Krooninen sairaus

tiivistelmä

interleukiini-11 (IL-11) on pleiotrooppinen sytokiini, FDA: n hyväksymä vastaan kemoterapian indusoima trombosytopenia. Kombinatorisesta valinta syöpäpotilaan, me eristetty IL-11: n kaltaisen peptidin kartoitus domeeni I IL-11 (sekvenssi CGRRAGGSC). Vaikka tämä motiivi on ligandin ominaisuuksia, se ei sisällä aiemmin tunnettu vuorovaikutuksessa sivustoja. Tässä me suunnitella ja validoida-tandem sitoutumismääritykset, kohdennettua mutageneesiä ja NMR-spektroskopia osoittaa, (i) peptidi jäljittelee reseptorin sitoutumiskohdan sisällä IL-11, (ii) sitoutuminen CGRRAGGSC IL-11Rα on toiminnallisesti asiaan, (iii) Arg

4 ja Pa

8 ovat keskeisiä tähteitä välittävä vuorovaikutus, ja (iv) IL-11: n kaltainen motiivi indusoi soluproliferaatiota kautta STST3 aktivointia. Nämä rakenteelliset ja toiminnalliset tulokset paljastamaan vielä tunnistamaton reseptorin sitoutumiskohdan ihmisen IL-11. Koska IL-11Rα on ehdotettu tavoite ihmisen syövässä, tuloksemme antaa vihjeitä järkevää suunnittelua kohdennettuja lääkkeitä.

Citation: Cardo-Vila M, Zurita AJ, Giordano RJ, Sun J, Rangel R, Guzman-Rojas L, et ai. (2008) ligandin Peptide Motif valitut syöpäpotilaan on reseptori-Interacting Site sisällä Ihmisen interleukiini-11. PLoS ONE 3 (10): e3452. doi: 10,1371 /journal.pone.0003452

Editor: Maxim Antopolsky, University of Helsinki, Suomi

vastaanotettu: 23 heinäkuu 2008; Hyväksytty: 24 syyskuu 2008; Julkaistu: 20 lokakuu 2008

Copyright: © 2008 Cardo-Vila et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Specialized Program Research Excellence (SPORE) National Cancer Institute (WA ja RP), US Department of Defense (ja MGK, WA, ja RP), ja palkintoja Eturauhassyöpä Foundation , Marcus säätiön ja Gillson-Longenbaugh Foundation (WA ja RP). MCV sai tutkijatohtorin päässä Susan G. Komen Breast Cancer Foundation. AJZ sai tutkijatohtorin Instituto de Salud Carlos III (Espanja); RR on Scholaria Odyssey ohjelma The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center. CDA sai predoctoral apurahan National Research Council (Brasilia). FCLA ja APV saanut tukea Rio de Janeiro Research Support Foundation ja National Research Council (Brasilia). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Faagiesittely mahdollistaa tunnistamisen kudosspesifisiä tai angiogeneesiin liittyvä molekyyli allekirjoituksia verisuonia ja siten mahdollistaa ligandin ohjaama toimitus [1] – [10]. Aikaisemmin osoitimme, suoraan seulomalla kombinatorinen peptidin kirjasto syöpäpotilaan, että valikoiva itseohjautuva peptidien paikallinen ei-satunnaisesti tiettyihin elimiin [1]; Olemme myös tunnistaneet syklinen peptidi (sekvenssi CGRRAGGSC) kohdistaminen eturauhas- verisuoniston ja eturauhassyöpää kuin interleukiini-11 (IL-11) matkivat [1], [2]. Eri linjaa tutkimuksen, Kang et al. [11] ehdotti keskeinen rooli IL-11-reitin geneettisessä etenemistä pahanlaatuisia kasvaimia metastaattisen luuhun. Aktivointi jäsenten signaalitransduktion ja aktivaattori transkription (STAT) perheen, erityisesti STAT3, paljastui alavirtaan seurauksena sitoutumisen IL-11 sen vastaavan reseptorin [12].

