Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Distant eturauhasen syöpiä ovat yleisesti hormoniresistentti ja osoittavat lisääntynyttä kasvua ei enää estyy androgeenien puute hoitoa . Ymmärtäminen kaikki molekyylitason mekanismeja, jotka auttavat hallitsematon kasvu on tärkeää saada tehokas hoito strategioita hormoniresistentti eturauhasen syöpiä (HRPC). Aryylihiilivetyreseptori (AhR) vaikuttaa useisiin biologisiin prosesseihin kuten solun kasvua ja erilaistumista. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että eksogeeninen AhR ligandit estää solun proliferaatiota mutta viimeaikaiset todisteet viittaavat AhR saattaa olla luontaista toimintoja, jotka edistävät solujen lisääntymistä ilman eksogeenisten ligandien.

Menetelmät /Tulokset

qRT-PCR ja western blot-analyysiä käytettiin määrittämään AhR mRNA ja proteiini ilmentymistä hormoniherkkien LNCaP-soluja samoin kuin hormoni tulenkestävät DU145, PC3 ja PC3M eturauhassyövän solulinjoissa. LNCaP-solut ilmentävät AhR mRNA ja proteiini paljon alemmalla tasolla kuin hormoniresistentti solumalleja. Cellular fraktiointi ja immunosytokemiassa paljasti ydinvoiman lokalisoinnin AhR muodostetussa hormoneille resistentti solulinjat taas LNCaP-solut ovat vailla ydin- AhR proteiinia. qRT-PCR-analyysi käytetään arvioimaan perus CYP1B1 tasoa ja xenobiotic vastaava elementti sitoutumismääritys vahvisti ligandin riippumaton transkriptionaalista aktiivisuutta AHR DU145, PC3 ja PC3M soluja. Pohjapinta CYP1B1 tasot laskivat hoidon erityisiä AhR estäjä, CH223191.

in vitro

kasvun määritys paljasti, että CH223191 esti kasvua DU145, PC3 ja PC3M solujen androgeenin köyhdytettyä ympäristössä. Immunohistokemiallinen värjäys eturauhassyöpäkudoksille paljasti lisääntynyt ydinvoiman lokalisoinnin AhR palkkaluokkaan 2 ja 3. asteen syövät verrattuna hyvin erilaistuneet luokan 1 syöpiä.

Johtopäätökset

Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että AhR on konstitutiivisesti aktiivinen edennyt eturauhassyöpä solulinjoissa että malli hormoniresistentti eturauhassyöpä. Kemialliset ablaatio AhR signalointi voi vähentää kasvua edenneen eturauhassyövän solut, vaikutus ei saavuteta androgeenireseptorin estäjien tai kasvun androgeenien tyhjennetty kasvualusta.

Citation: Richmond O, Ghotbaddini M, Allen C, Walker, Zahir S, Powell JB (2014) aryylihiilivetyreseptori konstitutiivisesti Aktiivinen edennyt eturauhassyöpä solut. PLoS ONE 9 (4): e95058. doi: 10,1371 /journal.pone.0095058

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 20 joulukuu 2013; Hyväksytty: 23 maaliskuu 2014; Julkaistu: 22 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Richmond et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Näitä tutkimuksia tuettiin National Institutes of Health /National Institute on Vähem- terveys- ja terveys erot /Research Center Minority toimielimissä Grant # 8 G12 MD007590. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia kiinnostusta ole.

Johdanto

Kun Yhdysvallat, eturauhassyöpä (PCA) on yleisimmin diagnosoitu syöpä miehillä ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman miesten [1]. American Cancer Society arvioi, että siellä on noin 238590 miesten diagnosoitu PCa ja 29720 kuolee PCA liittyvistä syistä vuonna 2013 [1]. Mukaan kansallisen selviytymisen tilastojen viiden vuoden pysyvyys miesten diagnosoitu paikallinen tai alueellinen eturauhasen syöpä on 100%. Kuitenkin miehet diagnosoitu kaukainen etäpesäke on viiden vuoden eloonjäämisaste vain 29% [2].

