Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Omepratsoli on hiljattain kuvattu modulaattori kasvaimen chemoresistance, vaikka sen taustalla molekyylitason mekanismit ovat edelleen kiistanalaisia. Koska haiman kasvaimet ovat erittäin solunsalpaajaresistentti, looginen askel olisi tutkia farmakodynaamiset, morfologiset ja biokemialliset vaikutukset omepratsolin haimasyövän solulinjoissa.

Menetelmät /Principal Havainnot

annosvaikutuskuvaajia of omepratsoli, pantopratsoli, gemsitabiini, 5-fluorourasiili ja yhdistelmät omepratsolin ja 5-fluorourasiilin tai gemsitabiinin luotiin varten haimasyövän solulinjoissa MiaPaca-2, ASPC-1, Colo357, PancTu-1, Panc1 ja Panc89. Ne paljastivat, että omepratsolin estivät proliferaatiota luultavasti myrkytön pitoisuudet ja käänsi hormeesi ilmiöitä 5-fluorourasiilin kanssa. Elektronimikroskoopilla osoitti, että omepratsolilla johti kertymistä phagophores ja varhaisen autophagosomes in ASPC-1 ja MiaPaca-2-soluissa. Signaalin muutokset osoittavat esti lisääntymistä ja ohjelmoidun solukuoleman havaittiin protoni-NMR-spektroskopialla Molempien solulinjojen hoidetuilla omepratsolia joka tunnistettiin solunsisäisesti. Omepratsoli moduloi lysosomaalisen liikenteen reitin, kuten on esitetty Western blot-analyysi ilmentymisen LAMP-1, katepsiini-D, ja β-COP lysosome- ja Golgin kompleksi, joka sisältää solufraktioita. Akridiinioranssivärjäyksellä paljasti, että pumpun toiminta vATPase ei nimenomaisesti inhiboi omepratsolia. Geeniekspression autophagy liittyvien LC3 geenin sekä Bad, MDR-1, Atg12 ja vATPase analysoitiin sen jälkeen, kun solujen käsittely 5-fluorourasiilin ja omepratsoli ja vahvisti edellä mainitut tulokset.

Johtopäätökset

hypoteesin, että omepratsolin vuorovaikutuksessa sääntelyn toiminnot vATPase estämättä sen pumpun toiminta. Modulointigeneraattori lysosomaalisen kuljetus- reitin ja autophagy johtuu haiman syöpäsoluissa, mikä johtaa ohjelmoituun solukuolemaan. Tämä voi kiertää yhteinen resistenssimekanismeja haimasyövän. Koska omepratsolin käyttö on jo vahvistettu kliinisessä käytännössä nämä tulokset voivat johtaa uusiin kliinisiin sovelluksiin.

Citation: Udelnow A, Kreyes A Ellinger S, Landfester K, Walther P, Klapperstueck T, et al. (2011) Omepratsoli Estää leviämisen ja säätelee Autophagy haiman syöpäsoluja. PLoS ONE 6 (5): e20143. doi: 10,1371 /journal.pone.0020143

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu 24. marraskuuta 2010 Hyväksytty: 26 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 24, 2011

Copyright: © 2011 Udelnow et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka asiaa etenemistä diagnosoinnissa, resektion ja kemoterapia, haimasyöpä liittyy lyhyen selviytymisen [1]. Konstitutiiviset leviämisen ja syvällinen vastustuskykyä apoptoosin ovat tunnusomaisia ​​piirteitä haimasyöpäkasvainsoluissa tekevät niistä erittäin vastustuskykyinen yhteisiä kemoterapia-strategioita. Useita mekanismeja vastuussa apoptoosin resistenssin on raportoitu, mukaan lukien downregulation proapoptoottiset proteiinien säätelyä antiapoptoottisten proteiinien [2], [3], aktivaatio eri kinaasien, kuten proteiinikinaasi C: n (PKC) /proteiinikinaasi D1 (PKD1) ja kaseiinikinaasi 1 (CK1) [4] – [6], kohonnut ilmentyminen eri MikroRNA [7], p53 mutaatioita ja mdm2 polymorfismien [8]. Siksi aineiden tunnistaminen, jotka pystyvät kiertämään näitä mekanismeja olisi arvokasta.

