, että ERK5 on miR-143 kohde eturauhassyövässä.

Johtopäätökset

miR-143 on uutena kohteena eturauhassyövän hoitoon.

Citation: Clape C, Fritz V, Henriquet C, Apparailly F, Fernandez PL, Iborra F, et ai. (2009) miR-143 häiritsee ERK5 Signaling, ja kumotaan Eturauhassyöpä Progression hiirissä. PLoS ONE 4 (10): e7542. doi: 10,1371 /journal.pone.0007542

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 kesäkuu 2009; Hyväksytty: 29 syyskuu 2009; Julkaistu: 26 lokakuu 2009

Copyright: © 2009 CLAPE et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoittajien ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Tätä työtä tukivat avustuksia Agence Nationale pour la Recherche (ANR physio2006), Institut National du Cancer (INCA) Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC), ja Fondation pour la Recherche Medicale (FRM). CC tukee apurahan Region Languedoc-Roussillon, ja ARC. PLF tukee Ministerio de Ciencia e Innovacion FIS-PI080274.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (CAP) on yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuoleman miehillä länsimaissa. Androgeenireseptorin (AR) on todennäköisesti ratkaiseva tekijä eturauhassyövän etenemiseen. Eturauhassyöpä on alun perin riippuvainen androgeenien kasvua, ja androgeeniablaatio hoito aiheuttaa kasvaimen taantumisen [1], todennäköisesti kautta inaktivointi transkription AR-kohdegeenien. Kuitenkin, vastaus tähän hoito on usein ohimenevä ja monet miehet kehittää toistuvan androgeenista riippumaton eturauhassyöpä, joka on erittäin huono ennuste, koska ei ole tehokasta hoitoa on tällä hetkellä saatavilla (ks [2] tarkistettavaksi).

Äskettäin uuden luokan pieniä RNA: ita on kuvattu, joita kutsutaan MikroRNA, joiden on havaittu säädellä mRNA: n toiminto moduloimalla sekä mRNA: n stabiilisuuteen ja käännös [3], [4]. MiRNA ovat pieniä, ei-koodaus, yksijuosteinen RNA: t ~22 nukleotidin negatiivisesti säädellä geeniekspressiota post-transkriptionaalisella tasolla, pääasiassa emäspariutumisen 3′-transloimaton alue (UTR) ja kohde-mRNA: iden. Kasvava näyttö osoittaa, että miRNA ohjata perustoimintoja solujen toimintoja, jotka vaihtelevat leviämisen apoptoosiin [5], [6], [7]. Noin 50% miRNA geenit sijaitsevat syöpään liittyvän genomialuetta tai hauras sivustoja [8] ja jotkut niistä on osoitettu suoraan mukana syövän kehittymisen ja etenemisen [9]. MicroRNA ekspressioprofiileja myös luokitella kasvainten kehitys- linjaa ja erilaistumisen valtion [10]. Useita MikroRNA on osoitettu olevan onkogeenisia ominaisuuksia tai toimivat kuten tuumorisuppressorigeeneille [9], [11]. Tämä pätee miR-15A ja miR-16-1, joka ilmentyminen on menetetty edennyt eturauhassyöpä. Nämä kaksi miRNA osoittavat anti-kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden kohdistamalla sykliini D1 ja Wnt3A, jotka ovat välittäjiä syöpäsolujen lisääntymistä ja eloonjääminen [12]. Vähentynyt ilmentyminen muiden miRNA, kuten miR-23b, -100, -145, -221 ja -222 on myös dokumentoitu. Lisäksi ektooppinen ilmentyminen näiden miRNA johtaa eturauhasen syöpäsolujen inhibition [13]. Toisin kuin nämä anti-onkogeenisen miRNA, onkogeeninen miR-106b, tai miR-32 on tunnistettu eturauhasen syöpä. Nämä miRNA tuki solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen syöpäsolujen aallonpohjasta kohdistaminen p21 /WAF1 ja Bim proteiineja vastaavasti [14]. Mitä mielenkiintoisinta on se havainto, että jotkut miRNA, kuten miR-141 erittävät syöpäsoluja, ja niitä löytyy seerumista eturauhassyöpäpotilailla. Nämä tulokset vahvistetaan mittaus kasvain- miRNA seerumista tai plasmasta uutena diagnostinen työkalu ei-invasiivinen menetelmä, havaitseminen ihmisen syövän [15].

