Krooninen sairaus

tiivistelmä

tiosemikarbatsonien (TSC) ovat mielenkiintoinen luokka ligandeja, jotka osoittavat monipuolisia biologista aktiivisuutta, kuten anti-sieni, anti-virus ja anti-syöpä vaikutuksia. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet voimakas

in vivo

antituumorivaikutuksen uudenlaisten TSC: iden ja niiden kyky voittaa vastustuskyvyn kliinisesti käytetty kemoterapeuttisia. Nykyisessä tutkimuksessa 35 novel TSC 6 eri luokkiin suunniteltiin yhdistämällä retro-fragmenttien, jotka näkyvät TSC. Lisäksi di-substituutio terminaalin N4 atomi, joka oli aiemmin tunnistettu olevan kriittinen voimakas syövän vastainen vaikutus, oli säilynyt läpi sisällyttäminen N4-pohjainen piperatsiini- tai morfoliinirengas. Anti-proliferatiivista aktiivisuutta uuden TSC tutkittiin eri syövän ja normaalin solutyyppejä. Erityisesti, yhdisteet, 1d ja 3c osoitti suurimman lupauksen syöpälääkkeiden kanssa tehokas ja selektiivinen anti-proliferatiivista aktiivisuutta. Rakenne-aktiivisuus-suhde tutkimukset paljastivat, että kelaattorit, että käytetään ”pehmeä” luovuttaja-atomia, kuten typen ja rikin, tuloksena on voimakas syövän vastainen vaikutus. Todellakin,

N

,

N

,

S

luovuttaja-atomi setti oli ratkaiseva muodostumista redoksiaktiivinen raudan kompleksit, jotka pystyivät hapetuksen välittämiseksi askorbaatin. Tämä korostaa entisestään tärkeää roolia reaktiivisen hapen sukupolvi välittämisessä voimakas syövän vastainen vaikutus. Merkittävää tässä tutkimuksessa tunnistettu tehokas ja selektiivinen syövän vastaisen aktiivisuuden 1d ja 3 c, joka oikeuttaa lisätutkimuksia.

Citation: Serda M, Kalinowski DS, Rasko N, Potůčková E, Mrozek-Wilczkiewicz A, Musiol R, et ai. (2014) Exploring Anti-Cancer aktiivisuus Novel tiosemikarbatsonien luomaa kautta Yhdistelmä Retro-Fragments: Dissection of Critical Structure-Activity Relationships. PLoS ONE 9 (10): e110291. doi: 10,1371 /journal.pone.0110291

Editor: Ashley I. Bush, University of Melbourne, Australia

vastaanotettu: 07 elokuu 2014; Hyväksytty 10 syyskuuta 2014; Julkaistu 16. lokakuuta 2014

Copyright: © 2014 Serda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Tietopaketti.

Rahoitus: Kirjoittajat arvosti taloudellista tukea Twing ja DoktoRIS PhD apurahoja, NCN (DEC-2011/01 /N /NZ4 /01166, 2013 /09 /B /NZ7 /00423 ja N405 /068440), ja National Center for tutkimuksen ja kehityksen, Warsaw (Organomet nro: PBS2 /A5 /40/2014 apurahat). Tätä työtä tukivat myös Project Grant National Health ja Medical Research Council (NHMRC) Australiasta DRR [Grant 632778]; ja DSK [Grant 1048972]; NHMRC Senior Principal Research Fellowship DRR [Grant 571123]; ja Helen ja Robert Ellis Fellowship DSK päässä Sydney Medical School Foundation of The University of Sydney. EP ja TS arvostavat myös tukemiseksi Czech Science Foundation Grant [13-15008S]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Rauta on keskeinen elementti, joka on välttämätöntä useiden solun prosessien, kuten solujen lisääntymisen [1], [2], [3]. Itse asiassa, rautaa sisältävä entsyymi, ribonukleotidi- redutase, on mukana nopeutta rajoittava vaihe DNA-synteesiä, ja se on vastuussa ribonukleotidien muuntaminen niiden deoksiribonukleotidi kollegansa [4], [5]. Mikä tärkeintä, muutokset rauta aineenvaihduntaa syöpäsolujen suhteessa niiden normaaliin kollegansa ovat korostaneet mahdollisia raudan kelaatiohoitoa toimimaan uutena hoitoa avenue. Syöpäsolut osoittaa korkeampi vaatimus raudan kuin normaalit solut, ja tämä korostuu lisääntynyt ilmentyminen transferriini-reseptori 1 (TfR1), joka vie rautaa raudan kuljetusta proteiinia, transferriini (Tf), solun pinnalla [6] [7], [8]. Lisäksi, ekspression riippuvaisia ​​raudasta entsyymi, ribonukleotidireduktaasi, on selvästi korkeampi tuumorisoluissa kuin normaaleissa soluissa [9]. Nämä tekijät tekevät kasvainsolujen herkempiä rautakelaattikromatografia-.

