Krooninen sairaus

tiivistelmä

Etäpesäke on vastuussa 90% syöpäkuolemista. Aikana etäpesäke, kasvainsolut irtautumaan primaarikasvaimen, anna verta ja imusuonten, ja käyttää niitä valtateitä matkustaa kaukaisiin kohtiin kehossa muodostaen sekundaarikasvaimia. Syöpäsolu läpi kulkeutumista endoteelin ja osaksi tyvikalvon edustaa kriittinen vaihe metastaattisen Cascade, mutta se ei ole oikein ymmärretty. Tämä prosessi on hyvin ominaista immuunijärjestelmän soluja, jotka rutiininomaisesti transmigrate läpi endoteelin infektio-, tulehduksen tai vamman. Aiemmat tutkimukset leukosyytit ovat osoittaneet, että tämä vaihe riippuu suuresti aktivointistatuksen endoteelin ja subendoteliaalisessa alustan jäykkyyttä. Tässä käytimme aiemmin vahvistettu

in vitro

malli endoteelin ja elävien solujen kuvantamisen, jotta tarkkailla syöpäsolun transmigraatio ja vertaa tätä prosessia leukosyytteihin. Mielenkiintoista, syöpäsolun transmigraatio sisältää lisäksi vaiheen, jota termi ”sisällyttäminen”, osaksi endoteelisolujen (EY) yksikerroksinen. Tässä vaiheessa syöpäsolut fyysisesti syrjäyttää hankittua, joka johtaa sijoiltaan EY VE-kadheriinin pois EY liittymissä raja syöpäsoluja, ja levitä yksikerroksista. Joissakin tapauksissa, EC kokonaan irrottaa matriisista. Lisäksi syöpäsolun sisällyttäminen tapahtuu riippumatta aktivoinnin tilan ja endoteelin alla alustan jäykkyyttä rintasyövän ja melanoomasoluja, huomattava ero prosessi, jossa leukosyytit transmigrate. Samaan aikaan, haimasyövän solujen sisällyttäminen riippui aktivointistatuksen endoteelin ja muuttui hyvin jäykkä subendoteliaalisessa alustoille. Yhdessä meidän tulokset tarjoavat mekanistinen oivalluksia kasvainsolun ekstravasaatio ja osoittavat, että sisällyttäminen on yksi varhaisimmista vaiheet.

Citation: Hamilla SM, Stroka KM, Aranda-Espinoza H (2014) VE-kadheriinin-Independent Cancer Cell Inkorporaatio verisuoniendoteelissä edeltää Transmigration. PLoS ONE 9 (10): e109748. doi: 10,1371 /journal.pone.0109748

Editor: Claudia Daniela Andl, Vanderbilt University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 30, 2014; Hyväksytty 10 syyskuuta 2014; Julkaistu: 02 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Hamilla et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Institutes of Health National Research Service Award F31NS068028 (KMS) ja Human Frontier Science Project Award RGP0058 /2011 ( HAE). Sisältö on ainoastaan ​​vastuulla kirjoittajien ja ei välttämättä edusta näkemyksiä National Institute of neurologiset häiriöt ja aivohalvaus tai National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cancer etäpesäke tapahtuu, kun kasvainsoluja fragmentti primaarikasvaimen sivusto, anna verta ja imusuonten, ja levinnyt kaukaisiin kehon elimiin. Tämä prosessi on yksi tärkeimmistä osasyy tappavuuden syövän [1], [2]. Kun metastasoituneen syöpäsolut ovat tulleet verenkiertoon, ne on ylitettävä endoteelisolujen (EY) este ennen tunkeutuvat kudoksen alla vaiheessa kutsutaan ekstravasaatio. Useimmat kasvainsolut pidättäneet epäspesifisen sitoutumisen hyytymistekijöiden ja koon rajoitus hius- [3]. Joissakin tapauksissa ligandit kasvainsoluihin ovat korreloineet lisääntyneen metastaattista potentiaalia [4] – [6]. Tähän mennessä merkittävää tutkimusta on omistettu analysoimalla biokemiallisia ja molekyylitason ominaisuudet syöpäsolujen [7] – [9], mutta taustalla olevan mekanismin syöpäsolun ekstravasaation kautta endoteelin edelleen suurelta osin tuntemattomia. Syöpäsolut on havaittu kautta muuttaa EY solun elin [10], ja sen kautta endoteelisolujen-soluliitos tuhoamatta n kerros [11]. Kuitenkin ristiriitaisia ​​tutkimus on myös osoittanut, että syöpäsolut eivät jätä endoteelin ehjä ekstravasaation [10], [12] – [14]. On tärkeää huomata, että mainituissa tutkimuksissa käytettiin eri tuumorisolulinjoja, sekä eri EY linjat ja

