Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ei lihas invasiivinen virtsarakon syöpä (NMIBC) on korkein uusiutumisriski tahansa pahanlaatuisen ja peräti 70%: lla potilaista kokevat uusiutumisen. Poikkeava DNA: n metylaatio on läsnä kaikissa virtsarakon kasvaimet ja voidaan havaita virtsanäytteitä. Aiemmat tutkimukset ovat tunnistaneet DNA: n metylaatio markkereita, jotka osoittivat merkittävää diagnostista arvoa. Arvioimme merkitys biomarkkereita varhaisia ​​kasvaimen uusiutumisen virtsassa.

Menetelmät /Principal Havainnot

metylaatiotasoilla on

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

TWIST1

,

VIM,

ja

ZNF154

vuonna virtsanäytteitä mitattiin reaaliaikaisella PCR (MethyLightTM). Analysoimme 390 virtsaa sedimenttien 184 potilasta diagnosoitu NMIBC. Virtsaa 35 samanikäisiin verrokeilla käytettiin määrittämään metylointi lähtötasolle. Toistumisen diagnosoitiin kystoskopian ja varmistettiin histologisesti. Aluksi vertasimme virtsaa virtsarakon syöpäpotilaiden ja terveiden yksilöiden ja havaittiin merkittävä hypermetylaatiota kaikki kuusi markkereita (P 0,0001) saavuttaa herkkyys on välillä 82% -89% ja spesifisyys alueella 94% -100%. Sen jälkeen, me validoitu virtsateiden hypermetylaation käytettäväksi uusiutumisen valvonta- ja löysi tuntemukset 88-94% ja erityispiirteet 43-67%.

EOMES

,

POU4F2

,

VIM

ja

ZNF154

oli useammin metyloituja virtsasta potilailta, joilla on korkeampi laatu kasvaimet (P≤0.08). Univariate Coxin regressioanalyysi osoitti, että viisi markkereita liittyi merkittävästi taudin uusiutuminen;

HOXA9

(HR = 7,8, P = 0,006),

POU4F2

(HR = 8,5, P = 0,001),

TWIST1

(HR = 12,0, P = 0,015)

VIM

(HR = 8,0, P = 0,001), ja

ZNF154

(HR = 13,9, P 0,001). Mielenkiintoista, yhdelle ryhmälle potilaita (n = 15) havaittiin, että hypermetylaation oli johdonmukaisesti läsnä virtsanäytteistä puuttumisesta huolimatta kasvaimen uusiutumisen, että niissä on kentän vika.

Päätelmä /merkitys

metylointi tasot

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

TWIST1

,

VIM,

ja

ZNF154

virtsassa yksilöt ovat lupaavia diagnostisia biomarkkereita virtsarakon syövän uusiutumisen valvontaa.

Citation: Reinert T, Borre M, Christiansen A, Hermann GG, Ørntoft TF, Dyrskjøt L (2012) diagnoosi virtsarakon syövän uusiutuminen perustuen Virtsan tasot

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

TWIST1

,

VIM,

ja

ZNF154

hypermetylaation. PLoS ONE 7 (10): e46297. doi: 10,1371 /journal.pone.0046297

Editor: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine Dartmouth, Yhdysvallat

vastaanotettu: 7. kesäkuuta, 2012 Hyväksytty: 29 elokuu 2012; Julkaistu: 03 lokakuu 2012