Olemme aiemmin osoittaneet, että yhdistelmähoidon avulla PPARy agonistien ja HDAC-inhibiittorit johtaa inhibitioon eturauhassyöpäsolujen kasvua hiirissä [16]. Global analyysi mikro-RNA ilmentymisen näissä käsitellyissä soluissa korreloi kasvoi miR-143 kasvu pidätys. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkittiin ekspressiota miR-143 eturauhassyövässä ja totesi, että ilmentymisen taso miR-143 oli merkittävästi vähentynyt. Lisäksi ilmaisu taso korreloi käänteisesti histopatologisia arvosana ihmisen eturauhassyöpää. Transfektio LNCaP ja C4-2-solujen in vitro prekursori miR-143, tai elektroporaatio miR-143 eturauhassyöpäksenografteissa hiirillä osoittivat, että miR-143 negatiivisesti vaikuttaa eturauhasen syöpäsolujen kasvua. Lopuksi, bioinformatiikka analyysit tunnistettu ERK5 mahdollisena kohteena geeni mir-143. ERK5 tiedetään edistävät solujen kasvua ja lisääntymistä vasteena kasvutekijöiden ja tyrosiinikinaasiaktivaation. Siksi jatkuva alentuneesta mir-143 syöpäsoluissa voidaan suoraan mukana karsinogeneesi aktivoimalla mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) cascade kautta ERK5. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että mir-143 voisi olla tuumorisuppressorina ja mahdollinen uusien diagnostisten tai prognostinen markkeri eturauhassyövän.

Tulokset

miR-143 ilmentyminen väheni eturauhassyövän etenemisen

ensimmäinen osoitus osallistumisen miR-143 eturauhassyövässä oli havaittu vähentynyttä ilmentymistä tämän miRNA LNCaP, ja C4-2 eturauhassyöpä, verrattuna normaaliin epiteelisolujen linjat, analysoituna kvantitatiivinen RT-PCR (Fig. 1A). Yhdenmukaisesti tämän havainnon, ekspressio miR-143 laski voimakkaasti ihmisen eturauhassyöpä, verrattuna normaaliin eturauhasen kudoksiin (kuva 1B). Lisäksi tasot transkriptio- miR-143 oli korreloi käänteisesti histopatologisia arvosana ihmisen eturauhassyövän saavuttaen määritysrajan korkealaatuista syöpiä (Gleason 7; Fig. 1 B). Täsmällisemmin analysoida ekspression miR-143,

in situ

hybridisaatio suoritettiin korkean tiheyden kudosmatriisien, joka sisältää 40 eturauhassyöpäkudoksille vs. 10 normaalin eturauhasen kudoksissa. miR-143 ilmaisua ei voitu havaita erityisesti eturauhassyövän soluissa korkean Gleason, kun taas miR-143 ilmentyi normaalissa eturauhasessa epiteelin, ja eturauhasen rauhaset (Fig. 1 C). Nämä tulokset viittaavat siihen, downregulation miR-143 ilmaisu voisi olla vaadittu tapahtuma syövän kehittymisessä tai etenemisessä.

, Quantitative reaaliaikainen PCR (QPCR) Mir-143, normalisoitu määrä RNU48 tavoite eturauhassyövän solulinjoissa. Suhteelliset tasot miRNA ilmentyminen mitattiin määrittämällä ACt-arvot ilmoitettu solulinjan verrattuna PNT2-soluissa. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tilastollista merkittävyyttä, täällä ja myöhemmissä kuvioissa, * 0,05; ** 0,01; *** 0001.

B

, QPCR Mir-143, normalisoitu määrä RNU48 tavoite eturauhasen kudosnäytteistä. Suhteelliset tasot miRNA ilmentyminen mitattiin määrittämällä ACt-arvot ilmoitettu gleason eturauhassyövän ja normaalissa eturauhasessa. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM yhdentoista eturauhasessa kullekin ryhmälle.

C

, edustaja

in situ

-hybridisaatio värjäytymisen miR-143 ihmisen ei-kasvain ja kasvain eturauhasessa. TMA esittelee 40 eturauhassyöpäkudoksille vs. 10 normaalin eturauhasen kudoksia. (TMA, suurennus, 400 x).

Vähentynyt proliferaatio ja lisääntynyt apoptoosi miR-143-ilmentävien syöpäsolujen