Vaikka IL- 11 oli alun perin tunnusomaista sytokiiniä, jossa trombopoieettista aktiivisuutta, se todettiin myöhemmin on pleiotrooppisia vaikutuksia useissa kudoksissa [13]. Rekombinantti IL-11 on FDA-hyväksytty lääke (oprelvekin; Neumega®) vastaan ​​käytetään kemoterapian aiheuttaman trombosytopenian (https://www.fda.gov/cder/biologics/products/opregen112597.htm) [14]. Sekä yli 10 muuta neljän kierteen kimppu sytokiinit, mukaan lukien interleukiini-6 (IL-6), leukemiaa estävä tekijä (LIF), siliaarinen neurotrofinen tekijä (CNTF), onkostatiini-M (OSM), ja kardiotrofiini-1 (CT 1), IL-11 kuuluu gp130: n tai IL-6-tyypin [15], [16]. Nämä sytokiinit aiheuttavat vasteita, jonka kokoonpano oligomeerisen signalointikompleksejaan jotka sisältävät transmembraanireseptoriproteiinia gp130. Rakenne IL-11 on tehty Molekyylimallinnuksen ja mutageneesitutkimukset [17] – [21]. Tutkimus on osoittanut, että IL-11 sisältää kolme tunnettua reseptori-sitoutumiskohtia (I, II ja III). Site I IL-11 sitoutuu sytokiini-reseptori homologia alue (CHR) aloilla, 2 ja 3 (D2-D3) IL-11Rα, kun taas sivustot II ja III vuorovaikutuksessa kahdesta erillisestä alueesta gp130 homodimeerin: ihmisoikeustoimikunnan ( D2-D3, site II) ja Ig-kaltaisen domeenin (D1, site III) [22] – [24]. Ei ole kuitenkaan suoraa rakenteellinen analyysi on saatavana joko IL-11 tai signalointi monimutkaisia. Itse asiassa, kun taas X-ray rakenne IL-6-reseptorin kompleksin heksameerisen IL-6 /IL-6Rα /gp130 kolmen komponentin kompleksin on otettu käyttöön malli IL-11 [25] – [27], tarkkuus tämän ekstrapolointi on todellisuudessa asetettu kyseenalaiseksi, koska IL-11 ja IL-6 osuus merkittävää samankaltaisuutta ensisijainen rakenne ja vuorovaikutuksessa eri reseptoreihin oletettavasti erilaisten mekanismien kautta [28]. Ligandi aiheuttama siirtymä aktiiviseen tetrameeristä kompleksin (mukaan lukien gp130-dimeeri) inaktiiviseksi heksameerisen kompleksin on ehdotettu IL-11 [28], [29]. Vastata IL-11 rajoittuu soluihin, jotka ekspressoivat IL-11Rα lisäksi gp130. Analogisesti IL-6-reseptorin α (IL-6Rα) ja IL-6, on oletettu, että IL-11Rα ”esittelee” IL-11: n gp130, joka on otettu palvelukseen homodimeerinä ja johtaa sukupolven niin -called korkean affiniteetin IL-11-reseptorikompleksin. Tämä aktiivinen kompleksi on aloittava askel aktivoituminen Janus-kinaasi (JAK) /Tyk tyrosiinikinaaseja, mikä puolestaan ​​fosfo- tyrosiinitähteiden sytoplasminen alue gp130; Näiden jälkeen toimivat telakointikohtina jäsenten STAT perheen transkriptiotekijöiden, esimerkiksi STST3 [12], [13], [17].

Vaikka in vivo-valittujen homing motiivi CGRRAGGSC oli tiettyjä ligandeille erityispiirteet [1], [2], vastaava sijainti sisällä natiivi sytokiini ei ole perustettu vuorovaikutuksessa sivuston välillä IL-11 ja IL-11Rα [17] – [28]. Oletimme, ja vahvisti myöhemmin, että tämä peptidi motiivi toimii uuden sitoutumiskohdan sisällä IL-11. Tandem kohdennettu mutageneesi, sitoutumismääritykset, magneettikuvaus (NMR), ja signaalitransduktion analyysi voimakkaasti tukevat päätelmää, että tämä peptidisekvenssi on todellakin aikaisemmin tunnistamattomia reseptoria vuorovaikutuksessa sivustolle ihmisen IL-11.

tulokset

Selected sekvenssi-sitoutumisen IL-11-reseptori-kompleksi on erityinen ja ei sisällä gp130

Olemme aiemmin todettu, että faagit motiivin CGRRAGGSC erityisesti vuorovaikutuksessa IL-11Rα; tämä vuorovaikutus estyi rekombinantti-IL-11: n pitoisuudesta riippuvaisella tavalla, mutta ei IL-1β [1], [2]. Koska toiminnallisen IL-11-reseptorikompleksin näyttää olevan usean heterodimeeri, joka koostuu IL-11, IL-11Rα, ja gp130 [15], ensin arvioidaan, onko valittu IL-11: n kaltainen motiivi [1], [2] olisi sitoutuvat IL-11Rα, gp130, tai molemmille. Tätä tarkoitusta varten olemme päällystetyillä levyillä seuraavalla proteiini: IL-11Rα, gp130, tai leptiinin reseptorin (liity gp130 kumppani). Naudan seerumin albumiini (BSA) toimi negatiivisena kontrollina sitoutumisen määrityksessä (kuvio 1A). CGRRAGGSC-faagi ei sido tausta-arvoja suurempi immobilisoituun gp130, verrattuna sen merkittävää sitoutumista ihmisen IL-11Rα (kuvio 1A), dataa, joka osoittaa ei-faagin sitoutuminen gp130 yksin. Lisäksi CGRRAGGSC-faagi sitoutumisesta leptiinireseptorin tai BSA oli undistinguishable kuin kohdistamattomien valvonnan faagin. Nämä tulokset vahvistaa, että CGRRAGGSC peptidi vain sitoutuu IL-11Rα reseptorin monimutkainen, kun yksittäiset alayksiköt analysoidaan. Me seuraavaksi osoitti, että CGRRAGGSC-faagin sitoutuminen IL-11Rα välittyy IL-11: n kaltainen motiivi, koska synteettinen CGRRAGGSC inhiboivat sukulais faagin konsentraatiosta riippuvalla tavalla (kuvio 1 B).

