Krooninen sairaus

tiivistelmä

Zero painovoima aiheuttaa useita muutoksia aineenvaihdunnan ja toiminnalliset näkökohdat ihmiskehon ja kokeet avaruuslentojen aikana ovat osoittaneet muutoksia syövän kasvua ja etenemistä. Tämä tutkimus raportoi genomin laaja ilmaus profilointi on peräsuolen syövän solulinja-DLD-1, ja lymfoblasti leukemiasolulinjan-MOLT-4, simuloiduissa mikropainovoiman vaivaa ymmärtää keskeiset prosessit ja solujen toimintoja, jotka väärin säädellystä keskuudessa solulinjoja . Altered solujen morfologia, vähentää solujen elävyyden ja poikkeava solukierron profiilin verrattuna niiden staattinen valvonnan havaittiin molemmissa solulinjoissa alla mikrogravitaatiota. Prosessi solusyklin DLD-1-soluissa oli merkittävästi vaikuttanut pienemmällä elinkelpoisuutta vähensi pesäkkeenmuodostuskyvyn, apoptoottinen väestö ja häiriöstä solusyklin geenien, onkogeenien ja syövän etenemiseen ja ennustetekijöitä markkereita. DNA-siru analyysi paljasti 1801 (voimistunut) ja 2542 (vaimentua) geenit ( 2 kertaisesti) DLD-1-viljelmissä mikrogravitaatiota taas MOLT-4 kulttuureissa eri tavalla ilmaistuna 349 (voimistunut) ja 444 (vaimentua) geenit ( 2-kertainen) alle mikropainovoimassa. Tappio soluproliferaatioon kapasiteettia vahvistivat kanssa downregulation solusyklin prosessia osoituksena toiminnallinen ryhmittely on DNA-siru dataa geeni ontologian termejä. Genomin laajuinen lauseke profiili osoitti myös merkittävää häiriöstä jälkeisen transkription geenien koneet ja useita microRNA isännän geenejä, jotka ovat mahdollisia tuumorisuppressoreilla ja esikasvaintekijät lukien

MIR22HG

,

MIR17HG

ja

MIR21HG

.

MIR22HG

, kasvain-vaimennin geeni oli yksi korkeimmista upregulated geenien microarray data osoittaa 4,4 log kertainen säätelyä alla mikrogravitaatiota. Reaaliaikainen PCR vahvisti dysregulation vastaanottavassa geenissä osoittamalla 4,18 log kertainen ylössäätely MIR-22 microRNA. Microarray tiedot osoittivat myös häiriöstä kohdistu suoraa miR-22,

SP1

,

CDK6

ja

CCNA2

.

Citation: Vidyasekar P, Shyamsunder P Arun R, Santhakumar R, Kapadia NK, Kumar R, et ai. (2015) Genome Laaja Expression profilointi Cancer Cell Lines viljeltiin Microgravity paljastaa merkittäviä häiriöstä Cell Cycle ja MicroRNA Gene Networks. PLoS ONE 10 (8): e0135958. doi: 10,1371 /journal.pone.0135958

Editor: Zheng Li, Pekingin unionin Medical College Hospital, Kiina

vastaanotettu: 26 helmikuu 2015; Hyväksytty: 28 heinäkuu 2015; Julkaistu: 21 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Vidyasekar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Defense Research Development Organization (DLS /81/48222 /LSRB-189 /ID /2009 ja DLS /81/48222 /LSRB- 273 /SH DD /2013) RSV. url: https://www.drdo.gov.in/drdo/boards/lsrb/fplsrb.htm