Vähentynyt ilmentyminen eturauhassyövässä ehdotti, että miR-143 voi olla antiproliferatiivisia vaikutuksia. Tämän hypoteesin testaamiseksi miR-143 oli ektooppisesti ilmaistu C4-2 ja LNCaP eturauhassyövän solulinjoissa. miR-143 ilmennettiin 5- ja 12-kertainen transfektoiduissa LNCaP, ja C4-2-soluissa, verrattuna kontrolliin, jotka oli transfektoitu joko ei-asiaa miRNA, tai anti-miR-143, joka on miR-143-estäjän (Fig. 2A). Mitään eroja solujen lukumäärät havaittiin, kun ei-asiaa miRNA tai anti-miR-143 käytettiin näissä soluissa. Jyrkästi, solujen määrä oli kääntäen korreloi ekspressiotasoja miR-143 sekä LNCaP, ja C4-2-solulinjat (Fig. 2B-C). Tämä viittasi siihen, että miR-143 säätelee negatiivisesti solujen lisääntymistä. Tämän mukaisesti BrdU kokeet osoittivat, että miRNA ilmentyminen johtaa DNA-synteesin inhibitio, ja siten kumoamisesta soluproliferaation näiden syöpäsolulinjoissa (kuvio 2D). Mielenkiintoista, nämä solunsalpaajavaikutus myös korreloivat lisääntynyt solukuolema miRNA ilmentävät eturauhassyövän solut, kuten arvioitiin sininen trypaani kokeita (Fig. 2E). Lisäksi solusyklin analyysi osoitti kasvua G

0-G

1 väestö, samanaikainen vähenemiseen S-vaihe miR-143 ilmentäviä soluja (kuvio. 2F). Mielenkiintoista on, että FACS-analyysi osoitti kasvua solukuoleman (Fig. 2G). Apoptoosi oli kuitenkin, ei ole muuttunut miR-143, verrattuna kontrollisoluihin, jota arvioidaan annexine sisällyttämällä kokeissa (tietoja ei ole esitetty) tai kaspaasi-3 tasolla 48 h transfektion jälkeen (kuvio. 2H). Tämä viittasi siihen, että havaittu solukuolema ei ole riippuvainen apoptoosiin, vaan nekroosi tapahtumia. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittivat, että miR-143 negatiivisesti ohjaa solujen lisääntymisen ja positiivisesti ohjaa solukuolemaa eturauhassyöpäsolujen.

, QPCR Mir-143 C4-2 soluissa (valkoiset palkit ) ja LNCaP-soluja (mustat palkit), normalisoitu RNU48 48 h kuluttua transfektion kanssa sekoitetun miR (kontrolli), miR-143 esiaste tai antimiR-143. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM viidelle itsenäisestä kokeesta.

B-C

, Cell kasvu LNCaP (B) tai C4-2 (C) solut 48 tuntia transfektion jälkeen salattu miR (musta vinoneliö), miR-143 esiaste (musta risti) tai antimiR-143 (valkoinen kolmio). Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

D

, kvantifiointi BrdU 48 h kuluttua transfektion C4-2 ja LNCaP-solujen puuttuessa miR-143 (top), läsnäollessa miR-143 (keskellä) tai antimiR-143 (pohja). Tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta.

E

, Blue trypaani sisällyttäminen C4-2 (valkoiset pylväät) ja LNCaP (mustat palkit) soluja 48 h transfektion jälkeen puuttuessa tai läsnä ollessa miR-143 tai läsnäollessa antimiR-143.

F

, prosentuaalinen solujen eri vaiheissa solusyklin LNCaP ja C4-2 solulinjoissa 36 tuntia transfektion kanssa ohjaus 5 (ei relevantti), miR-143 tai antimiR-143. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kahdessa riippumattomassa kokeessa. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± sem (n = 2-4).

G

, FACS-analyysi apoptoosin C4-2 (valkoiset pylväät) ja LNCaP (mustat palkit) soluja 48 h transfektion jälkeen puuttuessa tai läsnä ollessa miR-143 tai läsnäollessa antimiR-143.

H

, suhteellinen aktiivinen kaspaasi 3 pitoisuus C4-2 (valkoiset pylväät) ja LNCaP (mustat palkit) soluja 48 h transfektion jälkeen puuttuessa tai läsnä ollessa miR-143 tai läsnäollessa antimiR-143. Pitoisuus aktiivisen caspases 3 normalisoidaan maailmanlaajuisen proteiinipitoisuus.

ERK5 on miR-143 kohdegeenin

Halusimme tunnistaa miR-143 tavoitteita, joita voitaisiin sekaantunut eturauhassyöpä etenemisen. Bioinformatiikan analyysi osoitti, että 3 ’UTR ihmisen ERK-5-geenin satamiin oletetun konsensus sivuston miR-143 sitova (nukleotidit 2917-2932) (kuvio 3A). Kokeellisesti vahvistaa tämän tavoitteen, meidän on ensin analysoida ERK5 ilmentyminen eturauhassyöpäsolulinjoissa. ERK5 proteiini erittäin lisääntynyt LNCaP, ja C4-2 eturauhasen syöpäsolujen, verrattuna ei-syöpä PNT2 eturauhasen epiteelisolujen (Fig. 3B). Mielenkiintoista on, ERK5 ilmentyminen korreloi käänteisesti miR-143 ilmentymistä näissä solulinjoissa (Fig. 1A). Tarkempi analyysi ihmisen eturauhassyövän tiheäksi kudosmatriisien osoitti ERK5 ilmaisua, analysoituna IHC oli erittäin lisääntynyt syövän, verrattuna normaaliin eturauhasen kudoksen (kuvio 3C, alempi paneeli). Silmiinpistävän, ERK5 ilmentyminen korreloi käänteisesti miR-143 ilmaisun, kuten analysoitiin in situ -hybridisaatiolla, viittaa siihen, että ERK5 voisi olla