( A) CGRRAGGSC-faagin sitoutuminen yksittäisten reseptoriin komponentit IL-11-reseptorikompleksin: IL-11Rα ja gp130. Leptiinireseptorin ja BSA toimi negatiivisten kontrollien sitovia. (B) pitoisuus riippuvainen sitoutumisen inhibition CGRRAGGSC-faagin IL-11Rα joita samaa alkuperää synteettinen peptidi. Pylväät edustavat keskiarvoa ± keskivirhe keskiarvon (SEM).

NMR-spektroskopia kohdennettujen peptidi-reseptori vuorovaikutuksen

NMR on erityisen sopiva menetelmät tutkia keskipitkällä alhainen affiniteetilla [30], [31], joka on usein kyse vuorovaikutuksen peptidiligandeja tunnistetaan phage display (kuten CGRRAGGSC peptidin ja IL-11Rα). Mittaamalla hienovaraisia ​​muutoksia NMR parametrien ligandin (esimerkiksi kemiallisten siirtymien ja rentoutumista kertaa) voidaan koetin sitovia tapahtumia tällä JlM mM pitoisuusalue johtuen nopea välistä sitoutuneen rakenne ja vapaamuotoinen ligandin. Kun nopea vaihto regiment saavutetaan ylimäärä ligandin (mM) yli reseptorin (uM) voidaan käyttää mittausten. Nopea vaihto ehto on usein läsnä sitovia tutkimuksia peptidit valitaan faaginäyttökirjastot koska niiden luontainen keskisuuri tai pieni affiniteetti välillä [30] – [32]. Siten luonnehtia rakenteellinen vuorovaikutus peptidin CGRRAGGSC ja IL-11Rα, käytimme NMR-spektroskopia [30], [32]. Aloitimme analysoimalla rakenteen käyttäytymistä vapaan synteettisen peptidin CGRRAGGSC protoni NMR. Yksiulotteinen (1 D-

1H-NMR) avulla näytetään päälinjat 25 ° C: ssa (kuvio S1A) että niissä on konformationaalisten vaihto kesken useiden CGRRAGGSC konformeerien. Vaikka resonanssi linja tuli enemmän määritelty 5 ° C: ssa, konformationaaliset vaihto pysyi alhaisissa lämpötiloissa (kuva S1A); todellakin, esiintyminen useiden konformeerien ei ole harvinaista tässä tilanteessa eikä ole suljettu pois tutkimuksesta ligandireseptorin vuorovaikutusten [30]. Kun kyseessä on CGRRAGGSC peptidin lähes kaikki resonanssien spektrit yksiselitteisesti osoitettu yksittäisten tähteiden peptidin perusteella kaksiulotteinen protonispektreistä (2D-

1H-NMR) TOCSY- ja NOESY (taulukko S1 ja S2).

Kun ominaista rakenteellinen käyttäytymistä CGRRAGGSC peptidin liuoksessa ja luovutti resonanssia vuonna NMR-spektrit, me seuraavaksi perustaa sitoutumismääritykset [30] perehtyä perustan reseptoriin sitoutumisesta ligandiin peptidi. Spektrin vapaan CGRRAGGSC on verrattu CGRRAGGSC läsnä ollessa IL-11Rα (alle mooliylimäärä peptidin ~16-, 33- ja 66-kertainen), ja muutokset kemiallisen siirtymän (Δδ) analysoitiin (kuvio 2A). Vaikka tarkka kartoitus jäämien CGRRAGGSC ei saavuteta alkaen 1 D-

1H-NMR-spektrit johtuen reseptoriin huippu päällekkäisyyttä, vuorovaikutus CGRRAGGSC ja IL-11Rα johti kemiallisen siirtymän muutoksia ja uusia spin järjestelmät (kuvat 2A -C). Tällaiset muutokset ovat osoitus sitovia ja ovat viitteellisiä, että useat tähteet edistävät vuorovaikutusta. Lisäksi sitova tasapaino oli riippuvainen peptidin pitoisuus ja joka takaa nopean vaihtokurssin (ps alue) johtuen resonanssia vapaan ja sitoutuneen muotoja peptidin havaittiin kuin keskimääräinen bändejä (kuvio 2A).