Äskettäin omepratsoli (OMP), perustettiin maailmanlaajuinen standardi lääke gastriitti ja pohjukaissuolihaava 1980-luvulta lähtien, on kuvattu mahdolliset antiproliferatiivisesti ja vastus modulaattori sekä in vitro että ksenograftikasvaimissa hiirillä [9], [10]. Edelleen tutkimus on ehdottanut, että esto vakuolaarisen protonipumpun (vATPase), joka säätelee lysosomaalisen pH tai kertyminen sisällä lysosomeihin voi olla johtava mekanismeja herkistävä soluja kohtaan sytostaattinen hoito [9] – [12]. Lisäksi, reaktiivisten hapen lajien [9] ja osallistuminen p38 MAPK [13] on raportoitu liittyvän OMP-indusoidun solujen vaikutuksia. Lisäksi P-glykoproteiinin (Pgp) [14] ja P450 2C19 isoformi [15] syy farmakokineettisiä yhteisvaikutuksia OMP muiden lääkkeiden kanssa (ts antibiootit, barbituraatit, sytostaatit), jotka ovat kliinistä merkitystä. Nämä tiedot toistaiseksi osoittamaan monimutkaisia ​​mekanismeja, joihin liittyy muun muassa lysosomaalisen liikennejärjestelmä. Keskustelu siitä, onko ja miten OMP voivat estää syöpäsolujen kasvua ja parantaa solunsalpaajavaikutus sytostaattien ovat käynnissä.

Toistaiseksi kumpikaan lääkeaine itse eikä sen tavoitteita ole suoraan havaittu erityisesti syöpäsoluja. Myös käytännössä mitään dataa, joka kuvaa annoksen ja vaikutuksen väliseen suhteeseen OMP kasvainsoluissa. Olisi erittäin kiinnostavia, onko tämä lääke on tehokas kliinisesti pitoisuudet. Lisäksi tietojemme mukaan OMP ei ole vielä käytetty haimasyövän hoidossa, vaikka saadut tiedot potilailla, joilla on Zollinger-Ellisonin oireyhtymä osoittavat, että OMP on laaja terapeuttinen leveys ja aiheuttaa vain harvoissa ja lieviä sivuvaikutuksia jopa suurempia annoksia [ ,,,0],16]. Sen sijaan muut vastukset modulaattorit kuten verapamiilin [17] tai bafilomysiini [18] ovat liian myrkyllisiä kliiniseen käyttöön.

Kun otetaan huomioon korkea chemoresistance haiman kasvainsolujen, yksi tärkeimmistä tavoitteista meidän oli selvittää onko OMP olisivat tehokkaita haimasyövän solulinjoissa. Siksi tutkittiin yksi- ja kaksiulotteisen annos-vastesuhdetta OMP yksin tai yhdessä 5-fluorouracile (5-FU) tai gemsitabiinia (GEM) on hyvin karakterisoitu ihmisen haimasyövän solulinjoissa MiaPaca-2, ASPC-1 , Colo357, Panc1, Panc89 ja PancTu1 in vitro [19] – [21]. Tuloksemme osoittavat, että keskimääräinen estävät pitoisuudet (IC

50) OMP olivat alueella kliinisen soveltuvuus näissä solulinjoissa.

lisätutkimuksia käytimme kahta solulinjaa MiaPaca-2 ja ASPC -1, ja vieressä OMP, sytostaattisen 5-FU voidakseen arvioida spesifisyyden vaikutusten OMP aiheuttaa näissä solulinjoissa.

tutkineet subsellulaariseen ja molekyylitason muutoksia MiaPaca-2 ja ASPC- 1-solut käsiteltiin OMP. Transmissioelektronimikroskopia (TEM) ja protoni-ydinmagneettinen resonanssi-spektroskopia elävien solujen (H-NMRS) suoritettiin. Huomasimme, että modulaatio autophagy on varhainen vaikutus OMP. Lisäksi analyysi subsellulaarisista sisältävien fraktioiden lysosomeihin ja Golgin komplekseja Western blot analyysi ja NMR-spektroskopiaa käsittelemättömän ja käsitellyn MiaPaca-2-soluissa vahvisti, että lysosomeihin ovat tärkeimmät solunsisäisiä tavoite OMP johtavat vaikutukset proteiinin kierrätyksen ja liikenteen väyliä, mukaan lukien Golgi monimutkainen .

tulokset osoittavat, että OMP inhiboivat haimasyövän soluja annoksesta riippuvaisella tavalla, ja luultavasti ei-myrkyllisiä pitoisuuksia in vitro. OMP myös, tehostaa 5-FU: n ja GEM. Lysosomaalisen liikenne polku muuttuu, kun OMP hoito ja autophagy on, suoraan tai välillisesti, moduloitu. Siten OMP voi tarjota käyttöön uusi terapeuttinen lähestymistapa hoitoon haimasyövän.

Tulokset

OMP estää haimasyövän soluproliferaatiota annosriippuvaisesti ja parantaa sytostaatit vaikutuksia GEM ja 5- FU

annosvaikutuskuvaajia OMP, pantopratsolin (PZL), GEM ja 5-FU luotiin käyttäen ATP-bioluminisenssimääritystä. Yksi tavoitteista tutkimustemme oli arvioida kliininen sovellettavuus OMP. Siksi määritettiin IC

50ies sovittamalla kaartaa kolmen parametrin log-logistinen malli. IC

50, on lueteltu taulukossa 1, olivat 9-42 ug /ml OMP, 22-99 ug /ml PZL, 0,004-0,24 ug /ml GEM ja 0,20-0,57 ug /ml 5- FU riippuen solulinjasta.