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Microgravity avaruuteen lennot on osoitettu vaikuttavan fysiologiaa solun huomattavasti [1]. Normaali painovoiman (1 g) vaikuttaa 2-ulotteinen kulttuuri kerrostamalla solujen pinnalla kudosviljelymaljalla (TCP), jossa ankkurointi riippuvaiset solut kiinnittyvät ja lisääntyä yksikerroksinen hyvin rajallinen solu-vuorovaikutuksiin. Painottomuus ja alentunut kiihtyvyys (alle 1 g) avaruudessa, poistaa painovoiman vaikutuksesta, jolloin soluviljelmissä avaruudessa on vapaa liikkuminen viljelyalustan, leikkaus- vapaa ympäristö ja, koska solut eivät sido mitkään suuntaava voima, rajoittamaton liikkuvuus solujen keskipitkän. Tällaisissa olosuhteissa soluja on taipumus sulautua ja muodostaa aggregaatteja luoda kolmiulotteinen (3D) ympäristöissä, joissa ne ovat vuorovaikutuksessa useita lentokoneita [2]. Vaikutus vähennetään painovoiman ei rajoitu muutoksia viljelyolosuhteet kuin ainutlaatuista ympäristöä voidaan tuottaa muutoksia perustavanlaatuinen fysiologian solun. Vaikka vaikutusmekanismi miten painovoiman tai sen puute, vaikuttaa molekyyli- ja solutason toimintoihin on edelleen epäselvä, on todettu, että mikrogravitaatiota tai painottomassa vaikuttaa elintoimintoihin solun ja tärkeintä, mikrogravitaatiota on osoitettu muuttavan syövän kasvua ja etenemiseen [3-5]. Kuitenkin eri syöpien reagoivat eri mikrogravitaatiota kadottamalla tai parantamalla solun prosesseja ja toimintoja. Tässä tutkimuksessa viljeltiin solulinjat tyypillinen kiinteiden ja hematologiset kasvaimet-DLD-1, MOLT-4, ja HL-60 pyörivän soluviljelmässä järjestelmän (RCC), joka simuloitu mikrogravitaatiota. RCC on mekaaninen järjestelmä, joka simuloi pienempi painovoima maan päällä peruuttamalla suuntaava vektori jatkuvalla kierto korkean Aspect Ratio Vessel (HARV). Tämä ylläpitää solujen jatkuvassa vapaassa pudotuksessa ja leikkaus- vapaa ympäristö mahdollistaa solujen hajoamaan ja muodostavat 3D aggregaatteja [2]. Nämä aggregaatit ylläpidetään vapaassa pudotuksessa ja kokemus vähentynyttä painovoiman jäljellä viljelmän aikana. Oletimme, että fysiologisia muutoksia solun toimintoja, kuten solujen lisääntymisen ja elinkelpoisuus voitaisiin Havaintoa muutoksiin perusprosesseihin solun kuten geenien ilmentyminen. Suhteuttaa fysiologiset muutokset kuten muuttuneessa solukierron profiili säätelyhäiriötä geenien ilmentymisen, reaaliaikainen PCR-analyysi solusyklin geenejä, onkogeenien ja syövän kehittymisen ja etenemisen markkereita toteutettiin. Genomin laaja ilmaisun profilointi DNA-siru näistä solulinjoista viljeltynä mikropainovoimassa paljasti dysregulaatio useita reittejä syövän ja tärkeintä, Havaintoa havaittujen fysiologisia muutoksia solun. Olemme käyttäneet myös geeniekspressioprofiili tutkia säätelyhäiriötä reitteihin keskeinen syövän kuten Notch merkinantolaitteet ja säätelyhäiriö jälkeisessä transkription geenien koneita. Geeniekspression profiilin paljasti myös häiriöstä mikroRNA isäntägeenejä mikropainovoimassa lukien merkittävät tuumorisuppressori, miR-22 DLD-1.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

DLD-1 on epiteelin, joka tarttuu solulinja, joka on johdettu paksusuolen ja peräsuolen adenokarsinooma (Dukes C-tyypin). MOLT-4 on T-lymfoblasti, suspension solulinja, joka on peräisin akuutin lymfaattisen leukemian, kun HL-60-solulinja on promyeloblast johdettu akuutti promyelosyyttinen leukemia. Solulinjat hankittiin National Center for Cell Science, Pune, Intia ja ylläpidettiin DMEM-F12 (DLD-1) tai RPMI1640 (MOLT-4, HL-60), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Life Technologies, USA) 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO 2-inkubaattorissa 25 mm:

3 kudosviljelymaljoille (TCP) ja 10 ml:

3 suuri sivusuhde alukset (HARV) sisällä pyörivä soluviljelmässä (RCC). Solulinjat tuotiin 10ml HARV läpi 5 ml ruiskuja ja pyörimisnopeus 27 kierrosta minuutissa (rpm) oli standardoitu perustuu yhdistäminen DLD-1-solut ladattiin 0,5 x 10

6 solua 24 tunnista 48 tuntiin . Soluja kasvatettiin HARV enintään 72 tuntia lisäainetta ruiskutetaan HARV jokaisen 16-24 tunnin vaahtoamisen estämiseksi tai ilmakuplia. Sisältö HARV siirrettiin 60mm TCP ilman tapahtuu erillään solun aggregaattien tavanomaisesta micrographic tarkkailu ja muut solupohjaiset määritykset käyttämällä 10 ml pipetit. 0,25% trypsiini-EDTA: ta käytettiin dissosiaatio soluaggregaatteja ja yksikerrosviljelmissä, kun tarvitaan.

Yhteensä RNA: n uutto ja cDNA: n muuntaminen

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen RNeasy-kittiä (Qiagen, Saksa) . 2 x 10

6 soluja sentrifugoitiin ja pestiin kahdesti PBS: llä. RNA eristettiin näistä soluista kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 1,5 ug kokonais-RNA: ta muutettiin cDNA: ksi käyttäen MMLV-RT (Thermo tieteellinen, USA) ja oligo-dT-alukkeita (NEB, USA). miRNA muuntaminen cDNA tehtiin käyttämällä varsi-silmukka-käänteistranskriptaasi (RT) alukkeet ilman ditiotreitolia (DTT) ja RNA: n denaturointivaihe säilyttää eheys varsi-silmukka-aluketta.