Vaikka rautakelaattorit (

esim

, desferrioksamiinia; DFO) on kliinisesti käytetty hoitoon raudan ylikuormitus taudin [1], [3 ], uusi tiosemikarbatsonia (TSC) kelaattorit on laajalti tutkittu mahdollisina syöpälääkkeet [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Vaikka molekyylitason mekanismeja toimintaa TSC: iden ei ole täysin selvitetty, useat toimintatavat on raportoitu [3], [15], [21], [22], [23]. Tämä sisältää:

(

1

)

estää solun raudan oton välillä Tf [10], [13], [18];

(

2

)

liikkeelle rauta soluista [10], [13], [18];

(

3

)

estyminen ribonukleotidireduktaasin toimintaa [24], [25];

(

4

)

ylös-säätely etäpesäke soriproteiini, N-myc alavirtaan säännelty geeni 1 [26], [27], [28], [29]; ja

(

5

)

muodostuminen redoksiaktiivinen metallikompleksit, jotka tuottavat reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) [10], [15], [21], [23 ], [30]. Tämä jälkimmäinen mekanismi on merkittävä, etenkin kun tutkimukset ovat osoittaneet tärkeän roolin ROS sukupolvi kasvattamisessa selektiivinen aktiivisuus kelaattorien kasvainsoluja vastaan ​​[10], [15], [21].

TSC, 3- aminopyridiini-2-karboksaldehydiä tiosemikarbatsonia (Triapine, Fig. 1), on tarkasteltu 20 vaiheen I ja II kliinisissä kokeissa uutena syövän kemoterapia-[11], [31], [32], [33], [34 ], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]. Vaikka kliinisissä tutkimuksissa Triapine ovat yleensä osoittaneet rajoitettu antituumorivaikutuksen [36], [37], [38], [40], muut tutkimukset ovat osoittaneet positiivisia tuloksia paikallisesti levinnyt kohdunkaulan ja emättimen syöpien, kun sitä annetaan yhdessä sisplatiinin ja radiochemotherapy [33], [34]. Merkittäviä sivuvaikutuksia huomioitava Triapine antoon sisältävät methemoglobiinia muodostumista ja hypoksia [35], [39], [41] ja nämä ongelmat ovat edellyttäneet kehittämään muita aktiivisempia ja selektiivinen TSC voimakkaiden syövän vastainen vaikutus.

useita luokkia TSC on kehitetty mahdollisina antiproliferatiivisia aineita (Fig. 1), joka on määrä, jotka osoittavat merkitty ja selektiivisiä tuumorin vastaista aktiivisuutta sekä

in vitro

[10], [15] , [21], [42] ja

in vivo

[12], [21], [26], [42]. Esimerkiksi viiden päivän hoidon di-2-pyridylketon 4,4-dimetyyli-3-tiosemikarbatsonia (Dp44mT, Fig. 1), 0,4 mg /kg hiirillä vähensi kasvua hiiren M109 keuhkosyöpä ja 47% ohjaus [21]. Lisäksi Dp44mT osoitti tehokas ja selektiivinen antituumorivaikutus

in vitro

ja

in vivo

vastaan ​​erilaisten ihmisten tuumoriksenografteja [42] ja pystyi muodostamaan redoksiaktiivinen metallikomplekseja, jotka tuottavat ROS [15], [21], [30]. Vaikka tämä TSC osoitti suurta potentiaalia, se osoitti sydänfibroosi korkealla, ei-optimaalisia annoksia [42]. Näin ollen, jatkotutkinnan Dp44mT analogit olivat välttämättömiä ja ovat johtaneet kehittämiseen di-2-pyridylketon 4-sykloheksyyli-4-metyyli-3-tiosemikarbatsonia (DPC, Fig. 1) [12], [26]. DPC on osoittanut selektiivisiä

in vitro

ja

in vivo

antituumorivaikutuksen Sekä laskimoon [12], [26] ja suun reitit [12] ja parhaillaan arvioidaan lisäksi sisäänkäynti kliinisiin kokeisiin. Viime aikoina muita TSC: iden on myös osoitettu olevan uusi hakemuksen fotodynaamiseen parantajina [43].