( A) vaikutus CGRRAGGSC peptidin suus biding IL-11Rα. Amidi alueella 1 D-

1 H-NMR-spektrit lisätä moolipitoisuuksien peptidin CGRRAGGSC sitoutumisen IL-11Rα (6 uM) on esitetty (sininen). CGRRAGGSC peptidi yksinään (400 uM) ja spektri IL-11Rα yksin on myös esitetty (punainen ja musta, vastaavasti). Ulkonäkö arginiini sivuketjun resonanssia (ei nähty spektri peptidin yksin) on merkitty (*). (B) Kemiallisen siirtymän aiheuttamien muutosten on CGRRAGGSC resonanssia sitoutumalla IL-11Rα. 2D-

1H-NMR TOCSY spektrit CGRRAGGSC (400 uM) joko yksinään (musta) tai, kun läsnä on 6 uM IL-11Rα (punainen) on esitetty. Single-johdossa ja kaksipäinen nuolet osoittavat kemiallisen siirtymän muutoksia ja se, että uusien spin-järjestelmien, vastaavasti. (C) koostumus amidin alueella 1 D-

1 H-NMR ja vastaavat 2D-

1H-NMR TOCSY spektrit CGRRAGGSC peptidin 5 ° C: ssa (vasemmalla), 25 ° C: ssa (keskellä) ja 25 ° C: n läsnä ollessa IL-11Rα (oikealla). Ympyrät pisteviivoilla ja nuoli osoittaa arginiini resonanssia.

Jos haluat laskea yksittäisen kemiallisen siirtymän muutoksia (Δδ) indusoi IL-11Rα kun kukin vetyatomien CGRRAGGSC vertasimme yksittäisten 2D –

1H-NMR TOCSY-spektri on saatu, ja IL-11Rα (molaarinen peptidin ylimäärä ~66-kertainen) (kuvio 2B ja taulukko 1). Nämä spektrit myös käyttää analyysiin uusien spin järjestelmät (kuvat 2B ja 2C). Vuonna 2D-

1H-NMR TOCSY reseptoriin NMR-signaalin suodatettiin aikana 80 ms spin-lukitus, mikä johtaa puhtaampaan analyysi kemiallisen siirtymän häiriön. Havaitsimme, että useimmat yksittäiset resonanssia CGRRAGGSC osoitti merkittäviä Δδ sitoutumisen IL-11Rα (kuvio 2B ja taulukko 1), tuloksena osoittaa, että lähes kaikki tähteet CGRRAGGSC osallistuvat sitoutumiseen reseptorin suoraan tai epäsuorasti. Näkyvin Δδ ( 10 Hz) mukana α-vetyatomien Gly

7 ja Cys-tähteiden (joita ei voida yksiselitteisesti määritetty ja tässä sitä kutsutaan Cys

1/9). Kuitenkin Δδ 5 Hz jäämien Cys

1, Gly

2, Gly

6, Ser

8, ja Cys

9 oli myös huomionarvoista. Uusi spin järjestelmät havaittiin 1 D-

1H-NMR-spektri (kuvio 2A) esiintyi myös TOCSY spektrit, ja jaettiin Cys

1/9, Arg

3/4, ja Ala

5 (kuvio 2B, kaksipäinen nuolet). Nämä uudet spin järjestelmiä karttaa peptidin alueella, joka käy läpi monimutkaisen konformationaalisen tasapainoa vapaassa tilassa. Tämä tulos viittaa siihen, että sitoutumisen IL-11Rα segmentin Cys-ss-Cys-Gly-Arg-Arg-Ala CGRRAGGSC tulee konformationaalisesti, jolloin voitto-of-rakennetta ja vastaavia loss of vapauden CGRRAGGSC sidotussa tilassa. Johdonmukaisesti, havaittiin samanlaiset tulokset vertaamalla 1 D-

1 H-NMR ja 2D-

1H-NMR TOCSY spektrit CGRRAGGSC 5 ° C: ssa ja 25 ° C: ssa (kuvio 2C). Arg

3, Arg

4 ja Ala

5 resonanssia voitiin havaita vain spektreissä 5 ° C: ssa (kuvio 2C, vasen paneeli), mutta ei spektrien 25 ° C: ssa (kuvio 2C, keskimmäinen paneeli), mikä myös osoittaa, että konformationaaliset vaihtelu on merkitystä, kun havaita tällaiset spin järjestelmiä, joka on hiljattain raportoitu [31], [33] – [35]. Kuitenkin sitoutumisen IL-11Rα, resonanssia vastaava Arg

3, Arg

4 ja Ala

5 havaittiin myös spektrien 25 ° C: ssa (kuvio 2C, oikea paneeli).

yhdessä meidän NMR-tiedot osoittavat, että konformationaaliset vaihtelu näyttelee rakenteellista roolia CGRRAGGSC peptidin vuorovaikutusta IL-11Rα ja viittaavat siihen, että: (i) suurin tähteiden CGRRAGGSC muuttaa niiden konformaatio sitoutumisen IL-11Rα, ( ii) Cys-ss-Cys-Gly-Arg-Arg-Ala-domeenin peptidin läpikäy reseptori-riippuvainen voitto-of-rakenne, (iii) motiivin Gly-Gly-Ser-Cys-ss-Cys käsittää ehdokas sivuston suoraa vuorovaikutusta peptidin IL-11Rα, ja (iv) että jäämät Gly

7 ja Pa

8, yhteisymmärryksessä mutaatiotutkimukset (kuvattu alla), ovat merkityksellisiä myös sitovia.