Microarray-analyysi

Microarray-analyysi suoritettiin RNA näytteitä DLD-1 ja MOLT-4-solulinjoja kasvatettiin mikrogravitaatiota ja staattisissa olosuhteissa rinnakkaista. Expression tiedot kunkin näyte saatiin annetun Affymetrix GeneChip- Human Primeview Array. Hybridisaatio suoritettiin kestoltaan 16 tuntia 60 rpm 48 ° C: ssa ja skannataan sen GeneChip- mikrosirulla Scanner 3000 7G. Raakadataa uutettiin skannauksen jälkeen dioja ja raaka aineistoja analysoitiin GeneSpring GX 12.6 ohjelmisto seuraa ero geenien ilmentyminen (DE), taita muutos klusterianalyysillä.

Gene ontologia analyysi

DE geenit tutkittiin niiden ylitarjonta eri Gene ontologian (GO) ehdot sekä reittejä käyttäen mikrosiruanalyysi ohjelmisto DAVID (Database varten Annotation, visualisointi ja Integrated Discovery) [6]. Kaksi työkalut DAVID ohjelmassa käytettiin, geeni toiminnallinen luokitus työkalu ja toiminnallinen merkintä klusterointi työkalu. David toiminnallinen käsinkirjoitustyökalun käytettiin korostamaan asiaan GO ehdot liittyvät toimitti geenin lista ryhmittämällä samankaltaisia, tarpeeton, ja heterogeeninen merkintä sisältö samasta tai eri resursseja huomautus ryhmiin perustuu oletukseen, että vastaavia merkintöjä olisi oltava vastaavat geeniä jäsentä. Gene rikastaminen perustuu joukko esitti geenejä, jotka ovat erittäin liittyy tiettyjä ehtoja, joka on tilastollisesti mitataan Fisherin Exact sisään DAVID järjestelmässä. Tässä tutkimuksessa käytimme ryhmä rikastamiseen pisteet, joka on geometrinen keskiarvo kaikkien p-arvoja yksittäisten jäsenten vastaavalla merkintä klusteri. Korkeampi pistemäärä osoittaa erittäin rikastettua klusteri, joka puolestaan ​​osoittaa biologista merkitystä klusterin luettelossa.

Reaaliaikainen PCR-monistuksen

Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttämällä SYBR vihreä Reaaliaikainen PCR pakki Qiagen Eppendorf Mastercycler, ep realplex (Eppendorf, Saksa). Suhteellinen mRNA: n ekspressio määritettiin normalisoinnin ilmentymisen siivous geenin, beeta-aktiini ja U6 varten microRNA geenin ilmentymisen. Primer lista annetaan S1 taulukossa.

Western blotting

Solut lyysattiin radioimmuunimäärityk- Sateen Assay (RIPA) puskuri, sekoitetaan Laemmlin näytepuskuria (1 x) ja keitetty. Proteiinit tehtiin 12% SDS-PAGE: lla ja elektroblotattiin päälle BioRad, 0,22 uM nitroselluloosakalvolle (BioRad Laboratories, USA). Kalvo estettiin Tris-puskuroidulla suolaliuoksella plus 0,2% Tween 20 (TBS-T), joka sisälsi 3% BSA (Sigma Aldrich, USA) ja sen jälkeen primäärisen vasta-aineen inkubointi yön yli ja pesu TBS-T-puskuria. Sekundaarinen vasta-aine (anti-hiiri-HRP-konjugaatti, 1: 10000 Sigma Aldrich USA) laimennettuna blokkauspuskuriin inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja pestiin jälleen TBS-T: llä. Vasta-aine-reaktiivisia proteiinien havaittiin tehostamalla kemiluminesenssin, Amersham ECL Plus Western blotting tunnistus reagenssit (GE terveydenhuolto, UK). Vasta-aine yksityiskohdat annetaan S1 taulukossa.

Virtaussytometria solusyklin analyysi

Solut kerättiin ja pestiin PBS: ssä ennen kiinnittäminen kylmään 70% etanolia, joka lisättiin tipoittain pelletti taas vorteksoimalla. Solut kiinnitettiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut pestiin kaksi kertaa PBS: ssä ja sentrifugoitiin 250 g sentrifugissa. Soluja inkuboitiin 50 ui 100 ug /ml kannan RNaasia ja 200 ui propidiumjodidia (50 ug /ml kantaliuosta). BD FACSCalibur (USA) virtaussytometrillä käytettiin analysoimaan solupopulaatio solusyklin muutoksia.

CFU- määritys

Soluja viljeltiin metyyliselluloosa 10X lopullisen pitoisuuden (0,3 ml solujen 3 ml: aan metyyliselluloosaa). Putkia vorteksoitiin varmistaa soluihin ja komponentit sekoitettiin perusteellisesti. Metyyliselluloosa annosteltiin käyttämällä 3CC ruiskua ja tasaisesti vuokaan kevyesti pyörittäen. Viljelmiä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO2 ilmassa, ja ≥95%: n kosteudessa. Pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla (0,5 mg /ml 1% metanolia) 20 minuutin ajan ja ilmakuivattiin pesun jälkeen tislatussa vedessä. Stained pesäkkeet visualisoitiin Nikon Eclipse Ti faasikontrastimikroskooppia.