Olemme aiemmin tutkinut erilaisia ​​kinoloni-pohjainen TSC: iden, jotka osoittavat

in vitro

anti- lisääntymisaktiivisuus [16]. Nykyisessä tutkimuksessa, syntetisoimme 35 novel TSC 6 luokat, jotka on suunnitellut yhdistelmän aktiivisten fragmenttien läsnä aiemmin raportoitu analogit [16], [44]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että di-korvaaminen terminaalissa (N4) typpi on ratkaiseva tehokasta syövän vastaista aktiivisuutta [12], [21]. Tässä tutkimuksessa olemme säilynyt di-substituutio N4 atomi rakentamalla N4-pohjainen piperatsiini- tai morfoliinirenkaan, fragmentti, joka on läsnä useita aktiivisia TSC [45], [46]. Anti-proliferatiivista aktiivisuutta ja selektiivisyyttä näiden uusien TSC tutkittiin

in vitro

ihmisen syöpäsolujen-tyypit ja normaalin ihmisen ihon fibroblasti (NHDF-solut). Ne sarja, joka osoitti kyky muodostaa redoksiaktiivinen raudan kompleksit ja hapetuksen välittämiseksi askorbaatin osoittivat voimakas anti-proliferatiivista aktiivisuutta, korostetaan ROS sukupolvi niiden syövän vastainen vaikutus.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit hankittiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), ACROS Organics (Geel, Belgia) tai Princeton Chemicals Ltd (Luton, Bedfordshire, UK). Silikageeliä 60 (0,040-0,063 mm, Merck, Darmstadt, Saksa) käytettiin pylväskromatografialla. Ohutkerroskromatografia (TLC) kokeet suoritettiin alumiinioksidilla tukema silikageeli 40 F

254-levyillä (Merck). Levyt valaistiin UV (254 nm) ja arvioitu jodikaasulle. Sulamispisteet määrät määritettiin Optimelt MPA100 väline (Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA, USA) ja ne ovat korjaamattomia. Korkean resoluution massaspektrometria (HRMS) analyysi tehtiin kaikille uusia yhdisteitä Finnigan MAT95 spektrometri (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Saksa) tai on Mariner ESI-TOF spektrometri (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific).

Kaikki

1 H- ja

13C-NMR-spektrit rekisteröitiin Bruker AM-400 spektrometrillä (399,95 MHz

1 H; 99,99 MHz

13C, BrukerBioSpin Corp., Coventry, Iso-Britannia) . Kemialliset siirtymät ilmoitetaan ppm vastaan ​​sisäistä standardia, Si (CH

3)

4. Helposti vaihdettavissa signaaleja jätettiin pois, kun hajanainen. Synteesit suoritettiin CEM-DISCOVERY -mikroaaltoreaktoria (CEM Corporation, Matthews, NC, USA) lämpötilan ja paineen säätö.

Log

P

lask arvot laskettiin käyttäen ChemDraw 12 (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) suorittamalla Crippen n pirstoutuminen [47], Viswanadhan n pirstoutuminen [48] ja Broto menetelmällä [49] ja sen jälkeen laskemalla keskiarvo log

P

lask.

synteesi tiosemikarbatsidia esiasteiden (a-f) B

Yleinen menetelmä I

N

alkyylillä tai

N

aryyli piperatsiinia ( 6 mmol) lisättiin liuokseen, jossa oli 1,1′-tiokarbonyylidi-imidatsolia (6 mmol; 1,068 g) 25 ml: ssa dikloorimetaania, ja reaktioseosta sekoitettiin 24 tuntia huoneenlämpötilassa. Orgaaninen liuotin erotettiin ja uutettiin 3 kertaa vedellä, sitten kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja konsentroitiin, jolloin saatiin raakaa piperatsiinijohdannaisten. Nämä raa’at tuotteet käytettiin seuraavassa vaiheessa ilman lisäpuhdistusta. Nämä välituotteet lisättiin liuokseen, jossa oli hydratsiinihydraattia 25 ml: ssa etanolia huoneenlämpötilassa. Reaktioseos refluksoitiin 3 tuntia ja jäähdytettiin, jolloin saatiin valkoinen sakka, joka kerättiin

kautta

suodattamalla lopputuote (Fig. 2). Kaikki saadut tiosemikarbatsideja kiteytettiin metanolista. Katso Tiedosto S1 rakenteellisiin kuvaamista yksityiskohtia ja kiderakenne (Fig. S1 File S1) ja (taulukko S1 File S1) 4-etyylipiperatsiinia-1-carbothiohydrazide (a).

Yleistä menetelmä II.

hiilidisulfidia (CS

2) (0,2 mol, 12,06 ml) lisättiin tipoittain 15 minuutin aikana

N

-methylcyclohexylamine (0,2 mol, 26,3 ml) NaOH -liuosta (0,8 M, 250 ml). Reaktioseos voimakkaasti sekoitettiin 20 minuuttia ja sitten natriumklooriasetaatti (0,2 mol) lisättiin liuokseen, ja annettiin sekoittua 15 tuntia. Reaktioseos neutraloitiin väkevällä HCl: llä (20 ml), jolloin saatiin carboxymethylthiocarbamate välituote valkoinen sakka. Saatu carboxymethylthiocarbamate välituote (0,08 mol) saatettiin sitten reagoimaan hydratsiinihydraattia (0,08 mol) vedessä (10 ml). Tätä reaktioseosta palautusjäähdytettiin varovasti 2 tuntia, jolloin saatiin valkoisia kiteitä tiosemikarbatsidin (Fig. 3). Lopullinen tuote kiteytyi metanoli-vesi (1/1,

v /v

).

