Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kemoterapia on tärkeä vaihtoehto hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä, kuten keuhkosyöpä . Kuitenkin kasvain vastustuskyvyn solunsalpaajahoito on yleistynyt. On raportoitu, että autophagy on yksi prosesseista edistää tämän resistenssin. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että syöpälääke 5-fluorouraci (5-FU) voivat aiheuttaa autophagy A549-soluissa. 5-FU hoito saattaa johtaa muuntaminen LC3 I /II säätely ylöspäin Beclin-1, alas-säätely P62 ja muodostumista happaman vesicular soluelimiin (Avos) A549-soluissa. Esikäsittely syöpäsolujen 3-MA tai siAtg7 voitaisiin lisätä 5-FU: n indusoiman apoptoosin kautta kaspaasien aktivaatio, ja kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk pelastettu solujen elinkelpoisuuden alennus. Lisäksi esto autophagy myös stimuloi ROS muodostumista ja huuhteluilman ROS mukaan antioksidantti NAC esti kaspaasi-3: n aktiivisuuden, esti vapautumista cyt-c mitokondrioista ja lopulta pelastettiin syöpäsolujen 5-FU-välitteisen apoptoosin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että 5-FU-herättänyt autophagic vasteen lähettää suojaava rooli vastaan ​​apoptoosia ja esto autophagy voi herkistää niitä 5-FU-indusoidun kaspaasi-riippuvaista apoptoosia stimulaation kautta ROS-muodostelman.

Johdanto-osan : Pan X, Zhang X, Sun H, Zhang J, Yan M, Zhang H (2013) Autophagy esto Edistää 5-Fluorouraci indusoiman apoptoosin stimuloimalla ROS Formation in Human ei-pienisoluinen keuhkosyöpä A549 Cells. PLoS ONE 8 (2): e56679. doi: 10,1371 /journal.pone.0056679

Editor: Tetsuo Takehara, Osakan yliopisto Graduate School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 13 lokakuu 2012; Hyväksytty: 12 tammikuu 2013; Julkaistu: 18 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Pan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Project Shandongin maakunnassa Higher Educational Science and Technology Program (J10LC66) ja National Natural Science Foundation of China (Grant nro. 81102828, 81273037, 81202516). Kirjoittajat halusivat myös osoittaa arvostavansa Natural Science Foundation Shandongin maakunnassa Kiinassa (nro ZR2011HM011). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten maailmassa ja johtava syöpään liittyvän kuoleman useissa maissa. Arvioitu 85% keuhkosyöpää kuuluvat ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [1], [2]. Kemoterapia on tärkeä vaihtoehto kuivatuksen tai valvontaan keuhkosyöpä. 5-fluorourasiili (5-FU), joka kohdistaa sen syöpää ehkäisevistä vaikutuksista inhibition kautta tymidylaattisyntaasin ja sisällyttämällä sen aktiivisten metaboliittien RNA: ksi ja DNA niin, että se vaikuttaa urasiili aineenvaihduntaan ja lopulta johtaa apoptoosin syöpäsolun [3] . Aiemmin vuosikymmeninä 5-FU-pohjainen yhdistelmähoidot ovat vakiona hoitoja monille potilaille diagnosoitu erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien NSCLC [4] – [6]. Kuitenkin yhdessä sen käyttö, resistenssin 5-FU on yleistynyt ja on tunnustettu syynä moniin syöpiin hoidon epäonnistumisen [7], [8]. Siksi monet yritykset ovat tehty vähentämiseksi vastusta ja parantaa sen terapeuttista tehoa. Vaikka monet aggressiivinen hoitojen, kuten uusien lääkkeiden yhdistettynä 5-FU, ovat parantaa potilaiden eloonjäämisen, vaikutus näiden hoitojen edelleen kaukana tyydyttävästä tällä hetkellä. Näin ollen on toivottavaa löytää sopivampi terapeuttista mahdollisuuksia NSCLC. Tässä me raportoimme induktio autophagy 5-FU ihmisen NSCLC A549-solut.