Funktionaalianalyysi villityypin ja paikka- suunnattua IL-11-mutanttien

Aiemmissa työssä, muut tutkijat ovat tuottaneet rekombinanttiproteiineja, jotka sisältävät pistemutaatioita valottaakseen toiminnallisiin ominaisuuksiin natiivin IL-11; etenkin, pistemutaatiot alueen sisällä sisältävä CGRRAGGSC sekvenssin ei ole raportoitu [17] – [21]. Siten edelleen osoittaa, että jäämät 112-117 edustavat proteiini-vuorovaikutuksessa sivuston, ensin yritetty tuottaa sarjan yhdistelmä-site-directed alaniini-skannaus mutanttien motiivin RRAGGS sisällä ihmisen IL-11.

katsovat DNA-sekvensointi (tuloksia ei ole esitetty) ja SDS-PAGE-analyysi (kuvio 3A) osoitti, että villityypin ja mutantti-IL-11 yhdistelmä-DNA-proteiinit tuotetaan odotettu molekyylipaino, useita IL-11-mutanttien esitetty steerisen esteen ja virhelaskostuminen aberrances . Tällainen luonnostaan ​​tekninen rajoitus minkä tahansa mutational Tutkimuksen perusteella on ilmeistä, ettei epitoopin saavutettavuus havaittu tutkimuksissa anti-IL11-vasta-aineita (kuvio 3B ja tietoja ei ole esitetty). Huolimatta näistä mahdollisista ongelmista, seuraavan kerran käytetään ELISA arvioida ominaisuuksia IL-11 pistemutaatiot (tähteet 112-117) ja niiden kyky sitoa IL-11Rα. Mutaatio tähteiden Arg

113 (R113A), Gly

115 (G115A), ja Pa

117 (S117A) vähensi huomattavasti IL-11 reseptorin, suhteessa villityypin sekvenssi ( 86, 71, ja 86% sitova esto, vastaavasti), kun taas mutaatio jäämien Arg

112 (R112A) ja Gly

116 (G116A) tuotti vain kohtalainen vaikutus (43 ja 29% sitova esto, vastaavasti) ( kuvio 3C). Nämä tiedot osoittavat, että suurin osa tähteiden RRAGGS motiivi osallistua sitoutumisen IL-11Rα; kuitenkin, Gly

115 ja Ser

117 ovat todennäköisesti keskeisiä tähteitä välittävä ligandi-reseptori vuorovaikutuksen. Täten vastaa meidän työhypoteesin, alaniinin skannaus mutanttien ei näytä pienentää, joskin tiettyjä, sitoutuminen vastaavaan reseptoriin, IL-11Rα (kuvio 3C).

(A) Puhdistetut rekombinanttiproteiineja analysoitiin Coomassie värjäystä. (B) Western blot -analyysit, joissa polyklonaalisia anti-IL-11 ja anti-GST-vasta-aineita. (C) Rekombinantti GST-fuusioproteiinit (alaniinikuvauksella mutantteja tähteiden 112-117 IL-11, villityypin IL-11, GST yksin tai rhIL-11) päällystettiin kolmena kappaleena yön yli ja inkuboitiin IL-11Rα. Sitoutuminen detektoitiin anti-Fc-vasta-ainetta. Pylväät edustavat keskiarvoa ± keskivirhe keskiarvon (SEM).

rooli Jäännös Arg

113 on jonkin verran ongelmia arvioida ELISA, koska tämä mutaatio vaikuttaa reaktiivisuus anti-IL -11-vasta-aineita. Sulkea pois sitä mahdollisuutta, että havaittu väheneminen sitoutumisen IL-11-mutanttien IL-11Rα oli toissijainen väärinlaskostumisen ja täyspitkän proteiinin ja /tai steerisen esteen, olemme kehittäneet vaihtoehtoisen ligandi-reseptori-määritystä, joka perustuu sivusto- kohdennettu mutageneesi peptidi-kohdennettuja faagia. Yhden jäännös alaniiniskandeerausmutageneesiä on CGRRAGGSC faagia tuotettiin ja sitovat jokaisen faagin immobilisoituun IL-11Rα testattiin funktionaalisella testillä (taulukko 2). Mutaatio Arg

4, Gly

7 ja Pa

8 jäämiä CGRRAGGSC faagi kumottiin sitoutumista reseptoriin (taulukko 2), kun taas mutaatio jäämien Arg

3 ja Gly

6 ei inhiboida mutta vähensi CGRRAGGSC-reseptorin vuorovaikutus yli 70%. Nämä tiedot ovat yhteisymmärryksessä NMR ja IL-11 mutageneesin tutkimukset ja osoittavat, että useimmat tähteiden RRAGGS motiivi osallistua vuorovaikutuksessa IL-11Rα. Lisäksi rekisteröidyllä tunnistaa keskeinen rooli Ser

8 jäännös CGRRAGGSC (vastaa Ser

117 IL-11) in sitoutumista reseptoriin ja osoittavat, että sekä glysiinitähteet ovat tärkeitä vuorovaikutuksessa IL- 11Rα. Lopuksi, tähteet 112-117 ihmisen IL-11 käsittävät rakenteellisia ja toiminnallisia sivuston vuorovaikutuksen proteiinin ja sen reseptorin.