Copyright: © Reinert et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat John ja Birthe Meyer Foundation, Tanskan neuvoston riippumattomia Research, Lundbeckin Foundation, Novo Nordisk Foundation, EU: n avustus UROMOL Consortium no. 201663, Tanskan Cancer Society, Aarhusin yliopiston, ja Tanskan sisäministeriön ja terveys. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä virtsarakon on viidenneksi yleisin kasvain teollisuusmaissa. Noin 75% kaikista tapauksista, potilaat esittää vaiheen Ta tai T1 kuin lihas invasiivisia virtsarakon syöpä (NMIBC), kun taas loput 25% kasvaimista on lihas invasiivisia vaihe T2-4 syöpiä (MIBC) [1] . Noin 60% -70%: lla NMIBC kokemusta kasvaimen uusiutumisen 3 vuoden kuluessa resektion jälkeen [2], [3] ja potilaille voi kehittyä toistuva kasvaimia vuosittain monia vuosia ilman taudin etenemistä. Kuitenkin jopa 25% etenee lihasten invasiivisen sairauden [4]. Korkea uusiutumisriski ja etenemisen riskiä kehottavat tarvitaan usein ja pitkään valvontaa, mikä virtsarakon syöpä kallein syöpä hoitoon [5], [6]. Sen jälkeen resektio primaarikasvaimen, potilaat ovat usein seurataan kystoskopian ja sytologia. Koepaloja otettu aikana kystoskopia ovat kultakantaan diagnosoimiseksi rakkokasvaimista. Herkkyys kystoskopian varten NMIBC on lähes 80% valkoisen valon kystoskopia, ja 96% käytettäessä kalliimpaa, fluoresenssilla ohjatun kystoskopian käyttäen Heksaminolevulinaattia (HAL). Havaitsemiseksi dysplasia ja karsinooma in situ (CIS), herkkyys valkoisen valon kystoskopian laskee 48% ja 68%, tässä järjestyksessä; kun taas herkkyys kystoskopian käyttää HAL näitä vaurioita pysyy välillä 93% -95% [7] – [9]. Sytologia käytetään usein yhdessä kystoskopian, koska korkea spesifisyys 99% (0,83-0,997; 95% CI), mutta joilla on alhainen herkkyys 34% (,20-,53; 95% CI). Herkkyys sytologia lisää korkean vaiheessa ja korkea-asteen kasvaimet, erityisesti primaarikasvainten [10]. On ehdotettu, että rakko kentän vika voi aiheuttaa tiheä kasvaimen uusiutumista virtsarakon syöpäpotilailla [11]. Useat molekyyli muutokset on osoitettu olevan läsnä tavanomaisissa esiintyvät alueilla uroteelin potilailla, joilla on virtsarakon syöpä [12], [13], ja viime aikoina perimästä näkökenttäpuutoksesta on kuvattu [14].

Epigenetics on tutkimus mitoottisesti ja /tai meioottisesti periytyviä muutoksia geenien ilmentymisen, jota ei voida selittää muutokset DNA-sekvenssi [15]. DNA: n metylaatio on hyvin tutkittu epigeneettiset mekanismi mukana normaaleissa prosesseissa kuten kehitys, leimautuminen, ja X-kromosomin inaktivaatiota [16] – [18]. Muutoksia DNA: n metylaatio on liittynyt useita ihmisen pathologic sairauksia kuten syöpää [19], ja transkription inaktivointi poikkeava hypermetylaation on vakiintunut mekanismi geenien rakon syövissä [20] – [23]. Tunnistaminen DNA: n metylaatio merkkiaineita havaitsemiseen virtsarakon syöpä on ollut käynnissä jo joitakin vuosia. Useissa tutkimuksissa on raportoitu korkea herkkyydet ja erityispiirteet näitä markkereita, mikä tekee niistä potentiaalisesti käyttökelpoisia diagnostisina markkereina virtsarakon syöpään [24] – [31]. Aikaisemmassa tutkimuksessa havaittiin useita DNA: n metylaatio markkereita (

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2,

ja

ZNF154

), jotka osoittivat potentiaalia diagnostiset arvo virtsanäytteitä BC potilaista [26].

nyt validoitu diagnostinen ja ennusteen arvioinnissa näiden biomarkkereiden yhdessä aikaisemmin ilmoitettu

TWIST1

[25] ja

VIM

[30] virtsanäytteistä. Aluksi vahvistaa merkitys valitun metylaation markkereita, ja määrittää merkkiaineen raja-arvot, vertasimme ensimmäistä virtsanäytettä kustakin potilaan kanssa NMIBC että virtsanäytteistä terveiltä yksilöiltä. Sen jälkeen, arvioimme ja ennustavia arvo merkkiaineiden varhaisia ​​kasvaimen uusiutumisen käyttäen virtsanäytteistä saadun myöhemmin seurantakäyntejä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Tietoon kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta, ja tutkimussuunnitelmissa oli hyväksynyt Keski-Jyllanti valiokuntaistunnot Biomedical Research Ethics.

Patient Materiaali

yhteensä 652 mitätöidään virtsa kerättiin laitoksella urologian Århusin yliopiston sairaalan 390 virtsarakon syöpäpotilaiden ja 47 yksilöiden hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu tai virtsarakon kivet, mutta ei ollut virtsarakon syöpä (verrokkiyksilöitä). Näiden olemme ulkopuolelle 227 näytettä, koska DNA-määrä oli alle meidän kynnyksen (Suppl. Taulukko 1), joka jätti 425 näytettä (390 näytettä 184 BC potilaista ja 35 kontrollista henkilöä) (taulukko 1 ja Suppl. Kuvio 1). Kymmenen viisikymmentä ml virtsaa kerättiin säännöllisin seurantakäyntejä. Virtsanäytteitä kerättiin välittömästi ennen kystoskopia; solut sentrifugoidaan, ja jäädytettiin -80 ° C: ssa. Kasvaimet olivat lavastettu mukaan TNM järjestelmää [32] ja porrastettu Bergkvist [33]. Viisitoista Verrokkiyksilöitä stix positiivisia nitriitin virtsassa osoittaa bakteeri-infektio. Potilaiden hoito ja seuranta suoritettiin ohjeiden mukaisesti European Association of Urology [34].