bona fide

miR-143 kohde (Fig. 3C, vertaa ylempää alemman paneelit). Todistaa tämän hypoteesin yliekspressio kokeet tehtiin. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-143 LNCaP, ja C4-2 eturauhassyövän solulinjoissa aiheutti huomattavan laskun ERK5 proteiinin ilmentymistä, verrattuna soluihin transfektoitu epäolennainen miRNA, tai antisense miR-143. (Fig. 3d). Vähentynyt ERK5 ilmentyminen korreloi vähentynyt proliferaatio näissä solulinjoissa, kun ilmentymisen miR-143 (Fig. 2). Lisäksi, vähentynyt ERK 5 ilmentymisen mir-143 käsitellyt solut korreloi myös vähentynyt ilmentyminen Jun, joka on tunnettu ERK5 kohde (Fig. 3E).

, Kaavioesitys ennustettu kohdepaikan miR-143 3 ’UTR: ERK5 mRNA. Seed-matching sekvenssi on merkitty. H.s ERK5 3’UTR on Homo Sapiens 3’UTRsequence.

B

, Western blot-analyysi endogeenisen ERK5 eturauhasessa normaaleissa ja syöpäsolulinjoissa. Suhteellinen ilmaisuja, normalisoitu GAPDH, mitattiin Image J ohjelmisto kuin kannen ilmoitettu tilanteesta vs. salattu miR. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. C, edustaja immunohistokemiallisella värjäyksellä ERK5, ja in situ hybridisaatio miR-143 peräkkäisissä leikkeissä tiheän kudoksen array.

D

, Western blot-analyysi endogeenisen ERK5 ilmentymisen C4-2 ja LNCaP-soluissa 48 h kuluttua ohimenevän transfektion ilmoitettu miR-143. Suhteellinen ilmentyminen, määrä mitataan Image J ohjelmisto normalisoidaan GAPDH, ja mitataan kannen ilmoitettu tilanteesta vs. salattu miR. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

E

, mittaus lusiferaasin aktiivisuuden transfektoitujen COS-solujen toimittaja lusiferaasigeeni pGL3 fuusioitu ERK-5 3 ’UTR mutatoitu tai kasvavien pitoisuuksien kanssa tai miR-143 (0, 25, 50, 100 nM). Arvot on normalisoitu beetagalaktosidaasi aktiivisuus ja ilmaistaan ​​kertaiseksi verrattuna ilman miR-143. Mustat palkit, ERK5 3’UTR, valkoiset pylväät, mutantti 3 ’UTR; tiedot ovat keskiarvoja ± SEM neljälle kokeita kolmena kappaleena.

F

, Western blot-analyysi endogeenisen c-Jun ilmentymisen LNCaP-soluissa 48 h kuluttua ohimenevän transfektion ilmoitettu miR-143. Tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta.

G

, QPCR of ERK5 vuonna C4-2 soluissa (valkoiset pylväät) ja LNCaP-soluja (mustat palkit), normalisoitu 18 s geenin 48 h kuluttua transfektion pSuper-shNeo (kontrolli) tai pSuper-shERK5. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

H

, kvantifiointi BrdU vuonna C4-2 soluissa (valkoiset pylväät) ja LNCaP-soluja (mustat palkit) 48 transfektion jälkeen pSuper-shNeo (kontrolli) tai pSuper-shERK5. Tiedot edustavat kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta.

Seuraavaksi edelleen osoittamaan hypoteesin, että havaitut vaikutukset proliferaation ovat seurausta ERK5 eston, hiljentäminen kokeet suoritettiin. shRNA ilmaus suunnattu ERK5 johti vähentynyt merkittävästi solujen lisääntymisen LNCaP ja C4-2, verrattuna soluihin transfektoitu epäolennainen shRNA (Fig. 3F). ERK5 ilmentymisen taso laski noin 90% molemmissa solulinjoissa, jotka on transfektoitu erityisen shERK5 (Fig. 3G).