in vitro

menetelmissä, joten on mahdollista, että eri yhdistelmiä erilaisten kasvainsolujen ja hankittua voi johtaa erilaisiin mekanismeja ekstravasaation. On olemassa kolme ehdotettu menetelmiä syövän solumigraation endoteelin läpi: (a) syöpäsolut voivat kulkeutua EY kehon [10], (b) syöpäsolut voi aiheuttaa EY apoptoosin [10], [13] ja (c) syöpäsolut voi kulkeutua endoteelisoluspesifiseksi soluliitos ilman pysyvästi tuhoamatta EY kerros [11]. Viime vuosina tutkimus on myös osoittanut, että syöpäsolut myös kohdistaa voimia hankittua että työntää niitä syvemmälle soluväliaineen aikana transmigraatio [15], [16], ja että endoteelin tehostaa syöpäsolun muuttoliike [17]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että syöpä läpi kulkeutumista endoteelin on monimutkainen prosessi, joka vaatii lisätutkimuksia selvittämään sen mekanistisen kurssi.

Leukosyyttiarvon rutiininomaisesti transmigrate läpi endoteelin ja taustalla kerrosten verisuoniston tavoittaa kudoksen tulehdus-, infektio, tai vamma. Tämä on hyvin tunnettu prosessi, joka perustuu paikallisia biokemiallisten signaaleja. Vuonna leukosyyttiliikenteen, endoteeli toimii selektiivinen este, joka vähentää huomattavasti hyökkäys korko [18]. Immuunivasteen aikana, kemokiini tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-α) tuotetaan stroomasolut, ja paikallinen altistuminen hankittua TNF-α ylössäätelee adheesiomolekyylien, kuten solujen välinen adheesiomolekyyli-1 (ICAM-1) pinnalla endoteelin. Lisäksi lisäksi molekyyli muutoksia, TNF-α myös merkittävästi muuttaa rakenteellisia ominaisuuksia endoteelin, joka indusoi pehmenemisen, aktiini uudelleensuuntausta, ja kasvu yleisen läpäisevyyden [19], [20]. Ylimääräinen tekijä, joka lisää leukosyyttien transmigraatiota on subendoteeliseen alustan jäykkyyttä ja mekaaniset ominaisuudet endoteelin. Nämä vaihtelevat aikana verisuonten homeostaasiin ja patologisissa olosuhteissa [19]. Neutrofiilit kykenevät mechanosense niiden mikroympäristölle [19], [21] – [24], ja neutrofiilien transmigraatio kasvaa subendoteliaalisessa alustan jäykkyyttä suurenee EY myosiinikevytketjua kinaasi (MLCK) -välitteisen supistuvien joukot [19]. Kaikki nämä muutokset EY yksikerroksista helpottaa valkosolujen transmigraatio immuunivasteen aikana.

Koska valkosoluja rutiininomaisesti transmigrate läpi EY kerros, oletetaan, että metastaattinen syöpäsolujen voi jakaa monia samoja mekanismeja. Nämä mekanismit ovat vielä tutkimatta tarkemmin. Esimerkiksi osallistuminen kemokiinien kasvaimeen endoteelin vuorovaikutusta ja niiden vaikutuksia syöpäsolujen muuttoliikettä ei ymmärretä hyvin [25]. Vielä, merkittävä molekyyli- ja rakenteellisia muutoksia, jotka tapahtuvat endoteelin seuraavat TNF-α hoito saattaa parantaa metastaattinen syöpäsolujen transmigraatio. Lisäksi jää nähtäväksi miten syöpäsolujen ekstravasaation vaihtelee subendoteliaalisessa alustan jäykkyyttä. Kuten havaitaan leukosyytit [19], on mahdollista, että syöpäsolu transmigraatio voi kasvaa yhä alustan jäykkyyttä. Syöpäsolut ovat myös havaittu työntää hankittua solunulkoiseen matriisiin aikana ekstravasaatio, mikä osoittaa, että mekaaniset ominaisuudet ECM voi olla tärkeä rooli. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että sekä aktivoinnin tilan endoteelin ja subendoteliaalisessa alustan jäykkyyttä voi vaikuttaa syöpäsolun ekstravasaation.

Tässä työssä, joka on

in vitro

malli verisuonten endoteelin [19 ], [26] – [28] käytettiin tutkimaan syöpäsolun transmigraatio ja miten tämä prosessi vertaa leukosyyttien ekstravasaatio. Tuloksemme osoittavat, että yksi varhaisimmista vaiheista ekstravasaatio metastaattisen rintasyövän solujen sisällyttäminen EY yksikerroksista, joka merkittävästi häiritsee EY este ja fyysisesti siirtää hankittua, joskus johtaa täydelliseen poistamiseen ECS: n yksikerroksista. Toisin valkosolujen sielunvaelluksesta, syöpäsolun sisällyttäminen ei riipu aktivointistatuksen endoteelin tai subendoteliaalisessa alustan jäykkyyttä melanoomasolujen ja rintasyövän soluja. Mielenkiintoista on, että haiman solujen sisällyttämisen riippuu aktivoinnin tilan endoteelin ja endoteelin alla jäykkyys. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että metastaattinen rintasyöpä solun ekstravasaatiota käsittää lisävaiheen, jossa sisällyttäminen endoteelin, mikä ei tapahdu aikana leukosyyttien ekstravasaatio.