Viimeisten vuosikymmenten apoptoosin induktio on ollut tärkeä näkökohta syövän huumeiden kehitystä. Kuitenkin, syöpäsolut käynnistää useita eri reittejä pitkin paeta apoptoosin [1]. Äskettäin autophagy on tutkittu laajasti syövän hoidossa. Sen lisäksi, siivous rooli poistamalla väärin laskostuneet tai yhteen proteiineja, clearing vaurioitunut organellit ja poistaa solunsisäisiä patogeenejä, autophagy on useita fysiologisia ja patofysiologisia toimintoja, syövän hoidossa. Monet tutkimukset ovat keskittyneet suhdetta autophagy ja kasvaimen synnyssä, kehitys ja hoito. Kuitenkin autophagy tuntuu olla paradoksaalinen rooli syöpäsolujen selviytymisen ja kuoleman. Kemoterapiassa, kun solut kohdata joitakin syöpälääkkeet, autophagy indusoituu suojata syöpäsolujen apoptoosia vastaan ​​solun eloonjäämisen. Sentähden autophagy on tunnustettu cytoprotective prosessi [7], [9] – [11]; Samaan aikaan, Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että inhibitio autophagy indusoi alentaa apoptoottista tasolla, siis autophagy osallistuu säätely apoptoosin [12], [13]; Lisäksi, kuten apoptoosi, autophagy on myös vaihtoehtoinen reitti ohjelmoidun solukuoleman, jota kutsutaan tyypin II ohjelmoidun solukuoleman [14] – [16]. Oletettavasti rooli autophagy voi riippua kasvaimen tyypistä ja ärsykkeitä, vaihe kasvaimen ja apoptoottisten tila kasvainsoluissa. Asianmukainen muutos autophagy, inhibitio soluja suojaava autophagy parantaa kasvainsolujen apoptoosia vasteena syöpälääkkeille voidaan parantaa vaikutuksia kemoterapian [9]. Näin ollen sen lisäksi, että apoptoottisen vasteen, tutkimus autophagy on mahdollinen suunta kehittämiseen syöpälääkkeet.

reaktiivisen hapen (ROS) on tärkeä rooli erilaisissa solun ohjelmien aikana fysiologinen kuten sekä sairauksiin. Kun tuotetaan kohtuullisesti, ROS toimivat signalointimolekyylejä signaalitransduktioreitteihin säätelemään solujen kasvuun, erilaistumiseen, selviytyminen, tulehdusta ja immuunivasteen [17]. Toisaalta, jos liian tuotetaan, niillä on kyky aiheuttaa hapettumista elintärkeisiin biologisiin molekyyleihin, kuten DNA, lipidit ja proteiinit, jotka muuttavat niiden toimivuutta ja aiheuttaa heikentynyt solun eheys [18]. Viime vuosina, asennus todisteet osoittavat, että ROS kietoutuvat autophagy induktio syövän hoidossa [19] – [21], mikä viittaa siihen, että ROS ratkaisevassa asemassa vastauksena syöpähoitojen, vapautuminen ROS muodostumisen liittyy syöpään aloittamista, etenemistä ja lääkeresistenssi.

tässä tutkimuksessa tutkimme taustalla oleva mekanismi syövän vaikutukset 5-FU: A549 keuhkokarsinooma. Olemme havainneet, että 5-FU indusoiman autophagy A549-soluihin ja estyminen autophagy voisi johtaa parantamiseksi 5-FU-välitteisen apoptoosin. Lisäksi olemme osoittaneet, että mekanismi, joka autophagy inhibitio herkistyneet solusta apoptoottisen solukuoleman oli lisäämällä muodostumista ROS että lopulta helpottaa vapautuminen sytokromi c: mitokondrioista, joka myöhemmin parantaa kaspaasi-riippuvaista apoptoosia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

ihmisen NSCLC-solut A549 saatiin Type Culture Collection of Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). Soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa (Gibco, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ja antibiootteja (100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä), 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95 % ilmaa ja 5% CO

2. Solujen kasvun logaritmisessa vaiheessa käytettiin tässä tutkimuksessa.

Kemialliset reagenssit ja vasta-aineet

5-FU, 3-MA, 3- (4,5-dimetyyli-2-tiatsolyyli) -2,5-diphnyl-2H-tetratsolium (MTT), 5,5 ’, 6,6′-tetrakloori-1,1′, 3,3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine jodidia (JC-1) ja 5- (ja 6) -kar- boksi-2’7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (DCFDA) ostettiin kaikki yhtiöltä Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Anti-LC3, anti-Beclin1, anti-p62, anti-sytokromi c, anti-lohkaista caspase9, anti-lohkaista caspase8, anti-halkaistut caspase3 ja anti-pilkkoutuu PARP vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) . Anti-aktiini-vasta-aine ja toinen vasta-aineet saatiin Santa Cruz Biotechnology (CA, USA).

