Krooninen sairaus

tiivistelmä

säädeltyyn miRNA kriittisiä rooleja aikana syövän synnyn ja syövän etenemistä. Esillä olevassa tutkimuksessa, toiminta miR-1228 * säätelyssä syövän etenemiseen tutkittiin mahasyövässä. Vähentynyt ilmentyminen miR-1228 * havaittiin ihmisen mahasyövän kudosten verrataan normaaleissa kudoksissa. Myöhemmin rooli miR-1228 * arvioitiin

in vivo

käyttäen -tuumoriksenografti mallia. Tässä mallissa miR-1228 * yliekspressio tukahdutetaan ksenograftin kasvaimen muodostumisen. Lisäksi osoitimme miR-1228 * säätelee negatiivisesti NF-KB: n aktiivisuuden SGC-7901 mahalaukun syöpäsoluja ja totesi, että CK2A2 oli tavoite miR-1228 *. Ylössäätely miR-1228 * väheni ilmaus mesenkymaalisten markkereita ja lisäsi epiteelin merkki E-kadheriinin, mikä viittaa sen mahdollisen roolin tukahduttaa epiteelin-mesenkymaalitransitioon. Yhdessä nämä havainnot tarjoavat ensimmäiset todisteet että miR-1228 * on tärkeä rooli säätelyssä mahalaukun syövän kasvua ja viittaavat siihen, että selektiivinen palauttaminen miR-1228 * saattaa olla hyötyä mahasyövän hoidossa.

Citation: Jia L Wu J, Zhang L, Chen J, Zhong D, Xu S, et ai. (2013) palauttaminen miR-1228 * Expression vaimentaa epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon mahasyövän. PLoS ONE 8 (3): e58637. doi: 10,1371 /journal.pone.0058637

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 25 lokakuu 2012; Hyväksytty: 05 helmikuu 2013; Julkaistu: 12 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Jia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat luokan lyhyt ( 20-23 nukleotidia), endogeeninen, yksijuosteiset RNA: t, jotka säätelevät geeniekspressiota aiheuttaa translaation tukahduttamisen tai mRNA: n hajoamisen [1], [2]. Via nämä molekyylitason mekanismeja, miRNA hallussaan normaali biologisia toimintoja, kuten solujen jakautumisen, erilaistumisen ja apoptoosin. Lisäksi säädeltyyn miRNA on osoitettu olevan kriittisiä rooleja säätelyssä syövän synnyn ja syövän etenemistä [3], [4]. Abberant miRNA ilmentyminen on havaittu monenlaisia ​​maligniteetteja, mukaan lukien mahasyöpä [5].

Epithelial-mesenkymaalitransitioon (EMT) on biologinen uudelleenohjelmointi tapahtuma, jonka avulla epiteelisolujen tehdään useita biokemiallisia muutoksia hankkia mesenkyymisolujen fenotyyppi. Vaikka EMT on kriittinen asianmukaisen alkion kehitystä lisäämällä viittaavat siihen, että poikkeava aktivaatio EMT johtaa pahanlaatuisen kasvaimen etenemistä [6]. On osoitettu, että EMT on keskeinen prosessi edistää syövän kehittymistä, jolle on ominaista menetys epiteelin merkki E-kadheriinin, kasvua mesenkymaaliset merkki vimentiinista ja lisääntyminen muuttavien ja invasiivisen käyttäytymisen [7], [8].

aiemmassa tutkimuksessa, analysoimalla miRNA joukko haimasyövän aloilla, miR-1228 * havaittiin yksi syöpään liittyvien miRNA (tuloksia ei ole esitetty). Täällä esittänyt todisteita siitä, että miR-1228 * oli alassäädetty mahasyövän kudoksiin verrattuna normaaleihin kudoksiin. Palauttaminen ilmentyminen miR-1228 * mahalaukun syöpäsoluissa merkitsevästi estävän solujen vaeltamiseen ja kasvaimen kasvua. Mekanistisesti osoitimme, että miR-1228 * inhiboi NF-KB: n aktivoitumista ja mahdollisesti estää EMT.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat SGC-7901 , AGS ja BGC-823 ostettiin Institute Biokemian ja solubiologian (Chinese Academy of Sciences). Yksi normaali mahan epiteelisolujen linja GES-1 hankittiin Beijing Institute for Cancer Research. Nämä solut pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO 2-inkubaattorissa RPMI-1640 (SGC-7901 ja BGC-823), F-12K (AGS) tai DMEM (GES-1) väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia [ ,,,0],9], [10].