Lopuksi, edelleen todistaa, että ERK5 on miR-143 kohdegeenin lyhytaikaista transfektiota kokeet suoritettiin käyttäen 3’UTR alueella ERK5 sisältävät otaksutun miR-143 vastaavan sivuston, mutatoitu tai ei, alavirtaan lusiferaasin avoin lukukehys. Lusiferaasiaktiivisuus 3 ’UTR ERK-Luc-konstrukti väheni läsnä miR-143, kun taas lusiferaasiaktiivisuus mutatoidun -Luc konstruktin ei ollut vaikutusta, mikä viittaa siihen, että miR-143 moduloivat ERK5 ilmentymisen sitoutumalla ERK5-3’UTR ( kuvio 3F).

pelastaminen miR-143 ilmaisu vähenee syövän etenemisen hiirillä

vaikutuksen tutkimiseksi miR-143 syöpäkasvainten kasvuun, joilta puuttuu kateenkorva nude-hiiriin ihonalaisesti oksastettu eturauhassyöpä LNCaP ja C4-2-soluja. Kaksi viikkoa ymppäyksen jälkeen, kun solut, kun kasvaimet saavuttivat keskimääräisen tilavuuden 392 mm

3, miR-143 pelastus kokeet suoritettiin. Kasvaimensisäistä injektio miR-143, jonka jälkeen elektroporaatiolla kuvatulla aineisto ja menetelmät jaksossa johtivat kumoamisen tai vähennys kasvaimen kasvua hiirissä oksastettua LNCaP ja C4-2-soluissa (kuvio. 4A ja 4B), kun taas elektroporaatio valvonnan non -relevant miR ei ollut mitään vaikutusta kasvaimen kasvuun (kuvio. 4A ja 4B). Huolimatta odotetaan miR-143 nopea hajoaminen in vivo ilmentyminen miR-143 pysyivät merkittävästi lisääntynyt miR-143 elektroporoitiin kasvaimia (Fig. 4C). Yhdenmukainen havaittu väheneminen kasvaimen kasvua, leviämisen suhde LNCaP ja C4-2 kasvaimia väheni myös, kun kvantitoitiin PCNA värjäys kasvaimissa elektroporatoiduissa miR-143 (Fig. 4D). Lopuksi analyysi ERK5 proteiinin tason immunohistokemiallisesti osoitti, että ERK5 ilmentyminen väheni läsnäollessa miR-143 LNCaP ja C4-2 kasvaimet (Fig. 4E). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että miR-143 toimii tuumorisuppressorina eturauhassyöpäsoluissa.

A-B

, kasvaimen kasvu LNCaP (A) tai C4-2 soluissa (B) ihon alle ja elektroporaatio kolmesti epäolennainen miR (ohjaus, valkoinen neliö) tai miR-143 esiaste (musta rhombus). Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM seitsemän hiirillä analysoitiin kohden kussakin ryhmässä.

C

, QPCR analyysi miR-143 ilmentymisen C4-2 (valkoiset pylväät) ja LNCaP ksenograftit (mustat palkit), normalisoitu RNU48. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM seitsemän hiirillä analysoitiin kohden kussakin ryhmässä.

D

, analyysi soluproliferaation PCNA-värjäyksellä ksenografti osiin Kateenkorvattomien Nude-hiiret injektoitiin subkutaanisesti C4-2 (valkoiset pylväät) tai LNCaP (mustat pylväät) soluissa, sen jälkeen kolme elektroporaatiot salattu miR tai miR-143 esiaste . Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM seitsemän hiirillä analysoitiin kohden kussakin ryhmässä.

E

, edustaja immunohistologinen värjäys ERK5 vuonna C4-2 ja LNCaP kasvaimia. Nude-hiiriin injektoitiin subkutaanisesti C4-2 (valkoiset pylväät) tai LNCaP (mustat palkit) soluja kolmen elektroporaatiot salattu miR tai miR-143 esiaste. Tiedot edustavat seitsemän hiirillä analysoitiin kohden kussakin ryhmässä. (Suurennus, 400 x).