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. Solut ympättiin 96-kuoppaisille tasapohjaisille mikrotiitterilevyille tiheyteen 1 x 10

4 solua /ml 100 ul: lla per kuoppa, inkuboitiin 24 tuntia ja sitten altistetaan osoitettujen konsentraatioiden 5-FU, että ilmoitettu ajat . Hoidon jälkeen, 20 ui MTT-liuosta (5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä 37 ° C: ssa 4 h. Kiteet liuotettiin sitten 100 ul: aan dimetyylisulfoksidi /kuoppa. Absorbanssi liuosta mitattiin 490 nm: ssä mikrotiitterilevylukijalla (Bio-Tek ELX800). Solujen elinkelpoisuus laskettiin seuraavan kaavan mukaan: Solujen elinkyky (%) = A490 (näyte) /A490 (kontrolli) x 100. Ainakin kolme toistoa tehtiin kunkin hoitoon.

Immunofluoresenssikoe varten LC3

taso LC3 tutkittiin käyttäen immunofluoresenssianalyysia mukaan edellisessä raportissa [22]. Lyhyesti, A549-soluja ympättiin lasipeitinlevyille. Käsittelyn jälkeen 5-FU: ta (10 uM) 48 tunnin ajan, kun läsnä tai poissa ollessa 3-MA (5 mmol /l), solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 min ajan. Kiinnityksen jälkeen solut tehtiin läpäiseviksi 0,5% Triton X-100: ssa 30 minuuttia ja sitten blokattiin 2% BSA: lla 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Blokkauksen jälkeen soluja inkuboitiin anti-LC3 (1:400 laimennettuna BSA-puskuri) vasta-ainetta 4 ° C: ssa yön yli, ja saatetaan sitten reagoimaan fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -konjugoitu vuohen anti-kani-IgG: tä (1:100 laimennettuna BSA-puskuri) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Tuma värjättiin 1 umol /l DAPI (Sigma-Aldrich) 5 minuutin ajan. Sitten LC3 puncta ja värjätään tumassa havaittiin fluoresenssimikroskoopilla ja yhdistettiin (Olympus, Japani).

Detection happamien vesicular soluelimiin (Avós) B

määrällisesti kehittämisen Avós, A549-solut olivat ympättiin 24-kuoppaisille tasapohjaisille mikrotiitterilevyille tiheyteen 1 x 10

4 solua /ml 1 ml: lla per kuoppa ja inkuboitiin 24 tuntia. Hoidon jälkeen 10 uM 5-FU: ssa 48 tuntia, kun läsnä tai poissa ollessa 3-MA (5 mmol /l), solut värjättiin 1 uM akridiinioranssilla 37 ° C: ssa pimeässä 15 minuutin ajan, sitten pestiin kahdesti PBS: llä. Kuvia AO värjäystä visualisoitiin heti käyttäen fluoresenssimikroskooppia. Kvantifioimiseksi määrän happamia rakkulat käsitellyistä soluista, muut solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille. Värjäyksen jälkeen AO PBS: ssä 37 ° C: ssa 15 min, solut kerättiin, pestiin kahdesti PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen 200 ul: aan PBS: ää, sitten analysoitiin virtaussytometrialla määrityksessä. Green (500-550 nm, FL1-kanava) ja punainen ( 650 nm, FL3 kanava) fluoresenssi, joka oli valaistu sinisellä (488 nm) valovirityksen, mitattiin käyttämällä virtaussytometriä kanssa CellQuest analyysin ohjelmisto (Becton Dickinson).

Apoptoosi havaitsemisen virtaussytometrialla

havaitseminen suoritti anneksiiniV-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Diego, USA). Breifly, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 24 tuntia, ja sitten altistettiin 10 uM 5-FU: ssa 48 tuntia, kun läsnä tai poissa ollessa 3-MA (5 mmol /l). Hoidon jälkeen noin 1 x 10

6 solut otettiin talteen, pestiin kahdesti PBS: ssä, ja sen jälkeen värjättiin anneksiini V-FITC ja PI mukaan valmistajan ohjeiden. Saatu fluoresenssi havaittiin virtaussytometrialla CellQuest analyysin ohjelmisto.

mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) Analyysi

arvot mitokondrion kalvon potentiaali määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä JC-1 värjäystä mukainen valmistajan ohjeita. Lyhyesti, käsiteltyjen-solut kerättiin, pestiin PBS: llä, ja inkuboitiin 10 uM JC-1 30 min ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Positiiviset solut havaittiin sitten virtaussytometrillä kanssa CellQuest analyysin ohjelmisto.