Kliiniset näytteet

Viisikymmentä paria mahasyövän ja viereisen ei-syöpä kudosnäytteet saatiin potilailta, joille tehtiin kirurginen resektio pidetyssä toisessa Affiliated sairaala, College of Medicine , Zhejiangin yliopistossa. Sovitetun kuin syöpä viereisten kudosten saatiin vähintään 5 cm: n päässä syöpäkasvaimen. Yksikään potilaista ei ollut sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta. Tissue kerättiin, snap-jäädytettiin nestetypessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes sitä käytettiin [11]. Kaikki kudokset histologisesti vahvistettiin olevan mahalaukun adenokarsinooman. Tutkimuksen hyväksyi toisen Affiliated sairaalan eettisen komitean Zhejiangin University College of Medicine. Allekirjoitettu suostumus saatiin kaikki osallistujat tai potilaiden edustajia jos suoraa suostumusta ei saatu.

RNA ja Reaaliaikainen PCR

Yhteensä RNA eristettiin viljellyistä soluista tai kudoksia käyttäen TRIzol (Invitrogen), ja konsentraatio kokonais-RNA määritettiin. CDNA: n synteesi ja reaaliaikaisen PCR suoritettiin käyttäen TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) ja TaqMan MicroRNA Assay Kit (Applied Biosystems), vastaavasti. Reaaliaikainen PCR suoritettiin Applied Biosystems StepOnePlus ™ Real-Time PCR System protokollan mukaan. Ilmaisu taso miR-1228 * normalisoitiin RNU6B. Reaaliaikaisen PCR-reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Suhteellinen ilmentyminen miRNA laskettiin käyttäen vertailevaa Ct menetelmällä [12].

tuumorin istuttamisen Assay nude-hiirissä

Naaraspuoliset BALB /c-kateenkorvattomia nude-hiiriin iässä 4 viikkoa oli ostettu Shanghai Laboratory Animal Center (Kiinan tiedeakatemia). Kaikki toimenpiteet, joissa eläimet hyväksynyt Experimental Animal eettisen komitean, College of Medicine, Zhejiangin yliopistossa. miR-1228 * tai miR-NC stabiili transfektio SGC-7901-solujen suspensioita (2,5 x 10

7 solua /ml) 200 ul: ssa seerumitonta väliainetta ihonalaisesti ruiskutettiin paljaiden hiirien kylkiin, vastaavasti. Kasvaimen kasvu tutkittiin kahdesti viikossa 5 viikkoa ja kasvaimen tilavuus (V) seurattiin mittaamalla pituus (L) ja leveys (W) kasvaimen mittaharpilla ja lasketaan kaavalla V = 1/2 (L x W × W) [13].

Cell Migration

migraatio kykyä miR-1228 * tai miR-NC vakaa transfektio SGC-7901-soluja havaittiin käyttäen siirtoaltaat (8 mm huokoskoko, Corning). Siirtoaltaat pantiin 24-kuoppaisille levyille. Juuri trypsinoitiin ja pestiin solut suspendoitiin 100 ui seerumitonta RPMI 1640, joka sisälsi 1% naudan sikiön seerumia. Noin 1 x 10

5 solua /kuoppa asetettiin yläkammiossa kunkin insertin. 200 ui RPMI 1640, joka sisälsi 20% naudan sikiön seerumia lisättiin alakammioissa. Kun oli inkuboitu 24-48 h 37 ° C: ssa 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa, solut kiinnitettiin 95% absoluuttista alkoholia ja värjättiin kristallivioletilla [14]. Solut kammiossa poistettiin pumpulipuikolla ja solut pohjaan kiinnitetyn membraanin laskettiin ja kuvattiin alle käännetyn mikroskoopin x 200 suurennus viiden satunnaisen kentät kuhunkin kuoppaan. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Western Blot