valmistaminen TSC johdannaisten

heteroaromaattinen TSC analogit syntetisoitiin saattamalla vastaavan heteroaromaattisen ketoni tai karbaldehydistä ja tiosemikarbatsidia mikroaaltosädetyksessä. Ekvimolaariset määrät sopivan tiosemikarbatsidia (0,5 mmol) ja karbonyyli yhdiste (0,5 mmol) liuotettiin 4 ml: aan EtOH: ta, johon on lisätty 0,1 ml etikkahappoa katalyyttinä (Fig. 4). Saatua seosta kuumennettiin mikroaaltouunissa reaktorissa 83 ° C /30 min (max. Mikroaaltouuni 50 W). Jäähdytyksen jälkeen, saostunut kiinteä aine suodatettiin ja pestiin eetterillä. Lopullinen tuote puhdistettiin käyttäen kiteyttämällä (etanoli tai metanoli), tai pylväskromatografialla. Katso Tiedosto S1 rakenteellisista kuvaamista yksityiskohtia, kiderakenne (Fig. S2 File S1) ja (taulukko S1 File S1)

Z

–

N

’- (di (pyridin -2-yyli) metyleeni) -4- (pyridin-2-yyli) piperatsiini-1-carbothiohydrazide (1 d) ja isosbestic käyriä (kuvio. S3 File S1).

HPLC puhtaus Data

lopullinen puhtaus TSC: iden määritettiin käyttäen seuraavia yleisiä ehtoja: Gynkotek HPLC System (Gynkotek); Pumpun T580; Automaattinen näytteenottaja GINA50 (Gynkotek); Detektori DAAD UVD340U; Pylväs: Hilic Kinetex 100 Å (Phenomenex, Torrance, CA, USA); Virtaus: 0,5 ml /min (0-1 min), 0,5-1,2 ml /min (1-3 min), 1,2 ml /min (3-7 min), 1,2-0,5 ml /min (7-8 min), 90% CH

2CI

2, 10% CH

3OH; UV 250 nm; Ohjelmisto: Chromeleon (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Katso Tiedosto S1 HPLC- puhtaus (taulukko S2 File S1).

Cell Culture

Ihmisen syöpäsolutyyppien (neuroepithelioma (SK-N-MC), paksusuolen syöpä (HCT116 villejä tyyppinen p53 (p53

+ /+)), Burkittin lymfooma (Raji) ja kohdunkaulan karsinooman (HeLa)) solut ja normaalin ihmisen ihon fibroblasteista (NHDF) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). HCT116 null p53 (p53

– /-) solut saatiin Maria Sklodowska-Curie Memorial Cancer Center ja Institute of Oncology, Puola.

SK-N-MC-soluja viljeltiin vähintään essential medium (MEM, Life Technologies, Grand Island, New York, USA), joka sisälsi 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS; Life Technologies), 1 mM natriumpyruvaattia (Life Technologies), 1% (v /v) ei- välttämättömiä aminohappoja (Life Technologies), 2 mM L-glutamiinia (Life Technologies), 100 U /ml penisilliiniä (Life Technologies), 100 ug /ml streptomysiiniä (Life Technologies) ja 0,28 ug /ml fungitsonia (Bristol Myers Squibb Pharmaceuticals, Montreal , Kanada). HCT116 ja NHDF-soluja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, Sigma-Aldrich), jota oli täydennetty 12% (v /v) lämpö-inaktivoitua FBS: ää (HCT116, Life Technologies) tai 15% (v /v) FBS (NHDF; Life Technologies), 100 ug /ml gentamisiini (Polfa Warszawa SA, Warsaw, Puola), 100 ug /ml streptomysiiniä (Polfa) ja 100 U /ml penisilliiniä (Polfa). Raji ja HeLa-soluja viljeltiin Roswell Park Memorial Institute keskipitkän (RPMI: ssä-1640-; Sigma-Aldrich), johon on lisätty 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua FBS: ää (Life Technologies) ja täydentää kuvattu SK-N- MC-soluja edellä. Kaikkia solulinjoja viljeltiin vakio-olosuhteissa 37 ° C: ssa kostutetussa atmosfäärissä, 5% CO

2 ja jatkoviljeltiin joka 3-4 päivä tarpeen mukaan.