Measurement reaktiivisten happilajien (ROS) B

ROS-tasot määritettiin käyttämällä fluoresoivan markkerin 2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (DCFH-DA). Lyhyesti, käsiteltyjen-solut trypsinoitiin, pestiin ja inkuboitiin 10 uM DCFH-DA 30 minuuttia pimeässä, ja fluoresenssin intensiteetti seurasi virtaussytometrillä kanssa CellQuest analyysin ohjelmisto.

mittaus Sytokromi c Release

mitokondrioita jae ja sytosoliin jae valmistettiin eri sentrifugoimalla kuten Jie Li, MD kuvattu [3]. Lyhyesti, käsiteltyjen-solut kerättiin ja pestiin kaksi kertaa PBS: llä, minkä jälkeen ne suspendoitiin uudelleen sakkaroosi-puskurissa (250 mM sakkaroosia, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, jota oli täydennetty 1 mM PMSF, 1 ug /ml leupeptiiniä, 1 ug /ml pepstatiini A: ta, 5 ug /ml aprotiniinia, ja 5 mM DTT), jäillä 30 minuutin ajan. Solut homogenisoitiin ja sitten sentrifugoitiin 1000 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa tumien poistamiseksi ja ehjä soluja. Mitokondriot fraktio sitten pelletoitiin sentrifugoimalla 10000 g 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti sentrifugoitiin edelleen 100,000 g 60 minuutin ajan 4 ° C: ssa saada sytosoliin osa.

Caspase aktiivisuusmäärityksen

aktiivisuus kaspaasien-3 mitattiin käyttäen kaupallisesti saatavilla kaspaasi kolorimetristä määritystä sarjat (Beyotime, Kiina). Lyhyesti, sen jälkeen, kun hoidon osoitettu aineilla, A459-solut otettiin talteen ja pestiin PBS: llä sentrifugoimalla 600 g: llä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solupelletit suspendoitiin uudelleen hajotuspuskuriin ja jätettiin jäille 15 minuutin ajan. Lysaatit sentrifugoitiin 160.000 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti kerättiin kaspaasi 3: n aktiivisuuden määritys in lyysipuskuri, joka sisältää Ac-DEVD-pNA mukaisesti sarjat ohjeita. Pitoisuus pNA mitattiin 405 nm: ssä mikrotiitterilevylukijaa, joka käyttää ohjeellinen kaspaasi 3: n aktiivisuuden.

Western blot-analyysi

A549-soluja, inkuboitiin vastaavat olosuhteet, olivat kerätään ja rikotaan. Yhtä suuri määrä proteiinia erotettiin SDS-PAGE: lla (5-15%) ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Blotatun membraanit blokattiin kuoritun maidon 5% 1 tunti ja sitten inkuboitiin halutun primaaristen vasta-aineiden (laimennus 1:1000) yön yli 4 ° C: ssa. Sitten immunoreaktiivisia nauhojen tehtiin näkyviksi tehostetulla kemiluminesenssilla käyttäen piparjuuriperoksidaasikonjugoitua IgG sekundääriset vasta-aineet. Määrällisesti yhtä suuri lastaus, membraani uudelleenseulottiin β-aktiini vasta-aine.

tutkiminen autophagosome TEM

A549 solut kiinnitettiin 2,5% glutaraldehydillä 4 ° C: ssa yön ja jälkikiinnitettiin 1% OsO

4 1,5 tuntia. Sitten solut värjättiin 70% etanolilla kyllästetty uranyyliasetaatilla, minkä jälkeen kaltevuus nestehukka etanolilla-asetonilla ja lopuksi upotettiin epoksihartsiin varten osassa. Ultraohuen leikkeet kaksinkertaisesti värjättiin uranyyliasetaatilla ja johtaa sitraatti ja analysoitiin läpäisevällä elektronimikroskoopilla (TEM) B

RNA-interferenssiä Atg7

Atg7 RNA-interferenssi suoritettiin transfektoimalla A549-soluja kanssa Atg7- kohdennettu siRNA ja Universal ohjaus siRNA (Invitrogen; 100 pmol /kuoppa). Lyhyt oligo-RNA: t transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. 24 tunnin kuluttua transfektiosta solut käsiteltiin 5-FU vielä 48 tuntia. Sitten solut kerättiin ja solujen lysaatit altistettiin immuno- Atg7, LC3 ja PARP. Soluja käsitellään myös solujen elinkelpoisuutta ja apoptoosin analyysillä.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (n≥3). Tilastollinen analyysi näiden kahden ryhmän välillä laskettiin käyttäen Studentin t-testiä, ja useita ryhmiä suoritettiin SPSS 10.0 ohjelma.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