DNA Extraction ja bisulfiittimodifikaatio

DNA uutettiin kanssa QIAsymphony Virus /Bakteerit Midi kit (96) (Qiagen) käyttäen QIAsymphony® SP väline ja käyttämällä Complex800_V5_DSP protokollaa. Viisisataa nanogrammaa DNA bisulfiitin muutetaan käyttämällä EZ-96 DNA: n metylaatio D5004 (Zymo Research) mukaan valmistajan suositusten ja eluoitiin 60 ul: aan eluointipuskuria ja säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti.

Real- kvantitatiivinen Metylaatiospesifinen Polymerase Chain Reaction (MethyLight) B

metylointi analyysi suoritettiin käyttäen MethyLight [35]. Alukkeita ja koettimia kuutta haluttua geeniä oli suunniteltu sisältämään kahdeksasta kymmeneen CpG-dinukleotidejä (Suppl. Taulukko 2). Normalisoimiseksi DNA syöttömateriaalin, käytimme ALU-C4 toistoelementin sekvenssi [36]. qPCR monistukset suoritettiin TaqMan Universal PCR Master Mix: o AmpErase (Applied Biosystems) mukaisesti valmistajan ohjeiden kaksinkertaisina käyttäen 2 ui (5 ng) bisulfiitti-muunnetun DNA: n lopullisessa tilavuudessa 5 ui 384-kuoppalevyille ABI 7900 HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems). Jos kaksoiskappaleet olivat epäjohdonmukaisia, yksi rinnakkaista positiiviseksi metylaation ja yksi negatiivinen metylaation, analyysi toistettiin. Näyte ulkopuolelle osalta kyseisen merkin, jos toinen ristiriidassa tulos saatiin. Monistaminen protokollat ​​luetellaan ylim. Taulukko 2. monistaminen tulokset analysoitiin sekvenssin tunnistusjärjestelmä (SDS 2.4, Applied Biosystems). Jokainen levy sisälsi sarjalaimennosta (25-0.04ng) täysin metyloitua DNA: CpGenome ™ Universal metyloitua DNA: ta) (Millipore), jossa mielenkiinnon kohteena olevan geenin ja ALU-C4, useita ei templaattikontrollien (NTC) kuoppiin, 5 ng metyloitua vertailunäytteen [CpGenome ™ Universal Metyloidut DNA (Millipore)], ja metyloitumattomat otospohjaisesti koko genomin monistettu DNA ääreisverenkierron DNA. Prosenttiosuus metyloitua viite (PMR) laskettiin kunkin näytteen yhtälön mukaisesti: 100 x [(geeni-x kopio arvo) näyte /(ALU-C4 kopio arvo) näytteen] /[(geeni-x kopio arvo) Universal Metyloidut DNA /(ALU-C4copy arvo) Universal Metyloidut DNA].

tilastollinen analyysi

Stata 11 (Statacorp, Texas, USA) käytettiin kaikkiin tilastollisia laskelmia. Kaksitahoiset kokeet pidettiin tilastollisesti merkittävinä, jos P 0,05. Metylointi erot arvioitiin nonparametric Wilcoxonin-Mann-Whitney testi. Fisherin testiä käytettiin analysointiin dikotomista muuttujia. Tarkka $ x ^ 2 $ testiä käytettiin analysoitaessa assosiaatioita klinikka-patologinen parametrejä kahteen tai useampaan luokkaan. Korrelaatiot metylaatiotasoilla merkkiaineiden laskettiin Spearmanin korrelaatiokertoimet. ROC-käyrä tehtiin kunkin merkin ja markkereiden yhdistelmiä piirtämällä herkkyys vastaan ​​(1-spesifisyys) ja alue käyrän alla (AUC) laskettiin. Log-Rank testejä sovellettu arvioimaan tasa säilyminen ja Kaplan-Meier selviytymisen tontteja käytettiin visualisointiin. Univariate Coxin regressioanalyysiä käytettiin analysoimaan yhteenliittymien iän, sukupuolen, vaihe, laatu, moninaisuus, ja CIS uusiutui elinaikaa.