synteettinen peptidi CGRRAGGSC indusoi solujen lisääntymisen

on osoittanut, että motiivi RRAGGS merkityksellistä sivustolle ihmisen IL-11, jatkoimme sen määrittämiseksi, onko vastaava synteettinen peptidi on biologisesti aktiivinen. IL-11 indusoi konsentraatiosta riippuvaisen proliferaation, kun inkuboitiin ihmisen TF-1-leukemiasolujen ([36], ja tietoja ei ole esitetty). Näin ollen meidän arvioida, onko vastaava synteettinen CGRRAGGSC peptidi jäljittelee IL-11 sen stimulaation näiden solujen sitoutumisen IL-11Rα. Ensin alttiina TF-1 solut CGRRAGGSC peptidin läsnä tai poissa ollessa joko IL-11 tai GM-CSF: n (positiivinen kontrolli) alle ennalta määritetty olosuhteet, joissa IL-11 indusoi optimaalisen solujen lisääntymisen. Liukoinen CGRRAGGSC peptidi indusoi voimakas kasvua stimuloiva vaikutus TF-1-soluissa, yksin ja, kun läsnä on IL-11 (kuvio 4A, vasen paneeli) tai GM-CSF (tuloksia ei ole esitetty), kun taas mitään vaikutusta ei havaittu kontrolli ( ei-IL-11Rα ilmentävien) solujen (kuvio 4A, oikea paneeli) [2]. Tästä peptidi-indusoitu vaikutus oli selvempi CGRRAGGSC plus IL-11 tai CGRRAGGSC yksin kuin CGRRAGGSC plus GM-CSF: ää (tietoja ei esitetä); liity syklinen verrokkipeptidin eivät osoittaneet havaittavia vaikutuksia yksinään tai yhdessä IL-11. Seuraavaksi voidaan arvioida, onko CGRRAGGSC-indusoitua proliferaatiota riippuu solun pinnan IL-11Rα, käytimme vastaava liukoinen reseptori, sIL-11Rα, kuten molekyyli- houkuttimena peptidin sitoutumisen. Solujen lisääntymisen aiheuttama CGRRAGGSC oli alempi, kun läsnä on sIL-11Rα (t-testi, P 0,005), mutta ei, kun läsnä on ohjattu liukoisen reseptorin (kuvio 4B). Huomattavaa on, että vähemmän inhibitiota ei havaittu, kun soluja viljeltiin CGRRAGGSC, sIL-11Rα ja IL-11, data osoittaa, että CGRRAGGSC voi vuorovaikutuksessa kompleksin IL-11-sIL-11Rα (kuvio 4B). Nämä tulokset osoittavat, että synteettinen peptidi CGRRAGGSC voi indusoida solujen lisääntymistä yksinään, mahdollisesti toimii IL-11Rα stimuloivaa ligandi.

(A) pitoisuus riippuvainen proliferatiivinen vaste CGRRAGGSC näkyy IL-11Rα ilmentävien ihmisen TF-1-leukemiasoluja läsnä ollessa tai ilman IL-11 (vasen paneeli). Vastausta ei havaittu ei-IL-11Rα ilmentävien säätökennoja (oikea paneeli). (B) Liukoinen IL-11Rα estoa proliferatiivisen vaikutuksen aiheuttama 150 uM CGRRAGGSC peptidin (ja IL-11). * T-testi, P 0,005. Pylväät edustavat keskiarvoa ± keskivirhe keskiarvon (SEM).

STAT3 fosforylaatio välittää CGRRAGGSC-indusoidun soluproliferaation

IL-11 sitoutumisen IL-11Rα ja glykoproteiini 130 (gp130) välittää signaalitransduktion STAT3 aktivointi; Näin ollen, seuraavan kerran arvioidaan, onko CGRRAGGSC peptidi voi stimuloida soluproliferaatiota aktivointi samaa reittiä. Tätä varten tutkimme ligandi-välitteisen STAT3 aktivaation seerumia TF-1-soluja inkuboitiin, kun läsnä oli IL-11, CGRRAGGSC peptidi, tai jotka eivät liity syklinen kontrollipeptidiä. Huolimatta seerumistarvaatio, heikko STAT3 (P-Tyr

705) perustason aktivaatio havaittiin stimuloimattomissa TF-1-soluissa (kuvio 5). Kaksikymmentä minuuttia inkubaation joko CGRRAGGSC tai IL-11 (positiivinen kontrolli) johti STAT3 fosforylaation (kuvio 5A), joka kasvoi konsentraatiosta riippuvalla tavalla (kuvio 5B). Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin IL-11 yhdistettynä CGRRAGGSC tai liity syklinen peptidi (mutta ei ohjausta varten peptidi yksin) (kuvio 5A). Nämä tiedot paljastaa mahdollisen molekyylimekanismin taustalla CGRRAGGSC-indusoitua proliferaatiota aktivoimalla IL-11-reseptorikompleksin kautta STST3 ja osoittavat, että tämä sivusto sisällä IL-11 on toiminnallisesti aktiivinen sitomiseen ja signaalin siirtoon.

