Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sonic hedgehog (SHH) medulloblastooma (MB) alatyypin ohjaa proliferatiivinen CD15 + kasvain etenevä solu (TPC) , katsotaan myös kirjallisuudessa otaksutuksi syövän kantasoluja (CSC). Huolimatta paljon tutkimusta, paljon biologian tämän TPC ei tiedetä. Me raportoimme näyttöä siitä fosfataasi ja tensin homologi (PTEN) ja fosfoinositidi 3-kinaasi (PI-3K) on ratkaiseva rooli leviämistä, selviytymisen ja mahdolliset hoitovaste tällä CD15 + CSC /TPC-ajettu pahanlaatuinen sairaus. Käyttäen ND2-

SmoA1

siirtogeenisen hiiren mallia MB, hiiren genetiikka ja potilaasta johdettujen ksenografteissa (PDXs), osoitamme, että CD15 + TPC ovat 1) obligaatisti tarvitaan SmoA1Tg perustuva kasvainten muodostumiseen 2) säätelee PTEN ja PI-3K signalointi 3) selektiivisesti herkkiä sytotoksisia vaikutuksia pan PI-3K estäjät

in vitro

ja

in vivo

mutta resistenttejä kemoterapiaa 4) on SmoA1Tg hiirimallissa ovat genomisesti samankaltaisia että SHH ihmisen MB alaryhmä. Tulokset antavat ensimmäiset todisteet että PTEN on rooli MB TPC signalointi ja biologian ja että PI-3K estäjät tavoite ja tukahduttaa eloonjäämistä ja solujen lisääntymisen sisällä hiiren ja ihmisen CD15 + syövän kantasolujen. Sitä vastoin, CD15 + TPC ovat resistenttejä sisplatiini, temotsolomidi ja SHH-inhibiittori, NVP-LDE-225, aineita käytetään tällä hetkellä hoidossa medulloblastoma. Nämä tutkimukset vahvistaa terapeuttinen teho pan PI-3K estäjien hoidossa CD15 + TPC riippuvainen medulloblastoma ja ehdottaa peräkkäinen yhdistelmä PI-3K inhibiittorit ja kemoterapia ovat täydennetty tehoa tämän sairauden hoidossa.

Citation : Singh AR, Joshi S, Zulcic M, Alcaraz M, Garlich JR, Morales GA, et al. (2016) PI-3K estäjät Edullisesti Target CD15 + Cancer Stem Cell väestö SHH Driven Medulloblastoma. PLoS ONE 11 (3): e0150836. doi: 10,1371 /journal.pone.0150836

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 13 lokakuu 2015; Hyväksytty: 19 helmikuu 2016; Julkaistu: 03 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Singh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Microarray data on talletettu GEO julkisen tietokannan (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), jossa GEO hakunumerolla GSE41717.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat NIH avustus RO1 CA94233 -09 ja FDA RO1 FD- 04385 on DLD ja avustukset Alexin limonadi seistä Foundation for Childhood Cancer (ALSF), (ponnahduslauta Grant) ja Hyundai Hope pyörät Foundation, Hope Grant, Cricket Corporation ja Olivia Hudson Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Joseph R. Garlich ja Guillermo A. Morales työskentelee SignalRx Pharmaceuticals. SignalRx Pharmaceuticals tuettiin muodossa palkkojen tekijöille JRG ja GAM, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut: Tekijät Joseph R. Garlich ja Guillermo A. Morales työskentelee SignalRx Pharmaceuticals. Dr. Durden esiin taloudellisia eturistiriidat SignalRx Pharmaceuticals ja SF1126 huume. On seuraavista patenteista aineellisia merkitystä tässä artikkelissa (PI-3 estäjä aihiolääkkeiden patentti no: 6949537). Suhde Dr. Durden ja SignalRx on sisäisesti tarkistanut ja hyväksynyt University of California, San Diego mukaisesti eturistiriitoja politiikkaa. Tämä Tutkimuksen rahoittivat osittain Cricket Corporation. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Lyhenteet: CSC, syöpä kantasolujen; TPC, kasvain etenevä solu; PI-3K, fosfoinositidi 3-kinaasi; PTEN, fosfataasi ja tensin homologin; PDX, potilaasta peräisin vierassiirrettä