Koska PCA androgeeniriippuvaisessa, ensisijainen hoito käsittää androgeenien puute hoitoa (ADT) metastaattista sairautta [3] . Useimmat eturauhasen syövät aluksi vastata ADT mitattuna väheneminen seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA). Kuitenkin 2 vuotta useimmat potilaat lakkaa reagoimasta hoitoon ja kehittävät hormoniresistentti eturauhassyöpä (HRPC) [4], [5]. Ei ole parannuskeinoa hormoniresistentti eturauhassyöpä (HRPC), joka tosin ADT kestävä edelleen androgeenireseptoria riippuvainen [6]. Lukuisia mekanismeja ovat sekaantuneet jatkuvia androgeenireseptorin signalointi HRPC. Näitä ovat lisäykset androgeenireseptorin ilmaisua, lisääntynyt steroidien sisällä kasvainsolujen pistemutaatioita, jotka muuttavat androgeenireseptorin aktiivisuutta, tasapainon muutoksiin yhteistyön aktivaattori /co-repressoriproteiinit, ja muutoksia solujen signaalipolkuja ylikuulumisongelmissa kanssa androgeenireseptorin [5 ], [7]. Viimeaikaiset havainnot viittaavat siihen, että aryylihiilivetyreseptori voivat osallistua ylikuuluminen AR ja tukea AR kasvua alle androgen riistää olosuhteissa. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että AhR vaikuttaa androgeenireseptorin transkriptionaalisen aktiivisuuden. AhR ja Ahr-ydin- translocator (ARNT) vuorovaikutuksessa androgeenireseptorin [8]. Kuitenkin vain AhR pystyttiin parantamaan androgeenireseptorin transkriptionaalista aktiivisuutta ilman eksogeenisen ligandin [9].

Tällä hetkellä AhR on ainoa tunnettu ligandi-aktivoitujen jäsen perus-helix-loop-helix ( bHLH) perhe transkriptiotekijöiden. Se aktivoidaan sitovan monenlaisia ​​ympäristömyrkkyjä, kuten polyaromaattisten ja polysykliset hiilivedyt (PAH) [10]. Kun sytosoliin, AhR löytyy monimutkainen, jotka koostuvat kaksi molekyyliä HSP90, co-kaperonin p23, immunofiliiniin kuten AhR vuorovaikutuksessa proteiinin (AIP) ja tyrosiinikinaasi c-src [11], [12], [13] , [14]. Tämä proteiini kompleksi suunniteltu ylläpitämään aktiivinen rakenne ja estää ydinaseiden translokaation.

Kun sitovia ligandeja, aktivoitu AhR siirtyy tumaan ja heterodimerizes kanssa AhR ydin- translocator proteiini (ARNT) [10], [15] . Ydin- AhR kompleksi on vuorovaikutuksessa xenobiotic vaste elementtejä (XRE) geenissä edistäjiä vaiheen I ja vaiheen II lääkettä metaboloivia entsyymejä parantaa transkription [16], [17], [18]. Induktion jälkeen AhR reagoiva geenien, AhR signalointi lopetetaan heti heikentämällä tai sitomalla jota inhibiittoriproteiinista [19], [20], [21].

AhR ligandin aktivaation on raportoitu antagonisoida androgeenireseptorin signalointia. Voimakkaat AhR agonisti, 2,3,7,8-tetra- kloori-dibentso-

p

dioksin (TCDD), esti testosteroni-riippuvaisen transkription aktiivisuus ja testosteronin säädelty prostataspesifisen antigeenin (PSA) ilmentymistä annoksesta riippuvainen tavalla [22]. TCDD estää myös androgeeniriippuvaisessa leviämisen eturauhasen syöpäsolujen [23]. Co-aktivointi AhR ja androgeenireseptorin TCDD ja dihydrotestosteroni (DHT) väheni AR proteiinin tasot [24]. Tämä havainto on osaltaan kykyä AhR edistää proteolyysin AR kautta koottaessa ubikitiinipromoottori ligaasilla kompleksi, jossa AhR toimii substraattina tunnustamatta alayksikköä rekrytoida AR ja voi selittää antiandrogeenisesta toiminnasta useiden AhR ligandien [25].

huolimatta tutkimukset vahvistavat AhR ligandi sääntelyn AR signalointi, AhR saattaa olla luontaista toimintoja, jotka säätelevät kasvua eturauhasen syöpien riippumaton AR asema, joka ei ole täysin tutkittu. Rakenteellisesti AhR sisältää sekä tumalokalisaatiosignaalin ja tumasta signaalia, joita tarvitaan ydin–sytoplasmista sukkuloimisen AhR [26]. Useat raportit paljastavat konstitutiivista AhR signalointi sisällä eri syöpätyyppeihin. Koska eksogeenisten ligandien, AhR yliekspressio sääteli ilmentymistä kohdegeenin CYP1B1 alkuvaiheessa keuhkojen adenokarsinooma [27]. CYP1B1 ilmentyy myös ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut ilman eksogeenisen ligandin. CYP1B1 ilmentyminen liittyy lisääntynyt AhR ilmentyminen ja konstitutiivista aktiivisuutta reseptoria [28], [29]. Ehtyminen AhR proteiinin johti myöhemmin lasku CYP1B1 ilmaisun, joka vahvistaa, että pohjapinta CYP1B1 ilmentymistä säätelee konstitutiiviset AhR signalointi. Pre-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen rintarauhaskudosten raportoidaan konstitutiivisesti ilmaista CYP1B1 mRNA. Näiden ihmisen ja jyrsijöiden nisäkasvaimia, AhR oli yli-ilmentynyt ja konstitutiivisesti aktiivisen [30].