5-FU ehkäisee solujen lisääntymistä A549

Tutkiakseen 5-fluorourasiili: n mahdolliset solujen kasvun inhibitio A549-soluja, vaikutus 5-FU-hoidon soluissa tutkittiin MTT-määrityksellä. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, 5-FU (0-200 uM) tuotti annoksesta ja aikaa riippuvainen väheneminen A549 solujen kasvua. IC50: ssa 48 tuntia 5-FU: käsittely A549-soluja oli 10,32 ± 0,69 uM. Tulosten perusteella, 10 uM 5-FU: ssa 48 tuntia A549-soluissa käytettiin lisäkokeita. Lisäksi morfologiset muutokset myös, että 5-FU hoidossa vähentynyt solutiheyden. Mielenkiintoista on, että 5-FU-käsitellyissä soluissa ei synny kovin ilmeinen apoptoottisen merkkiä, mutta monet ontelot sytoplasmassa (Fig. 1 B). Tämä sai meidät tutkimaan, onko 5-FU indusoiman autophagy sisällytettiin myös keuhkojen syöpäsoluja.

(A) Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-analyysi sen jälkeen, kun hoidon eri pitoisuuksia 5-FU 24 tunnin ja 48 tunnin . IC50 laskettiin IC50 ohjelma. (B) Morfologiset muutokset havaittiin käsittelyn jälkeen soluja 10 mikromol /l 5-FU 48 h Käänteismikroskooppi (Olympus, Japani). Kaikki tiedot edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen.

5-FU indusoi autophagy A549-soluissa

Myöhemmin transmissioelektronimikroskopiaa käytettiin tarkistaa muodostumista autophagosomes in 5- FU käsitellyt solut. Kuten kuviossa 2A on esitetty, hoito 5-FU 6-48 h aiheutti kertyminen autophagic vakuolien, jolla oli autophagosome ja /tai autolysosomal ominaisuudet, kun taas vain muutama vacuoles havaittiin kontrollisoluihin. Autophagy-spesifisten LC3, Beclin-1 ja p62 käytettiin myös tutkimaan autophagic tasot ja autophagic vuon tässä prosessissa immunoblot-analyysillä. Kuten on esitetty kuviossa. 2B säätely ylöspäin Beclin-1, alas-säätely P62 ja muuntaminen LC3 I /II osoitti yhä muodostumista autophagosomes on ajasta riippuva tavalla A549-solut.

A549-soluja käsiteltiin 10 mikromol /l 5-FU eri osoittaman ajan, sitten autophagosomes ja autophagic tasot havaittiin. (A) muodostuminen autophagosomes käsitellyissä soluissa tarkastettiin TEM. (B) LC3, Beclin-1 ja p62 tutkittiin Western blot. β-aktiini oli latauskontrollina. Kaikki tiedot edustavat vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

Seuraavaksi Jotta voitaisiin edelleen osoittaa autophagy aiheuttama 5-FU, otimme käyttöön 3-MA, joka on suosittu estäjä autophagy [3 ]. 5 mM 3-MA lisättiin A549-soluihin 1 tunnin ennen 5-FU altistumista. Solut jaettiin neljään ryhmään: kontrolli (ei käsittelyä), 3-MA (käsiteltiin 3-MA), 5-FU (käsitelty 5-FU), ja yhdistelmä (käsitelty sekä 5-FU: n ja 3-MA) . Virtaussytometrillä suoritettiin sen jälkeen, kun värjäämällä solut akridiinioranssilla kvantifiointiin Avós. Tulokset osoittivat, että määrä happamia rakkulat 5-FU ryhmässä kasvoi tietenkin, joka inhiboitui 3-MA, vahvistaa induktio autophagy (Fig. 3A ja C). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös fluoresenssiin mikroskooppinen tutkimus. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, A549-soluja käsiteltiin 5-FU 48 tuntia näkyy useita fluoresoivia rakkuloiden sytoplasmassa, kun taas vain harvat loisteputki rakkulat havaittiin kontrolliryhmässä, 3-MA ryhmä ja yhdistelmä ryhmä. Lisäksi LC3 immunofluoresenssilla ja immunoblottauksella suoritettiin myös. Fluoresenssimikroskopiaa paljasti pistemäinen jakelu LC3 fluoresenssin parannettu 5-FU ryhmässä (Fig. 3d). Western blot osoitti myös, että ilmaus LC3 yhdessä ryhmässä osittain palautettu alkuperäiseen tilaan, samaan aikaan, mikä heijastaa tehokkaasti estävä vaikutus 3-MA (Fig. 3E). Nämä tulokset osoittivat, että autophagy aiheutettiin 5-FU-käsiteltyjen A549-solut. Siksi päätimme tutkia inhibition autophagy vaikuttaa herkkyys A549 5-FU hoitoon.