Tulokset

analyysi jakautuu kahteen osaan: 1 ) vahvistaa raja tason metylaation merkkejä ja osoittaa merkitystä valitun merkkiaineiden analysoimme ensimmäisen virtsanäytteen kustakin potilaasta ja vertailuryhmän virtsanäytteistä terveistä yksilöistä; 2) käyttämällä määriteltyä merkki sulku tasot me sitten vahvistanut ja ennustavia arvo metylaation merkkiaineiden virtsanäytteistä otettujen potilaiden seurannan.

perustaminen Test Cut-off tasoa ja ensimmäinen validointi Marker merkitys

Aluksi määrittelimme cut-off tasoa keskimääräinen metylaation taso kunkin merkin + 2x keskihajonnan metylaation tason virtsanäytteistä 35 verrokkiyksilöitä (vain näytteitä metylaatio arvot nollan yläpuolella olivat mukana). Cut-off tasoa (PMR-arvot – katso materiaalit ja menetelmät), joita käytetään dichotomize Metylointilaitteistoon merkkiaineet olivat:

EOMES

= 0,348,

HOXA9

= 0,077,

POU4F2

= 0,371

TWIST1

= 0,405,

VIM =

0,368 ja

ZNF154

= 1,51. Muut cut-off tasoa (keskiarvo + 1xSD ja + 3xSD), joka perustuu metylaatiotasoilla in kontrollivirtsanäytettä pidettiin aluksi (tuloksia ei esitetä). Validoida merkitys markkereita virtsarakon syövän diagnoosia vertasimme ensimmäisessä virtsanäyte 184, joilla on diagnostisoitu NMIB ja virtsanäytteistä 35 verrokkiyksilöitä (taulukko 1). Kaikki kuusi merkkiaineet olivat erittäin merkittävästi hyper-metyloituja virtsaan sairastavien potilaiden NMIBC verrattuna virtsan terveiltä yksilöiltä (Mann-Whitney, P 0,0001) (taulukko 2). Parempi herkkyydet markkereita havaittiin analysoitaessa virtsanäytteistä potilaista, joilla tapahtumasta kasvain verrattuna virtsaa potilaalla on toistuva kasvain (Suppl. Taulukko 3). No association välillä havaittiin yksittäisiä merkintöjä ja kasvaimen vaiheesta, mutta

EOMES

,

POU4F2

,

VIM

, ja

ZNF154

olivat metyloituja palkkaluokassa III vaurioita verrattuna grade I vaurioiden (Fisherin testiä, P≤0.048) (Suppl. taulukko 4).

EOMES

,

POU4F2,

ja

ZNF154

olivat vähemmän metyloituja kasvaimissa, joiden koko on alle 3 cm. (Fisherin testiä, P≤0.047) (Suppl. Taulukko 4).

havaitseminen uusiutuminen metylointi merkkiaineet

validoitu kliinistä hyödyllisyyttä merkkiaineita virtsarakon syövän valvontaa. Olemme kerrostunut analyysimme sisältävät vain potilailla, jotka aluksi osoitti hypermetylaation yhden tai useamman metylointi markkereita. Riippuen merkki tutkittu, 11-18%: lla potilaista ei ilmennyt metylaation ensimmäisessä kasvain, ja näin ollen eivät sisälly. Tämä rajoitti analyysiä 158 potilasta ja 206 virtsanäytteiden alkaen seurantakäynnit; 139 virtsanäytteestä olivat potilaita, joilla on toistuvia virtsarakon tuumorin ja 67 virtsanäytteiden olivat potilailta, joilla ei ole uusiutunut (taulukko 1). Käyttävät cut-pisteet määritetään aluksi käyttäen virtsaa terveiltä henkilöitä; saimme herkkyyksiä alueella 87%: sta 94%, ja erityispiirteet alueella 28%: sta 47% (taulukko 3). Vertailun vuoksi herkkyys sytologian oli 77% ja spesifisyys oli 60%. Havaitsimme ole merkittäviä assosiaatioita metylaatiotasoilla ja ennusteeseen viittaavia muuttujat tälle potilaalle kohortin kanssa toistuva kasvaimia (Suppl. Taulukko 5).

molekyylitestejä saattaa olla suurempi herkkyys verrattuna kultakantaan cystoscopy. Ongelman siksi käytetty kystoskopian tulokset 12 kuukauden jakson jälkeen virtsaan otettiin näyte. Löysimme monet näytteistä aiemmin luokiteltu vääriä positiivisia olevan totta positiivisia; he yksinkertaisesti ollut myönteinen läpimenoaika verrattuna cystoscopy. Herkkyys saatu vaihteli 88%: sta 94%, ja spesifisyys vaihteli 43%: sta 67% (taulukko 4). Lukien kasvaimet diagnosoitu aikana 12 kuukauden seuranta-aikana ja yhdistämällä kaksi markkereita vaatimusta, että molemmat merkkiaineet olivat positiivisia positiivinen testitulos herkkyys heikkeni (alue: 86-93%), kun taas spesifisyys lisääntynyt (alue: 50-73 %). Jos vain yksi kahden merkin pitäisi olla positiivinen, herkkyys lisääntynyt (alue: 92-98%), kun taas spesifisyys laski (alue: 29-60%) (Suppl. Taulukko 6 ja Suppl. Taulukko 7, tässä järjestyksessä). Kaiken markkereiden yhdistelmiä ei parantunut sekä herkkyys ja testien.