Keskustelu

Olemme analysoineet ilmaisun ja vaikutukset miR-143 eturauhassyövän kehitykseen ja etenemiseen. Jotkut tutkimukset ovat aiemmin osoittaneet, että miR-143 voisi olla rooli kasvainten synnyssä, koska sen ilmentyminen väheni useissa syövissä [19]. Raportoimme kaksi suurta havainnoista tässä tutkimuksessa. Ensinnäkin, me osoitamme, että miR-143 ilmentyminen selvästi vaimentua aikana eturauhassyövän etenemistä. Seulonta strategiat ovat johtaneet havaitseminen eturauhassyövän asteittain aikaisemmissa vaiheissa ja alemmilla tasoilla prognoosi- riski [20]. Monissa miehet, eturauhasen syöpä on pitkä luonnollinen historia, kun taas toiset edetä etäpesäkkeitä ja kuolevat heidän sairautensa (tarkistetaan [21]). Huolimatta hyväksytty arvo mitataan eturauhasen-erityisvaatimusten antigeenin (PSA) tasot seuloa eturauhassyövän diagnosointiin, sen arvo ennustetyövälineenä merkki on vielä Kiistanalaista. Kasvaimeen liittyvät muuttujat, kuten kliininen lavastus käyttäen TNM järjestelmää, Gleason koepala pisteet ja esikäsittely seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA) taso tällä hetkellä käytetään luokittelemaan potilaiden ollessa matala-, keski- tai korkean riskin kehittymisen aggressiivinen syöpä [22] – [24]. Mikään yksittäinen analyysi pystyy kuitenkin riittävästi tunnistamaan kaikki potilaat, joilla paikallinen eturauhassyöpä, joilla on suuri todennäköisyys etenemisen jälkeen hoidon. Meidän havainto, että miR-143 on rajoilla havaitseminen aggressiivinen eturauhassyöpä voisi auttaa tunnistamaan näille potilaille. Vastaa meidän havainnot ilmentymisen miR-143 on havaittu pienentyneen myös muissa syövissä, kuten paksusuolen syöpä [25], B-solujen maligniteetteja [26], eturauhassyöpä [27], aivolisäkekasvaimet [28], tai kohdunkaulan syöpä [29]. Tämä alas-säätely miR-143 eturauhassyöpänäytteissä on ehdotettu heijastaa alemman erilaistumisen vaiheessa kasvainkudoksen verrattuna normaaliin kudokseen [30]. Lisäksi prospektiiviset tutkimukset vahvistaa miR-143 ennustearvona kohteena eturauhassyövän etenemisen perusteltua.

Toinen tärkeä havainto Tutkimuksemme on havainto, että pelastamiseen miR-143 ilmentyminen eturauhassyövässä soluissa johtaa kumoamiseen syöpäsolun kasvua, sekä in vitro ja hiirillä. Olemme osoittaneet, että ensimmäistä kertaa, että miR-143 on kasvaimia estävä hiirissä. Muut tutkimukset ovat viitanneet tuumorisuppressorina roolin miR-143 paksusuolen ja muiden syöpäsolujen [26], erityisesti estämällä KRAS, ja ERK5 proteiinit [26], [31]. On osoitettu, että ERK5 voi olla suora tai epäsuora kohteena miR-143 [32]. Näytämme nyt ja riittävästi näyttöä siitä, että ERK5 on välittömänä kohteena miR-143 eturauhassyövässä. Tätä tukee läsnäolo miR-143 sitoutumiskohta 3’UTR ERK5 mRNA. Lisäksi miR-143 inhiboi ilmentymistä reportteri-proteiinin, kun tämä sitoutumiskohta korvaa 3’UTR lusiferaasin mRNA. Lopuksi, ilmentyminen ERK5 proteiinin korreloi käänteisesti miR-143 ilmentymistä ihmisen eturauhasen syöpiä. ERK5 on osallisena solujen jakautumisen, ja on viimeksi tunnistettu MAPKK [33]. Toiminta useiden transkriptiotekijöiden, useimmiten osallisina syövän on osoitettu säänneltävä ERK5, kuten MEF2, c-Fos ja Fra1, Sap-1, c-Myc ja NF-kappaB [34] – [37]. Yhdenmukainen tuloksemme ERK5 yliekspressio liittyy metastasoituneen eturauhassyövän ja indusoi, liikkuvuuteen ja invaasio eturauhassyöpäsoluissa [38].

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että miR-143 on tuumorisuppressorina miRNA eturauhassyövässä , joka ohjaa solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen moduloimalla, ainakin osittain ERK5 ilme. Pelastaminen miRNA ilmaisun eturauhastuumoreissa olisi siis pidettävä uutena kohteena eturauhassyövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki ihmisen näytteitä hankittiin. Meidän tarjoajat BioChain (Hayward, CA), Cytomix (Lexington, MA) ole tarvittavia oikeuksia.

Kliiniset näytteet

Kolmekymmentäseitsemän ei-pariksi (13 normaali ja 24 kasvaimen RNA: t eri potilaiden ) ja yhden parin eturauhassyövän ja sen ympärillä vaikuta kudoksen RNA: t saatiin BioChain (Hayward, CA), Cytomix (Lexington, MA).