Johdanto

Medulloblastoma (MB) on aggressiivinen pikkuaivojen kasvain ja yleisimmät lapsipotilailla aivot maligniteetti [1, 2]. Nykyinen hoito on medulloblastooma sisältää kasvaimen resektion seuraa säteilyn ja kemoterapian, joka sisältää sisplatiini hoito. Vaikka paranemisasteella on 50-80%, perhe kärsii vakavia haittavaikutuksia, kuten kasvun hidastuminen, endokriiniset häiriöt ja merkitty neurokognitiivisia alijäämät [3]. Siten tehokkaampi ja vähemmän myrkyllisiä hoitojen medulloblastoma kiireellisesti. Viime aikoina useat ryhmät [4-8] ovat esiintyneet geeniekspressioprofilointi ja DNA-copy-number analyysi MB, ja ovat tunnistaneet ainakin neljä suurta taudin alalajeja: WNT, Sonic hedgehog (SHH), ryhmä C, ja ryhmä D . Näiden molekyylien alatyyppejä on erityispiirteitä suhteen geenien ilmentyminen, Mutaatioiden, epidemiologia, ja ennusteen. Joukossa molekyyli alatyyppejä, kasvaimet liittyy kontrolloimaton aktivaatio SHH reitin määritellään yleisesti SHH MB. SHH reitti on olennainen alkion signalointi cascade joka säätelee kantasolujen ja kantaisä-solujen erilaistumista useiden kehitysprosessien [9]. Mutaatiot SHH koulutusjakson vaimennin

Patched

tai muutoksia muiden SHH reaktiotien komponenttien aiheuttaa sen pysyvä aktivointi ja MB kasvainten muodostumiseen [10, 11]. Noin 30% MB osoittaa hallitsemattoman aktivaation SHH signalointireitin [11]. Vaikka useat smoothened (SMO) salpaajiin myös NVP-LDE225 GDC0449 arvioidaan parhaillaan kliinisissä tutkimuksissa potilailla, joilla medulloblastoma, on nopea kehitys kasvain resistenssin [12, 13]. Tekemässä tutkimuksessa Buonamici et al osoittivat, että NVP-LDE225 resistenssin MB välittyy aktivointi fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) signalointireitin. [14]. Olemassa kirjallisuus viittaa siihen, että kasvain vaimennin, PTEN ja tavoitteensa PI-3K ovat tärkeitä patogeneesissä SHH liittyviä MB [15-20]. Viimeaikaiset genomisen analyysin medulloblastoma kasvaimia paljasti, että PI-3K mutaatio (PIK3CA, PTEN, PIK3C2G) on yleisempää SHH alaryhmässä kasvaimissa [21, 22]. Yhdessä näistä tutkimuksista, ulos 13 Hedgehog alaryhmä kasvaimia profiloitu, 2 oli keskeytys- toiminto mutaatioiden

PTEN

, ja toinen potilas oli aktivoiva mutaatio PIK3CA [22]. Toisessa tutkimuksessa, ulos 133 SHH MB kasvaimia profiloitu, PI-3K reitin on mutatoitunut 5% of SHH MBs [21, 22].

Useiden raporttien mukaan MB ohjaa hoidon vastustuskykyisiä kantasolujen -kuten soluja, kutsutaan syövän kantasolut /kasvaimen lisäys- solua (CSC /TPC). Landmark tutkimukset osoittavat, että kasvain näytteet uutettu hiiren geneettisestä MB malleja, Sonic siili (

SHH-Patched

) ja ihmisen MB, jotka levittävät ilmentävät solut kantaisä markkeri CD15 /SSEA [23, 24]. CD15 on hiilihydraattiantigeeniä joka ilmentyy sekä esisolujen ja kantasolujen alkion ja aikuisen keskushermoston [25, 26] ja etenkin pidetään tärkeänä merkkiaineena TPC vuonna SHH alaryhmässä medulloblastoma [23].

TPC pidetään proliferatiivista ja merkittävä tekijä kasvaimen vastus ja uusiutumisen [27-30]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet rooli PI-3K /AKT väylän leviämisen ja leviämisen TPC [31-33]. Raportit ovat osoittaneet, että esto PI-3K aktiivisuus estää leviämisen TPC rinta-, munasarja- ja erilaiset muut syövät [34]. Hambardzumyan

et al

. ehdotti, että PI-3K signalointia säätelee eloonjäämistä syövän kantasoluja seuraavat säteilyn medulloblastoma

in vivo

. [35]. Niinpä arveltu, että kohdistaminen PTEN-PI-3K signalointi akselia MB TPC osasto voi tarjota pitkäaikaista kasvain ohjaus ja /tai hävittämistä medulloblastoma. Aikaisemmin ryhmämme on raportoitu, että heterotsygoottisuustesti PTENin edistää tumorigeneesin sekä ihmis- ja

SmoA1

hiirimallissa medulloblastoma [15]. Olemme raportoitu, että 61% ihmisen medulloblastooman kasvaimia ovat menettäneet ilmentymisen PTEN-proteiinin, ja tämä menetys PTEN on prognoosi- merkitys tässä sairaudessa (15). Tässä käyttäen

SmoA1Tg

hiirimallissa ja ensisijainen ihmisen MB potilaan ksenograftin kasvainnäytteet (PDXs), havaitsimme, että kasvain-lisäys kapasiteetti CD15 + TPC in SHH rakentuvassa MB säädellään ainakin osittain PTEN- PI-3K signalointireitteihin, ja että kohdistaminen tämä akseli käyttää PI-3K estäjät saattavat estää

in vivo

leviämistä TPC ja aiheuttaa apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Animal tutkimukset