Tilastollinen

Kaikki kokeet suoritettiin rinnakkaisnäytteiden ja tulokset ilmaistiin keskiarvo ± S.D. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen opiskelija T-testiä kanssa Prism 5 ohjelmaa (GraphPad ohjelmisto, USA).

Tulokset ja keskustelu

Culture solujen mikropainovoimassa

saatavuus pinta kiinnittyä soluihin TCP on ärsyke kasvun kiinnittyneitä soluja kuten DLD-1 ja näin ollen staattinen kulttuurien TCP olivat konfluentteja (kuvio 1A). Hidas kierrosta minuutissa (rpm) on HARV (16 rpm, kuvio 1 B) ei salli solujen hajoamaan mutta solut voisivat muodostaa aggregaatteja 27 rpm (kuvio 1 C). Värjäämällä AO /EB, ei havaittu solukuolemaa staattisessa TCP kulttuureissa (kuvio 1 D), mutta paljasti solukuolemaa mikropainovoimassa kulttuureissa DLD1 16 rpm (kuvio 1 E). Solujen elinkelpoisuus paranee, kun solut yhteen 27 rpm (kuvio 1 F). Kun nämä solu-aggregaatit entsymaattisesti hajotettiin ja viljeltiin TCP 48 tunnin jälkeen mikropainovoimassa solut kesti 48 tuntia kiinni (kuvio 1G, päivä 2), kun taas solut staattinen viljelmät noudatetaan 24 tunnin kuluessa (kuvio 1G, päivä 1) ja valmistettu konfluentteja viljelmät päivänä 4. Microgravity on osoitettu vaikuttavan useisiin solun toimintoihin [7] ja ilmentymistä tai toimintaa solun adheesiomolekyylien voisi vaikuttaa [8] vähentämällä DLD-1-soluja, jotka voivat noudattaa TCP. Kun tällainen soluaggregaatteja maljattiin TCP ilman entsymaattiseen dissosiaa-, morfologia DLD-1-solut oli muuttunut (kuvio 1 H ja 1 I). Kristalliviolettia solujen värjäys kasvatettiin staattisessa yksikerrosviljelmässä osoittaa tyypillistä morfologiaa DLD-1-soluissa (kuvio 1 H), kun taas solun aggregaattien olettaa kasvun malli, joka muistuttaa explant kulttuurin ja reuna-solut sisälsivät suuren sytoplasmassa ja tumassa (kuvio 1 i). Laajentunut solu ehkä johtuu solun tukirangan muutoksiin kasvun aikana mikropainovoimassa [9] tai soluja, jotka ovat menettäneet kontrollin solusyklin, voivat kerääntyä pre antimitoottisten proteiini sytoplasmassa polyploidiaan tumassa [9] kasvaa kokoa. Pesäke muodostava määritys (CFA) on DLD-1 viljelmät mikropainovoimassa siirtynyt staattiseen TCP jälkeen entsymaattisen dissosiaation (kuvio 1J ja 1K) paljasti vähentää mahdollisuuksia DLD-1-soluissa, jolloin muodostuu pesäkkeitä (kuvio 1K) verrattuna staattiseen soluissa (kuvio 1J). Pienentynyt proliferatiivista kapasiteettia kulttuurien mikropainovoimassa varmistettiin solunelinkykyisyysmääritys käyttäen MTT. Staattinen viljelmät olivat 41% tehokkaampia kuin 27 RPM kulttuureissa ja 75% tehokkaampia kuin 16 RPM kulttuureissa mikropainovoimassa (kuvio 2A). Kun nämä tulokset otetaan yhdessä, mikrogravitaatiota näyttää vaikuttavan merkittävästi elinkelpoisuutta ja leviämisen DLD-1-soluissa. Virtaussytometrianalyysi PI ladattu DLD-1-soluja viljellään mikrogravitaatiota verrattiin solusyklin profiilia kulttuurien staattisessa TCP ja staattisia jousitus agar alustalle (kuvio 2B, 2C ja 2D). Puutteesta kiinnityspisteen, staattisen suspension soluviljelmissä agar myös koota samanlainen RCC, mutta simulointi mikrogravitaatiota on poissa. DLD-1 kulttuureissa mikropainovoimassa oli merkittävä populaatio soluja sub G0 vaihe vaikka suuri solupopulaatio oli vielä kannattava mikropainovoimassa (kuvio 2C). Staattinen yksikerroksista, TCP viljelmät olivat täysin elinkelpoisia (kuvio 2B) ja merkittävästi, staattinen suspension viljelmät eivät osoittaneet sub G0 vaihe ja oli samankaltainen staattinen ohjaus (kuvio 2D). Kuviossa 2E esitetty keskimääräinen sub G0 vaihe väestön kaikkien kolmen kulttuurin olosuhteet rinnakkaisnäytettä solusyklin analyysi, joka vahvisti, että alentunut elinkelpoisuus oli yksinomainen vaikutus mikropainovoiman DLD-1 solun aggregaatteja. MOLT-4 solulinja kasvaa suspensiona kulttuuriin ja se ei saa yhdistää suotuisasti mikropainovoimassa korkeassa tai alhaisilla kierrosluvuilla, joka osoittaa yksittäisten solujen HARV (kuvio 2F, 16 RPM HARV). Kuitenkin, solujen elinkelpoisuus väheni 20% verrattuna staattisen ohjauksen sekä RPM 48 tuntia (kuvio 2G), joka korreloi alentunut solujen määrä mikroskoopilla tarkkailu 48 tunnin jälkeen (kuvio 2F, 16 RPM HARV). Virtaussytometria havaittiin pieni apoptoottinen väestö (Sub G0 vaihe) solusyklin analyysi MOLT-4 kulttuureissa mikropainovoimassa 16 rpm (kuvio 2 H ja 2I).