Materiaalit ja menetelmät

valmistaminen polyakryyliamidigeelillä substraattien

Ohut polyakryyliamidigeeleillä valmistettiin lasipeitinlevyille menetelmän mukaisesti ensimmäisen kuvanneet Wang ja Pelham [29] ja on kuvattu yksityiskohtaisesti edellisessä julkaisuissa [19], [23], [30] – [33]. Lyhyesti, 280 kPa (15% akryyliamidia + 1,2% bis akryyliamidi) ja 0,87 kPa (3% akryyliamidia + 0,1% bis akryyliamidi) geelit luotiin ja päällystettiin 0,1 mg /ml fibronektiiniä (Sigma-Aldrich), kuten aiemmin on kuvattu [19]. Luonnehdinta Youngin moduuli geelien suoritettiin atomivoimamikroskopialla ja dynaaminen mekaaninen analyysi, kun taas analyysi pinta-sitoutuneen fibronektiinin suoritettiin immunofluoresenssilla [23], [32]. Kokeisiin, lasi, 22 x 22 mm peitinlaseilla (Fisher Scientific) päällystettiin 0,1 mg /ml fibronektiiniä 2 tuntia huoneen lämpötilassa.

Soluviljely

Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (Lifeline Cell Technology) viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [34]. MDA-MB-231 metastaattisen rintasyövän soluja (ATCC) ja A375-melanoomasoluja (ATCC) viljeltiin DMEM: ssä, 10% FBS: ää ja 1% penisilliini streptomysiiniä. SW1990 haimasyövän soluja (ATCC) viljeltiin DMEM: ssä, 10% FBS: ää, ja 50 ug /ml gentamysiini. HUVEC-soluja (kohdat 2-5, 4 x 10

5 yhteensä) maljattiin fibronektiinillä päällystetyn lasipeitinlevyille tai polyakryyliamidigeeleillä ja kasvatetaan noin 48 tunnin ajan, jolloin yksikerroksinen muodostettu. Soluja käsiteltiin kontrolli väliaine tai 25 ng /ml tuumorinekroositekijä-α (TNF-α) 24 viimeisen tunnin aikana ennen kokeita. Joissakin kokeissa HUVEC transfektoitiin VE-kadheriinin-GFP (VEcadGFP) käyttämällä adenovirus (AdV), joka oli saatu antelias lahjoitus tri William Luscinskas (Harvard Medical School). Dr. Luscinskas laboratoriosta on aiemmin kuvattu menettely rakentamiseen VEcadGFP plasmidin ja siirrettäisiin adenoviruksen ekspressiovektoriin [35]. HUVEC-solut maljattiin fibronektiinillä päällystetyn polyakryyliamidigeeleillä tai lasipeitinlevyille ja annetaan 1-2 tuntia levitä, ja 3 ui AdV-VEcadGFP lisättiin solut 2 ml: ssa väliainetta kohti substraattia. HUVEC-soluja viljeltiin sitten ja yksikerroksista muodostuminen edellä kuvatulla tavalla. Monokerrokset pestiin PBS: llä ennen lisäämällä ylimääräisiä HUVEC tai kasvaimen solut (1 x 10

5-solut yhteensä) apikaaliseen pintaan 22 x 22 mm yksikerroksinen. Erottaa HUVEC-solujen yksikerroksen ja lisäksi solut lisätään yksikerroksista, lisättiin HUVEC tai MDA-MB-231-solut värjättiin lipofiilisen DiIC

16 väriainetta (1 uM) suspensiossa 5 minuuttia huoneen lämpötilassa sentrifugointi ja PBS pestä.