Lisäksi hiiren hepatoomasolujen ei altistettiin eksogeeniselle AhR ligandien osoitettiin sisältävän transkriptionaalisesti aktiivinen AhR. Lisäksi merkittävä määrä konstitutiivisen AhR aktiivisuus ilmoitettiin eristetyt solut pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) potilasta (DiNatale2012). Myös ohimenevä yli-ilmentyminen AhR osaksi AhR null solulinjassa indusoi myös ligandin itsenäinen transkriptioaktiviteettia [29], [31].

Eturauhasen kudos analysoitiin immunohistokemiallisesti paljasti, että hyvänlaatuinen liikakasvu (BPH) epiteelisolut omistavat merkittävästi vähentynyt AhR ilmaisu verrattuna normaaliin kudokseen. Kuitenkin AhR ilmentyminen usein lisääntynyt enemmän dedifferentoituneiden kasvaimen alueilla [32]. Erillinen tutkimus havaitsi myös huomattavasti korkeampi AhR ilmaisun ja aktivointi kasvainsoluissa verrattuna hyvänlaatuinen rauhasepiteelin [33].

LNCaP-solulinja, joka on johdettu imusolmuke etäpesäke, on laajalti käytetty ihmisen eturauhassyövän solulinja käytetään osoittamaan androgen herkkyyttä. LNCaP-solut ilmentävät mutatoitua androgeenireseptorin ja prostataspesifisen androgeenin [34]. LNCaP-solut eivät tuumorigeenisia nude-hiirissä [35], [36]. Sen sijaan, androgeeni herkkä eturauhassyövän solulinjoissa, DU145 ja PC3 ovat erittäin tuumorigeenisiä nude-hiirissä. Vaikka ne eivät ilmennä androgeenireseptorin, ne reagoivat Androgeenit, mutta eivät ole tukahdutettu kasvua alle androgeenireseptorin riistää kasvuolosuhteissa [37], [38]. Näitä solulinjoja käytetään yleisesti

in vitro

malleja tutkimuksia hormoniresistentti eturauhassyöpä. PC3M eturauhassyövän solulinja eristettiin nude-hiirissä intraspenic injektion PC3-soluissa ja on erittäin metastaattinen [39]. Vaikka useat tutkimukset ovat osoittaneet vaikutuksia AhR ligandin aktivaation eturauhassyövän solulinjoissa, ei tutkimus on selvittänyt rooli konstitutiivisen AhR signaloinnin eturauhassyövän solujen kasvua. Olemme aiemmin raportoitu, että AhR on velvollinen pitämään hormoni riippumaton signalointi ja kasvua androgeenireseptorin vuonna C4-2 eturauhasen syöpäsoluja. Tulokset osoittavat suoraa roolia AHR androgeenireseptorin riippuvainen kasvua eturauhassyöpäsolujen [29]. Tässä Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että AhR on konstitutiivisesti aktiivinen edenneen eturauhassyövän solut ja että ablaatio perustava AhR signaloinnin estävän androgeeniriippumattomaksi kasvu ei riipu androgeenireseptorin asemasta.

Materiaalit ja menetelmät

Kemialliset ja reagenssit

AhR agonisti, 2,3,7,8-tetra- kloori-dibentso-

p

dioksin (TCDD) hankittiin AccuStandard (New Haven, Connecticut). AhR antagonisti, (CH223191) ostettiin Sigma Aldrich. Androgeenireseptoriantagonistin, Casodex (CDX) ostettiin Sigma Aldrich.

Cell Culture

Adherent yksikerroksisiin ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa LNCaP, DU145, PC3 ja PC3M ylläpidettiin RPMI 1640-alustassa täydennetty 10% FBS: ää ja 100 mmol /l kutakin penisilliiniä ja streptomysiiniä. Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa 5% CO 2: ssa kostutetussa ilmakehässä, ja väliaine vaihdettiin joka kolmas päivä. Solut jaettiin (1:03), jolloin se oli lähellä yhtymäkohta. Vaste androgeenien kasvun ja androgeenireseptorin aktiivisuutta tarkkailtiin ajoittain tutkimuksen aikana.