DLD-1 soluviljelmissä; Staattinen kulttuuri (kontrolli) B DLD-1 Microgravity kulttuuri 16 RPM C DLD-1 Microgravity kulttuurin 27RPM Erilainen värjäystä havaita apoptoottista väestön D DLD-1Static yksikerrosviljelyissä E Microgravity viljelmistä DLD1 16 RPM F Microgravity viljelmistä DLD1 27 RPM G Soluadheesio ja runsaudenmäärityksessä Yläpelti-staattinen kulttuureissa alapaneelin-mikrogravitaatiota kulttuureissa siirtynyt staattiseen TCP H morfologiset muutokset DLD-1; Kristallivioletti värjäys DLD-1-soluissa staattisessa yksikerrosviljelmässä I Kristalliviolettiliuos värjäytymisen DLD-1-solujen siirtämisen jälkeen solujen kiviaineksia mikrogravitaatiota TCP J pesäkkeenmuodostuskyvyn määritys; Staattinen kulttuureissa K pesäkkeenmuodostuskyvyn määritys; DLD-1-solujen siirtämisen jälkeen solujen aggregaattien mikropainovoimassa TCP

solunelinkykyisyysmääritys DLD-1-solut; Elinkelpoisuus mitattiin mikropainovoima viljelmät (16 min ja 27 min) ja staattisia viljelmiä käyttäen MTT B Solusyklianalyysiä varten DLD-1-solut; Staattinen C Solusyklianalyysiä; Mikrogravitaatio D Solusyklianalyysiä; Staattinen suspendointijärjestelmiä agar aluskatteet E Keskimääräinen osa G0 väestön rinnakkaisnäytettä solusyklin analyysi mikrogravitaatiota, staattinen ja staattiset keskeyttäminen kulttuurien DLD-1-solujen F MOLT-4 soluviljelmässä Staattinen ja Microgravity kulttuurien MOLT-4 G solunelinkykyisyysmääritys Viability mitataan for mikropainovoima viljelmät (16 min ja 27 min) ja staattisia viljelmiä käyttäen MTT H Solusyklianalyysiä; Staattinen I Solusyklianalyysiä; Mikrogravitaatio viljelmät MOLT-4.

Real Time PCR geenien ilmentymisen analyysi

vaikuttaa keskushermostoon prosesseihin syöpä kuten solujen lisääntymisen ja solusyklin, mikrogravitaatiota on vaikuttaa merkittävästi perustavanlaatuinen toimintojen solu kuten geenien ilmentyminen. Mittasimme mRNA-tasoja merkittävien geenien solusyklin ja syövän etenemisen tarkistaa niiden säätelyhäiriötä alle mikrogravitaatiota. Sykliini geeniekspressiotasot vaikuttaa merkittävästi syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden, koska ne voivat ohjata solujen lisääntymisen tai apoptoosin. Cdk ovat välttämättömiä G1 /S- ja G2 /M-vaiheen siirtymiä solusyklin ja säädeltyyn geenin ilmentyminen voi vaikuttaa etenemistä solusyklin. Transkriptiota

CDK1

säädellään siten, että se toimii aikana mitoosi profaasissa ja metafaasissa [10].

CDK1

ilmentymistä alas säännelty MOLT-4 ja yläreguloituja DLD-1 (5-kertaiseksi staattinen ohjaus) (kuvio 3A). Geenien ilmentymisen olennaista syövän kehittymisen ja etenemisen, jotka ovat onkogeenien ja mahdolliset syöpää kantasolujen merkkiaineita, jotka väärin säädellystä mikropainovoimassa.