ND2:

SmoA1

(

SmoA1

) siirtogeenisiä hiiriä lahja James Olson (University of Washington, Seattle, WA) [36]. Hiiret ylläpidetään Moores Cancer Center vivariums Kalifornian yliopistossa, San Diego, ja kaikki kokeet suoritettiin käyttäen hyväksymiä University of California, San Diego IACUC komitea.

stereotaxic istuttaminen kasvainsolujen

stereotaxic implantaation kasvainsolujen suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [23, 37]. Nude

nu-nu

hiiret nukutettiin käyttämällä 60 mg /kg ketamiinia (Fort Dodge Animal Health) plus 20 mg /kg ksylatsiinia (Ben Venue Laboratories), ja sijoitettu stereotaksiakehykseen hiiren sovitin (Kopf Instruments ). Viilto tehtiin keskiviivan päänahan yli pikkuaivot, ja pieni reikä tehtiin kallon (3 mm oikealle ja 1 mm anterior päälakipisteeseen) käyttäen viistetty (terävä kärki) 25 G neulaa. 30-gaugen Hamilton ruisku täynnä soluja oli asennettu mikromanipulaattorilla ja reiän läpi pintaan oikean otsalohkon, syvyydellä 4,5 mm. Tuore-lajiteltu CD15 +/- kasvain (sivistymätön) solua injektoitiin kuluessa 2 minuuttia, ja neula jätettiin paikoilleen vielä viisi minuuttia välttää refluksi. Lopuksi iho suljettiin 6-0 nopeasti imeytyvä tavallinen gut ommelta käyttäen 3/8 PC-1 leikkaus neula (Ethicon). Eläimiä seurattiin jatkuvasti aikana ja leikkauksen jälkeen sen varmistamiseksi, että hiiret ovat toipuneet leikkauksesta ja ovat avohoidossa ilman todisteita epämukavuutta. Mahdolliset kivulias ja stressaavaa vaikutuksia tämän selviytymisen leikkaus ovat: 1) huono ruokinta, 2) laihtuminen, 3) ryppyiset kuusi, 4) menetys liikkuvuutta häkki, 5) infektio-leikkausalueella. Kipulääke buprenorfiini (0,1 mg /kg) injektoitiin tapauksessa kipua tai epämukavuutta. Imeytymättömiä ompeleet ja /tai niittejä poistettiin 10-14 päivä leikkauksen jälkeen. Jos sairastuvuuteen ei korjata puheenvuorojamme, hiiret lopetettiin käyttämällä CO2 määritetään niskanmurrolla.

Solujen eristämisen Virtaussytometria

Kasvaimen solut eristettiin PDX sekä 4-6 kuukautta vanhan SmoA1Tg hiirissä seuraavasti. Lyhyesti, kasvain kudos leikattiin pieniksi paloiksi, ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 min hajotuspuskuria, joka koostuu Dulbeccon PBS: ää (DPBS, Life Technologies, Grand Island, NY), jossa oli 10 U /ml papaiini (Worthington, Lakewood, NJ) , 200 ug /ml L-kysteiiniä ja 250 U /ml DNaasia (Sigma, St. Louis, MO). Digestion puskuri poistettiin ja korvattiin DPBS: llä, joka sisälsi 8 ​​mg /ml soijapavun trypsiini-inhibiittoria (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 8 mg /ml naudan seerumin albumiinia (BSA, Sigma), ja 250 U /ml DNaasi, minkä jälkeen titraus kudoksen käyttäen pipettiä vähenee sisähalkaisijan saamiseksi yhden solususpensiota. Solut sentrifugoitiin huoneenlämmössä ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 200 ug /ml BSA: ta (PBS /BSA), ja johdettiin solusiivilän (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) jätteiden poistamiseksi. Tämä suspensio sentrifugoitiin läpi vaihegradientilla 35% ja 65% Percol (Amersham Biosciences), ja solut kerättiin 35% -65% käyttöliittymä, pestiin PBS: ssä /BSA: ta. Lajitteluun CD15 + ja CD15- soluja, kasvainsoluja suspendoitiin uudelleen FACS-puskuriin (DPBS + 2% FBS) ja värjättiin 30 min CD15-vasta-ainetta (BD Biosciences, Cat no. 340850, ensisijainen antibodiy), pestiin FACS-puskurilla, värjättiin 30 minuuttia toissijainen antibodiy (FITC), ja sitten analysoitiin tai lajiteltiin käyttäen FACSVantage SE virtaussytometria.