RNA uuttaminen ja määrälliset qRT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin yksisolukerrosten kasvatettiin 100 mm: n kudosviljelmässä astiat käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen). 2 ug kokonais-RNA käänteistranskriboitiin käyttäen Superscript II (Invitrogen), mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. CDNA toimi templaattina 25 ul reaktioseosta ja prosessoitiin käyttäen seuraavaa protokollaa: ensimmäinen denaturaatio 95 ° C: ssa 3 min, jonka jälkeen 39 monistussykliä (95 ° C: ssa 10 s, ja 55-65 ° C: ssa 30 s), 95 ° C: ssa 10 s, 65 ° C: ssa 5 s ja 95 ° C: ssa 50 s. 25 ui qPCR reaktioseosta sekoitettiin GoTaq qPCR Master Mix (Promega). Melt-käyrä analyysit suoritettiin jokaisen ajon varmistaa yhden tuotteen. Suhteellinen geenin ilmentyminen määritettiin käyttäen ΔΔCq laskentamenetelmää. Alukesekvenssit käytettiin: L-19: Eteenpäin (5′-3 ’) TCCCAGGTTCAAGCGATTCTCCTT Reverse (5’-30 ’TTGAGACCAGCCTGACCAACATGA. CYP1B1: Eteenpäin (5′-3′) TGCCTGTCACTATTCCTCATGCCA Käänteinen (5’-3 ’) TCTGCTGGTCAGGTCCTTGTTGAT. Spesifisyyttä Näiden alukesarjoista todensi kokeiden avulla erityisiä shRNAs jotka kohdistuvat AHR Tran et al [29].

Protein eristäminen ja Western Blot analyysi

proteiini näytteet eristettiin käyttäen Thermo Scientific NE-PER Extraction kit solufraktioiden tai kaupallisesti saatavilla soluhajotuspuskurin (Cell Signaling ) ja kokonaisproteiinista. Proteiininäytteet erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-membraanille. Immunoblottaus toteutettiin 1 ug /ml hiiren AhR monoklonaalinen vasta-aine on 1:1000 laimennus 5% maitoa. Membraanit pestiin kolme kertaa (15 min kukin) TBST: llä. Täpliä inkuboitiin sitten 1:2500 laimennus sekundaarisen vasta-aineen ja pestiin kolme kertaa (15 min kukin) TBST: llä, kolme kertaa (10 min kukin) TBS ja kerran ddH20 (10 min). nauhat visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi (ECL) kitti valmistajan ilmoitus. Päällekkäisvalotuksia kunkin sarjan näytteet tuotettiin. Suhteellinen pitoisuus kohdeproteiinin määritettiin tietokoneella analyysin ja normalisoitiin sisäisen standardin (topoisomeraasin, β-tubuliinia, β-aktiini).

immunosytokemiallinen Värjäys ja fluoresenssimikroskopiaa

Soluja kasvatettiin lasi kansi liukuu 6-kuoppalevyillä pestiin kylmässä PBS: ssä ja kiinnitettiin inkuboimalla 1:01 metanoli: asetoni-liuoksessa 4 ° C: ssa 30 minuuttia ja sitten kuivattiin ilmassa. Solut huuhdeltiin ja sammutettua Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 0,05% Tween 20 (TBST) ja siirrettiin puhtaaseen 6-kuoppalevylle. Soluja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan 5% maidon liuos TBST estää epäspesifisen sitoutumisen, jonka jälkeen inkuboitiin huoneenlämmössä 1 tunnin ajan affinitecttipuhdiste- kanin anti-AhR polyklonaalista vasta-ainetta 1 ug /ml 1:1000 laimennus 4% maitoa ratkaisu TBST. Sitten solut pestiin kolme kertaa (15 min kukin) TBST: llä. Soluja inkuboidaan 1:200 laimennus fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoidulla anti-kani-vasta-aineita (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) 4% maitoa huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan. Sitten solut pestiin kolme kertaa (15 min kukin) TBST: llä, kolme kertaa (10 min kukin) TBS ja kerran ddH20 (10 min). Sitten solut kiinnitetään objektilaseille käyttäen UltraCruz vaikea asettaa kiinnitysväliaine sisältävä 4’6′-diamino-2-fenyyli (DAPI).

XRE Sidonta

4 × 10

4 solut maljattiin 96-kuoppaiselle levylle. Eturauhassyövän solut transfektoitiin XRE toimittaja, sekä positiivisten ja negatiivisten kontrolli toimittaja plasmideja käyttäen attractene. 18 tunnin kuluttua transfektion väliaine vaihdettiin standardi määritys media (DMEM + 0,5% FBS: ää 0,1 mM NEAA). Soluja kasvatettiin vielä 24 tuntia normaaleissa solun olosuhteissa. Dual Lusiferaasimääritys suoritettiin 42 tunnin jälkeen transfektion, ja promoottorin aktiivisuus arvot ilmaistaan ​​mielivaltainen fluoresenssi yksikköä (AFU). Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja keskivirheen ilmoitetaan.

leviämisen Tutkimukset

kasvu solut testattiin käyttämällä Promega CellTiter 96 proliferaatiomääritystä. Solut suspendoitiin uudelleen loppukonsentraatioon 1,0 x 10