proliferaatiotestillä

solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille (SK-N-MC: 1,5 x 10

4 solua /kaivo, HeLa: 5,0 x 10

3 solua /kuoppa, Raji: 3,0 x 10

3 solua /hyvin, HCT116: 3,5 × 10

3 solua /kuoppa; NHDF: 3,0 × 10

3 solua /kuoppa) 24 tuntia ennen lisäämistä uusista yhdisteistä. Määritykset suoritettiin käyttämällä 72 h (SK-N-MC, Raji, HeLa) tai 96 h (HCT 116, NHDF) itämisaika aineiden kanssa 37 ° C: ssa. Nämä kylvö ja kasvuolosuhteet hyödynnettiin niin, että solut eivät tulleet yhtenäisiksi aikana itämisaika. Lisäksi DFO ja Dp44mT sisällytettiin positiivisena kontrollina kaikissa kokeissa kuin niiden toiminta on hyvin tunnettu [21], [42], [50].

kelatoija varastoliuokset valmistettiin DMSO: hon ja laimennetaan media jotta lopullinen [DMSO] 0,05%. Tulokset ilmaistiin prosentteina valvonnan ja tuloksena IC

50-arvot laskettiin käyttäen GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). IC

50 määriteltiin pitoisuus tarpeen vähentää absorbanssia 50% käsittelemättömään kontrolliin. Kukin yksittäinen yhdiste testattiin kolmena rinnakkaisena yhdessä kokeessa, jossa kukin koe toistetaan kolme kertaa. Inkuboinnin jälkeen HCT 116 ja NHDF-solujen kanssa testattavien yhdisteiden, 20 ui CellTiter 96 Aqueous One Solution – MTS (Promega, Madison, WI, USA) lisättiin jokaiseen kuoppaan (100 ui DMEM: ä ilman fenolipunaista) ja inkuboitiin 1 h /37 ° C. Optinen tiheys näytteiden analysoitiin 490 nm.

MTT (3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) käytettiin arvioimaan antiproliferatiivisia vaikutuksia n kelaattoreiden SK-N-MC ja Raji-soluja. Inkuboinnin jälkeen tutkittujen yhdisteiden, 10 ui MTT: tä (5 mg /ml PBS: ssä, Sigma-Aldrich) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Jälkeen 2 h (SK-N-MC) tai 4 h (Raji) Inkuboinnin jälkeen levyt sentrifugoitiin, ja solut lyysattiin 100 ui 10% SDS-50% isobutanolin 0,01 M HCI: a (SK-N-MC- ) tai DMSO (Raji). Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm. Anti-proliferatiiviset vaikutukset näiden uusien aineiden HeLa-solut arvioitiin käyttäen kristallivioletilla värjäytymistä (0,5% kristalliviolettia liuokseen 10 min ajan). Lopuksi kuopat huuhdeltiin vedellä ja solut hajotettiin 2% SDS: ää. Optinen tiheys näytteiden analysoitiin 595 nm:.

leimaus Transferrin kanssa

59Fe

rauta liikenne proteiinia, Tf (Sigma-Aldrich), leimattiin

59Fe (PerkinElmer Life ja Analytical Sciences, Boston, MA) muodostaa

59Fe

2-Tf tavanomaisilla menetelmillä [6], [7]. Sitoutumaton

59Fe poistettiin läpi Sephadex G25 pylvääseen ja se seurasi tyhjentävä dialyysi [6], [7].

vaikutus Kelaattorit aktivoimista Cellular

59Fe

tutkimiseksi kyky uusien kelatoivien aineiden liikkeelle

59Fe SK-N-MC-soluja,

59Fe ulosvirtaus kokeet suoritettiin käyttäen vakiintuneita tekniikoita [50], [51]. Yksikerroksista SK-N-MC-solujen esimerkittyyn 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa MEM: ssä, joka sisälsi

59Fe

2-Tf (0,75 uM). Sitten solut pestiin neljä kertaa jääkylmällä PBS: llä ja inkuboitiin vielä 3 tuntia 37 ° C: ssa pelkällä väliaineella (ohjaus) tai väliaineessa, joka sisältää kelaattorin (25 uM). Tämän inkuboinnin jälkeen päällä oleva väliaine, joka sisälsi vapautuneen

59Fe erotettiin soluista käyttäen Pasteur-pipetillä. Radioaktiivisuus mitattiin sekä solujen ja supernatantti käyttäen γ-tuikelaskimella (Wallac Wizard 3, Turku, Suomi). Näissä tutkimuksissa uuden ligandit verrattiin aiemmin tunnettu kelaattorit, DFO ja Dp44mT, koska niiden kyky mobilisoida solujen

59Fe on tutkittu laajasti näissä soluissa [10], [12], [17], [18 ], [50].

vaikutus kelaattorit estämään Cellular

59Fe otto

kyky kelaattorien estää solun oton

59Fe iältään

59Fe

2-Tf tutkittiin tavanomaisilla menetelmillä [10], [14], [17], [18], [50]. Yksikerros SK-N-MC-soluja inkuboitiin väliaineessa, joka sisälsi