Solulisääntyminen, BrdU, apoptoosin ja solusyklin analyysi

Kasvainsoluja eristetty kuten aiemmin on kuvattu [23] ihmisen potilas johdettu ksenografteja (PDX) sekä 4-6-kuukautta vanhan

SmoA1

PTEN + /+ hiirillä näyttää fyysisen ja käyttäytymiseen merkkejä medulloblastoma.

FACS lajitellut CD15 + ja CD15- solut maljattiin 4 x 10

4 solua /kuoppa ultralow sitoutumisen 96-kuoppalevyille seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi Neurobasal ja B27 täydentää. Soluja inkuboitiin yön yli ja käsiteltiin DMSO tai estäjien 48 tuntia. Solunelinkykyisyysmäärityksen suoritettiin käyttäen AlamarBlue® (Roche) valmistajan protokollan. BrdU-sisällyttäminen tutkimuksia, kasvaimen soluja eristettiin Smo A1 Tg kuten on kuvattu edellä. 2000000 kasvain solua per kuoppa maljattiin 24-kuoppaisille levyille seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi Neurobasal ja B27 täydentää. Solut pulssitettiin BrdU: ssa 30 minuuttia ja sitten pestiin media poistaa mahdolliset jäljellä BrdU. Solut kerättiin heti pulssin ( ”30 minuuttia”), ja värjättiin CD15-vasta-ainetta, kuten edellä on kuvattu. Sitten solut kiinnitettiin ja värjättiin käyttäen FITC BrdU Flow Kit (BD Biosciences) ja propidiumjodidilla (PI) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Analyysi suoritettiin käyttäen FACS Calibur virtaussytometrillä (BD Biosciences). Apoptoosin tutkimukset, CD15 + ja CD15- soluja käsiteltiin inhibiittorin 24 tuntia, jota seurasi kaspaasi-3: n aktiivisuuden määritys käyttäen kittiä (Roche) tai värjäystä anneksiini V:

FITC-vasta-ainetta ja propidiumjodidilla (PI) valmistajan ohjeiden ( BD, Pharmingen, San Diego, CA). Solusyklin analyysi DNA-pitoisuus analysoitiin FACS Calibur virtaussytometrillä (BD Biosciences).

Western blot-analyysi

, FACS-lajiteltu CD15 + tai CD15- soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla estäjien tai DMSO 30 minuuttia ja stimuloitiin sitten IGF 50 ng /ml 30 minuutin ajan. Solut lyysattiin RIPA-lyysipuskuria (Pierce), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseoksen. Proteiinit kvantifioitiin BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce) ja yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin polyakryyliamidigeeleillä, siirrettiin nitroselluloosakalvolle ja koetettiin seuraavilla primaaristen vasta-aineiden: p-AKT (Ser473) (cat no. 9271), p-AKT ( Thr308) (cat no. 9275), AKT (cat no. 9272), p-p70S6K (Thr389) (cat no. 9205), p70S6K (cat no. 2708), p-4EBP1 (Thr37 /46) (cat no. 2855), 4EBP1 (cat no. 9452), Perk (Thr202 /Tyr204) (cat no. 9101), p-PRAS40 (Thr246) (cat no. 2997), PRAS40 (cat no. 2610), p27 Kip1 (cat no . 2552), p-MDM2 (S166) (cat no. 3521), Bad (cat no. 9292) ja PARP (cat no. 9542) (kaikki Cell Signaling Technologies); p21 CIP1 /Waf1 (sc-397), Bax (sc-493) ja β-aktiini (sc-47778) päässä Santacruz.

Quantitative reaaliaikainen analyysi

RNA eristettiin CD15 + ja CD15- soluihin käyttäen RNeasy-kittiä (Qiagen, Germantown, MD) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sillä RTPCR, cDNA valmistettiin 1 ug RNA-näytettä käyttäen iscript cDNA-synteesi kit (Bio-Rad, Hercules, CA). cDNA monistettiin RT-PCR-reaktioissa 1 x SYBR green SuperMix (Bio-Rad, Hercules, CA) 96-kuoppalevyille koskevasta CFX96 Reaaliaikainen järjestelmä (Bio-Rad, Hercules, CA) käyttämällä erilaisia ​​alukkeita ihmisen tai hiiren geenejä. Sekvenssi alukkeiden kuvatulla S1 taulukossa. Suhteellisten ekspressiotasojen normalisoitiin GAPDH ilmaisun kaavan mukaisesti 2 ^ (Ct geeni-Ct GAPDH) .