Nämä annosvaikutuskuvaajia-käyrät (kuvio 1) osoitti asteittaista eroja sigmoidicity ja muut farmakodynaamiset parametrit. On selvää, että pieninä pitoisuuksina lääkkeistä solumäärä voi olla jopa suurempi kuin vastaavana verrokkiryhmässä (arvot yli 1 kuviossa 1) osoittaa, että kasvua stimuloiva vaikutus. Tämä ilmiö, jota kutsutaan hormeesi, joka määritellään overcompensatory vaste elävien organismien eri stressitekijöitä [22], voi selittää vastustuskyvyn kehittyminen kemoterapian aikana [23].

ASPC-1, MiaPaca-2, Colo -357, Panc-1, Panc-89 ja PancTu-1-soluja kasvatettiin ilman tai kun läsnä on ilmoitettua pitoisuudet omepratsoli, 5-fluorouracile, pantopratsoli tai gemsitabiini, vastaavasti, 4 päivää määrittämään IC

50 arvot. IC

50 t ja sigmoidicities vähitellen eri väliin solulinjoista. Pieninä pitoisuuksina lievää kasvua stimuloiva vaikutus (hormeesi) havaittiin.

Siksi tutkimme vaikutuksia OMP yhdistettynä solumyrkyn pieninä pitoisuuksina arvioidakseen sen asemaa chemoresistance ja hormeesi voittaa . Lisäaine, synergistisiä tai antagonistisia keskinäistä vuorovaikutusta kahden lääkkeen voidaan mitata sisällä quasilinear alueen annos-vaikutus-käyrät käyttäen mediaanivaikutus periaate Chou [24] tai yhtenäisenä pinta-ala Greco et al. [25]. Kuitenkin vuorovaikutukset lääkeaineen yhdistelmä on vaikea määrittää varten hormetic annos-vaste-suhteet [26]. On olemassa erilaisia ​​malleja arvioida hormeesi yhden lääkehoitoa [27], [28].

Taulukko 2 esittää vaikuta jae (f

u), joka on solujen määrän liittyvän valvonnan, kun pieninä pitoisuuksina 5-FU: n ja GEM, kun käytetään yksittäisinä aineina. In ASPC-1, Panc-1 ja PancTu-1-solujen merkittävää nousua f

u yli 1 upon 5-FU, mikä osoittaa hormeesi, havaittiin. Sen sijaan ei ollut merkittävää hormeesi upon GEM. Kun OMP lisätään 5-FU näillä pitoisuuksilla hormeesi lieventää että ASPC-1, Panc-1 ja PancTu-1-solulinjoja (kuvio 2). In MiaPaca-2 solujen OMP ja 5-FU yhdistelmällä osoitti additiivisia vaikutuksia, että Panc-89 solulinjaa OMP johti antagonistista vuorovaikutusta. Vuonna Colo357 soluissa ei annosvaikutuskuvaajia-käyrää voitaisiin perustaa johtuen suurista keskivirheet. GEM ja OMP osoittivat lisäaineen tai antagonistisia vuorovaikutuksia (tuloksia ei ole esitetty).

solulinjat ASPC-1, MiaPaca-2, Colo357, Panc-1, Panc89 ja PancTu1 olivat käsittelemättömiä tai käsiteltiin 5-FU yksin tai yhdessä osoitettujen konsentraatioiden OMP 4 päivää. Alemmilla annoksilla 5-FU yksinään (mustat viivat, 0 ug /ml OMP) kasvua stimuloivaa vaikutusta (hormeesi) havaittiin solulinjoissa ASPC-1, Panc-1 ja PancTu-1. Datapisteet osoittavat keinoja 8 mittausta. Käyrät on sovitettu näissä solulinjoissa käyttäen Brain-Cousens malli (katso jäljempänä kohta 4.11). In MiaPaca-2 ja Panc-89 soluja ei hormeesi tapahtunut, nämä käyrät sovitettiin käyttäen kolmea parametrin logistista mallia. Vuonna Colo357 soluissa käyrät ei voida asentaa mitään farmakodynaamista mallia johtuen suurista keskivirheet näillä pienemmillä pitoisuuksilla (datapistettä esitetty). Punainen, vihreä ja sininen viivat osoittavat annos-vaikutuksen käyrät 5-FU, kun erilaisia ​​pitoisuuksia OMP lisättiin (10, 20 ja 40 ug /ml, vastaavasti). In ASPC-1 ja Panc-1 solujen hormeesi 5-FU oli päinvastainen ja PancTu-1 solussa se lievensi OMP riippuen pitoisuus on 5-FU. In MiaPaca-2-solut löysimme lisäainetta vuorovaikutus 5-FU kanssa OMP. In Pancin-89-solujen vuorovaikutus oli antagonistinen.