live solukuvauksessa ja analyysi

live solujen mikroskopia valmistui suljetussa mikroskoopilla vaiheessa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ja 55%: n kosteudessa käyttämällä käännettyä mikroskooppia (Olympus IX71). Kuvat otettiin joko QImaging Retiga-SRV CCD-kenno (CCD) digitaalikameran (QImaging Corporation) käyttäen IPLab ohjelmistoa (Becton, Dickinson and Company), tai aa QImaging Rolera-MGI CCD digitaalikamera (QImaging Corporation) käyttäen Slidebook (versio 4.2.0.9 Älykäs Imaging Innovations). Vaihe sijaan ero häiriöitä kontrasti (DIC), ja /tai fluoresenssi timelapse kuvat otettiin käyttäen joko 20 × /0,45 NA Ph1 tavoite tai 60 x /1,42 NA öljy tavoite. Osa sisällytetty soluja (HUVEC: t tai MDA-MB-231) laskettiin jakamalla soluja, jotka tuli liitetyksi milloin tahansa aikana timelapse sekvenssin kokonaismäärä vaihe-valkosolujen edellä yksikerroksista alkuperäisen rungon sekvenssi. Aika loppuun inkorporaatio lasketaan erotus, kun solu alkoivat levitä yksikerroksinen ja kun solu saavutti suurimman leviämisalueelle sisällä yksikerroksista.

Interference piassa

Interference piassa (IRM) käytettiin havaitsemaan pinta-alan ja pinnan välisen häiriön valonsäteet heijastuvat substraatin /väliaineen käyttöliittymän ja niitä alustasta /solu-liitäntä, kuten on kuvattu edellisessä työssä [36] – [38] . Tässä tekniikassa valon intensiteetti on mitta lähellä solun lasin pintaan niin, että alueet kalvon pintaa lähinnä tummia ja niitä kauempana näyttää kirkkaammalta. Siksi IRM on optimaalinen tapa arvioitaessa cellular liitetiedoston, tarttuvuus ja leviäminen käytös [36] – [38]. Levittää kokeita, 1 x 10

5 MDA-MB-231-soluja maljattiin 22 x 22 mm fibronektiini-pinnoitettu lasipeitinlevyille HUVEC mediassa, jolloin havainnointi yksittäisiä soluja. Näitä kokeita varten, käännettyä mikroskooppia (Olympus IX71), jossa on 60 x /1,42 NA öljy objektiivin linssin ja 100 W elohopealamppu (Olympus; käytetty aallonpituus 561) käytettiin yhdessä CCD-kamera (Retiga SRV kamera, QImaging) Kuvansiirtäjä. Kokeet suoritettiin suljetussa mikroskoopilla kammion, joka ylläpitää viljelyolosuhteita 37 ° C: ssa, 50% kosteudessa, ja 5% CO

2. Aikana solujen leviäminen, yhden kehyksen kirjattiin 5 sekunnin välein aikana 1 μhour N = 5 itsenäisestä kokeesta. Tilastollista arvioinnit leviää alueilla, kuvat analysoitiin käyttämällä ImageJ (National Institutes of Health) ohjelmiston. Solu-rajat jäljitettiin käsin ja alue laskettiin ImageJ rutiineja. Alueet, MDA-MB-231-solujen leviäminen osaksi HUVEC yksikerroksista myös jäljittää käsin ja verrataan yksittäisiä soluja leviävä endoteelin vapaa peitelasi.

konfokaali Imaging

yhteensä 1 x 10

5 MDA-MB-231-solut transfektoitiin 10 ui CellLight Actin-GFP (Life Technologies) valmistajan protokollan ja annettiin inkuboitua 24 tunnin ajan. 24 tunnin jälkeen, tartunnan MDA-MB-231-soluja otettiin käyttöön konfluentin HUVEC yksikerroksisen ja annettiin sisällyttämään 15 tuntia. Sen jälkeen sisällyttäminen, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja värjättiin käyttäen Texas-punainen falloidiinia (Invitrogen). Z-pino kuvia kerättiin käyttämällä Zeiss LSM 710 -konfokaalimikroskoopilla kanssa 63 × öljyä tavoite.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi valmistui käyttäen Studentin t-testi välillä tietoparit, tai käyttämällä ANOVA ryhmille tietojen, jossa P 0,05 osoitti tilastollista merkittävyyttä. Sen jälkeen ANOVA, monivertailuja tehtiin käyttäen Turkin rehellisesti merkitsevä ero kriteeri. Kaikki mittaukset raportoidaan tässä muodossa keskiarvo ± keskivirhe.

Tulokset

Inkorporaatio endoteelin on ensimmäinen askel metastaattisessa syöpäsolun transmigraatio