5 /ml RPMI. 50 ui solususpensiota (5000 solua) lisättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisella levyllä, joka sisälsi 50 ui elatusainetta, jossa vastaava käsittely johtaa kokonaistilavuudessa 100 ui. Mikrolevyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 24-72 tuntia kosteassa, 5% CO

2-ilmakehässä. Per valmistajan ohjeita, inkuboinnin jälkeen, 20 ui MTS-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tuntia. 100 ui stop-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 1 tunti. Luettiin 570 nm: ssä käyttämällä Synergy H1m multimode mikrolevylukijaa.

immunohistokemiallinen värjäys

Tissue diat poistettiin parafiini ksyleenillä ja niihin lisätään arvostellaan alas-sarja etanolia (70, 90 ja 100% ) ja lopuksi ddH20. Antigeenejä noutaa biocare puskuria ennen inkubointia 0,3% H

2O

2 10 minuuttia huoneenlämpötilassa. Levyjä pestiin kolme kertaa (5 min kukin) PBS: ssä. Objektilasit blokattiin normaalissa vuohen seerumissa blokkausliuoksessa 1 tunti huoneen lämpötilassa. Levyjä inkuboitiin 1 ug /ml kanin anti-AhR polyklonaalista vasta-ainetta (1:100 laimennos) yön yli 4 ° C: ssa. Inkuboinnin jälkeen primaarisessa vasta-aineen, levyjä pestiin kolme kertaa (5 minuuttia kukin) PBS: llä ennen 1 tunnin inkubaatio vuohen anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (1:400) laimennus huoneenlämpötilassa. Levyjä pestiin kolme kertaa (5 min kukin) PBS: ssä ja inkuboitiin 10 minuuttia diaminobenzedine kohti valmistajan ohjeiden. Jälleen levyjä pestiin kolme kertaa (5 min kukin) PBS, huuhdeltiin DDH

2O ja vesi väkevyydeltään up-sarjan etanolia ennen kirkastettiin ksyleenissä ja asennetaan käyttäen ksyleeniä perustuu kiinnitysväliaineet. Kuvia kunkin kudosnäytteen sekä vastaavat hematoksyliinillä ja eosiinilla tahroja tallennettiin 400x suurennuksella myöhempää pisteytys. Anti-AhR reaktiivisuus pisteytettiin asteikolla 1-3 (1 = alhainen reaktiivisuus ja 3 = korkea reaktiivisuus) ja sytoplasmassa ja tumassa kunkin kudosnäytteen kahden ulkopuolisen tutkijat.

Tilastollinen analyysi

Jokainen koe suoritettiin vähintään 3 kertaa, ja kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona + SEM. Erot ryhmien verrattiin t-testillä tai ANOVA käyttämällä InStat ohjelmistoa (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Arvo P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

I. AhR yliekspressoituu edennyt eturauhassyöpä Cell Lines

DU145, PC3 ja PC3M eturauhassyövän solulinjaa käytettiin hormoni tulenkestävien eturauhassyövän solu malleja. Nämä 3 solulinjat on osoitettu ylläpitämään kasvulukuihin androgeenin köyhdytetyn ympäristöön [37], [38], [39]. LNCaP on androgen herkkä eturauhasen syöpäsolun mallista, jonka kasvuvauhti pienenee alle androgeenireseptorin köyhdytettyä olosuhteissa [34]. Ekspression AhR mRNA: n solulinjoissa kvantifioitiin qRT-PCR: llä. AhR proteiinin ilmentymistä jokaisen rivin tutkittiin western blot. Advance eturauhassyövän solulinjoissa on ekspression lisääntymisen AhR mRNA: ta ja proteiinia verrattuna androgen herkkä, LNCaP, solulinja. LNCaP-solut ilmentävät sekä AhR mRNA ja proteiini. Kuitenkin DU145 ja PC3 solu on 2,5 ja 5 kertainen lisäys AhR mRNA vastaavasti (Fig. 1 B). Tämä korreloi 2 kertainen nousu AhR proteiinin DU145 ja yli 2,5 kertainen lisäys PC3-soluissa (kuvio. 1A). PC3M solut on suurin kasvu AhR ilmaisun verrattuna LNCaP. Oli 10-kertainen kasvu PC3M mRNA: ta ja 3-kertainen nousu AhR proteiinia (Fig. 1).