Näin OMP on annoksesta riippuvainen antiproliferatiivinen vaikutus ja in vitro IC

50 OMP näissä tukevat oletusta kliinisten sovellettavuus (jota käsitellään keskustelussa jaksossa). Kuitenkin annos-vaikutus suhdetta huumeiden vaihteli solulinjat. Yhdistetyt hoito OMP joko 5-FU: n tai GEM paljasti annoksesta riippuvan lisäaineen vuorovaikutukset ja lieventäminen hormetic kasvun stimulaatio pieniannoksisen 5-FU: ASPC-1, Panc1 ja Panc89 soluja. .

solulinja erityisiä muutoksia intralysosomal pH käsittelyn jälkeen haimasyövän soluja OMP ja 5-FU: joko yksin tai yhdistelmänä

Akridiini oranssi (AO) fluoresenssimikroskopialla suoritettiin sen määrittämiseksi, onko OMP lisää intralysosomal pH kuvatun viimeaikaisissa raporteissa, joko estämällä vATPase [10], tai keräämällä sisällä lysosomeihin [11]. Happamia soluluokille värjätään punaista ja neutraaleja osastot värjätään vihreä mukaan AO. Spesifinen esto on vATPase mukaan bafilomysiini A1 on osoitettu johtavan nopeaan inhibitio punaisen fluoresenssin [29], [30].

punainen-to-vihreän fluoresenssin suhde määrällisesti kvantitatiivisen kuva-analyysin MiaPaca -2 ja ASPC-1-solut on esitetty kuvassa 3. varhaisista muutoksista (30 minuutin kuluttua hoidon) muodostui hieman suurempi happamuus, kun 5-FU hoidon MiaPaca-2 soluissa ja ASPC-1-soluja käsiteltiin OMP tai OMP + 5-FU. 24 tunnin kuluttua, lysosomaalisen happamuus MiaPaca-2-soluissa oli vähitellen, mutta merkittävästi tukahdutti OMP, 5-FU: n ja OMP + 5-FU. Kuitenkin nämä havainto ei yksiselitteisesti vastaa edellä mainittujen raporttien, koska vaikutus ei ollut spesifinen OMP. In ASPC-1-soluja, kaikki kolme hoito-ohjelmien johti hieman korkeampi happamuus 24 tunnin kuluttua.

akridiinioranssia lisättiin elävän käsittelemättömän ASPC-1 ja MiaPaca-2-soluja ja soluja käsiteltiin 5-FU, OMP tai yhdistelmä 30 minuuttia tai 24 tuntia. Mikroskooppisen elämä kuvat otettiin 525 nm (vihreä) ja 650 nm (punainen) muutosten havaitsemiseksi lysosomaalisen pH-arvo (kolme kuvaa per levy, kolme levyä ryhmää kohden). Punainen vihreä fluoresenssin suhde lysosomeihin käsiteltyjen solujen verrattiin kontrolliryhmiin, jotka Mann-Whitney-U-testillä. Merkittäviä eroja kontrolliin verrattuna on merkitty *. In ASPC-1-soluissa, sen jälkeen kun 30 minuutin hoidon, intralysosomal happamuus lisääntynyt käsittelemällä OMP (p: 0,0051) ja 5-FU + OMP (p 0,0001). 24 tunnin jälkeen happamuus on lisääntynyt kaikkia hoito-ohjelmat (5-FU – p: 0.0002, OMP – p 0,00001; OMP + 5-FU – p: 0,037). In MiaPaca-2 solujen happamuus nostetaan 30 min upon 5-FU (p: 0.005) ja väheni käsittelyn jälkeen OMP (p: 0,037), 5-FU (p: 0,00026) ja 5-FU + OMP (p: 0,011) 24 tunnin kuluttua.

Näin ollen voimme todeta, että OMP ei aiheuttanut johdonmukaista muutoksen intralysosomal pH-arvo haimasyövän soluja. Kuitenkin vähäistä estämistä tapahtunut MiaPaca-2-soluissa kaikkia hoitoja mukaan 24 tunnin kuluttua. Sen sijaan, ASPC-1-solut oli suurempi lysosomaalisen happamuutta, kun niitä käsitellään OMP, 5-FU tai molempia.

Phagophores ja autophagosomes kerääntyä ASPC-1 ja MiaPaca-2-soluissa sen jälkeen, kun OMP hoidon

toistaiseksi tulokset viittaavat siihen, että vATPase esto ja lysosomaalisen pH korkeutta eivät olleet tärkein aiheuttamia OMP in MiaPaca-2 ja ASPC-1 solulinjoissa. AO fluoresenssimikroskopiaan kuitenkin paljasti, että lysosomeihin olivat mukana sekä OMP- ja 5-FU-välitteisen proliferaation esto. Siksi tutkimme subsellulaarisista morfologiset muutokset hoidon jälkeen OMP, 5-FU ja molempia TEM.