Yhteensä proteiinit mitattiin käyttäen BCA-pakkausta (Pierce) mukaan valmistajan protokollaa. Proteiinit solut fraktioitiin elektroforeesilla 12% SDS-polyakryyliamidigeelillä ja elektro-blotattiin nitroselluloosalle (NC) kalvoja 2,5 tuntia 200 V NC membraaneja inkuboitiin blokkauspuskurissa 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, mitä seurasi yli yön käsittely ensisijaisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa, ja sitten HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (MBL). Pesun jälkeen reaktiiviset vyöhykkeet havaittiin käyttäen ECL Western blot havaitseminen kit (Millipore) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vasta-aineita käytettiin tässä kokeessa olivat kanin monoklonaalista anti-E-kadheriini (Epitomics), anti-vimentiinistä (Epitomics), anti-β-kateniinin (Epitomics), anti-Snail (Cell Signaling), anti-Slug (Cell Signaling), anti- -ZEB1 (Cell Signaling), anti-ZEB2 (Santa Cruz), anti-CK2A2 (Santa Cruz) ja hiiren anti-GAPDH (KangChen Biotech).

immunohistokemia

Parafiinisektioista, 3- um paksuus, paistettiin 2 h 60 ° C: ssa ja parafiini. Antigeeni haku suoritettiin käyttäen sitraatti- natrium-puskuria (pH 7,2) 95 ° C: ssa 15 minuuttia ja sitten liukuu jäähdytettiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Sen jälkeen, kun käsiteltiin 3% vetyperoksidia 15 minuutin estää endogeenisen peroksidaasin, leikkeet käsiteltiin normaalilla vuohen seerumilla rajoittamalla nesteen 30 minuuttia vähentää ei-spesifisen sitoutumisen ja sitten kanin polyklonaalista anti-E-kadheriini (Santa Cruz) tai kanin monoklonaalista anti-vimentiinista (Epitomics) inkuboitiin osat 12 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Jälkeen rewarming 1 h ja pesu 5 kertaa, leikkeitä inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen kanssa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Diaminobenzidine käytettiin värireaktiot.

plasmidin muodostaminen ja Cell transfektio

miR-1228 * ekspressiovektorin (miR-1228 *) tai negatiivinen kontrolli (miR-NC) rakennettiin kloonaamalla oligonukleotidit, jotka sisälsivät optimoitu miR-1228 * varsi-silmukka (oligonukleotidit suunniteltiin: päälisäie, 5′-TGC TGG TGG GCG GGG GCA GGT GTG TGG TTT TGG CCA CTG ACT GAC CAC ACA CCC CCC CGC CCA C-3 ’ ; pohjasäie, 5’- CCT GGT GGG CGG GGG GGT GTG TGG TCA GTC AGT GGC CAA AAC CAC ACA CCT GCC CCC GCC CAC C-3 ’.) tai negatiivinen kontrolli varsi-silmukka pcDNA6.2-GW /EmGFP vektorin ( Invitrogen) [15]. 2-kb miR-1228 * promoottori monistettiin (Alukkeet suunniteltiin niin: eteenpäin, 5’-ATC TAG GGT ACC CTC ACT TGG AG CCA CAC AGA-3 ’, käänteinen, 5’-GAC TGA AGA TCT ACC TCA AGA GTT GGG GTG TG-3 ’.) ja coloned ja pGL3-Enhancer Vector (Promega) [16], nimettiin pGL3-miR-1228 * -promoottorin. Tyhjä pGL3-Enhancer Vector toimi negatiivisena kontrollina (pGL3-kontrolli). MIR-1228 * kohdealueella CK2A2 3’UTR sekvenssi syntetisoitiin kemiallisesti Shanghai Biotech ja lisätään alavirtaan pMIR-REPORT lusiferaasiplasmidin (Applied Biosystems), nimettiin pMIR-CK2A2. Preceiver-c-Rel ORF klooni GFP-tag hankittiin GeneCopoeia. Tuottavat vakaita transfektoituja soluja, MIR-1228 * ja miR-NC ilmentymisen rakenteet transfektoitiin SGC-7901 solulinjan kanssa käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 48 tunnin kuluttua blastisidiini (14 ug /ml) lisättiin väliaineeseen. PGL3-miR-1228 * -promoottorin /ohjaus, GFP-c-Rel /ohjaus, pMIR-CK2A2 /ohjaus tai NF-KB: n reportteri-vektoriin (Promega) transfektoitiin transientisti SGC-7901-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000, PRL-TK ( Promega) käytettiin sisäisen normalisoinnin [17].