59Fe

2-Tf (0,75 uM) ja kelaattorin (25 uM) 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Sitten väliaine poistettiin ja solut pestiin neljä kertaa jääkylmällä PBS: llä. Sitten soluja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa yleisen proteaasin, pronaasia (1 mg /ml; Sigma-Aldrich), poistamiseksi kalvoon sitoutunut

59Fe. Solut poistettiin käyttäen muovilastaa ja sentrifugoitiin 14000 rpm /1 min erottamiseksi sisäistetään kalvoonsitoutuneilta

59Fe. Solupelletti suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan PBS: ää ja sisäistää

59Fe mitattiin γ-tuikelaskimella. Sisäistetty

59Fe otto laskettiin prosentteina ohjaus (pelkästään väliainetta). Jälleen uusia ligandeja verrattiin DFO ja Dp44mT niiden kyky inhiboida solujen

59Fe otto on ollut laajalti tunnettu käyttäen SK-N-MC-soluja [10], [14], [17], [18], [ ,,,0],50].

askorbaatti hapettaminen Pitoisuus

kyky raudan kompleksit uusien ligandien hapetuksen välittämiseksi fysiologisen substraatin, askorbaatti, tutkittiin käyttäen vakiintuneita menetelmiä [10], [18 ], [22], [52], [53]. Askorbiinihappo (100 uM) valmistettiin välittömästi ennen kutakin koetta, ja inkuboitiin, kun läsnä oli Fe

III (10 uM; kuten FeCl

3), kelaattorin (1-60 uM) ja 50-kertainen molaarinen ylimäärä sitraatti (500 uM). Absorbanssi 265 nm: ssä mitattiin 10 ja 40 minuuttia ja eron absorbanssin näinä ajankohtina, laskettiin. Tulokset näistä kokeista ilmaistiin rauta-sitovia vastineet (PPS) johtuen eri hampaisuus on kelaattoreiksi tutkittu. Kelaatinmuodostajat, Dp44mT, DFO ja etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), käytettiin kontrolleina, koska kyky raudan kompleksien hapettaa askorbaatin on laajasti tunnettu [10], [15], [52], [53].

tilastollinen analyysi

Data ilmaistiin keskiarvona ± SD ainakin 3 kokeesta. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Prism v6 (GraphPad Software, Inc.) sovelletaan yksisuuntainen ANOVA Bonferronin post-hoc-testi.

Tulokset ja keskustelu

Drug Design

Molecular ominaisuuksien, kuten molekyylipainon (MW) ja laskettiin oktanoli-vesi-jakaantumiskerroin (log

P

lask) ovat avaintekijöitä onnistuneen kehittämisen lääkeaihiota [54], [55]. Yleensä keskimääräinen MW ja log

P

lask lääkkeitä, joiden tuoda markkinoille ovat 300-450 Da ja 2-4, vastaavasti [56], [57]. Tämä huomioon ottaen kliinisesti kokeillaan TSC, Triapine (MW: 195 Da; log

P

lask: 0,761), edustaa mielenkiintoinen johtomolekyyli huomattavan varaukseen MW ja log

P

lask muuttamista.

tunnistaminen toiminnalliset fragmentit lääkkeiden kehittämisen on monimutkainen ongelma, johon liittyy erilaisia ​​lähestymistapoja, mukaan lukien ne, joilla on kokeellinen ja teoreettinen perusta. Jälkimmäinen koostuu eri menetelmiä joiden joukossa ovat ne, tunnistaa edullista osa-rakenteisiin, tukirunkoja ja /tai linkkereitä perusteella aiemmin raportoitu yhdisteitä. Vaihtoehtoisesti pirstoutuminen orgaanisten molekyylien pienempiin osiin on tärkeä menetelmä retrosynteettisen analyysiin ja on inspiroinut useita pseudo-retrosynteettisen lähestymistapoja [58]. Tämä on tunnistettu fragmentteja, jotka voivat olla hyödyllisiä lääkkeiden kehittämisen. Esimerkiksi di-2-pyridyyli [12], [15], [21], [59], kinolinyyli [60], piperatsinyyli [60], [61], [62], morfolinyyli [63] ja kinoksalinyyli [ ,,,0],64] kuviot ovat yleisiä fragmentteja muiden syöpälääkkeiden, jotka on otettu huomioon suunnittelussa romaani TSC raportoitu tässä.

nykyisessä tutkimuksessa tärkeimmät syyt että lähestymistapamme oli, että juuri syntetisoidun TSC tulisi säilyttää voimakas syövän vastaista aktiivisuutta niiden TSC esiasteiden, säilyttäen sopiva MW ja log