Kuva 4 verrataan hoitamattomaan ASPC-1 solun (kuvio 4 A) käsiteltyjä soluja 160 ug /ml (kuvio 4B) ja 80 ug /ml OMP (kuvio 4C) 24 tunnin ajan. Käsittely 80 ug /ml OMP johti autophagy kuten ulkonäkö varhaisen kuppimaisen phagophores sisältävät sytoplasmisen materiaalin ja autophagosomes täytetty päällystetyn vesikkelit (kuvio 4C). Käsittelyn jälkeen 160 ug /ml OMP, The ASPC-1-soluissa tehtiin apoptoosia jälkeen 24-48 tuntia (kuvio 4B). Samanlaisia ​​muutoksia havaittiin MiaPaca-2-solut käsiteltiin 80 ug /ml OMP lukien Vakuolisaatiota kuin samanaikainen merkkinä apoptoosin (kuvio 4D).

(A) ASPC-1 solun ilman hoitoa (800-kertainen). (B) ASPC-1 solun apoptoosin upon 160 ug /ml OMP 24 tunnin kuluttua (800-kertainen). Vakuolisaatiota ja sytoplasmaan ja kondensaatio tuman ovat näkyvissä. (C) Phagophores ja autophagosomes on segmentti ASPC-1 käsitelty solu omepratsolia 80 ug /ml 24 tuntia (2800fold laajentuminen). Phagophores on tunnusomaista kuppimainen (valkoiset nuolet). Autophagosomes ovat suljettu partikkeleita, joiden määrä on lisääntynyt käsitellyissä soluissa (mustat nuolet). (D) Early phagophores ja autophagosomes esiintyy myös MiaPaca-2: lla käsiteltyjen solujen OMP 80 ug /ml sen jälkeen, kun 24 tuntia perinuclear alueen, joka sisältää lysosomeihin ja Golgin monimutkainen. Toisin kuin ASPC-1-soluja, varhaiset merkit apoptoosin kuten vakuolisaatiota, ovat myös läsnä. (E) BarChart lukumäärästä autophagosomes ja lysosomeihin per solu MiaPaca-2 ja ASPC-1-solut käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 5-FU, OMP tai molempia 24 tuntia keskivirheet. Merkittäviä eroja kontrolliin verrattuna on merkitty *. In ASPC-1-soluissa oli merkittäviä eroja verrattuna valvonnan OMP ryhmässä (p: 0.03) ja 5-FU + OMP (p: 0.03). In MiaPaca-2-solujen 5-FU + OMP ryhmä poikkesi merkittävästi kontrolli (p 0,001).

Vaikka phagophores oli helppo tunnistaa ainutlaatuisia morfologisia ominaisuuksia, autophagosomes, lysosomeihin endosomeista ja autolysosomes voinut erotettava TEM. Merkittävästi suurempia määriä kaikkia näitä lysosomifuusio kaltaiset organells havaittiin ASPC-1-solut käsiteltiin OMP tai OMP + 5-FU ja MiaPaca-2-solut käsiteltiin OMP + 5-FU (kuvio 4E).

Yhteenvetona, OMP johti kertyminen merkkiaineiden alkuvaiheessa autophagy (autophagophores) molemmissa solulinjoissa. Vaikka merkkiaineita myöhempiin vaiheisiin, kuten autolysosomes, ei voitu erottaa morfologisesti muista lysosomaalisissa liikenteen väyliä, kokonaismäärä lysosomifuusio kaltaisten organelles kasvoi ASPC-1-solujen käsittelyllä OMP tai 5-FU + OMP ja MiaPaca-2 soluja käsiteltiin 5-FU + OMP. Nämä havainnot viittaavat siihen, että joko aktivoituminen proteiinin liikevaihdon tai vajaatoiminta lysosomaalisen liikenteen reitin tapahtunut.

tunnistaminen metabolisia muutoksia elävien solujen hoidon jälkeen OMP, 5-FU tai molempia

Protoni-NMR-spektroskopia elävien solujen suoritettiin MiaPaca-2 ja ASPC-1 solulinjojen jotta analysoida biokemiallisten prosessien liittyvät morfologiset muutokset edellä kuvatulla tavalla. Erilaiset ominaisuus pienimolekyylinen solunsisäisten metaboliittien kuten rasvahapot, aminohapot, kalvoon liittynyt fosfolipidiä mebolites ja väli- sitraatti aikana ja glykolyysin metaboliitit tunnistettiin (kuvio 5).