Soluja esikäsiteltiin 5 mmol /l 3-MA 1 h ennen altistusta 10 umol /l 5-FU: ssa 48 tuntia, sitten akridiinioranssilla käytettiin värjäämään Avós, fluoresenssi-aktivoitujen solujen analysoitiin virtaussytometrialla (A). Käsittelyn jälkeen solut värjättiin akridiinioranssilla AVO havainnointia. Solut visualisoitiin punainen suodatin fluoresenssimikroskoopilla (B). TO kvantifiointi solujen kehittää AVO A549-solujen prosenttiosuus kehitetty Avós laskettiin tulosten perusteella fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu määrityksessä (C). Fluoresenssimikroskoopilla immunofluoresenssilla värjäystä LC3 käsitellyn-A549-soluja (D). Western blot analyysi suoritettiin havaitsemiseksi LC3 proteiinin tasoja. Blotit uudelleen osoittautuneet anti-β-aktiini latauskontrollina (E). Kaikki tiedot edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen.

Autophagy esto tehostaa 5-FU aiheuttama apoptoottisen solukuoleman

Ensinnäkin tutkia eston autophagy herkistää A549 soluja 5-FU-solukuolema, vaikutus hoidon tutkittiin MTT-määrityksellä (Fig. 4A). Yhdistelmässä ryhmää, elinkelpoisuutta A549 väheni nopeammin kuin 5-FU ryhmässä, yhdistelmä ryhmä ajoi 65.75% soluista kuolemaan, noin 39,28% enemmän kuin, että 5-FU ryhmässä. Vaikka solujen elinkelpoisuutta 3-MA ryhmä myös vähentynyt, siinä määrin kuin ei ollut merkittävä. Nämä tulokset osoittivat, että 3-MA parantaa 5-FU-indusoituvaa solukuolemaa A549-soluja. Seuraava, vahvistaa havainto, että inhibitio autophagy vaikuttaa solujen herkkyyttä 5-FU, anneksiini V-FITC: llä ja PI-värjäys suoritettiin. Virtaussytometrisia analyysi osoitti, että määrä AV- ja AV /PI-positiivisten solujen lisääntynyt merkittävästi yhdistetyn hoitoryhmässä kuin 5-FU-vasta hoitoryhmässä (Fig. 4B). Edelleen Tämän vahvistamiseksi teloittajiensa kaspaasi-8, kaspaasi-9, kaspaasi-3 ja PARP tutkittiin sitten. 5-FU-käsitellyillä ryhmillä, he olivat kaikki pilkotaan niiden erityiset aktiivisia muotoja, ja aktiivisuus on 5-FU-käsitellyt solut estettynä autophagy oli merkittävästi suurempi kuin soluissa, joita käsiteltiin 5-FU yksinään (Fig. 4C).

Soluja esikäsiteltiin 5 mmol /l 3-MA 1 h ennen altistusta 10 umol /l 5-FU: ssa 48 tuntia. (A) Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä. Tulokset edustavat avulla neljästä itsenäisestä kokeesta. (B) Solujen kuolleisuus analysoitiin anneksiini V määritys virtaussytometrillä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (C) Solulysaatit valmistettiin ja alistettiin immunoblottaus vasta-aineita kaspaasi-9, kaspaasi-8, kaspaasi-3, PARP, ja β-aktiini. Kaikki tiedot edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen.

rooli autophagy 5-FU-välitteisen sytotoksisuuden tutkittiin edelleen lakkauttamalla Atg7 ilmaisua käyttäen siRNA. Kuten on esitetty kuviossa. 5, ilmentyminen Atg7 oli merkittävästi vaimentaa A549-soluja, jotka on transfektoitu Atg7 siRNA, mutta ei niitä, Control siRNA (Fig. 5A). Näin ollen, solut, jotka on transfektoitu Atg7 siRNA oli vähentynyt taso LC3-II keskittymisen ja kohonnut taso clPARP jälkeen 5-FU hoidon (Fig. 5A). Lisäksi, sytotoksista vaikutusta 5-FU oli merkittävästi lisääntynyt estämällä Atg7 ilmaisun ja pancaspase inhibiittori z-VAD-fmk pelastettu solukuolemaa (kuvio. 5B). Vastaavasti aste indusoiman apoptoosin 5-FU oli myös parantunut, kun nakutusta alas Atg7 ilmaisun ja z-VAD-fmk vähensivät solujen apoptoosia merkittävästi (kuvio. 5C). Kuten koottu kuvioon. 5, knockdovvn Atg7 myös nopeuttaa indusoiman apoptoosin 5-FU. Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​käyttäen 3-MA, joka osoittaa, että autophagy aiheuttama 5-FU: lla on suojaava rooli tuumorisolujen apoptoosia vastaan, ja salpaus autophagy jälkeen parannettu apoptoosin kautta kaspaasien aktivaatio A549-soluissa.