Luciferase Reporter Assay

lusiferaasireporttiterilla määritys suoritettiin SGC-7901-soluja. Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja hajotettiin in Passive Lysis Buffer (Promega) ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin 20 ui lysaattia käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) on GloMax 20/20 Luminometer (Promega). Kaikki tiedot saatiin keskiarvoistamalla tulokset vähintään kolme riippumatonta toistoa.

Tilastollinen analyysi

Erot ilmentymistasojen miR-1228 * mahasyövän potilaille määritettiin Wilcoxonin allekirjoitettu-rank-testi. Kliiniset tiedot analysoitiin käyttäen chi-neliö testi. Studentin t-testi ja ANOVA käytettiin analysoimaan

in vitro

ja

in vivo

tietoja. Kaikki

P

arvot olivat kaksipuolisia ja erot määriteltiin tilastollisesti merkitsevä

P

0,05. Tulokset analysoitiin SPSS V.16.0 ohjelmisto (SPSS Inc.). * P 0,05, ** P 0.01.

Tulokset

miR-1228 * on usein alassäädetty Human mahasyövän

Ensinnäkin, onko miR-1228 * ilmentyy differentiaalisesti ihmisen ensisijainen syöpien, ilmentymistason kypsän miR-1228 * tutkittiin käyttäen TaqMan reaaliaikaisia ​​PCR 50 paria ihmisen mahasyövän kudosten ja pari-sovitettu viereisten noncancerous mahan kudoksissa. Tuloksemme osoittivat, että ilmentymistaso miR-1228 * on merkittävästi vähentynyt mahalaukun syövän kudoksissa verrattuna viereisen noncancerous mahan kudoksissa (Fig. 1A). Noin 72% kasvaimen näytteistä oli pienempi ilmaistaan ​​miR-1228 * (Fig. 1 B). Käyttäen 2

-ΔΔCT arvot kertainen muutos miR-1228 * 1.0 pidettiin alhainen, vaikka se 1.0 pidettiin korkea ekspressio [18]. miR-1228 * ekspressiota tutkittiin myös mahasyövän solulinjoissa ja yksi kuolemattomiksi normaalin mahan limakalvon epiteelin solulinja (GES-1). Kuten on esitetty kuviossa. 1C, miR-1228 * merkitsevästi heikkoa ilmentymistä kaikissa syöpäsolulinjoissa verrattuna GES-1. Yhdessä nämä tulokset antavat vahvaa näyttöä siitä, että miR-1228 * oli alassäädetty mahasyövän.

(A) Ihmisen mahasyövän kudoksiin verrattuna pariksi viereisen noncancerous (normaali) mahalaukun kudoksia, miR-1228 * oli alassäädetty. Ilmaisu Mir-1228 * analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä ja normalisoitiin RNU6B. Tulokset näkyvät log mittakaavassa. Tilastolliset erot analysoitiin kanssa Wilcoxonin-rank-testi (n = 50). (B) Suhteellinen ilmentyminen miR-1228 * 50 mahasyövän kudoksiin verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin. Data näytetään 2

-ΔΔCT arvoja. (C) ilmentymistä miR-1228 * 3 mahasyövässä solulinjoissa ja yksi kuolemattomaksi normaali mahan limakalvon epiteelisolujen linja (GES-1) suoritettiin reaaliaikaisella PCR ja normalisoitiin RNU6B. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM, n = 3.

Lisäksi, miR-1228 * ilmentyminen arvioitiin, mitä tulee kliinis potilaiden ominaisuuksiin. Kaikki potilaat ollut etäinen etäpesäke ja kaikki kudokset olivat histologisesti varmennettu mahalaukun adenokarsinooman. Kaikissa tapauksissa (n = 50) on ositettu kahteen ryhmään: miR-1228 * heikkoa ilmentymistä (n = 36) ja miR-1228 * korkea ekspressio (n = 14). MIR-1228 * alhaisen ilmentymisen ryhmässä oli taipumuksia kohti suurempaa kasvaimen kokoa. Kuitenkin, ei ollut merkittäviä suhteet miR-1228 * ilmaisun ja muita viittaavia tekijöitä, kuten ikä, sukupuoli, histologinen tyyppi tai TNM (taulukko 1).