CD117

(Reseptorityrosiinikinaasin-c-kit) ilmentyminen voimistuvan 11,2 kertaisesti MOLT-4 ja vaimentua 0,2 kertaisesti DLD-1 alla mikropainovoima (kuvio 3A). Korkea c-kit ilmaisun suojaa koolonkarsinoomasoluja apoptoosia vastaan ​​ja parantaa heidän invasiivisia potentiaalia [11]; siksi, c-kit downregulation DLD-1 alla mikrogravitaatiota voivat olla merkittäviä. DLD-1 konstitutiivisesti yli ilmentää

MYC

geeni [12] normaaliolosuhteissa. Yliekspressio

MYC

herkistää soluja apoptoosin ja alle mikrogravitaatiota

MYC

geenin ilmentyminen kasvoi vuonna DLD-1 3-kertaiseksi (kuvio 3A). MOLT4 ilmaistuna alentuneet

MYC

(0,4-kertainen) mikropainovoimassa (kuvio 3A).

JUNB

koodaa transkription säätelijä solujen lisääntymisen geenejä ja on osa välittömän varhaisen geenin perhe [13]. Yksi merkittävimmistä geenien väärin säädellystä molemmissa solulinjoissa mikropainovoimassa,

JUNB

ylössäädellään mikropainovoimassa 2,1 ja 1,2 kertaisesti MOLT-4 ja DLD-1 vastaavasti (kuvio 3A).

CDK1

-solujen syklin kinaasigeenissä,

CD117

-proto-onkogeeni,

JUNB

-transcription tekijä ja välitön varhainen geeni,

MYC

-proto-onkogeenin ilmentymisen DLD-1 ja MOLT-4 B Reaaliaikainen PCR-analyysi HL-60

CCNE1

ja

CDK2

,

CCNB1

ja

CDK1

, Onkogeenit:

CD117

ja

MYC

, Cancer ennustetekijöitä markkereita

CD105

,

CD90

ja

CD71

.

geeniekspressioanalyysissä HL-60, promyelosyyttinen leukemia solulinjassa

Ylimääräisenä ohjaus veren kasvaimen (ja jousitus) kulttuureissa, tarkistimme geeniekspressiotasot solusyklin geenejä ja onkogeenien promyelosyyttinen leukemia solulinjassa, HL-60. Reaaliaikainen PCR paljasti säätelyn

CCNE1

ja

CDK2

in HARV viljelmissä

CDK2

ovat huomattavasti sääteli (1,1 ja 1,8 kertaiseksi) (kuvio 3B) .

CCNB1

ja

CDK1

geenin ilmentyminen oli väärin säädellystä kanssa

CDK1

olevan jopa säänneltyä 1,5 kertaiseksi ja

CCNB1

säädeltiin 0,8 kertaiseksi (kuvio 3B). Merkittävää on, että proto-onkogeenien

CD117

ja

MYC

olivat erittäin ylös säädellään mikropainovoimassa 4,7 kertaiseksi ja 10,8 kertaiseksi (kuvio 3B). Samanlainen DLD-1-solulinjassa, HL-60 myös yli ilmaisee

MYC

geeni konstitutiivisesti standardiolosuhteissa. Prognostisia markkereita

CD71

,

CD105

ja

CD90

oli väärin säädellystä alle mikrogravitaatiota 0,75-kertainen (vaimentua), 1,4-kertainen (voimistunut) ja 2,1-kertainen (voimistunut) vastaavasti ( kuvio 3B). Endogliiniksi (

CD105) B aids uudissuonittumisen syöpä [14] ja

CD90

ilmaus ilmaisee positiivisen ennustetta leukemiasolujen kantasolujen AML, jotka pystyvät säilyttämään taudin in vitro ja in vivo eivät ilmaista CD90 [15]. Reaaliaikainen PCR-analyysi ehdokkaan solusyklin, onkogeeni, transkriptiotekijän ja syövän etenemisen merkki osoitti sekä voimistumista ja downregulation. Koska solukierron säätelee vaikuttavat monet tekijät, joista monet voi vaikuttaa mikrogravitaatiota, joka on ”kollektiivinen” downregulation tai häiriöstä liittyviä prosesseja solukierron voisi vahvistaa havaitun fysiologisen pysähtyminen tai väheneminen soluproliferaation alle mikrogravitaatiota. Tavoitteen saavuttamiseksi genomin laaja ilmaus profilointi käyttäen DNA-siru suoritettiin. Genominen profilointi myös antoi meille mahdollisuuden spekuloida vaikutuksesta mikrogravitaatiota keskus- reittejä syövän kuten Notch opastejärjestelmän ja ekspressiotasot uusien sääntelyviranomaisten kuten microRNA.