Solut transfektoitiin Atg7 kohdistettu siRNA ja ohjaus siRNA 24 tuntia ennen altistusta ja 10 mmol /l 5-FU: ssa 48 tuntia. (A) Solulysaatit valmistettiin ja alistettiin immunoblottaus vasta-aineita LC3, Atg7, PARP, ja b-aktiini. (B) Solujen elävyys mitattiin käyttäen MTT-määritystä. (C) Apoptoottista solukuolemaa analysoitiin anneksiini V /PI-määrityksellä. Kaikki tiedot edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen.

Muutokset mitokondrioiden kalvon potentiaalia ja vapautuminen sytokromi c mitokondrioista

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että aktivaatio caspases johtui syt -C kautta luontainen mitokondrioiden apoptoottista koulutusjakson [23], [24]. Siksi vaikutus estetty autophagy on 5-FU-välitteisen vapautumisen syt-c mitokondrioista sytosoliin tutkittiin käyttäen solufraktioinnin. Tulokset saimme osoitti, että inhibitio autophagy 5-FU-käsitellyissä soluissa johti jyrkkä nousu kertyminen sytokromi c: sytosoliin (Fig. 6A). Vaikutus mitokondriot vahvisti myös lasku mitokondrion kalvon potentiaalia. Kuten on esitetty kuviossa. 6B, esto autophagy 5-FU-käsitellyistä soluista indusoi selvää laskua mitokondrion kalvon potentiaalia. Nämä tiedot viittaavat siihen, että mitokondrion kalvon potentiaalia voidaan tarvita 5-FU yhdistettynä 3-MA aiheuttama syt-c levittämisestä sytosoliin, joka myöhemmin laukaisi aktivointi ja lohkaisu caspases ja johti solujen apoptoosin.

Soluja kohdellaan kuten kuvassa. 3. (A) Mitokondriot ja sytosoliin fraktiot eristettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät, ja sitten alistettiin immunoblottaus havaitsemiseksi sytokromi c. (B) MMP muutos arvioitiin JC-1-värjäys virtaussytometrialla, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kaikki tiedot edustavat vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

inhibitio autophagy stimuloi ROS muodostumista, joka tarvitaan 5-FU-välitteisen apoptoosin A549-soluja

Viime aikoina useita raportteja edellyttäen näyttöä osallistumista reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) induktioon autophagy ja apoptoosin ja osoitti merkityksen ROS vapautumiseen cyt-c välillä mitokondrioiden [25], [26]. Siksi päätimme analysoida, onko estyminen autophagy voisi stimuloida sukupolven ROS 5-FU-käsiteltyjen A549-solut. Käsitelty-solut värjättiin kloorimetyyli-2 ’, 7’-dikloorifluoresiinidiasetaattia (CM-H2-DCFDA), solun läpäisevä fluoresenssiväriä, joka reagoi laaja kirjo ROS. Kuten kuviossa 7A, ROS kohoamiseen luonnollisesti soluissa, käsiteltiin 5-FU yhdistettynä 3-MA verrattuna 5-FU yksin virtaussytometrialla, ja tällainen korotus vaimentaa tehokkaasti, kun soluja esikäsiteltiin 10 mM N- asetyylikysteiini (NAC) 1 h. Koska taso ROS kohosi solujen tukahdutetaan autophagy, me analysoitava tarkemmin, onko estyminen ROS vaikuttanut 5-FU-välitteisen solukuoleman. Tätä tarkoitusta varten ROS muodostuminen inhiboitui NAC ja apoptoosi mitattiin virtaussytometrialla. Kuten on esitetty kuviossa 7B, herkistymisestä soluja 5-FU-indusoidun apoptoosin estyi täysin estää ROS muodostumista. Lopuksi tutkimme, onko estyminen ROS vaikutti kaspaasiaktiivisuus ja vapauttamaan syt-c. Itse asiassa, huuhteluilman ROS esti kaspaasi-3: n aktiivisuuden, esti vapautumista cyt-c mitokondrioista, ja pelastettiin A549-solut 5-FU-välitteisen apoptoosin (Fig. 7C ja D). Nämä tulokset osoittivat selvästi, että sukupolven ROS on tärkeä rooli säätelyssä solukuolemaan vastauksena 5-FU.