In vivo

BKM120 hoito

tutkimiseksi vaikutuksen BKM-120 kasvaimen kasvuun

in vivo

, CD15 + ja CD15- TPC istutettiin kallonsisäisesti osaksi pikkuaivoja toissijaisten NSG hiirten tai ihonalaisesti nu-nu hiirille. Ihonalaisen kasvaimia, 20 päivää transplantaation jälkeen, hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään: Ryhmä 1 sai vehikkeliä (käsittelemätön) ja ryhmän 2 annettiin 30 mg /kg BKM-120 letkulla suun kautta kerran päivässä 21 päivää. Kasvaimen mitat kirjattiin joka kolmas päivä ja kasvaimen tilavuus mitattiin käyttämällä seuraavaa kaavaa: tilavuus = 0,5 x pituus x (leveys)

2. Sillä kallonsisäinen kasvaimet, 40-50 päivää istutuksen jälkeen, kasvaimet tarkastettiin MRI ja jaettu ryhmiin ja käsiteltiin kuten on kuvattu ihonalaisen kasvaimia. Mittaus kasvaimen tilavuuden ihon alle istutettiin kasvainta tehtiin jarrusatulat ja kallonsisäinen ihonalaista kasvain suoritettiin Magneettikuvaus (MRI). MRI suoritettiin käyttäen 1,0-T MRI. Hiiret nukutettiin 2% isofluoraani ja hiiriä, sitten kuvataan kanssa Aspect M2 1,0 Teslan pieneläinten skanneri (Aspect Imaging; Shoham, Israel). T2-painotettu, kuvat saatiin käyttämällä toistoa aikaa 2500 ms, kaiku aika 60 ms, viipaleen paksuus 1 mm, näkökenttä 35 mm ja matriisin koko 184 x 184 (tasossa päätöslauselmassa 35 /184 = 0.19mm). MR kuvantamistutkimukset, kasvainten tilavuudet mitattiin manuaalisesti segmentoimalla kasvaimia joko Varian n Kuvaselainohjelmisto tai julkista ohjelmaa ImageJ Image (https://rsb.info.nih.gov/ij). T2-painotettu kuvia käytettiin joskus auttaa selvittämään kasvain marginaalit.

Ihmisen kasvaimen eristäminen ja eteneminen

Human MB kudosta potilaasta johdettujen ksenografteissa saatiin resektioleikkaukselle kasvaimia Rady lastensairaalassa ( San Diego, CA). Kaikki menettelyt käytetään ihmisen kudosta hyväksyi Institutional Review Boards of Rady lastensairaalassa. Kun haku, kudos hajotettiin mekaanisesti yhdeksi-solususpensiota, sitten välittömästi ruiskutetaan aivoihin NSG hiirillä. Kun hiiret tuli oireellinen, kasvaimet jälleen hajotettiin yksisoluiset suspensiot ja sitten uudelleen siirtää takaisin aivoihin naiivia isännät perustaa lisätyistä linja kullekin potilaalle johdettujen vierassiirrettä.

mikrosiruanalyysillä

SmoA1Tg

kasvainsoluja lajiteltiin CD15 + ja CD15- väestön ja käytettiin RNA: n eristämiseen käyttämällä RNeasy Kit (Qiagen, Germantown, MD). RNA eheys arvioitiin käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer. Näytteet osoittavat RNA eheys (RIN) on suurempi kuin 8,0 käytettiin mikrosiruanalyysillä. RNA leimattiin ja hybridisoitiin Affymetrix Mouse Genome 1.0 ST taulukot. Array tietoja käsittelee RMA ohjelmisto. Merkitys analyysi Microarray (SAM) ohjelmistoa käytettiin määrittämään ero ilmaisutapoja väärä löytö määrä (FDR) 1% ja vähintään fold-muutos 2, ellei toisin mainita. Heatmaps luotiin käyttäen R-paketti. Geenien ilmentyminen tietoja transformoitiin Z-score ja hierarkkinen klusterointi kanssa euklidinen etäisyys levitettiin tuottaa rivin ja sarakkeen dendrogrammissa. Microarray tiedot on talletettu GEO julkisen tietokannan (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), jossa GEO hakunumerolla on GSE41717.

alaluokka ja SUBMAP analyysi verrata hiiren CD15 + TPC ihmisten MB alaryhmiin

MB alaluokka ja SUBMAP analyysi, joka mahdollistaa cross-platform ja rajat lajien vertailu microarray tiedot perustuvat Kolmogorov-Smirnov tilastot (33), käytettiin vertaamaan hiiren kasvaimia ihmisen MB näytteet kuvattu [4]. Alaluokka Mapping moduuli Gene Pattern ohjelmistopaketti (www.broadinstitute.org/genepattern) käytettiin vertaamaan hiiren aineisto on geeniekspression aineisto koostuu primaaristen ihmisen MB luokiteltu molekyyli- alatyyppeihin (C1-C6), kuten on määritelty Cho et al. ja sarjan normaalin pikkuaivojen näytteiden ja epätyypillinen epämuodostunut rhabdoid kasvaimia [4]. Mapping tulokset edustettuina alaluokka yhdistys (SA) matriisi-täynnä p-arvot kullekin alaluokan -alueella.