Prognostic arvo Metylointi tussit ennustaminen Myöhemmin uusiutuminen

Puhuttaessa ennustetekijöiden arvo metylaation markkereita me analysoi virtsanäytteistä potilailta käyntejä, joissa ei ole kasvaimia todettiin käyttäen cystoscopy. Kaikille markkereita huomasimme, että positiivinen markkeri at kasvaimeen negatiivinen vierailua merkitsevästi yhteydessä myöhemmin kasvaimen uusiutumisen aikana 24- ja 60-kuukauden seurannassa jaksoja (Log-Rank testi, P≤0.04) (kuva 1 ja Suppl. Kuva 3). Merkittävimmät erot 24 kuukauden aikataulu havaittiin

POU4F2

ja

ZNF154

(Log-Rank testi, P 0,0001) jossa vain 12% (3/25) ja 8% (2/26) ilman metylaatio kokenut toistumisen 2 vuotta, vastaavasti. Sillä metylointi-positiivista näytettä potilaiden prosenttiosuus myöhemmin toistuminen oli 68% (21/31) ja

POU4F2

ja 63% (20/32) ja

ZNF154

. Univariate Coxin regressioanalyysi osoitti, että

HOXA9

(HR (95% CI) = 7,8 (1,8-33,7)),

POU4F2

(HR (95% CI) = 8,5 (2,5-28,5) ),

TWIST1

(HR (95% CI) = 12,0 (1,6-88,6)),

VIM

(HR (95% CI) = 8,0 (2,4-26,8)), ja

ZNF154

(HR (95% CI) = 13,9 (3,3-59,7)) liittyi merkittävästi uusiutumista elinaikaa. Ikä, sukupuoli, edellisessä vaiheessa, edellinen luokka, edellinen moninaisuus, ja edellinen CIS eivät merkittävästi yhteydessä uusiutumista vapaan elinajan (P 0,05). Näin ollen, kun läsnä on muuttunut metylaation DNA virtsassa näyttivät voimakkaasti liittyvät ennusteeseen.

DNA: n metylaatio liittyy myöhemmin kasvaimen uusiutumisen kuluessa 24 kuukautta potilailla, joilla ei kasvaimen mutta metylaatio-positiivisia virtsanäytteitä. Kaplan-Meier tontteja toistumisen vapaa elinaika funktiona kahtia metylaatiotasoilla varten

EOMES

(P = 0,0397) (A),

HOXA9

(P = 0,0009) (B),

POU4F2

(P 0,0001) (C),

TWIST1

(P = 0,0017) (D),

VIM

(P = 0,0001) (E), ja

ZNF154

(P 0,0001) (F).

tunnistaminen Potilailla, joilla on mahdollinen Epigeneettiset näkökenttäpuutoksesta

Jos metylointi biomarkkerit rajoittui pahanlaatuisia soluja, meidän pitäisi vain tunnistaa merkkiaineiden virtsaan kun kasvain oli läsnä, tai jotka tapahtuvat lähitulevaisuudessa riippuen kasvuvauhti kasvain. Kuitenkin meidän tulokset osoittivat, että vaikka suuri virtsan tasoa metylaatio saattaa olla läsnä käyntien ilman toistuminen (Suppl. Kuvio 2, potilaat C ja D, Suppl. Kuvio 3). Voisimme tunnistaa yhden ryhmän 15 potilasta (31%), jossa metylaatio oli läsnä virtsassa on ensimmäinen vierailu ja edelleen läsnä virtsanäytteistä otettu myöhemmin seurantakäyntejä, vaikka mitään kasvaimen tapahtunut. Esimerkiksi yksi metylointi-positiivinen potilas, jolla on eniten pitkittynyt seurannan diagnosoitiin CIS jälkeen 118 kuukautta, mutta ei ollut vaurioita välillä. 15 potilaasta, joiden näkökenttäpuutoksesta, mutta ei toistuminen, on merkittävä pienempi määrä kasvaimia edellisten käyntien (P = 0,02) verrattuna potilaisiin, joiden tauti uusiutuu.