(A) leviämisen ihmisen TF-1 leukemiasolujen aiheuttamien CGRRAGGSC liittyy STAT3 fosforylaation, arvioituna anti-STAT3-P-Tyr

705 vasta-aine. (B) CGRRAGGSC peptidi-indusoidun aktivaation STAT3 on pitoisuudesta riippuva. Ei vaikutusta havaitaan kontrollipeptidiä. Välttämiseksi välinen kokeellinen tasoitettu lysaatti jaettu kahteen: puolet lysaattia immunoblotat- anti-STAT3-P-Tyr

705-vasta kun taas toinen puoli palveli määrittää kokonaismäärä STAT3 (kuten korvike Proteiinilisäyksen) tietyllä anti-STAT3 vasta-aine. Huomaa, että kaupallinen HeLa solu-uutteiden toimii valvonta näyttää vain α-STAT3 bändi.

Keskustelu

kautta suora valinta peptidikirjastojen potilailla [1], [37], [38], me eristetty ligandi peptidi jäljittelee IL-11 eturauhasen verisuonistossa [1] ja ehdotti IL-11Rα tavoitteeksi etenemisen aikana eturauhassyövän [2]. Tässä me valittiin tutkia rakenteelliset ja toiminnalliset ominaisuudet tämän oletetun proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen, koska tällä hetkellä tiedossa sitoutumiskohtien sisällä ihmisen IL-11 [22] – [24] eivät kattaa valitun peptidin sekvenssi sisällä natiivia proteiinia (kuvio 6) .

Arrowheads osoittaa ihmisen IL-11 tähteiden ennustetaan (avulla mutageneesillä) on ligandi-reseptori-sitoutumiskohtia; yksiväriset täsmentää tähteitä, jotka ovat kriittisiä sitoutumiselle [17] – [21]. Jäännökset 112-117 vastaa IL-11: n kaltainen motiivi [1], [2] kuvattu tässä työssä korostetaan keltaisella. Perusjärjestelmässä ihmisen IL-11, kuten kuvassa, on muokattu viite [47].

Käytimme täydentäviä strategioita, kuten kohdennetulla mutageneesillä ja NMR-pohjainen tutkimuksia sen varmistamiseksi, että kaikki kuusi tähteet RRAGGS motiivin todennäköisesti tarvitaan sitoutumiseen IL-11Rα. Koska NMR-analyysi ei ole yksiselitteisesti paljastaa, mitkä Arginiinitähteiden (Arg

3 tai Arg

4) osallistuu reseptorin sitoutumisen tutkimuksia perusteella kohdistettuja faagin alaniinin skannaus ja IL-11 mutageneesillä osoitettiin. Molemmissa tapauksissa, Arg

4 osoittautui avain jäännös. Kaikki kolme menetelmää ehdotti myös, että Gly ja Ser-tähteitä edistää tason IL-11Rα sitovat ligandit. Todellakin, Ser

8 mutaation poisti sitoutumisen CGRRAGGSC IL-11Rα; Δδ havaittu Pa

8 indusoi sitoutumalla IL-11Rα vahvistavat tämän tuloksen.

Olemme yrittäneet luoda ja tulkita molekyylimalleja IL-11, joka perustuu korkean resoluution rakenteelliset tutkimukset saatavilla muille gp130 tyyppinen sytokiineja, mukaan lukien IL-6 [21], [39] ja CNTF [21], [40] ja mutageneesi IL-6, CNTF ja LIF [41] – [43]. Siinä tapauksessa, että sitoutumiskohta IL-11Rα tai sivuston I, mutageneesi spesifisten tähteiden C-pään kierteen D ja AB silmukka osoitettu, että nämä alueet osallistuvat reseptorin sitoutumisen ja sytokiini-välitteisen biologisen aktiivisuuden [17] – [ ,,,0],21], analoginen IL-6 [39]. Molemmissa paikoissa on sijoitettu lähelle toisiaan näissä malleissa ja miehittää C-pään neljän kierteen kimppu rakenne, joka sijaitsee vastapäätä BC silmukka. Samanlaisia ​​rakenne- ja mutageneesi perustuvia tutkimuksia gp130-tyypin sytokiinien (vil-6, CNTF ja LIF) sekaantunut tähteiden BC silmukan reseptorin tunnistaminen ja biologinen aktiivisuus [44] – [46]. Tällainen jäämiä kuuluivat sivuston II tai sivuston III (vuorovaikutukseen gp130 tai gp130 /LIF-reseptori), eikä sivuston I. On huomattava, että kiderakenne IL-6-reseptorikompleksin hexamer osoittanut mitään roolia IL-6-reseptorin sitova BC silmukka, joka on vastapäätä N-terminaalista aluetta D2 toisen gp130-molekyylin [47]. Meidän tiedot osoittavat, että CGRRAGGSC on peptidi jäljittelee IL-11, ja siten kykenee tunnistamaan ja sitoutumaan IL-11Rα aktivoida solujen signalointi ja proliferaatiota. Vaikka se on yleensä oletetaan, että mallin solun membraaniin sitoutunutta IL-11-reseptorikompleksin olisi samanlainen kuin IL-6 [26], [47], tiettyjä rakenteellisia ominaisuuksia monimutkainen alayksiköt voi itse asiassa eroavat toisistaan ​​merkittävästi. Esimerkiksi huomasimme olemassaoloa neljän ilmoittamattoman leusiini-vetoketju sisällä IL-11 (joista kolme ulottuu BC silmukan läpi Helix C, kuva 6). Heillä ei ole selkeää rinnakkain joukossa useimmat muut gp130-tyypin sytokiinien (vain OSM ja CT-1 näytä sisältävän yhden kyseisten alueiden). Lisäksi on olemassa kaksi IL-11Rα kalvoon sitoutunut isoformien, jotka eroavat läsnäolo tai puuttuminen sytoplasmisen domeenin, kun taas IL-6Rα on vain yksi muoto, jossa pitempi sytoplasminen häntä [48]. Kuten isoformit voivat osallistua muodostumiseen reseptorin kompleksin toisin kuin havaittiin IL-6Rα kompleksin muodostumisen. Tulevien yksityiskohtaisten Röntgenkristallografia IL-11-reseptorikompleksin edelleen selvittää näitä hienoja rakenteellisia piirteitä.