Eläimet., ja in vivo elektroporaatiota

Male kateenkorvattomiin nude Hiiret (Foxn1 nu /nu) (Harlan, Grannat, Ranska) käytettiin iässä 7 viikkoa. Kaikki menettelyt suoritettiin noudattaen eurooppalaisen yleissopimuksen selkärankaisten eläinten suojelua käytetään tutkimukseen ja hyväksynyt Comite d’Ethique du IRCM de Montpellier, joka on paikallinen eettinen komitea. -ksenografteja Perustettu ihonalaisesti injektoimalla 2 x 10

6 LNCaP tai C4-2 solua 100 ul: Matrigel ratkaisu. Kasvaimen tilavuus mittaukset tehtiin joka toinen päivä juuri ennen elektroporaatiota. Tällä eutanasia, kasvaimet irrotettiin ja joko jäädytettynä RNA uuttamalla tai kiinnitetty 4% formaliiniin immunohistologisilla analyysiä. Sisäiseen ksenografti Sähkösiirtomenetelmiä, hiiret nukutettiin intraperitoneaalisena injektiona ketamiini (30 mg /kg) ja ksylatsiinia (10 mg /kg) liuos. 500pmole Mir-143 esiaste tai salattu miR injektoitiin 100 ui PBS: ää ksenograftin. Ennen injektioita, ultraäänikuvasignaalin geeliä levitettiin, transkutaaniset sähköinen pulssia käyttäen kahta mittatilaustyönä ruostumaton teräs elektrodit sijoittaa kummalle puolelle ksenografti kuten aiemmin on kuvattu (Takei et ai., 2008). Lyhyesti, 8 kanttia sähköimpulsseja 50 ms pituus, ja antojännite 100 V /cm, jonka kehittää electropulsator ECM-830 (BTX, San Diego, CA, USA).

Soluviljely ja transfektiot

PNT2 eturauhasen epiteelisolujen linja saatiin ECACC (Sigma-Aldrich, Lyon, Ranska). Androgeenin herkkä LNCaP ja androgeenin riippumaton C4-2 ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa ostettiin ViroMed Laboratories (Minnetonka, MN). Nämä solulinjat säilytettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [16]. Transfektiot kanssa miR-143 esiaste, anti-miR 143 (HSA-mir-143, Ambion) suoritettiin pitoisuutena 50 nM Dharmafect 2 (Dharmacon, Lafayette, CO). Ohjaus on epäolennainen miR esiaste, jota kypsytetään vakaa muodossa RNAi koneita. Anti-miR-143 kykenee estämään miR-143 läsnä soluissa hybridisaatiolla. Jotta pudotus ERK5 proteiinin tason transfektiot suoritettiin 2 ug: lla plasmidi pSuper-shERK5 tai negatiivinen kontrolli, pSuper-shNeo kanssa JetPEI transfektanttia. 48 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin BrdU ja kiinnitettiin sitten 4% paraformaldehydillä lisäanalyysiä.

RNA: n eristämistä, käänteistranskriptio ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Kokonais-RNA ja QPCR kokeet suoritettiin kuvatulla [17] kantavassa oligonukleotidisekvenssit käytetään erilaisia ​​kokeiluja tässä käsikirjoitus on saatavilla pyynnöstä.

Quantitative Real-Time PCR kypsälle microRNA

cDNA käänteistranskriptio 10 ng yhteensä RNA-näytteet käyttämällä erityisiä alukkeita Taq Man MicroRNA määritykset ja reagensseja Taq Man MicroRNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). Saatu cDNA monistettiin PCR: llä käyttämällä Taq-Man MicroRNA Pitoisuus alukkeita Taq Man Universal PCR Master Mix, ja analysoitiin 7300 ABI PRISM Sequence Detector mukainen järjestelmä valmistajan ohjeiden (Applied Biosystems). Käyttämällä vertailevan CT menetelmä, käytimme endogeeninen kontrolli (RNU48) normalisoimaan ekspressiotasoja miRNA. Määritys nimet miR-143 ja U48 olivat seuraavat: HSA-mir-143 Mir-143 ja RNU48 varten U48 RNA.

MicroRNA tavoite ennustus

Käytimme miRBase Targets (http: //microrna.sanger.ac.uk/targets/v5/) ja TargetScan (https://www.targetscan.org/) varten microRNA kohde ennustamiseen.

miR Reporter Lusiferaasimäärityksiä

3’UTR tai mutantti-3’UTR ERK5 kloonattiin Xbal-pGL3-Control Vector, välittömästi alavirtaan lopetuskodonista lusiferaasin koodaavan sekvenssin. COS-solut ko-transfektoitiin 0,5 ug: pGL3-pohjaisia ​​vektoreita ja eri pitoisuuksia miR-143 esiaste, kuten on osoitettu, käyttäen Lipofectamine 2000: Lusiferaasiaktiivisuus mittaukset normalisoitiin β-galaktosidaasin aktiivisuus korjaamaan eroja transfektion tehokkuutta.