Modified Hermann GG et al. (https://skejby.net/Webudgaven/DaBlaCa2010.htm.).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa suoritettiin riippumaton validointi

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

TWIST1

,

VIM

, ja

ZNF154

metylaation varten virtsan diagnoosin virtsarakon syöpä valvontaan. Saimme herkkyyksiä välillä 87% -93% ja erityispiirteet välillä 28% -47%. Kun myös kasvaimia resektoitiin in 12 kuukauden seuranta-aikana saimme herkkyyksiä välillä 88% -94% ja erityispiirteet välillä 43% -67%. Univariate Coxin regressioanalyysi osoitti, että metylointi markkereita ennustettu toistuminen kanssa riskisuhteita alueella 7,8-13,9 (P≤0.015). Edellinen vaihe, laatu, moninaisuus ja CIS eivät merkitsevästi yhteydessä kasvaimen uusiutumisen. Kiinnostavaa kyllä, myös havaittu, että jotkut virtsarakon syöpäpotilailla uusiutumatta silti edelleen poikkeava virtsan metylaatio jotka erottaa ne verrokkiyksilöitä. Uskomme, että tämä saattaa johtua yleisestä epigeneettisellä virtsarakon limakalvon muutoksia.

laadunvarmistuksessa tässä tutkimuksessa olivat iältään, joilla on hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu (BPH) tai virtsarakon kivet ja 43% kontrollit olivat nitriitti positiivinen, osoittaa virtsarakon tulehdukset. Jotkut solut virtsan valvonnan voi olla peräisin liikakasvu, tai se voi olla immunologisen tai bakteerisoluissa. Samanlaisia ​​verrokkinäytteitä sovelletaan, kun markkerit alun perin tutkittu markkereita virtsarakon syövän, mikä viittaa siihen, että metylaatio taajuus valitun markkereita on edelleen pieni näissä solutyypeissä [25], [26], [30]. Soluja eturauhasen tai virtsarakon tulehdus voi silti esijännittävät saadut tulokset laimentamalla syöpäsoluja. Tämä voisi johtaa väärien negatiivisten testitulosten. Bakteeri-infektiot ovat paljon harvinaisempia ja tutkimuksessamme tartuntoja ei merkittävästi liittynyt merkki metyloinnin, mikä osoittaa, että infektiot eivät vaikuttaneet markkeri herkkyys (Suppl. Taulukko 4).

On huomattava, että vain 9% toistuminen ovat arvosana I. Siksi laskettiin herkkyydet markkereita voidaan suurempi kuin herkkyydet, joka olisi saatu peräkkäinen matalan riskin potilaita, joilla on paljon suurempi joukko luokan I kasvaimia.

Yksi tärkeimmistä haasteista käyttäen virtsan merkkiaineita saanut riittävästi kasvainsoluja, ja samalla MethyLightTM on erittäin herkkä menetelmä meillä oli vielä jättää 227 (35%) näytteistä tutkimuksesta riittämättömän määriä DNA: ta. Havaitsimme, että jos me mukana näytteissä on vähemmän kuin 5 ng DNA: ta templaattina analyysissä, herkkyys laski, ja potilaille valvonnassa spesifisyyttä lisääntynyt. Sulkemalla potilaiden määrän perusteella DNA uutetaan mitätöity virtsanäytteistä, me eheys säilyy MethyLightT määrityksen hinnalla käyttöön bias jossa erityisesti potilailla, joilla on vaiheen Ta luokan I kasvaimet eivät kuulu, kuten luokan I leesiot kuorivat pienimmän solujen lukumäärä [37] (Fisherin tarkka testi, P 0,05) (Suppl. taulukko 1). Hiljattain tekemän tutkimuksen Zuiverloon et al. raportoitu lisääntyminen herkkyyden

FGFR3

mutaatio merkkiaineena kasvaimen uusiutumisen 75%: sta 100%, kun virtsan määrä testissä käytetyn nostettiin [38]. Kasvattamalla kerättyjen virtsan nykyisestä 10-50 ml, vähemmän näytteitä on jätettävä [39], [40]. Muita mahdollisuuksia parantaa määrityksen havaitsemiseksi metylaatio voi sisältää analysoimalla kahta tai useampaa näytteen erikseen tai käyttää jotain muuta tekniikkaa kuin MethyLightTM (esim Perättäiset PCR).

Metylointi markkeri testi voidaan täydentää

FGFR3

mutaatio analyysi.