Toiminnallisesti, IL-11 matkivat peptidin CGRRAGGSC osoitti biologisia vaikutuksia välittävät IL-11Rα (konsentraatio-riippuvainen stimulaation solujen lisääntymistä) sekä läsnä ja poissa ollessa IL-11. Lisäksi CGRRAGGSC-välitteisen soluproliferaation läsnä ollessa sIL-11Rα vähennettiin, ja suuremmassa määrin, kun läsnä on natiivin IL-11, mutta ei vaikuttanut liity valvonta-reseptoriin. Näiden tulosten perusteella, voisi spekuloida vuorovaikutusta peptidi CGRRAGGSC ja kompleksi IL-11 /IL-11Rα. Itse asiassa liukoinen peptidi CGRRAGGSC havaittiin indusoivan STAT3 fosforylaation samalla tavalla kuin IL-11 natiivia sytokiini. Nämä tulokset on biologinen ennakkotapaus muissa järjestelmissä. Wrighton et ai. [49] eristettiin peptidejä, jotka sitoutuvat ja aktivoivat erytropoietiinireseptoriin (EPOR); kristallografinen analyysi reseptorikompleksin paljasti peptidi, joka syntyy toiminnallinen symmetrinen järjestely EPOR [50]. Cwirla et ai. [51] valitun peptidin agonistien trombopoietiinireseptoriin ja ehdotti aktivoinnin mekanismi. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös osoittaneet, että suunta ja viipymäaika ligandista reseptorien on pidettävä aktivoinnin [52], [53]. Lisäksi peptidit on valittu sitoutumisen tiettyihin reseptoreihin sitoutuvat useisiin sivustoja reseptorin ja aktivointi saattaa aiheutua konformaatiomuutoksiin sijaan multimerisaatiodomeeni [54].

From supra- näkökulmasta, IL-11-reseptorikompleksin muodostuminen on todennäköisesti monimutkainen: ligandia sytokiini (IL-11) voi joutua sitoa ensin esittelijänä reseptorin alayksikköä (IL-11Rα) ja tämän jälkeen rekrytoida dimeeri signalointi alayksiköiden (eli gp130). Tutkimukset siihen liittyvän IL-6-reseptorikompleksin tukevat väitettä, että muotoon aktiivinen dimeerejä reseptorin alayksiköiden esiintyy solukalvojen [28], [55], [56]. Aiemmat raportit päättänyt, että gp130-dimerisaatiota ei ole riittävä reseptorin aktivointi ja että aktiivinen konformationaalinen säätö tarvitaan biologisen vasteen [14], [57] – [59]. Näin ollen, on mahdollista, että liukoinen peptidi CGRRAGGSC monimutkaisia ​​IL-11Rα saattaisi vahvistaa gp130-dimerisaatio ja /tai aiheuttaa signaloinnin kykenevän konformaation.

lujuus yhdistää erilaisia ​​funktionaalisia määrityksiä (kohdennettu mutageneesi ja natiivien proteiinien rinnalla ELISA plus peptidi-alaniiniseulontaa rinnalla kohdennettuja faagilla sitoutumismääritykset) rakenteellisten tutkimukset (NMR-pohjainen spektroskopia peptidin reseptorin vuorovaikutus) voi voittaa joitakin rajoituksia mutaatiotutkimukset määritettäessä sitoutumiskohtien ligandi-reseptori-vuorovaikutusten (kuten vaikeasta geenin /proteiinin ekspressiota, ja mutantin proteiini väärinlaskostumista tai steerisen esteen).

Yhteenvetona, olemme osoittaneet, että (i) RRAGGS sekvenssin (joka vastaa sivuston sisällä ihmisen IL-