P

lask arvot varteenotettavia lupauksen lääkeainekandidaateiksi lääkekehitykseen. Käytimme yhdistelmä retro-fragmenttien, jotka näkyvät TSC lähtöaineiden [15], [16], [21], [44], [59] ja muut syöpälääkkeet [60], [61], [62] , [63], [64]. Lisäksi di-substituutio terminaalin N4 atomi säilyi rakentamalla N4-pohjainen piperatsiini- tai morfoliinirengas (Fig. 5), osa, joka havaitaan useita voimakkaita TSC [45], [46].

synteesi Novel Ligands

tiosemikarbatsidi esiasteita, a-f (Kuva. 5), syntetisoitiin kaupallisesti saatavissa reagenssit kaksivaiheisessa prosessissa, joka antoi kohtalainen tai suuri tuoton (47- 95%). Hoidossa bis (imidatsoli) tioketonia sopivalla piperatsiinin, jota seuraa reaktio hydratsiinihydraatin antoi

N

substituoitu piperatsiini-pohjainen tiosemikarbatsideja korkealla saannolla (File S1). Lopullinen tiosemikarbatsonia sarja, 1-6 (Fig. 5), syntetisoitiin kohtalaisesta high yield (58-96%) Schiffin emäksen tiivistymistä sopivaa ketonia /aldehydi valmistetun tiosemikarbatsideja. Puhtaus tiosemikarbatsonien varmistettiin HPLC: llä ja oli 95% (katso taulukko S2 File S1).

Anti-lisäkasvuaktiivisuus on Novel tiosemikarbatsonien suurta määrää vastaan ​​Cancer Cell-tyypit

kyky uuden tiosemikarbatsoni sarja 1-6 inhiboimaan solujen kasvainsolujen lisääntymistä tutkittiin erilaisissa syöpäsolun-tyypit (taulukko 1), mukaan lukien ihmisen p53 villityypin ja null paksusuolen syöpä (HCT116 p53

+ /+ ja HCT116 p53

– /-, vastaavasti), Burkittin lymfooma (Raji), ihmisen kohdunkaulansyövän (HeLa) ja neuroepithelioma (SK-n-MC) syöpäsoluja. Kyky Näiden uusien aineiden selektiivisyys kohde- syöpäsoluja arvioitiin tutkimalla niiden vaikutukset soluproliferaatioon kuolevaisen solu-tyyppi, eli normaalin ihmisen ihon fibroblasti (NHDF-solut). Antiproliferatiivista aktiivisuutta sarjan 1-6 on esitetty taulukossa 1 ja on myös edustettuina värikartoille (kts. S4 File S1). Vaikutukset Näiden uusien ligandien verrattiin sitten seuraavat kelaattorit, joita käytettiin positiivisina kontrolleina:

(

1

) B DFO, että on kliinisesti käytetään hoitoon rautaylikuormituksen taudin [1], [3] ja

(

2

) B Dp44mT, kelaattorin jossa voimakas anti-proliferatiivista aktiivisuutta

in vitro

ja

in vivo

[15], [21].

Kuten odotettua aikaisemmista tutkimuksista [10], [14], [17], [18], [ ,,,0],50], ohjaus kelaattorin, DFO, osoitti huonon antiproliferatiivisia vaikutuksia kaikissa syövän ja normaali solutyyppejä, IC

50-arvot vaihtelevat välillä 4,74 ja 25 uM (taulukko 1). Sen sijaan Dp44mT osoitti selektiivinen ja voimakas syövän vastaista aktiivisuutta IC

50-arvot 0,002-0,04 uM, mutta oli selvästi vähemmän tehokas kuolevainen NHDF soluissa (IC

50: 15,38 uM, taulukko 1).

Kun otetaan huomioon uusien terapeuttisten syöpää vastaan, on huomattava, että puute ilmentymisen tuumorisuppressoriproteiinia, p53, joissakin kasvaimissa tukien etenemistä neoplastisten solujen ja edistää vastustuskykyä kemoterapeuttiset [65], [66] . Siksi käyttämällä aineita, jotka tehoavat sekä villityypin että null p53 kasvaimet ovat elintärkeitä, etenkin kun otetaan huomioon korkea esiintyvyys p53 mutaatioiden edenneisiin syöpiin [42], [67]. Niinpä aluksi tutkittiin anti-proliferatiivista aktiivisuutta uuden TSC sarja 1-6 ihmisen HCT116 p53

+ /+ ja HCT116 p53

– /- paksusuolen syövän soluja (taulukko 1). Merkittävää on, että anti-proliferatiiviset vaikutukset useimmat uudet TSC oli sama yleinen malli aktiivisuutta HCT116 p53

+ /+ ja HCT116 p53

– /- solut, riippumatta p53: (taulukko 1). Yksi merkittävä poikkeus aktiivisuudessa näiden kahden solutyyppejä havaittiin yhdisteen 3e, joka osoitti 100-kertaisesti alentunut antiproliferatiivinen tehokkuus verrattaessa HCT116 p53

+ /+ (IC

50: 0,05 uM) ja HCT116 p53

– /- solut (IC

50: 5 uM, taulukko 1). Kuitenkin, yleisesti, anti-proliferatiivinen aktiivisuus TSC oli yleensä riippumaton p53: (taulukko 1), kuten on esitetty muita tämän luokan yhdisteiden [16], [42]. Näin ollen tämä on tärkeä ominaisuus TSC: iden, jotka voisivat selittää heidän merkittävästi toimintaa, joka on havaittu vastaavat valmisteet monelta syöpäsolu-tyypit [42].