Microarray-analyysi DLD-1 ja MOLT- 4 soluja viljeltiin mikropainovoimassa

Microarray-analyysi paljasti, 1801 ja 2542 geenit ylös ja alas säädellään yli 2 kertaisesti DLD-1-soluja kasvatettiin mikropainovoimassa verrattuna staattiseen valvontaa. MOLT-4-viljelmissä mikrogravitaatiota ilmentyvät eri kaikkiaan 349 ja 444 geenit ylös ja alas säädellään yli 2 kertaiseksi. Taulukko 1 esittää lyhyen luettelo yhteisistä geenien vapautettu keskuudessa solulinjoissa. Täydellinen luettelo erittäin vapautettu geenien joukossa molemmissa solulinjoissa annetaan S2, S3 ja S4 taulukot. Erittäin väärin säädellystä geenit edustettuina olevat tiedot taulukoissa mielenkiintoisia kandidaattigeenit kuten ribonukleotidireduktaasiin M2 (

RRM2

) alayksikköä, joka on kaikkein säädeltiin geenin DLD-1 alla mikrogravitaatiota. RRM2 yliekspressio voi liittyä Colo peräsuolisyöpä (CRC) eteneminen ja voi olla tärkeä rooli soluttautuminen ja etäpesäkkeiden CRC [16]. Se toimii prognoosi- biomarkkereiden ja ennustaa huono selviytyminen peräsuolen syöpiä [17]. Vaikka molemmat solulinjat osoittivat muutoksia solusyklin ja solujen elinkykyä, mikrogravitaatiota herättänyt suurempaa vastausta kiinteä kasvain solulinja DLD-1. Sub tappava stressi voi työntää solun tilaan, joka on samanlainen kuin monistus vanhenemista [18]. Stressin aiheuttama ennenaikainen vanhenemista (SIPS) voi ilmetä, kun DNA-vaurioita, oksidatiivista stressiä ja hoitoa histonideasetylaasi estäjien [18]. Ilmiö SIPS- voi selittää menetys solujen elinkelpoisuuden molemmissa solulinjoissa. Microarray-analyysi paljasti downregulation retinoblastooma-geenin (

RB1 ​​

; -0,42 log kertainen muutos) DLD-1-soluilla mikropainovoimassa ja läsnäolo RB1 proteiini on välttämätön SIPS [19], vaste DLD-1 soluja mikrogravitaatiota ei ehkä kautta SIPS- ja siihen liittyvien polkuja. Toisaalta MOLT-4-solut osoittavat ilmen- tymisen lisääntymisen RB1 lauseke (0,47 log kertainen muutos) alla mikropainovoimassa ja tappio solujen elinkelpoisuuden voidaan katsoa SIPS. Tämä voisi myös selittää suhteellisen pienempi määrä geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti MOLT-4-soluja verrattuna geeniekspressioprofiili of DLD-1 soluja mikrogravitaatiota. Muut biomarkkerit SIPS, apolipoproteiini J ja fibronektiiniä, joita yli-ilmennetään monistus vanhenemista ja SIPS [19], ei ole differentiaalisesti ilmaistut DLD-1 tai MOLT-4 alla mikrogravitaatiota. Mekanismia SIPS on epäselvä vielä ja siitä mikrogravitaatiota voi olla laukaista SIPS väyliä tulee varmistaa. Tiedot käsitellään tässä julkaisun on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus ja pääsee läpi GEO Sarjan hakunumerolla GSE69271 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69271) . Differentiaalisesti ilmaisi geenien microarray data tutkittiin niiden ylitarjonta eri Gene ontologia (GO) ehdot sekä reittejä käyttäen mikrosiruanalyysi ohjelmisto DAVID. Rikastamista pisteet yksittäisten GO termejä, liittyvien geenien käytettiin tunnistamaan prosesseja, jotka olivat merkittävästi säädeltyyn. GO tai toiminnallisia rikastamiseen analyysi suoritettiin yli 2 kertainen-ilmennetty eri geenien molemmissa solulinjoissa. Toiminnallinen luokittelu geenien perustuu samankaltaisuus toiminto tai perheen toteutettiin.

validointi kandidaattigeenejä valitaan microarray data

Microarray-analyysi paljasti säätelyä

CCNB1

ja alas säätely

ROMO1

ja

HES1

geenien kun MOLT-4-soluja viljeltiin mikropainovoima (kuvio 4A). Vastaavasti mikrosiruanalyysi osoitti alaspäin säätely

CDK2

geeni ja säätelyä

STST3

ja

HEY1

geenejä DLD-1-solut viljellään mikropainovoima (kuvio 4B). Microarray-analyysi paljasti, että molemmat solulinjat yleisesti osoitti alaspäin säätely

CCNE1

ja säätelyä

CD71

ja

CD44

geenejä (kuvio 4C Kuva 5A). Merkittävää on, että vapauttaminen mikroRNA-22 isäntä geenin ja sen tavoitteista oli myös alle mikropainovoima (kuvio 5B). mRNA: n ilmentymisen näistä kandidaattigeenejä edustaja solusyklin, kopioinnin säätely ja syövän etenemisessä todensi kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR. Sykliini B1, joka on ilmoitettu konstitutiivisesti yli-ilmentyy ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [20] on yli ilmaistuna MOLT-4-soluja, jotka oli 7,5-kertainen

CCNB1

mRNA: n ilmentymisen mukaisesti mikropainovoima (kuvio 4A). Alensi ilmentyminen

ROMO1

johtaa solujen kasvun esto [21] ja MOLT-4-solut ilmensivät 0,5-kertaisesti vähemmän

ROMO1

kuin staattinen ohjaus (kuvio 4A). Transkription ja replikointi ohjaimet säädellä onkogeenien ja ennustetekijöitä markkereita ja vaikutus solusyklin tapahtumia.