Gene asettaa rikastus analyysi (GSEA) B

GSEA suoritettiin kuten on kuvattu [ ,,,0],38]. Lyhyesti, geenit käskettiin perustuu niiden differentiaalikaavojen kahteen eri luokkaan (CD15 + vs. CD15-). Rikastumisen pistemäärä (ES) laskettiin sitten kullekin geeniperimä. Gene, joissa on nimellinen p-arvo 0.05 olivat mukana merkittäviksi. Tätä analyysiä varten, kuratoitu geenin sarjaa (c2) peräisin MSigDB v.3.0 (https://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp) käytettiin. PCA analyysi 22 etureunan geenit tunnistettu SUBMAP arvioinnissa verrattiin kaikilla eläinlajeilla esteen CD15 +, CD15- ja ihmisen MB kasvaimen geeniekspression tietokanta [4].

Tulokset

PI- 3K signalointi erittäin koholla CD15 + TPC eristää

SmoA1 Tg

medulloblastoma hiirimallissa

on hyvin tunnettua, että CD15 on merkkiaine kasvain etenevät solujen PTC +/- mallissa SHH ajettu medulloblastoomien [ ,,,0],23]. Esillä olevassa tutkimuksessa,

ND2SmoA1

siirtogeenisen hiiren mallia käytettiin luonnehtimaan signalointireittien tarvitaan leviämisen CD15 + TPC. Ensin suoritetaan Alustavissa kokeissa meidän

SmoA1

malli vahvistaa, että CD15 on solunpintamarkkeria kasvainten etenevät soluja tässä Shh ajettu medulloblastoma malli. Tätä tarkoitusta varten potilaalle tehdä elinsiirron määritys on perustettu, jossa

SmoA1

PTEN + /+ kasvaimen solut lajiteltiin CD15 + ja CD15- jakeet, ja 2 x 10

6 solua kustakin fraktiosta stereotaxically istutetaan pikkuaivot nude /

nu-nu

hiirillä. S1A Kuvio esittää FACS datan validointi, että puhdas CD15 + väestöstä on eristetty kasvaimista. Kuten on esitetty S1B kuviossa implantaatio vain CD15 + TPC johti toisen kasvaimia 10-12viikko että histologisesti muistutti primäärikasvaimissa, josta solut olivat peräisin (tuloksia ei ole esitetty). Vuonna S1B Kuviossa osoitamme Ki67 värjäystä vasta sekundaarikasvaimia johdettu CD15 + TPC osoittaa suurempi proliferatiivinen indeksi näiden solujen suhteessa normaaliin aivoihin. Lisäksi meidän havainnot osoittavat, että vain CD15 + soluja

SmoA1 PTEN + /+

medulloblastoma voi tuottaa kasvaimia

in vivo

. Jotta edelleen arvioida kantasolun kaltainen ominaisuudet CD15 + TPC, suoritimme reaaliaikainen PCR-analyysi useita kantasolujen merkkiaineiden ja tulokset osoittavat, että tietyt kantasolujen merkkiaineita esim Oct4, Klf4 Sox2, CXCR4, pou5f1, Nanog, nestiinifenotyypin ja musashi ovat erittäin rikastettu CD15 + TPC lokero

SmoA1

Tg hiirimallissa (S1C kuvio). Jotta saataisiin tarkempi käsitys kasvain etenevä ominaisuuksia CD15 + soluja, suoritimme useita biokemiallisia ja genomisen analyysejä CD15 + ja CD15- solupopulaatioiden eristetty

SmoA1

Tg kasvaimia. Tämän analyysin perusteella, huomasimme, että CD15 + väestö eristetään Smo

A1

Tg hiirimallissa neuropalloja muodostavien (tuloksia ei ole esitetty), näyttää selvästi ilme kuvio ja ovat erittäin proliferatiivisia kuten paljasti lisäämällä elävien solujen määrä ajan mittaan (kuvio 1A, vasen paneeli) ja suuremmat BrdU in CD15 + soluihin verrattuna CD15- soluihin samasta kasvain (kuvio 1A, oikea paneeli). Tämä tulos tukee myös korkeampi H

3-tymidiinin (tietoja ei esitetty) CD15 + -soluissa verrattuna CD15- soluihin. Data esitetään S2 taulukossa ja S2 kuvio osoittaa, että geenit liittyvät joukkotuhoaseiden leviämisen ja solujen eloonjäämistä (S2A kuvio), SHH signalointireitille (S2B S2C kuvassa) ja angiogeneesiä (S2D kuvio) ovat erittäin koholla CD15 + väestöstä. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat, että kasvain-etenevän kapasiteetti CD15 + solujen liittyy lisääntynyt kyky lisääntyä ja vähentynyt taipumus apoptoosiin ja erilaistumiseen.