Immunoblotit

Protein uuttamalla, ja western blot-analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [18]. Suodattimia inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa kaniinin anti-ERK5-vasta-ainetta (Cell Signalling Technology, Danvers, MA) ja sitten 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, jossa on anti-kani-peroksidaasi-konjugaatin sekundäärinen vasta-aine. Kompleksi visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi (Interchim, Montluçon, Ranska).

immunohistokemia of ERK5

Tissue Arrays (TMA) AccuMax Array sisälsi 7 normaalia ja 39 adenokarsinooma paikkoja eri potilaista saatiin Alphelys (Plaisir, Ranska). Immunohistokemiallista värjäystä, TMA depletoitiin parafiiniin ksyleenillä, vedettömät ja keitetty (95 ° C, 30 min) 0,01 M natriumsitraattipuskuriin. Sen jälkeen, kun esto Fc-reseptorien PBS: llä, joka sisälsi 5% vuohen seerumia, leikkeitä inkuboitiin anti-ERK5 kanin polyklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) yli yön 4 ° C: ssa. Immunovärjäys paljastettiin käyttäen peroksidaasi-konjugoitua anti-kani tai anti-hiiri-vasta-aineella (Jackson Immuno- Research, West Grove, Pennsylvania) ja diaminobentsidiini (DAKO, Carpinteria, CA) substraattina. Leikkeitä vastavärjättiin hematoksyliinillä (Vector, Burlingame, CA). Asennusratkaisu (Dako) ja peitelaseihin lisättiin kohdat.

BrdU värjäystä

nopeampi lisääntyminen C4-2, LNCaP ja PNT2 soluja inkuboitiin 6 h BrdU. Soluja viljellään peitinlasit kiinnitettiin 4% formaldehydiä PBS: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja sitten pestiin PBS: ssä ja läpäiseviksi 10 minuutin ajan 0,25% Triton X-100 PBS: ssä. Läpäiseväksi tekemisen jälkeen, DNA: ta denaturoitiin 2 N HCl: ssa 10 minuuttia, ja soluja inkuboitiin estopuskurilla (PBS-1% BSA: ta). BrdU havaittiin sitten anti-BrdU monoklonaalisen vasta-aineen (Dako, Carpinteria, CA), ja visualisoitiin FITC-anti-hiiri-vasta-aineella (Jackson Immuno- Research, West Grove, PA).

In situ -hybridisaatio

LNA-modifioitu antureista (Exiqon) oli 3′-päät leimataan digoksigeniiniperoksidaasia ddUTP kanssa terminaalitransferaasientsyymiä käyttäen Dig-3′-päähän -leimauskittiä (Roche Diagnostics, Ranska). 5 um: n ohuita leikkeitä köyhdytettyä parafiinia ksyleenillä ja rehydratoitiin laimennossarjaa etanolilla (2 x 100%, 75%, 50%, 25%). Objektilasit pestiin PBS: llä, digestoitiin proteinaasi K: lla (10 ug /ml) 5 minuutin ajan 37 ° C: ssa, huuhdottiin 0,2% glysiini /PBS: llä, sitten PBS: ssä, ja jälkikiinnitettiin 10% formaldehydillä PBS: ssä (10 min). Sitten lasit huuhdottiin PBS: llä (2 X). Leikkeitä esihybridisoidaan sitten 54 ° C: ssa 2 tunnin ajan hybridisaatiopuskuriin (50% formamidia, 5 x SSC, 0,1% Tween-20, pH säädettiin arvoon 6,0 9,2 mM sitruunahappo, 50 ug /ml hepariinia, 500 ug /ml hiivan tRNA: ta) . Seuraavaksi kalvot hybridisoitiin inkubointipulloissa kammioissa yön yli 54 ° C: ssa uunissa, jossa jatkuvassa liikkeessä, käyttäen 2 pl koetinta -200 ui esilämmitettyä hybridisaatiopuskuria. Leikkeet huuhdeltiin kahdesti 2 x SSC, ja sen jälkeen 3 pesua 30 minuutin ajan 54 ° C: ssa 50% formamidi /2 x SSC. Sitten leikkeitä huuhdeltiin 5 kertaa PBS /0,1% Tween-20 (PBST), ja blokattiin 1 tunnin ajan blokkausliuoksessa (2%: lla lampaan seerumia, 2 mg /ml BSA: ta PBST).