MDA-MB-231 metastaattisen rintasyövän soluja tuotu apikaalisella pinnalla EY yksikerroksisen ja seurataan niiden vuorovaikutuksessa endoteelin (Elokuva S1). Aluksi, MDA-MB-231-soluja kirkkaan valkoinen ja pallomainen toisin kuin taustalla vaihe-pimennetyssä ja litistetty endoteeliin (Fig. 1A). Muutaman tunnin kuluessa, MDA-MB-231-solut alkoivat sisällyttää endoteeliin, prosessissa, joka vaihteli keskimäärin 40-60 minuuttia (Fig. 1 B), ja se oli visuaalisesti erotettava neutrofiilien transmigraation endoteelin läpi (Fig. 1 C) . Erityisesti kävi ilmi, että hankittua vieressä sivuston Sisällyttämismenettelyistä fyysisesti joutuneiden luoden raot MDA-MB-231 solu levitetään taustalla matriisiin (Fig. 1A), kun taas neutrofiilit puristetaan läpi endoteelin häiritsemättä yksikerroksista ( kuva 1C). Jotkut hankittua irrottaa alla olevan matriisin, pyöristetään ylöspäin ja tuli pallomainen seuraavat sisällyttäminen MDA-MB-231-solujen yksisolukerroksen (Fig. 2). Noin 25% ECS irrottaa seuraavat syöpäsolun sisällyttäminen (kuvio 2). Kuitenkin sisällyttäminen MDA-MB-231-soluja endoteelin tapahtui hitaammin, pienemmällä kaltevuus ”leviämisalueelle vs. aika”, ja oli pienempi lopullisen solun alueella verrattuna MDA-MB-231-solujen leviäminen päälle endothelium- vapaa fibronektiini-päällystetyn alustan (Fig. 3d), mikä osoittaa, että endoteelin ei suosittu sisällyttäminen syöpäsolun, mutta melko vähäinen yleistä leviämistä alueella. Lisäksi MDA-MB-231 solu sisällyttäminen endoteelin tapahtui hitaammin, pienemmällä kaltevuus ”kumulatiivisen sisällyttäminen vs. aika”, verrattuna ECS sisällyttämällä monokerroksella ECS (Fig. 3A). Näin ollen on todennäköistä, että sisällyttäminen MDA-MB-231-solujen endoteeliin tapahtuu eri mekanismilla kuin natiivi hankittua leviäminen saman endoteeliin. A375-melanoomasoluja ja SW1990 haiman soluja myös esiteltiin apikaalisella pinnalle endoteelin. Samoin kuin MDA-MB-231-soluja, melanoomasolut ja haiman solujen alkoi sisällyttää endoteelin prosessi, joka kesti noin 15 minuuttia ja 50 minuuttia vastaavasti. A375 syöpäsolujen sisällytetty yksikerroksista at paljon nopeammin kuin metastaattisen rintasyövän soluja ja niiden liittäminen dynamiikka muistuttivat läheisesti natiivin hankittua leviäminen EY yksikerroksista. A375-melanoomasoluja oli viimeinen osa sisällyttäminen joka muistutti hankittua leviämisestä hankittua, vaikka SW1990 syöpäsolut oli paljon pienempi osa sisällyttäminen verrattuna kaikkiin ryhmiin (kuvio 3C). Lisäksi confocal kuvia (kuvio 4A) paljasti, että 15 tunnin kuluttua perustamisasiakirjat, MDA-MB-231 (vihreä) solut joutuneiden EC (punainen) levittämällä vierekkäisten hankittua. Orthogonal ennusteet osoittavat, että MDA-MB-231-solut ovat itse asiassa levittää välillä hankittua eikä vaeltavat niiden alla aikana sisällyttäminen (kuvio 4B).

(A) Faasikontrasti- kuva MDA-MB-231-soluja (kirkas valkoinen ) huipulla ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) yksikerroksinen. Mittakaava on 20 um. (B) MDA-MB-231 solua (mustat nuolet) alkaa sisällyttää endoteelin, kuten sen muutoksen faasikontrastimikroskopiaa kirkkaasta valkoisesta pimentynyt. Mittakaava on 20 um ja koskee kaikkia kuvia paneelissa B. Se aika pinnoituksen jälkeen MDA-MB-231-solujen endoteeliin ilmoitetaan oikeassa yläkulmassa jokaisen kuvan tunti: minuutti: sekunti muodossa. Lopullinen prosenttiosuus liittämisvakuutus tässä kokeessa oli 95%. (C) vaiheen kontrasti kuvan sekvenssin neutrofiilien transmigrating kautta TNF-α-aktivoitu endoteeli. Mittakaava on 20 um ja koskee kaikkia kuvia paneelissa C. Se aika pinnoituksen jälkeen neutrofiilit endoteeliin ilmoitetaan oikeassa yläkulmassa jokaisen kuvan tunti: minuutti: sekunti muodossa.

vaihekontrasti (vasemmalla) ja DiIC

16 fluoresenssi (oikealla) kuvaa MDA-MB-231-solut maljattiin käsittelemätön HUVEC yksikerroksista, ajankohtina heti pinnoituksen (ylhäällä) ja 16 tunnin vuorovaikutusta endoteelin (alhaalla ). Punaiset nuolet osoittavat vaiheittain valkosoluja, jotka eivät aiheuta fluoresenssia; nämä ovat endoteelisolujen, jotka ovat joutuneet pois yksikerroksisen ja näin on irrotettu ja tullut pyöristetty. Mittakaava on 25 pm ja koskee kaikkia kuvia.