. Solun kokonaisproteiinista eristettiin LNCaP, DU145, PC3 ja PC3M eturauhassyövän solulinjoissa. Proteiinit erotettiin SDS polyacrylamine geelielektroforeesilla ja blotattiin käyttäen anti-AhR vasta-aine. Anti-β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Kuva J saamiseksi käytettiin desitometric toimenpiteitä 3 itsenäisestä kalvoja. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± SEM (n = 3) ja analysoitiin Studentin t-testiä. Tilastollisesti merkitseviä eroja (* p 0,05) verrattuna LNCaP valvontaa. B. Yhteensä RNA: t eristettiin ja kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin sen määrittämiseksi, mRNA: n ilmentymistä AhR eturauhasen syöpäsolulinjoissa. mRNA-tasot normalisoitiin käyttäen L-19, joka toimii sisäisen valvonnan. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± SEM (n = 3) ja analysoitiin Studentin t-testiä. (*) Tarkoittaa tilastollisesti merkitseviä eroja ryhmien.

II. Ligandi Riippumaton Nuclear sijainnilla AhR

Voit selvittää lokalisoinnin AhR proteiinia, me eristää solufraktioiden ja suoritetaan immunoblottaus varten AhR ydinvoiman ja sytoplasman jakeet. Western blot-analyysi solufraktioiden paljasti, että kasvu AhR ilmentymistä edenneen eturauhassyövän solulinjoissa liittyy tumakertymään AhR ilman stimulaation eksogeenisen ligandin. Vaikka AhR-proteiinia ei havaittu sytoplasmisen fraktioita LNCaP-solujen, ei AhR havaittu LNCaP ydin- fraktioissa. Sen sijaan edenneen eturauhassyövän solulinjoissa osoittivat korkeaa ekspressiota AhR proteiinin ydin- fraktiot (Fig. 2A). Immunosolukemialliset varmisti AhR tumassa DU145, PC3 ja PC3M soluja. Puuttuminen värjäytymistä overlay yhdistetyssä kuva DAPI värjättyä ytimet ja FITC-värjätään AhR lisäksi osoittanut, että LNCaP eivät omaa ydinaseiden AhR (Fig. 2B).

. Nuclear ja sytoplasminen fraktiointiin: Solulinjat kasvatettiin 100 mm: n annoksia kunnes ~75% konfluentteja, pestiin kylmällä PBS: llä ja solujen fraktiot eristettiin kohden valmistajan ohjeiden avulla NE-PER Extraction kit. Ydin- ja sytoplasman fraktiot analysoitiin western-blottauksella varten AhR proteiinin ilmentymisen. Suhteellinen taso sytoplasman AhR oli normalisoitu β-tubuliinia ilmaisun ja suhteellisen tason ydin- AhR oli normalisoitu topoisomeraasi ilme. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SEM korjatun arvoista kolmesta itsenäisestä kokeesta ja (*) tarkoittaa konstitutiivista ydin- tasot AhR jotka ovat merkittävästi erilaisia ​​eri solulinjoissa. B. solunosasijaintia AhR eturauhassyövän solulinjoissa immunosytokemiallisella värjäys: Soluja kasvatettiin peitinlaseilla ja kiinnitettiin metanoli: asetoni. AhR visualisoitiin värjäämällä kanin anti-AhR polyklonaalisten vasta-aineiden ja sen jälkeen FITC-konjugoitua vuohen anti-kani-vasta-aine. Tumat vastapäivään värjättiin DAPI fluoresenssiväriä. Kuvat FITC ja DAPI-fluoresenssikanavan yhdistettiin. Kuvat otettiin koskevasta Olympus leveä fluoresenssimikroskooppia (400x suurennos).

III. Konstitutiivinen AhR transkriptionaalinen aktiivisuus

Cignal XRE toimittaja käytettiin mittaamaan pohjapinta aktiivisuutta AhR signalointireitin pitkälle eturauhassyöpäsolulinjoissa. Määrityksessä käytettiin testaamaan AhR promoottorin aktiivisuus osoitti, että etukäteen eturauhasen syöpäsolujen DU145, PC3 ja PC3M, kaikilla on korkea AhR sitoutumisen XRE ilman eksogeenisen ligandin. Androgen herkkä LNCaP-solulinja osoitti minimaalinen XRE sitova. PC3-solut osoittivat korkeimman promoottorin aktiivisuutta, jossa on 10-kertainen nousu XRE sitoutuminen verrattuna LNCaP solulinjoja. DU145 ja PC3M solujen osoittaneet 2,5 ja 8-kertainen nousu promoottorin aktiivisuuden verrattuna LNCaP-solulinja, vastaavasti (Fig. 3A).