Solut kerättiin yksikerrosviljelmä, säilytetään ja mitataan 20 ° C: ssa. Mittaus suoritettiin käyttäen 600 MHz: n Bruker -spektrometrillä. Paremman näkyvyyden osa spektristä, jossa protonien alifaattiset ryhmät on halkaistu 2 osaan – A ja B (A). alifaattisessa osassa I. metyyli ja β- ja γ- metyleeniryhmää erilaisia ​​rasvahappoja ja aminohappoja ovat näkyvissä. Lisäksi isopropanolia ja tetrachlorethan (ulkoinen pitoisuus standardi) tapahtui kuin päästön. (B) Alifaattiset osa II. Fosfolipidiä metaboliitit ja α-metyleeni aminohappojen ryhmät ja laktaatti ovat näkyvissä. (C) kaavan OMP numeroinnin vastaavien protonien. Metyyliryhmät (1-3, 9) ja metyyli-ryhmä (4) kuuluvat muiden aineenvaihduntatuotteiden alifaattisen spektrin osissa. Sen sijaan aromaattiset protonit ovat näkyvissä (H5, H8, H10). (D) Overlay aromaattisen osia eri spektrien solunsisäisen tunnistamiseen OMP. Singulet H5 protonin ja dublets ja H8 ja H10 protonit voidaan tunnistaa, kun keskipitkällä ja solun spektrit verrataan ilman OMP hoitoa. Lyhenteet: His – histidiini, Tyr – tyrosiini, Phe – fenyylialaniini, Leu, Ile, Vai – leusiini, isoleusiini, valiini. Ala – alaniini. Glu – Glutamaatti, Gin – glutamiini, PC – fosfatidyylikoliini, Cho – koliini, GPC – glycerophosphocholine, Tau – tauriini, Scyllo – scylloinositole.

OMP itse havaittiin solun sisällä molemmissa solulinjoissa hoidon jälkeen 80 ug /ml 24 tunnin ajan. Signaalit Aromaattisen H8 ja H10 protonien OMP (kuvio 5C) on helppo tunnistaa (kuvio 5D) in MiaPaca-2-soluissa. OMP tunnistettiin myös sisällä ASPC-1-soluja, jotka H5 protoni (tuloksia ei ole esitetty). Tietääksemme tämä on ensimmäinen kerta, kun OMP on havaittu solujen sisällä.

Vaikka määrittämiseksi absoluuttisen solunsisäisten pitoisuuksien NMR-spektroskopialla on yleensä altis systemaattisia virheitä, laskettaessa kiinteä suhde eri signaalien voi sisältää hyödyllistä kvantitatiivista tietoa metaboliareittiä. Nämä metaboliareittiä on esitetty vahvasti yksinkertaistettu verkko ASPC-1-soluja kuviossa 6 ja MiaPaca-2-solujen kuvassa 7. viiva kahden signaalin välinen symboloi metabolisen reitin. Viiva on oranssi, kun signaali voimakkuus suhde kytketty aineiden eroaa ohjaus p 0,05 ja punaisena, kun p on alle 0,01.

ASPC-1 solulinja on esitetty ilman ja kun eri hoito-ohjelmat ( OMP, 5-FU tai 5-FU + OMP yhdistelmä). Solmut Tämän verkoston symboloivat metaboliitti signaaleja, niiden värit vastaavat suhteellinen signaalin voimakkuus (verrattuna ulkoiseen standardiin) esitettyjä heatmap mittakaavassa alla. Signaali-intensiteetti on suoraan verrannollinen solunsisäistä pitoisuutta. Taustalla solmuista jätetään tyhjäksi, kun signaali voimakkuus on pois alue osoitetaan lämpökartta mittakaavassa. Linjat välillä laatikoiden symboloivat voimakkaasti yksinkertaistettu metaboliareitteihin. Värit Näiden viivat osoittavat merkittäviä eroja signaalin voimakkuuden suhteet kytketty aineenvaihduntatuotteiden verrattuna kontrolliryhmään, kun oranssi (p 0,05), punaiset viivat osoittavat p 0,01. Ilmeisin muutokset on, että PC /Cho suhde on huomattavasti pienempi OMP ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään. Kun 5-FU, Cho /Acetate suhde vähennys on ainoa merkittävä muutos. 5-FU + OMP ryhmä, on useita merkittäviä muutoksia, i.e.the FACH2 /CH = CH-suhde on huomattavasti suurempi. Lisäksi Cho /asetaatti-suhde muuttui, kun 5-FU + OMP kuin 5-FU ryhmässä, mutta myös sitraatti /GSH-suhde. Solu biokemiallisia vaikutuksia liittyy pääasiassa rasvahappojen ja fosfolipidiaineenvaihduntaan osoittaa solukalvon anaboliaa. Lyhenteet: Gin – glutamiini, Ala – alaniini, PC – fosfatidyylikoliini, Cho – koliini, Lac1 + FACH2 – metyyliryhmä signaalin laktaatin ja metyleeniryhmää rasvahappojen, lac2 – metyleeniryhmä laktaatin, CH = CH – protonien methin ryhmien tyydyttymättömiä rasvahappoja.