(A) Kumulatiivinen osa hankittua tai MDA-MB-231-solut (231), SW1990 (1990), ja A375-soluja sisällytettiin endoteelin koska ajan funktiona sen jälkeen, kun pinnoitus. Tietopisteet edustavat keskiarvo ± SEM vähintään 3 itsenäisestä kokeesta (N 20 solua kullekin kokeelle). (B) Lopullinen osa MDA-MB-231-solujen sisällytetty käsittelemättömän tai TNF-α-käsitelty endoteeliin 15 tunnin kuluttua. Pylväät edustavat keskiarvoa, kun taas virhepylväät edustavat SEM vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. P 0,05 näiden arvojen välillä osoittaa, ei ole tilastollista eroa (n.s.). (C) Lopullinen osa MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen, EC, A375-melanoomasolut, ja SW1990 haiman solujen sisällytetty endoteelin 15 tunnin kuluttua. Pylväät edustavat keskiarvoa, kun taas virhepylväät edustavat SEM vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. (*) Osoittaa merkitys (P 0,05) verrattuna hankittua. (D) Plot leviämisalueelle ajan funktiona paljastaa eroja leviämisen dynamiikka MDA-MB-231-solujen leviävä fibronektiiniä päällystetty peitelasi ( ”single solut”) tai osaksi käsittelemätön endoteelin ( ”osaksi yksikerroksisen”).

(A) edustava MDA-MB-231 (green; Actin-GFP) infektoitujen solujen GFP-aktiini on esitetty leviämässä osaksi HUVEC yksikerroksista (red; falloidiinia). Kohtisuorien projektioiden näytetään. (B) Kaavamainen osoittaa, että syöpäsolu (vihreä) syrjäyttää ECS (punainen) levittämällä vierekkäisten hankittua aikana sisällyttäminen.

aktivointi endoteelin TNF-α ei vaikuta sisällyttäminen dynamiikkaan rintasyövän ja melanoomasoluja

aktivointi endoteelin on keskeinen vaihe Leukosyyttiadheesion kaskadi, ja meidän aikaisempi työ on osoittanut, että leukosyytti transmigraatio riippuu suuresti aktivointistatuksen endoteelin [19], [28], [ ,,,0],30]. Aktivointi endoteelin TNF-a: n ei ainoastaan ​​ylössäätelee adheesiomolekyylien, kuten ICAM-1 ja verisuonten adheesiomolekyyli-1 (VCAM-1), mutta lisää myös EY supistuvuutta [31] ja vähentää EY suojafunktion [20]. Siksi meidän seuraava tavoite oli selvittää, onko sisällyttämisen metastaattisen rintasyövän solujen endoteeliin edellytti hankittua aktivoitava. Kiinnostavaa, olemme huomanneet, että kumulatiivinen osa sisällyttäminen ajan funktiona MDA-MB-231-soluissa oli samanlainen riippumatta siitä, onko hankittua käsiteltiin TNF-α (Fig. 3A). Lisäksi, lopullinen osa soluista, jotka sisällytetään TNF-α-aktivoidun endoteelin 15 tunnin kuluttua ei ollut erilainen osa liitettäväksi käsittelemättömän endoteeliin (Fig. 3B). Lopuksi, kun täytettävä sisällyttämistä (pyöristetystä pallo on litistetty solun sisällä endoteeli), ei ole riippuvainen siitä, onko endoteelin käsiteltiin TNF-α (Fig. 5C). Samanlainen rintasyöpäsoluja, osa sisällytetään A375-melanoomasoluja osaksi hankittua oli vastaava, riippumatta siitä, onko hankittua käsiteltiin TNF-α (kuvio S1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että jotkut metastaattinen syöpä solut kykenevät suorittamaan alkuvaiheessa ekstravasaation, jopa ilman tulehdusärsykkeeseen. Kuitenkin osa sisällyttäminen kuluttua 15 tunnin SW1990 haiman soluja oli tilastollisesti toisistaan ​​käsittelemättömän hankittua rinnastettavalle TNF-α (kuva S2). SW1990 solujen sisällytetty paljon nopeammin ja korkeampia jae TNF-α käsitelty EC verrattuna hoitamattomiin hankittua.