FGFR3

mutaatiot ovat läsnä noin 70% -80% huonolaatuisen NMIBC, ja mutaatiot

FGFR3

geenin on osoitettu olevan havaittavissa DNA mitätöity virtsasta [41], [42]. Samanlainen metylointianalyysi,

FGFR3

analyysi perustuu DNA: han ja ensisijainen vierailu voidaan osittaa läsnäolon mutaation. Viimeaikaiset tutkimukset

FGFR3

mutaatioita yksin havaita NMIBC uusiutumista raportoi herkkyys on 58% samanaikaiseen toistuminen. Herkkyys lisääntyi, kun 12 kuukautta seurannan sisällytettiin [43]. Yhdistelmä

FGFR3

mutaatioita ja metylaation markkereita on testattu Serizawa et al., Ja he havaitsivat lisääntyminen herkkyyden DNA mitätöidään virtsasta kun yhdistetään metylaatio merkkiaineita ja

FGFR3

mutaatioita [44 ]. On huomionarvoista, että he havaitsivat käänteinen korrelaatio hypermetylaation ja

FGFR3

mutaatioita.

Se, että emme löydä yhdistysten välillä metylaatio ja ennusteeseen viittaavia muuttujia käytettäessä vain virtsaa potilailta, joilla on uusiutuva kasvaimia on kiehtova , mutta se voi olla, että alempi herkkyys havaittiin heikompilaatuisen kasvaimia ei aiheuta vain harvat paisutettu kasvainsolujen virtsaan, vaan että hypermetylaation ei ole läsnä kasvain tai ympäröivässä uroteelin, ja ositettiin metylaation varhaisemmassa vierailun nämä potilaat eivät kuulu. On mahdollista, että potilailla, joilla ei ole metylaatio on pidettävä erillinen ryhmä virtsarakon kasvaimia. Lopuksi puute yhdistyksen välillä metylaation ja klinikan-patologinen muuttujat voivat myös olla seurausta suhteellisen pieniä keräämiseen.

Metylointi markkereita ovat spesifisyys arvot välillä 43%: sta 67%, mikä on alhainen ottaen että niillä kaikilla on välillä 94% -100% kasvaimen spesifisyys verrattuna ohjata henkilöitä. Vastaava alhainen spesifisyys ei havaittu tutkimuksessa, jossa mRNA hTERT: in, SENP1, PPP1CA, ja MCM5 virtsassa saatiin potilailta aikana taudinvalvontasuunnitelman [45]. Alhainen spesifisyys havaittiin myös Zuiverloon et al. jos tutkitaan

FGFR3

mutaatioiden havaitsemiseksi virtsarakon syövän uusiutumista [38]. Lisäksi alhainen spesifisyys metylaation merkkiaineiden aiemmin raportoitu muualla kahdesta tutkimuksesta, joilla pyritään havaitsemaan NMIBC uusiutumista [46], [47].

Metylointi havaittu virtsanäytteiden kystoskopian-negatiivisia käyntejä voi olla useita lähteitä, ( i) pieni kasvain ei havaittu kystoskopian, (ii) jäljellä kasvainsolut paikalla resektio, tai (iii) se voi olla oire epigeneettiseltä muuttuneiden urothelial solujen läsnä uroteelin ympäröivä kasvain tai muualla (näkökenttäpuutoksesta ), joilla ei ole fenotyyppi niiden erottamiseksi normaalista urothelial soluista – epigeneettisestä urothelial methylator fenotyyppi [14]. Jotkut vääriä positiivisia näytteitä toistumisen 12 kuukauden kuluessa kystoskopian todennäköisimmin aiheuttamia jäänyt kasvaimia tai jäljellä kasvainsoluja, mutta loput väärien positiivisten näytteiden tämä selitys on epätodennäköistä ja tuloksemme vastaavat hyvin läsnäolo virtsarakon näkökenttäpuutoksesta. Viimeaikaiset tiedot tukevat käsitystä, että on olemassa DNA hypermetylaation näkökenttäpuutoksesta rakot BC potilaista, jossa normaali-näkymästä kudos sisältää laajalti DNA: n metylaatio [14]. Wolff ja työtoverit viittaavat siihen, että poikkeava metylaatio ei johdu kloonilaajenemisen, vaan johtuu yleinen epigeneettisiä muutos uroteelin koko virtsarakon. On ehdotettu, että tämä laajalle levinnyt alan poikkeavan metyloitua normaali-näkymästä uroteeliin voi olla alkuperästä korkea toistumisen määrä virtsarakon syöpään [14].