CD15 + TPC eristää

SmoA1

Tg medulloblastoma hiirimallissa ovat erittäin proliferatiivisia ja näyttää kohonnut PI-3K signalointi (A) Vasen paneeli näyttää leviämisen CD15 + ja CD15- soluja eristettiin

Smo A1

kasvaimia. , FACS-lajiteltu CD15 + ja CD15- kasvainsoluja (n = 4) viljeltiin 48 tunnin ajan seerumittomassa väliaineessa, minkä jälkeen lisätään AlamarBlue® ja inkuboimalla levyjä 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 6 tuntia. Fluoresenssisignaalien luettiin kuin emissio 590 nm virittämisen jälkeen 560 nm. Oikea paneeli esittää BrdU in CD15 + ja CD15- soluja eristettiin Smo A1 Tg. CD15 + ja CD15- päässä Smo kasvaimia pulssitettiin BrdU, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (B) FACS-lajiteltu CD15 + ja CD15- solut analysoitiin ilmentymisen PTEN ja fosforylaation Akt, 4EBP1, p70s6K ja Erk. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C) Kvantitatiivinen PCR-analyysi mRNA ilmentymisen PTEN FACS-lajiteltu CD15 + ja CD15- soluja (n = 3). Suhteellisten ekspressiotasojen normalisoitiin GAPDH ilmentymisen. Koe toistettiin 3 kertaa samankaltaisilla tuloksilla.

PI-3K /AKT-reitin on osoitettu olevan tärkeä leviämisen TPC sekä kiinteitä kasvaimia ja leukemiaa [31-33]. Jotta voidaan tutkia mahdollisen mekanistisen rooli PI-3K signalointireitin TPC leviämistä ja selviytymistä medulloblastoma, päätimme suhteellinen aktivaatiotilaa PI-3K /AKT sisään CD15 + TPC vs. CD15- ei-TPC. Western blot -analyysi paljasti, että CD15 + -solut on pienempi pohjapinta-ekspressiotasot PTEN ja on aktivoitu PI-3K signaloinnin akselin verrattuna CD15- soluihin, jotka osoittavat huomattavaa lisäämistä fosfo-AKT, fosfo-S6 ja fosfo-4EBP1 (kuvio 1B). Nämä tulokset tukevat täydennetty tasot PTEN mRNA: n havaittiin CD15- väestön verrattuna CD15 + soluja (kuvio 1C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että PTEN ilmentyminen säädeltiin vähentävästi ja PI-3K signalointi koholla CD15 + TPC verrattuna CD15- väestöön.

Etuuskohteluun kohdentaminen TPC PI-3K estäjät

in vitro

edellä esitetyt tulokset osoittavat, että PI-3K signalointi yliaktiivista CD15 + TPC määritettynä alhaisempi PTEN ja aktivointi AKT. Siksi me arveltu, että hoitoon CD15 + soluja PI-3K inhibiittorit olisivat ensisijaisesti estää leviämisen CD15 + TPC. Tätä varten paneeli PI-3K estäjät, SF1126 [39], BEZ-235 [40] (Selleck kemikaalit), PF4691502 [41] (Selleck kemikaalit) ja BKM120 [42] (Novartis) käytettiin. Sisplatiini, TMZ ja NVP-LDE-225 ostettiin Selleck Chemicals. Tulokset kuviossa 2A osoittavat, että vaikka PI-3K estäjät annosriippuvaisesti vähentää leviämisen sekä CD15 + ja CD15- TPC eristää

SmoA1

Tg hiirimallissa, se oli tehokkaampi vastaan ​​CD15 + väestöstä. IC

50 BKM120, BEZ, PF4691502 ja SF1126 on 0,156 uM, 0,167 uM, 2,6 uM ja 4,3 uM CD15 + soluja ja 6,17 uM, 5,54 uM, 4,8 uM ja 19,9 uM tai CD15- soluja, tässä järjestyksessä. Aiempi työ on ehdottanut, että BKM120 on erinomainen veriaivoesteen läpäisy [42]. Siksi valitsimme BKM120 meidän

in vivo

tutkimuksissa. Nykyinen hoitojen nuoremmille lapsille medulloblastoma ovat olleet käytössä multiagent kemoterapeuttisten lähestymistapojen mukaan lukien kemoterapeuttiset aineet, temotsolomidi, sisplatiini [43, 44] ja NVP-LDE225, joka on Smo antagonisti kehittämä Novartis [45]. Näin ollen tutkimme suhteellinen sytotoksisuuden Näiden lääkkeiden CD15 + vs CD15- kasvainsoluja. Näitä kokeita varten, CD15 + ja CD15- soluja eristettiin Smo

A1

Tg malli käsiteltiin BKM120, sisplatiini, temotsolomidin, NVP-LDE225 tai yhdistelmä BKM120 kanssa sisplatiini tai temotsolomidin tai NVP-LDE225. Mielenkiintoista, sisplatiinia (IC