(A) Kumulatiivinen osa MDA-MB-231-solujen sisällytetty endoteelisolujen fibronektiiniä päällystetyn 0,87 kPa tai 280 kPa polyakryyliamidigeelillä tai lasi (50 GPa). Tietopisteet edustavat keskiarvo ± SEM vähintään 3 itsenäisestä kokeesta (N 20 solua kullekin kokeelle). (B) Lopullinen osa MDA-MB-231-solujen sisällytetty (käsittelemätön) endoteelin funktiona subendoteliaalisessa alustan jäykkyyttä. Pylväät edustavat keskiarvoa, kun taas virhepylväät edustavat SEM vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. P 0,05 näiden arvojen välillä osoittaa, ei ole tilastollista eroa (n.s.). (C) Aika MDA-MB-231-solujen täydellinen sisällyttäminen on riippumaton mekaanisten ominaisuuksien alustan alla endoteelisoluissa. Endoteelisolujen fibronektiinillä päällystetyn lasipeitinlevyille (50 GPa) tai polyakryyliamidigeeleillä (0,87 kPa tai 280 kPa) jätettiin käsittelemättä (ei TNF) tai käsitelty TNF-α (TNF). Ei ole tilastollista eroa sisällyttäminen mitattiin funktiona subendoteliaalisessa alustan jäykkyyttä tai endoteelisolujen hoito (P 0,05).

sisällyttäminen on riippumaton subendoteliaalisessa alustan jäykkyyttä rintasyövän ja melanoomasoluja

aikaisempi työ on myös osoittanut, että leukosyyttien transmigraatiota riippuu mekaaniset ominaisuudet substraatin alla endoteelisolujen [19], [30]. Jäykempi subendoteliaalisessa matriisit edistävät myosiinin kevytketju kinaasi riippuvainen EY contractility, mikä johtaa solujen väliset raot ja leukosyyttien transmigraatio [19], [30]. Siksi meidän seuraava tavoite oli selvittää, metastaattisen rintasyövän solujen sisällyttämistä endoteelin riippui subendoteliaalisessa alustan jäykkyyttä. Toisin kuin neutrofiilien sielunvaelluksesta, joka kasvaa subendoteliaalisessa alustan jäykkyyttä, dynamiikkaa MDA-MB-231 solu sisällyttäminen endoteelin olivat samankaltaisia ​​pehmeitä (0,87 kPa), keskitason (280 kPa), ja erittäin jäykkä (lasi, 50 GPa) subendoteliaalisessa alustoille (Fig. 5A). Lisäksi, lopullinen sisällytetty osa MDA-MB-231 osaksi endoteelin oli riippumaton subendoteliaalisessa alustan jäykkyyttä (Fig. 3B). ja kokonaisajan täytettävä transmigraatio oli riippumaton subendoteliaalisessa alustan jäykkyyttä (Fig. 5C). A375-melanoomasoluja osaksi pehmeä, väli-, ja erittäin jäykkä subendoteliaalisessa matriisit samanlaisia ​​sisällyttäminen dynamiikka ja lopullinen osa sisällyttäminen rintasyövän soluja (kuvio S3). SW1990 haiman solut näytetään eri käyttäytymistä melanoomasolut ja rintasyövän soluissa (kuvio S4). Kun SW1990 solut maljattiin pehmeä ja väli alustoille, ne näkyvät samantasoista sisällyttäminen dynamiikka ja lopullinen osa sisällyttäminen 15 tunnin kuluttua (Kuva S4). Kuitenkin, kun sallittu sisällyttää hyvin jäykkä matriiseja (lasi, 50 GPa), ne näkyvät huomattavasti pienempi osa sisällyttäminen ja hitaammin inkorporaatio. Kun taas myöhemmissä vaiheissa metastaattisen kaskadin voi riippua alustan jäykkyyttä, tuloksemme osoittavat, että alkuvaiheessa rintasyövän solun ekstravasaatiota ja melanooma ekstravasaatiota tapahtuu riippumatta siitä, mekaaniset ominaisuudet matriisin alla endoteelin kun haiman solujen sisällyttämisen muuttuu hyvin jäykkä alustoille.

Endoteelisoluja eivät ilmennä VE-kadheriinin sekä rajojen sisällytetty rintasyöpäsolujen

verisuonten endoteelin kadheriinin (VE-kadheriinin) on yksi tärkeimmistä homofiilisiä adheesiomolekyylien ilmaiseman hankittua klo solu-solu rajojen yksisolukerroksena. Eheyden endoteelin kuin verisuonten este on vahvasti riippuvainen asianmukaisen toiminnan VE-kadheriinin adheesiomolekyylien [39], [40]. ECS sisällytetty terve konfluentti endoteelin, GFP-VE-kadheriinin ilmaistiin kaikki hankittua naapurissa sisällytetty DiIC

16-leimattu EY (Fig. 6A, Elokuva S2), joka osoittaa, että uusien hankittua yksikerroksen päälle ei häiritä eheys n liittymissä. Meidän vieressä pyrittiin tunnistamaan mahdolliset muutokset VE-kadheriinin morfologia seuraavat sisällyttäminen MDA-MB-231-solujen osaksi endoteelin. Silmiinpistävän, EC naapurimaassa sisällytetty DiIC

16-leimattu MDA-MB-231-solut eivät ilmaisseet GFP-VE-kadheriinin klo rajojen kanssa MDA-MB-231-solujen, vaikka ne jatkoivat ilmaista GFP-VE-kadheriinin risteyksissä kanssa muut EC (Fig. 6B). Nämä tulokset osoittavat, että varhaisessa vaiheessa syöpäsolujen ekstravasaation ei vaikuta ainoastaan ​​VE-kadheriinin-riippuvaisen solu- soluadheesiota, mutta se voi myös tarjota helposti saatavilla reitin ekstravasaation muihin verenkierrossa olevia kasvainsoluja.