Kun löytö metylaation merkkiaineiden erittäin korkea herkkyys, täytäntöönpano metylaatio merkkiaineiden valvontaan potilaalla on matala-asteinen NMIBC näyttää todennäköiseltä. Tuolloin diagnoosin, metylointi taso kunkin metylaation merkki on perustettu ennen markkeri voidaan hakea valvontaan. Etukäteen seuraavan kontrollikäynnin, potilas voi toimittaa virtsanäyte analysointia, ja kolme mahdollista lopputulosta olemassa: i) jos testi on positiivinen potilas on kystoskopia tehty, ja 67 potilasta 100 toistuva kasvain löytyy, kun taas loput 33 potilasta ei ole uusiutunut. Tämä ei ole suuri ongelma, koska vääriä positiivisia potilaita olisi ollut kystoskopian tehdään joka tapauksessa; ii) negatiivinen tulos mahdollistaa potilaiden ohittaa nykyisen cystoscopy. Nykyisellä suorituskyvyn analyysin, 94 pois 100 BC potilaalla on uusiutunut oikein diagnosoidaan ja kuusi potilasta virheellisesti diagnosoitu joilla ei ole kasvaimen uusiutumisen. Tämä määrä vääriä negatiivisia on verrattavissa HAL-ohjattu cystoscopy ja paremmin kuin valkoinen valo kystoskopialla, jossa 20 potilasta voidaan olettaa väärin diagnosoitu joilla ei ole uusiutunut [7] – [9]. Kuitenkin tässä tutkimuksessa

ZNF154

merkki ei diagnosoida kaksi lihas-invasiivisen virtsarakon syöpiä, jotka etenivät kaksi T1 luokan III kasvaimet. Tämä ei olisi hyväksyttävää hoitopaikassa, ja siitä, että potilaat, joilla on suuri riski taudin etenemiseen (esim. Kaikki T1 tasolle III kasvaimet tai CIS) on jatkettava säännöllisesti hoito. Toinen vaihtoehto voisi olla käyttää enemmän konservatiivinen cut-off. Määrittelemällä cut-off-arvot keskiarvona plus 1x keskihajonta metylaation tasolla, kaksi lihas invasiivisen kasvaimia ei olisi jäänyt; iii) virtsanäyte riittämätön DNA pitäisi johtaa jatkoa alkuperäisen hoito-ohjelman. Kaikissa kolmessa tapauksessa potilas toimittaa uuden virtsanäyte ennen seuraavaa kontrollikäynnin joka määrittää, onko potilaalla on oltava cystoscopy suoritettu. Metylointi markkereita voi myös lisätä havaitsemismäärä CIS vaurioiden positiivisena testi negatiivinen cystoscopy voitaisiin seuraa toinen kystoskopian kuten HAL.

Yhteenvetona soveltamalla hyvin herkkä ja semikvantitatiivinen metodologia havaitsemiseksi virtsarakon syövän uusiutumista ja ositettiin metylaatiostatuksen alkuperäisen kasvaimen, olemme osoittaneet, että yhdellä merkki (

ZNF154

) voimme havaita samanaikaisen kasvaimen uusiutumisen herkkyydellä 94% ja spesifisyys 67 %. Mukaan EAU suuntaviivoja NMIBC, nykyinen hoito-ohjelma vähäriskisiä NMIBC potilailla on cystoscopy 3 ja 12 kuukautta TUR ja sitten vuosittain vielä 4 vuoden aikana [48]. Tämä tutkimus viittaa siihen, että metylaatio markkereita voidaan hyödyntää merkkiaineita virtsarakon syövän uusiutumisen vähentämiseksi määrää cystoscopies matalan riskin potilailla, joilla ei ole samanaikaista kasvain (kuva 2) ja näin ollen parantavat elämänlaatua potilaille sekä vähentää terveydenhuollon menoja.

tukeminen Information

Kuva S1.

vuokaavio, joka havainnollistaa näytteiden aikana tutkimuksen.

doi: 10,1371 /journal.pone.0046297.s001

(EPS) B Kuva S2.

Esimerkkejä metylaatiotasoilla aluksi käynti ja kaksi seuraavaa käyntiä varten 5 potilaalla ei toistuminen. Potilaat, joilla on kahden seuraavan toistuminen (A ja B). Potilaan ilman toistuminen aluksi kontrollikäynnin, mutta toistuminen myöhemmässä tarkastuskäyntejä (C ja D). Potilas, jolla ei ole myöhemmin toistuminen (E). PMR on prosenttiosuus suhteellinen viittaus. Arvo 0% = ei metylaatio ja arvo 100% tarkoittaa täysin metyloitu. Tumma palkki edustaa vierailua samanaikaisen kasvaimen ja harmaa pylväs edustaa käynti ilman kasvainta.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0046297.s002

(EPS) B Kuva S3.

Kaplan-Meier käyrä aikaa uusiutumiseen. DNA: n metylaatio liittyy myöhemmin uusiutunut 60 kuukautta potilailla, joilla ei kasvain mutta metylaation positiivinen virtsanäytteitä.