solulinja on esitetty ilman, ja kun eri hoito-ohjelmien (OMP, 5-FU tai 5-FU + OMP yhdistelmä). Solmut Tämän verkoston symboloivat metaboliitti signaaleja, niiden värit vastaavat suhteellinen signaalin voimakkuus (verrattuna ulkoiseen standardiin) esitettyjä heatmap mittakaavassa alla. Signaali-intensiteetti on suoraan verrannollinen solunsisäistä pitoisuutta. Taustalla solmuista jätetään tyhjäksi, kun signaali voimakkuus on pois alue osoitetaan lämpökartta mittakaavassa. Linjat välillä laatikoiden symboloivat voimakkaasti yksinkertaistettu metaboliareitteihin. Värit Näiden viivat osoittavat merkittäviä eroja signaalin voimakkuuden suhteet kytketty aineenvaihduntatuotteiden verrattuna kontrolliryhmään, kun oranssi (p 0,05), punaiset viivat osoittavat p 0,01. Kun OMP, PC /Cho suhteet ovat huomattavasti alhaisemmat verrattuna kontrolliin. Lisäksi asetaatti /FACH2 suhde on merkittävästi vähentynyt OMP ryhmässä. Jälkimmäinen oli myös korkeampi CH = CH tasolla, suhde FACH2 on kuitenkin vähentynyt. Kun 5-FU ja 5-FU + OMP, samanlaisia ​​muutoksia voitiin havaita. Lisäksi, toisin kuin ASPC-1-soluissa, Ala /Gln /AMP-reitin on myös mukana. Lyhenteet: Gin – glutamiini, Ala – alaniini, PC – fosfatidyylikoliini, Cho – koliini. Lac1 + FACH2 – metyyliryhmä signaalin laktaatin ja metyleeniryhmää rasvahappojen, lac2 – metyleeniryhmä laktaatin, CH = CH – protonien methin ryhmien tyydyttymättömiä rasvahappoja.

Kalvoproteiineilla rasvahappojen hapot ovat yleensä NMR-näkyvissä vain käytettäessä Magic-Angle-Spinning (MAS) tekniikka [31]. Sen sijaan mobiili monityydyttymätön rasvahappo (PUFA) ryhmiä (so. CH = CH, 5,3 ppm tai CH = CHCH2CH = CH 2,8 ppm), joka on yhdistetty muodostumista rasva-tippaa autophagosomes aikana autophagy ja ohjelmoidun solukuoleman (PCD) [32], tuli näkyvästi protoni-NMR-spektrit MiaPaca-2-solut käsiteltiin OMP tai 5-FU + OMP. Lisäksi kasvuun rasvahappo metyleeni (FACH2) ryhmät kuin asetaatti havaittiin, kun OMP ja 5-FU + OMP hoidon MiaPaca-2-, mutta ei ASPC-1-soluissa. Tämä korreloi elektronimikroskoopilla tietoja, jotka osoittavat, että morfologiset muutokset liittyvät autophagy liittyy vakuolisaatiota mikä viittaa alussa apoptoosin MiaPaca-2, mutta ei ASPC-1-soluja, 80 ug /ml: n OMP.

Cho ja Fosfokoliinin (PC) signaalit ovat indikaattoreita kasvun ihmissoluissa, jolloin kohonnut PC liittyy nopeaan lisääntymiseen ja pahanlaatuisten käytös [33] – [35]. Tukahduttaminen PC voi johtua koliinikinaasi ja fosfolipaasi C downregulation ja fosfolipaasi A2: induktio johtaa leviämisen estäminen [36]. Tutkimuksessamme PC oli merkittävästi tukahdutti verrattuna Cho MiaPaca-2: lla käsiteltyjen solujen OMP, 5-FU: n ja 5-FU + OMP ja ASPC-1-soluja käsiteltiin OMP yksin.

Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että rasvahapon ja fosfolipidin metaboliitti signaaleja vaihdetaan, kun OMP hoitoon. Vaikka samanlaisia ​​muutoksia havaittiin sekä ASPC-1 ja MiaPaca-2-soluissa, nämä muutokset enemmän parannettu MiaPaca-2-soluissa, erityisesti niiltä osin kuin signaali muuttuu ilmaisee esti lisääntymistä (PC) ja PCD (PUFA). Tämä vastaa edellä kuvattua farmakodynaamisten ja morfologisia muutoksia. Kuitenkin MiaPaca-2 solujen biokemiallisia vaikutuksia ei rajoitu OMP hoitoon, mutta myös tapahtunut upon 5-FU ja 5-FU + OMP ja näin ollen voida katsoa olevan erityinen OMP.