DiIC16-leimattua HUVEC (A) tai MDA-MB-231 (B) maljattiin endoteelisolujen ilmentävät VE-kadheriinin-GFP (VE-cad-GFP). Kuvat otettiin seuraavat sisällyttäminen kunkin solutyypin. Mittakaava on 10 um ja se koskee kaikkia kuvia tässä kuvassa.

Rintasyöpä solujen sisällyttäminen käynnistää by dislocating VE-kadheriinin at endoteelisolujen risteyksissä

Ennen puhkeamista MDA- MB-231 sisällyttäminen endoteelin, havaitsimme ehjä GFP-VE-kadheriinin at n risteyksestä suoraan alapuolella MDA-MB-231 solua (Fig. 7A, punaiset nuolet, elokuva S2). Tämä oli suorassa ristiriidassa MDA-MB-231-soluja, jotka sisällytetään endoteelin aikaisemmissa ajankohtina, jossa GFP-VE-kadheriinin ei ilmaistaan ​​viereisen ECS (Fig. 7A, keltaiset nuolet). Ensimmäinen vaihe sisällyttäminen luonut häiriö GFP-VE-kadheriinin at n risteyksestä suoraan alapuolella MDA-MB-231 solua, ja muodostuu pieni (~ 2 um

2) reikä n risteykseen (kuvio . 7B; punainen nuoli). Toinen pieni reikä muodostuu usein (Fig. 5B; kaksi punaiset nuolet) ennen mitätön tuli huomattavasti suurempi (~ 33 um

2 T = 6:35) ja tyhjennetään alueen kehon osaa EY. Lopuksi, mikä aloitti pienenä aukko GFP-VE-kadheriinin lisättyjen valtavaksi reikä endoteelin, joka tuli käytössä MDA-MB-231 solua (Fig. 7B). Havaitsimme myös merkittävää syrjäytymistä ja rakennemuutos GFP-VE-kadheriinin läheisellä EY-EY liittymissä (Fig. 7B; keltaiset nuolet).

DiIC

16-leimattu MDA-MB-231-soluja maljattiin endoteelisolujen ilmentävät VE-kadheriinin-GFP (VE-cad-GFP). (A) Näkyy ovat ero häiriöitä kontrasti (DIC), DiIC

16 (punainen) fluoresenssin, ja VE-kadheriinin-GFP (vihreä) fluoresenssi ja päällystä kuvia. Tällä hetkellä vaiheessa, yksi MDA-MB-231 on jo sisällytetty endoteelin (keltaiset nuolet), ja VE-kadheriinin-GFP on ehjä paikkaan suoraan alapuolella toinen MDA-MB-231 solu, joka ei ole vielä alkanut sisällyttää (punaiset nuolet). (B) Fluoresenssi timelapse sekvenssin DiIC

16-leimattu MDA-MB-231 solu (punainen), joissa osaksi endoteelin ilmentämään VE-kadheriinin-GFP (vihreä). Aika pinnoituksen jälkeen MDA-MB-231-solujen endoteeliin ilmoitetaan oikeassa yläkulmassa jokaisen kuvan tunti: minuutti muodossa. Asteikkoviiva paneelissa A (DIC kuva) on 10 um ja se koskee kaikkia kuvia tässä kuvassa.

Keskustelu

Cancer etäpesäke on edelleen johtava kuolinsyy syöpäpotilailla [1], [2], ja yksi kriittisistä vaiheiden säätelevä etäpesäke on ekstravasaation päässä verisuoniston. Vaikka sääntelymekanismeissa tässä prosessissa ovat epäselviä, endoteelin tiedetään olevan tärkeä rooli, joka toimii joko esteenä joitakin syöpäsoluja, tai promoottori invasiivisen valmiudet muissa syöpäsoluissa lukien MDA-MB-231 [15], [ ,,,0],41]. EY apoptoosin ja poistuminen tyvikalvon on aiemmin raportoitu sivuvaikutuksia aikana syöpäsolun ekstravasaatio [10], [13]. Vastaavasti munasarjojen tuumorisolun pallosia syrjäyttää mesoteelisolujen aikana interkalaatiolla osaksi submesothelial tilaan [16].