Soluja esikäsiteltiin 10 mM NAC 1 h ennen 10 mikromol /l 5-FU ( 48 h) hoidon läsnä ollessa tai puuttuessa 3-MA. (A) ROS sukupolven havaittiin käyttäen DCFDA virtaussytometrillä. Data käsiteltiin kanssa CellQuest-ohjelmaa ja analysoitiin densitometrillä. (B) Solukuolemaan mitattiin anneksiini V /PI värjäystä. (C) kaspaasi-3: n aktiivisuuden määritys suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (D) syt-c tason sytosoliin murto havaittiin immunoblottauksella. Kaikki tiedot edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen.

Keskustelu

keuhkosyöpä, kemoterapia on laajalti käytetään parantaa ja laajentaa postoperatiivista eloonjäämisen potilailla. 5-fluorourasiili (5-FU), käytetään tehokkaasti lääkkeenä hoidettaessa erilaisia ​​ihmisen syövissä, mukaan lukien keuhkosyöpä. Päämekanismi taustalla sen antituumorivaikutus on katsottu johtuvan häiriön DNA: n ja RNA-synteesin. Aiemmin vuosikymmeninä apoptoosin induktion 5-FU on ollut tärkeä näkökohta syöpähoidon [27] – [29]. Äskettäin autophagy on laajasti havaittu 5-FU hoitoon [3], [7], [30] – [32]. Tutkimuksessamme havaitsimme, että 5-FU voi estää A549-solujen lisääntymisen ilmeisesti (Fig. 1A), joka sisälsi solujen autophagy ja apoptoottista solukuolemaa (kuvio. 2,3,4 ja 5). Tuloksemme osoittivat myös, että molemmat LC3-II ja Beclin1, joiden on todettu olevan markkeri autophagy [33], oli merkittävästi lisääntynyt sen jälkeen, kun 5-FU hoidon A549 mukana alas-säätely p62 ilmentymisen (Fig. 2B). Samaan aikaan yhä muodostumista autophagosomes ja /tai autolysosomal ajan havaita TEM (Fig. 2A) ja lisääntynyt muodostuminen ominainen Avós sytoplasman edellyttäen toiset kaksi näyttöä (Fig. 3A-C). Kaikki nämä tulokset osoittavat, että autophagy indusoitiin 5-FU.

Autophagy on solunsisäinen suurin hajoamista, joka on todettu kaikkialla läsnä eukaryooteissa, joka on vastuussa hajoamista eniten pitkäikäisten proteiinien ja joitakin organelleja. Sytoplasmisen osatekijöiden, myös soluelimiin, jotka erottautuvat double-membraned autophagosomes ja sitten sulake lysosomeihin muodostavat autolysosomes missä niiden sisältö hajoavat. Huonontuneen tuotteita kierrätetään sytoplasmaan uudelleenkäyttöä varten [34]. Autophagy stimuloituu vasteena ulkoiseen stressitekijöiden ja sisäiset tarpeet ylläpitää solujen aineenvaihduntaan sekä selviytymistä. Kuitenkin, autophagy voi johtaa myös solukuolemaan kutsutaan ”autophagic solukuolemaa” (ohjelmoitu solukuolema tyyppi II) läpi liiallisen itsestään ruoansulatusta ja hajoaminen olennaisten solun ainesosien tietyissä olosuhteissa [18], [35]. Viime aikoina yhä useammat todisteet osoittavat roolin autophagy syövän leviämistä ja hoitovaste. Kuitenkin syövän kemoterapiassa, autophagy näyttää olevan ristiriitaisen rooli, todennäköisesti edistävät tai estämällä apoptoosin, syöpäsolun selviytymisen ja kuoleman [9]. Sen tutkimiseksi, osuus autophagy prosessissa 5-FU-indusoitua A549-solujen apoptoosin, käytimme autophagy estäjä 3-MA, joka on spesifinen inhibiittori alkuvaiheen autophagic prosessi, tässä tutkimuksessa. Kuten odotettua, 3-MA inhiboi 5-FU-indusoidun autophagy (Fig. 3). Autophagy esto parannettu 5-FU aiheuttaman apoptoosin kautta caspases aktivaatio A549-solut (Fig. 4). Selventää edelleen roolia autophagy 5-FU aiheuttama A549 solukuoleman, käytimme Atg7 siRNA kaataa Atg7 ja arvioitiin rooli autophagy suoremmin. Vastaa tuloksia, käyttäen 3-MA, transfektio Atg7 siRNA estää tehokkaasti LC3-II kertyminen, lisääntynyt clPARP tuotantoa ja tehostaa apoptoottista solukuolemaa indusoi 5-FU: A549-solut (Fig. 5).