osallistuminen lysosomeihin ja Golgin monimutkainen soluvasteen OMP

Mahdolliset subsellulaariseen tavoitteet OMP tunnistettiin eristämällä organelles päässä MiaPaca-2-solujen tiheyssentrifugaatiolla. Kuten kuviossa 8 on esitetty, ensimmäinen ja toinen tiheyden fraktiot sisälsivät varhaisen ja myöhäisen endosomeihin ja lysosomeihin, jotka tunnistettiin LAMP-1 ja Katepsiini-D-vasta-aineita (kuvio 8B) kontrolliryhmässä. Kun OMP käsitellyssä ryhmässä, näitä proteiineja havaittiin vain ensimmäinen fraktio. Kolmas osa kontrolliryhmän sisälsi Golgi kompleksin kuten on esitetty β-COP-vasta-ainetta. Kuitenkin tämän proteiinin ilmentymisen pienentynyt, kun OMP hoitoa. Protoni-NMR-spektrit Näiden fraktioiden on esitetty kuvioissa 8A ja 8C. Kuvio 8A esittää signaalin tehtävät vertaamalla spektrit näistä fraktioista (nimeltään F1-F3) kuin jodiksanoli (Optiprep), ja lysosomaalisen solun osa käsittelemättömien solujen (F1 *), joka pestiin kerran PBS-liuoksella ultrasentrifugaation jälkeen (toisin jakeet F1-F3, joka pestiin kahdesti). Jodiksanoli tapahtui kaikissa jakeet, mutta väheni pesun jälkeen ultracentrifugates kahdesti. Tämä viittaa siihen, osittainen sisällyttäminen jodiksanoli kalvoihin tai ontelon organelles. Useimmat vesiliukoiset alhaisemman molekyylipainon aineet vähenivät myös F1-F3, kuten laktaatti ja sitraatti, verrattuna F1 *, jotka viittasivat huuhtoutumisen. Eheyden soluelimiin olivat veryfied käyttämällä ulkoista standardia (tetrachlorethan) kemiallisen shift kalibrointia. Oli pH-riippuvaista siirtymä sitraatin signaaleja kohti happamoitumisen lysosomaalisen fraktiot verrattuna koko solun suspensiot.

(A) peitto on protoni-NMR-spektri fragmentteja seuraavat suspensioiden (ylhäältä alas) : käsittelemätön ensimmäinen (lysosomaalisen) solufraktio jälkeen ultracentrifgation ja yksi pesu (F1 *), iodixanole (Optiprep) jousitus, alempi (F3), keskimmäinen (F2) ja ylempi osa (F1) on ultracentrifugates jälkeen kaksi pesua. Kemialliset siirtymät spektrit kalibroidaan koliini /fosfatidyylikoliinia (Cho /PC) signaali. Paitsi jodiksanoli, voisimme tunnistaa PUFA ryhmät (metyleeniryhmää sijaitsee kahden CH = CH ryhmiä), Cho /PC ja glycerophosphocholine (GPC) F1 * ja F1-3. Lisäksi havaitsimme laktaatti ja metyleeniryhmää rasvahappojen (1,3 ppm), sitraatti (2,55 ja 2,7 ppm) ja fosfoetanolamiinia (3,1 ppm) F1 * mutta ei F1-F3 ryhmien .. (B) Western blot-analyysi LAMP-1, myöhään endosomissa markkeri, joka lähes identtisesti jakautunut kahteen ensimmäiseen jakeet verrattuna katepsiini-D, että controle ryhmässä, mutta ocurred vain ensimmäiseen fraktioon OMP hoidetussa ryhmässä. β-COP indikaattorina Golgin-kompleksi, löytyy voimakkaasti alemmassa jae kontrolliryhmässä, mutta hyvin heikosti OMP hoidetussa ryhmässä. Katepsiini – D, varhainen endosomissa markkeri, joka löytyy ylä- ja keskellä osa kontrolliryhmässä, mutta koskien OMP ryhmä, se löytyy vain ensimmäinen. (E) Overlay NMR-spektri kaikkien fraktioiden valvonnan ja OMP. Merkittävimmät ero on vieroittamiseen GPC-signaalin jälkeen OMP hoidon 1. murto jälkeen vain 6 tuntia.

Toisin kuin kokosolu-spektri (katso kuva 5B), glycerophosphocholine (GPC) oli sijaitsevat ensimmäisessä (lysosomaalisen) fraktio. Verrattaessa säädin OMP-hoidetussa ryhmässä (kuvio 8C), GPC signaali on selvästi vähentynyt, kun OMP hoitoa. Lisäksi kasvu PUFA OMP-käsitellyssä ryhmässä oli varmistunut (kuvio 8C), analogisesti kokosolu-spektrit. OMP ei voitu tunnistaa missään näistä murtolukuja ja näin ollen todennäköisesti ei kerry lysosomeihin tai Golgin monimutkainen. Tämä korostaa havainto, että endosomissa ja lysosomin jakeet tehtiin anabolisia muutosten aikana OMP hoidon (vastaa TEM data). Kuitenkin Golgin monimutkainen kuin merkittävän osan lysosomaalisen liikennejärjestelmän, on myös mukana.

määritys autophagic toiminnan

Suoritimme LC3-Western blot analyysi muutosten havaitsemiseksi ilmaus LC3 . LC3-geenin ilmentymisen korreloi hyvin useissa autophagosomes [37], [38]. Lisäksi kaksi jaetta voidaan yleensä eriyttää – LC3-I ja LC3-II. Ensimmäinen occures vuonna autophagophores ja pidetään autophagy induktio indikaattori, jälkimmäinen on sisällä autophagosomes ja hajoaa, kun niiden fuusio lysosomeihin in autolysosomes.