Kaikista sarjan TSC syntetisoitu tässä tutkimus, nämä analogit johdettu di-2-pyridyyli (1a-e) osoitti tehokkain antiproliferatiivisia aktiivisuuden HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solut, jolloin IC

50 arvot vaihtelevat +0,0008-,04 uM (taulukko 1). Vaikka analogeja, jotka ovat peräisin kinolin-2-yyli (2a-f) ja 8-hydroksikinolin-2-yyli (3a-f) tuotti kohtalaisia ​​antiproliferatiivisia vaikutuksia (IC

50: 0,026-3,55 ja 0,004-9,25 uM, vastaavasti). Sen sijaan ne kelaattoreita, jotka ovat peräisin 7-hydroksikinolin-8-yyli (4a-f), kinoksalin-2-yyli (5a-f) ja salisyylihapon (6a-f) ryhmiä, sillä oli huono syövän vastaista aktiivisuutta (IC

50: 1.02- 25 uM) in HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solut (taulukko 1).

samanlainen yleinen suuntaus antiproliferatiivista aktiivisuutta novel TSC: iden kuin ensimmäisen HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solut havaittiin myös Raji, HeLa ja SK-N-MC-soluja (taulukko 1). Itse asiassa, nämä kelaattoreita, jotka sisältävät di-2-pyridyyli-osa (1 a-e) olivat voimakas anti-syöpä (IC

50: 0,0003-2,21 uM) analogeja tarkastellaan. Samoin kuin HCT116 tietojen yhdisteiden sarja 2 yleisesti näytetään kohtalainen anti-proliferatiivista aktiivisuutta (IC

50: 0,04-5,14 uM) Raji, HeLa ja SK-N-MC-soluja, kun taas sarja 3, 4, 5 ja 6 yleensä osoittivat kohtalaisesta huono antiproliferatiivisia vaikutuksia (taulukko 1).

Only heikko tai kohtalainen korrelaatio (

R

2 = 0,01-0,6) oli ilmeinen välillä syöpälääkkeen aktiivisuus sarjan 1-6 ja niiden log

P

lask arvoja, mikä viittaa siihen, että muut tekijät kuin niiden kyky poikittain solukalvon passiivisella diffuusiolla olivat kriittisiä niiden antiproliferatiivisia vaikutuksia.

anti-proliferatiivisen aktiivisuus Novel tiosemikarbatsonien vasten normaali, Mortal solut

on tärkeää, että edustaja on käyttökelpoinen syöpälääkettä, on osoitettava etuoikeutetut anti-proliferatiivista aktiivisuutta tuumorisoluja vastaan ​​verrattuna normaaliin, kuolevainen solutyyppejä. Täten selektiivisyys romaani TSC tutkittiin kuolevainen soluissa, nimittäin NHDF soluja. Kaikki analogit tutkittiin, 1b, 1d, 2b, 2f ja 3c osoitti suurimman antiproliferatiivinen aktiivisuus useimmissa syöpäsolun-tyypit (taulukko 1). Täten tutkimaan selektiivisyys 5 parasta TSC edellä mainittu nimittäin 1b, 1d, 2b, 2f ja 3c, joka on ”terapeuttinen indeksi” laskettiin jakamalla NHDF solun IC

50, jonka IC

50 neoplastiset HCT116-p53

+ /+ tai HCT116 p53

– /- solutyyppejä (taulukko 2). Huomattavaa on, että selektiivisyys indeksi Dp44mT vertaamalla NHDFs HCT116 p53

+ /+ tai HCT116 p53

– /- solutyyppejä leimasi, että 7690 ja 3076, vastaavasti.

5 tehokkain syövän TSC tässä on kuvattu (taulukossa 1), suurin terapeuttiset indeksit havaittiin 1d ja 3c ja olivat 18-2650 (taulukko 2). Tämä korkea selektiivisyys syöpäsoluja vastaan ​​johtui siitä, että sekä 1 d ja 3 c osoittivat voimakas syövän vastaista aktiivisuutta (IC

50: ,002-0,017 uM) in HCT116-soluissa, mutta niiden sytotoksisuus on erittäin heikko NHDF soluissa (IC

50: 0,16-10,6 uM).