50 11,4 uM CD15 + soluja ja 4,5 uM CD15- soluja) ja TMZ (IC

50 30 uM CD15 + soluja ja 20 uM CD15- solut) ei ole vaikutusta, kun taas NVP- LDE-225 (IC

50 2,8 uM CD15 + soluja ja 2,5 uM CD15- soluja) on hyvin vähemmän vaikutusta eloonjäämiseen CD15 + soluja (kuvio 2B), mikä viittaa siihen, että CSC /TPC ovat resistenttejä tavanomaisille kemoterapiaa. S3A ja S3B kuvio esittää annoksesta riippuva vaikutus sisplatiinin, ja TMZ on CD15 + ja CD15- soluja. NVP-LDE-225 osoitti sytotoksisten vaikutusten suurina annoksina CD15 + ja CD15- soluja, joilla ei ole merkittävää vaikutusta 100 nM väk. (S3A S3B kuvassa) Mielenkiintoista yhdistelmä BKM120 sisplatiini ja BKM120 TMZ ei johtanut augmentaatioon sytotoksisuuden aktiivisuuden CD15 + soluja (kuvio 2B). Kuitenkin yhdistelmä BKM120 ja NVP-LDE225 osoitti synergiaa CD15 + soluja (kuvio 2B). Me seuraavaksi määrittää, jos PI-3K estäjät voivat estää kohonnut PI-3K signalointiryöpyn in CD15 + TPC. Treatment of CD15 + -soluja erilaisilla annoksilla BKM120 30 minuuttia, inhiboi fosforylaatiota AKT, sen alavirrassa oleva kohde PRAS40 ja mTOR substraattien PS6, p4EBP1 annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2C), joilla dramaattinen lasku 2,0 uM ja lähes täydellinen inhibitio 10,0 uM. Reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että 2 uM pitoisuus BKM120 täysin tukahdutetaan ilmentymistä SHH reitin geenien nim.

gli1

,

gli2

,

N-Myc

,

C-Myc

, ja

sykliini-D1

(kuvio 2D).

Etuuskohteluun kohdentaminen TPC PI-3K estäjät

in vitro

(A) Vaikutus PI-3K estäjien leviämisen CD15 + ja CD15- soluja. CD15 + ja CD15- soluja viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa, jossa ei ole lisäainetta, DMSO (ajoneuvo), BKM-120, BEZ-235, PF-04691502, ja SF1126 eri väk. 48 h jälkeen, AlamarBlue® lisättiin ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 6 tuntia. Fluoresenssisignaalien luettiin kuin emissio 590 nm virittämisen jälkeen 560 nm. (B) CD15 + ja CD15- soluja käsiteltiin 100 nM väk. of sisplatiini, TMZ, NVP-LDE-225 joko yksin tai yhdessä BKM 120 ja analysoitiin solujen elinkelpoisuus käyttäen Alamar Blue. (C) CD15 + TPC käsiteltiin BKM120 30 minuuttia, mitä seurasi stimulaatio IGF (50 ng /ml). Solulysaatit analysoitiin Western blot fosforylaatioon substraatteja PI-3K signalointia. (D) Suhteellinen ilmentyminen SHH reitin geenien BKM120 käsitelty (0,2, 2,0 uM) ja käsittelemättömän CD15 + TPC. Suhteellisten ekspressiotasojen normalisoitiin GAPDH. Käyrät esittävät keskiarvoa ± SEM 3-4 hiirtä kussakin ryhmässä B ja D Tilastollinen merkitys arvioidaan kahden otoksen

t

-testi, jossa * merkitsee

P

0,05, ** tarkoittaa

P

0,01 ja *** tarkoittaa

P

0,001. Koe toistettiin 4-5 kertaa samankaltaisilla tuloksilla.

Differential herkkyys CD15 + vs CD15- soluja PI-3-kinaasi-inhibiittori; Esto PI-3K reitin hillitsee indusoimalla solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin indusoimiseksi CD15 + TPC mutta ei CD15- soluihin

Seuraava selvitettävä, jos PI-3K: n estäjät voivat aiheuttaa solukierron pysähtymisen että CD15 + TPC lokero . Tämän vuoksi meidän arvioitiin ensin perustason prosenttiosuudet CD15 + ja CD15- soluja eri vaiheissa solusyklin ja havaitsi, että 67% 26%: n CD15- TPC olivat G0-G1 versus S-faasissa, kun taas CD15 + solut käsittävät 48% ja 45% soluista G0-G1 versus S-faasissa, vastaavasti (kuvio 3A). Lisäksi hoito CD15 + TPC kanssa BKM120 johti solusyklin pysähtymisen kanssa suhteessa kasvuun G0-G1 ja lasku solujen määrä S-vaiheen solusyklin (kuvio 3A, vasen paneeli), kun taas hoito CD15-