HES1

on transkription repressori ja on mukana DNA: n korjaukseen [22] ja

HES1

geeniekspressiota ohjataan Notch ja Jun merkinantojärjestelmän [23].

HES1

geeniekspressiota alas säätelevät 0,7 kertaisesti MOLT-4 (kuvio 4A) alla mikrogravitaatiota.

CDK2

geeniekspression DLD-1-soluissa oli 0,5 kertaa pienempi kuin staattinen ohjaus (kuvio 4B), kun taas

HEY1

, transkriptionaalisen säädin oli erittäin ylös säännelty 10,3-kertaisesti (kuvio 4B). Signaalin anturin ja aktivaattori transkription 3 (

STAT3

) on onkogeenisen transkriptiotekijä, joka aktivoituu, ja poikkeuksellisesti ilmaistuna monissa paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [24], ja geenit upregulation on validoitu RT-PCR: llä (kuvio 4B). Sykliini E1 geeniekspressiota alas säännelty kummassakin solulinjojen mikropainovoima (kuvio 4C). Sykliini E1 ohjaa etenemistä solusyklin läpi G1 vaihetta sen vuorovaikutus sykliiniriippuvainen kinaasi 2 [25]. Vastaavasti sekä solulinjat ilmaistuna alentuneet

CD71

, joka koodaa läpäisevä glykoproteiini, joka on vastuussa solun raudan oton (kuvio 4C). DLD-1 ilmaisi merkitsevästi alhaisempi (0,42-kertaisesti) mikropainovoimassa. Korkeampi ilmentymä

CD71

liittyy negatiivisia ennusteeseen monille kiinteiden kasvainten ja jotkut lymfoomat [26,27] ja lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet positiivista korrelaatiota raudan varastointi ja syöpäriskiä, ​​kuten kolorektaalikarsinoomasta [28 ]. Merkittävää on, että

CD44

geeni yläreguloituja molemmissa solulinjoissa (kuvio 4C Kuva 5A). Vaikka useimmat isomuotoja

CD44

liittyy pahanlaatuinen muodossa tauti, joitakin muotoja

CD44

estää syöpäsolujen leviämistä ulos ensisijaisen sivuston [29]. Kuten

CD44

ilmentyy sekä paksusuolen ja lymfaattisen syöpien ja mRNA analyysi aiheuttaisi useita variantteja, tutkimme sen proteiinin tasot DLD-1 ja MOLT-4 kulttuureissa mikropainovoimassa. Western blotting vakio isoformin

CD44

osoittaa korkeampi proteiinin molemmissa solulinjoissa yli staattinen ohjaus (kuvio 5A). Densitometrinen analyysi bändejä ja normalisoinnin β-aktiini-arvot on saatu aikaan merkittäviä säätelyn

CD44

proteiinia mikropainovoimassa. microRNA on tunnistettu mahdollisiksi onkogeenejä tai tuumorisuppressoreilla [30]. MIR-22 isäntä geeni,

MIR22HG

oli erittäin yläreguloituja DLD-1 (Log taittaa 4.4), mutta ei differentiaalisesti ilmaistut MOLT-4 (kuvio 5B). miR-22 toimii tuumorisuppressorina jälkeisessä transkription säätelyyn p21 määrittää solukohtalo- [31]. Se tukahduttaa syövän etenemisen indusoimalla solujen vanhenemista [32] ja ohjaa EVI-1 onkogeenin ilmentymisen metastasoitunut rintasyöpä solujen [33]. Jotkin kohteet miR-22, kuten

SP1

,

CDK6

ja

CCNA2

olivat myös merkittävästi vaimentua (kuvio 5B), kun taas toiset, kuten p21 (

CDKN1A

) ei merkittävästi väärin säädellystä. Farnesoid X-reseptori säätelee miR-22, joka on suunnattu

CCNA2

paksusuolen ja maksan syöpäsoluja [34]. Reaaliaikainen PCR miR-22 microRNA myös osoitti 4,18 log kertaiseksi säätelyyn ylöspäin DLD-1-soluilla mikropainovoima (kuvio 5B) vahvistetaan kertainen muutos havaittiin mikrosiruanalyysillä. Real Time PCR miR-22 targets-

CCND1

ja

CDKN1A

kuitenkaan eivät osoittaneet merkittäviä säätelyhäiriötä kanssa -0,09 log kertaiseksi (alas sääntely) ja 0,11 log-kertainen (ylös asetus) muutos,