. Kukin eturauhassyövän solulinja transfektoitiin XRE reportteriplasmidilla, sekä positiivisena ja negatiivisena kontrollina toimittaja plasmideja käyttäen attractene. Transfektion jälkeen kaksi Lusiferaasimääritys suoritettiin. Promoottorin aktiivisuus arvot ilmaistaan ​​mielivaltainen fluoresenssi yksikköä (AFU). Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± SEM (n = 3) ja analysoitiin Studentin t-testiä. (*) Tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (* P 0,05). B. qRT-PCR-analyysi CYP1B1 mRNA: n ekspression eturauhassyöpäsoluissa. Soluja käsiteltiin 50 uM AhR estäjä (CH223191) tai ajoneuvon ohjaus (DMSO) 24 tunnin ajan ja koko RNA: t eristettiin ja kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin sen määrittämiseksi, mRNA: n ilmentymistä CYP1B1 kussakin eturauhassyövän solulinjoissa. mRNA-tasot normalisoitiin käyttäen L-19, joka toimii sisäisen valvonnan. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± SEM (n = 3) ja analysoitiin Studentin t-testiä. (*) Tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (* P 0,05) verrattuna LNCaP eturauhassyövän solulinjassa.

Edellä esitetyt tulokset viittaavat siihen, että transkriptionaalisesti aktiivinen AhR pitkälle eturauhassyöpäsolulinjoissa. Monet tutkimukset ovat vahvistaneet koholla AhR ja CYP1B1 muttei CYP1A1 kasvaimia tuottavassa malleissa [30], [40]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että on olemassa eroja sääntelyn näiden kahden geenin. CYP1A1 ja CYP1B1 ilmaisut ovat AhR välittämää mutta erot promoottori rakenne voi johtaa erilaiseen ekspressioon. Raportit osoittavat, että CYP1A1 on valvonta ligandin aktivoituminen AhR ja CYP1B1 säätelee konstitutiiviset AhR signalointi [41], [42], siis vahvistaa transkriptionaalisen aktiivisuuden AhR signalointireitin, AhR reagoiva geeni, CYP1B1 mitattiin qRT- PCR androgen herkkä LNCaP-solulinjasta sekä edenneen eturauhassyövän solulinjoissa, DU145, PC3and PC3M. LNCaP-solut ilmaisivat minimiverotasot CYP1B1 transkriptio. DU145 ja PC3-solut osoittivat 12 ja 25-kertainen nousu CYP1B1 verrattuna LNCaP. PC3M solut osoittivat suurinta kertaistanut CYP1B1 kanssa lähes 30-kertainen kasvu verrattuna LNCaP. Esto AhR signaloinnin suora estäjä, CH223191, aiheutti merkittävän laskun CYP1B1 tasojen edennyt eturauhassyöpä solulinjoissa. Vähäisen perusilmennystä CYP1B1 LNCaP-soluissa, CH223191 ei ollut merkittävää vaikutusta CYP1B1 mRNA: n ilmentymisen (Fig. 3B).

IV. Ablaatio Konstitutiivinen AhR Signaling Estää androgeeniriippumattomaksi Growth

Edellä olevat tiedot osoittavat kykyä AhR antagonisti, CH223191, inhiboimaan konstitutiivinen AhR signalointia. Vaikutuksen määrittämiseksi konstitutiivisen AhR signaloinnin kasvu edenneen eturauhassyövän soluja, joista kukin rivi on kasvatettiin poissa ja läsnä ollessa erityisen AhR estäjä, CH223191. LNCaP, DU145, PC3 ja PC3M eturauhassyövän soluja kasvatettiin läsnä AhR inhibiittorin CH223191191 pitoisuuksina 1 uM 50 uM (Fig. 4A). Ablaatio AhR signaloinnin riitti vähentää kasvunopeutta kaikkien solulinjojen androgeenireseptorin herkkä LNCaP. Vahvista vaikutukset CH223191191 olivat AhR riippuvaisia, DU145-soluja transfektoitiin kontrollina vektorin (SCR) ja vektori, jossa tietyn shRNA kohdistaa AhR proteiinia (-AhR). Saadut solut, jotka ilmentävät AhR (SCR) ja ovat vailla AhR proteiinin (-AhR) käsiteltiin 50 uM CH223191191 (Fig. 4B). DU145 (SCR) solut reagoivat CH223191191 hoidon merkittävä väheneminen kasvu, kun taas DU145 (-AhR) soluja ei esiintynyt kasvua vastausta AhR antagonisti (Fig. 4B). Androgeenireseptorin esto casodex oli ainoa tehokas LNCaP-soluissa. Hoito edenneen eturauhassyövän solulinjoissa (DU145, PC3 ja PC3M) kanssa CDX ei ollut vaikutusta kasvunopeuteen. LNCaP osoitti 40%: n lasku kasvu läsnäollessa CDX. CH223191 hoito johti suurimman kasvun eston DU145 soluissa. DU145 solut osoittivat myös korkein kasvuvauhti kaikissa solulinjoissa kontrolloiduissa olosuhteissa. Myös yhtäaikainen käsittely CH223191 ja CDX aiheutti ylimääräisen lasku kasvu verrattuna CH223191 yksin kaikissa solulinjoissa (Fig. 4C). Kasvun estäminen eturauhassyövän solulinjoissa CH223191191 säilyi jopa 72 tuntia (Fig. 4D).