Lisääntynyt miR-1228 * Expression vaimentaa -ksenografti kasvainmuodostusta

sen arvioimiseksi toiminnallista roolia miR-1228 * mahasyövän, optimoidun miR-1228 * varsi-silmukka kloonattiin pcDNA6.2-GW /EmGFP vektori. Mahalaukun solulinja SGC-7901-soluja transfektoitiin pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR-1228 * tai pcDNA6.2-GW /EmGFP-NC vektori ja vakaa solulinjoja ja nimetty miR-1228 * tai miR-NC, vastaavasti. Kuten odotettua, RT-PCR-analyysi osoitti, että miR-1228 * stabiili soluissa nousu oli kypsän miR-1228 * ilmentymisen verrattaessa miR-NC vakaa solut (Fig. 2A). Ei ollut mitään morfologista muutosta miR-1228 * vakaa-transfektoiduissa soluissa verrattuna transfektoimattomista soluihin. SGC-7901-solujen kanssa tai ilman transfektiota miR-1228 * istutettiin ihon alle paljaiden hiirien kylkiin arvioida mahdollisia vaikutuksia miR-1228 * mahalaukun syövän kasvua

in vivo

. Yli-ilmentymisen miR-1228 * merkittävästi tukahdutti kasvaimen kasvua (Fig. 2B). Loppuun mennessä koejakson, koko ja märkäpainon kasvainten miR-1228 * yliekspressio oli merkittävästi pienempi ja pienempi kuin kontrolliryhmän (Fig. 2C-D). Siten tiedot osoittavat, että miR-1228 * estää ksenograftin kasvaimen kasvua mahalaukun syöpäsolujen

in vivo

.

(A) miR-1228 * oli yli kymmenkertaiseksi muutokset asennuspalveli- 1228 * vakaa transfektoitu SGC-7901 verrattuna NC. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM, n = 3 (B) Lisääntynyt miR-1228 * ilmaisun tukahduttaa ksenograftin kasvaimen kasvua. Vakaa transfektointi SGC-7901-solujen miR-1228 * tai miR-NC injektoitiin subkutaanisesti nude-hiiriin. Tilavuus kunkin kasvaimen mitattiin kahdesti viikossa. Keskimääräinen kasvainten tilavuuden kehitetty nude-hiirissä on esitetty keskiarvoina ± SEM, n = 6 per hoitoryhmä. Tilastolliset erot näytteet määritettiin kaksisuuntainen ANOVA. (C) verrattuna valvontaan, ksenografteissa kanssa miR-1228 * yliekspressio olivat merkittävästi pienempiä. Hiiret lopetettiin 5 viikkoa ymppäyksen jälkeen. Kaksi ryhmää ”valokuva kasvaimia näkyy. (D) Kasvaimet kustakin ryhmästä punnittiin välittömästi poiston jälkeen. Kasvain paino on ilmoitettu keskiarvoina ± SEM, n = 6.

NF-KB aktivointi vastaa Ala Expression of miR-1228 * mahasyövän

Viimeaikainen työ on osoitti, että useimmat miRNA on transkriptiotekijä (TF) sitoutumiskohtiin ja monet tutkimukset ovat kertoneet, että miRNA voitaisiin säädellä TF: t [19]. Tässä käytimme bioinformatiikan ohjelmia (Promoottori 2.0 ja P-ottelu) tunnistaa mahdolliset säätelijöitä miRNA-1228 * [16], [17]. Löysimme kolme c-Rel sitovat domeenit on 2-kb miR-1228 * promoottorialue (Fig. 3A). Koska c-Rel alayksikkö on jäsenenä NF-KB perheen ja hyperactivation NF-KB: n aktiivisuus on osoitettu liittyvän mahasyöpä [20], [21]. Oletimme, että NF-KB on johtuvan downregulation miR-1228 * mahasyövän.

(A) Kaavamainen esityksiä miR-1228 * promoottorialue (musta nuolenpäitä on c-Rel sitova domeenit), sitä pienempi on pGL3-miR-1228 * -promoottorin konstrukti. (B) 24 tuntia transfektion jälkeen pGL3-miR-1228 * -promoottorin tai pGL3-kontrolli, SGC-7901-soluja stimuloitiin tai ilman TNF-α ja /tai PDTC: ssa 8 tuntia, sitten suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Lusiferaasiaktiivisuus normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuutta ilmaiseman PRL-TK ja sitten verrataan suhteellista lusiferaasin taso pGL3-kontrolli. *

P

0,05 verrattuna kontrolli.