. Soluja kasvatettiin 96 kuoppalevylle 5,0 × 10

3 solua kuoppaa kohti. Soluja käsiteltiin DMSO: lla tai 1 uM, 5 uM, 10 uM, 25 uM tai 50 uM CH223191. Solujen kasvu mitattiin käyttämällä Promega CellTiter 96 proliferaatiomääritystä kohden valmistajan ohjeiden. B. vahvistus AhR proteiinin ilmentymisen DU145 solujen salattu vektorisäätö (SCR) ja shRNA lentivirukselle vastaan ​​AhR (-AhR) western-blottauksella. 20 ug proteiinia on eristetty analysoitiin western-blottauksella. β-toiminta käytetään latauskontrollina. Leviämisen DU145 (SCR) ja DU145 (-AhR) solut analysoitiin käyttämällä CellTiter 96 proliferaatiomääritystä läsnä ja poissa ollessa 50 uM CH223191. C. Solut kasvatettiin charcoaled riisuttu median ja käsiteltiin DMSO: n (CON), 20 uM Casodex (CDX), 50 uM CH223191 tai yhdistelmä CDX ja CH223191 72 tuntia. Solujen kasvu mitattiin käyttämällä Promega CellTiter 96 proliferaatiomääritystä kohden valmistajan ohjeiden. Jokainen pylväs edustaa keskiarvo ± SEM (n = 3), * p 0,05. D. Soluja seerumin puutteessa 24 tuntia ja kasvatettiin puuhiilellä puhdistettua (CSS) media. Solut, joissa käsiteltiin sitten DMSO: ta (Con) tai 50 pM CH223191 vielä 24, 48 tai 72 tuntia. Kunkin päätepiste, solut analysoitiin DNA-sisällön käyttäen solujen lisääntymisen määrityksessä, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Kukin tietopiste edustaa keskiarvoa ± SEM (n = 3). (*) Tarkoittaa merkittävää eroa verrattuna vastaaviin DMSO-kontrollin.

V. AhR Nuclear Kertyminen Eturauhassyöpä Tissue

Ilmaisu ja paikallistaminen AhR arvioitiin eturauhassyöpäkudoksen immunohistokemiallisella värjäyksellä. Mukaisesti Tämän tutkimuksen tavoitteena osoittaa, että AhR on konstitutiivisesti aktiivinen edennyt eturauhassyöpä, arvioimme AhR ilmentymisen eturauhassyöpäkudoksille vaihtelevat Grade 1 Grade 3 Grade 1 kudokset ovat hyvin erilaisia ​​ja solut näyttävät normaalia. Grade 2 kudokset ovat kohtalaisen eriytetty ja solut näyttävät hieman erilainen kuin normaali. Grade 3 kudokset ovat heikosti eriytetty ja solut näyttävät poikkeava ja taipumus kasvaa ja levitä aggressiivisemmin. 100% kudosten värjätään positiiviseksi sytoplasmisen AhR. Kuitenkin vain 14% luokan 1 kudosten olivat positiivisia ydin- AhR verrattuna 50% luokan 2 ja 3. asteen syöpä kudoksiin (kuva 5A ja taulukko 1). Läsnäolo ydinaseiden AhR palkkaluokkaan 2 ja 3. asteen kudosten yhdessä in vitro data eturauhassyövän solulinjoissa ehdottaa kopiointia ajatellen aktiivisen AhR näillä korkeamman asteen kasvaimet. Lisäksi kaikki luokka 1 kasvaimet positiivinen ydin- AhR olivat kaikki luokiteltu vaihe IV kasvaimia. Analyysi yhteensä AhR ilmaisun paljasti, että Grade 2 ja 3 kasvaimia niillä merkittävästi enemmän yhteensä AhR verrattuna grade 1 kudoksen (kuva 5B). Lisäksi -80% kudosten kanssa Gleason pisteet 7 tai enemmän ovat lisääntyneet anti-AhR reaktiivisuus verrattuna vain 47% kudosten kanssa Gleason pisteet 2-6 (taulukko 2).

. Edustavia Grade 1, Grade 2 ja luokan 3 eturauhassyöpäkudoksille: Ylähavas värjätään anti-AhR polyklonaalisen vasta-aine; alempi paneeli värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Nuolet kuvaavat positiivinen anti-AhR reaktiivisuus tumassa luokan 2 ja 3. asteen kasvaimet. B. yhteensä anti-AhR reaktiivisuus pisteytettiin palkkaluokkaan 1, luokka 2 ja 3. asteen eturauhassyöpäkudoksille perusteella intensiteetin taso sekä sytoplasmassa ja tumassa (0-1).