#

P

0,05 verrattuna TNF-α-hoidetussa ryhmässä. (C) SGC-7901-solut kotransfektoitiin pGL3-miR-1228 * -promoottorin /pGL3-ohjaus ja GFP-c-Rel /GFP-ohjaus, ja suhteellinen lusiferaasin ilmentymistä havaittiin 48 tuntia myöhemmin. Lusiferaasiaktiivisuus normalisoida Renilla lusiferaasiaktiivisuutta ilmaiseman PRL-TK ja sitten verrataan suhteellista lusiferaasin taso GFP-ohjaus. Tiedot ilmaistiin keskiarvoina ± SEM, n = 3.

todistaa hypoteesia, loimme lusiferaarikonstrukti kanssa miR-1228 * promoottorialueen ja arvioidaan sen toimintaa vastauksena NF-KB: n aktivoitumisen. Koe suoritettiin viljelemällä SGC-7901-soluja 8 tuntia, kun läsnä on TNF-α (50 tai 100 ng /ml, klassinen NF-KB-reitin aktivaattori) ja /tai pyrrolidiiniditiokarbamaatin (PDTC, 100 uM), joka on laajalti käytetty estäjä transkriptiotekijän NF-KB: n [22]. SGC-7901-solut transfektoitiin pGL3-miR-1228 * -promoottorin tai pGL3-kontrolli, 24 tuntia myöhemmin, transfektoitiin SGC-7901-soluja altistettiin 8 tunnin ajan TNF-α kanssa tai ilman PDTC tutkia NF-KB: n aktivaation säätelee miR-1228 * promoottorin aktiivisuutta. Havaitsimme, että TNF-α käsittely inhiboitui merkittävästi miR-1228 * promoottorin aktiivisuutta ja NF-KB: n kanssa, PDTC esti TNF-α-välitteisen vaimennussäätely aktiivisuudesta (Fig. 3B), mikä viittaa siihen, että NF-KB voi säädellä negatiivisesti asennuspalveli- 1228 * ilme. Edelleen onko NF-KB-alayksikön C-Rel vastaa vapauttamiseksi miR-1228 *, transfektoimme SGC-7901-solujen miR-1228 * -promoottorin tai ilman GFP-c-Rel ja havaittiin merkittävä lasku lusiferaasiaktiivisuuden GFP -c-Rel ryhmä kuin kontrolli (Fig. 3C). Yhdessä data viittaa siihen, että NF-KB alayksiköt c-Rel toiminnallisesti edistää downregulation miR-1228 * mahasyövän.

miR-1228 * Estää NF-KB Activity ja CK2A2 ilmentäminen SGC-7901

tutkiakseen vaikutuksen miR-1228 * on NF-KB signalointireitistä, NF-KB toimittaja rakenteet transfektoitiin joko miR-1228 * tai miR-NC vakaa transfektoidut SGC-7901-soluissa ja aktiivisuus NF-KB: n lusiferaasin määritettiin 48 tunnin kuluttua. Tuloksemme osoittivat, että aktiivisuutta NF-KB väheni merkittävästi yli-ilmentymisen miR-1228 * (Fig. 4A), joka osoittaa negatiivinen kierre välillä miR-1228 * ilmaisun ja NF-KB: n aktiivisuutta. Edelleen tunnistaa alavirtaan kohteet miR-1228 * NF-KB-reitin, suoritimme bioinformatiikan analyysi ja löysi CK2A2 oli yksi oletetun kohdegeenien jotka ennustivat. Käyttämällä Miranda ja RNA22 [23], [24], me sijaitsee yksi potentiaalinen sitoutumiskohta miR-1228 * klo 3’UTR CK2A2 (Fig. 4B). CK2A2 on yksi alayksikkö proteiinikinaasi CK2 joka on mukana NF-KB-reitin [25], [26] ja sen ilme on havaittu olevan säädelty useilla syöpiä, kuten mahasyövän [27], [28]. Lisätutkimukset järjestön välillä CK2A2 ja miR-1228 * osoitti, että proteiini tasot CK2A2 oli samanaikaisesti alassäädetty upon miR-1228 * stabiili yli-ilmentymisen SGC-7901-soluissa (kuvio. 4C). Sen tarkistamiseksi, onko CK2A2 on todellinen kohde miR-1228 *, segmentti CK2A2 3’UTR sitoutumiskohdan sisältäviä kloonattiin 3’UTR lusiferaasigeenin pMIR-SELVITYS plasmidista [29]. Fluoresoiva intensiteetti reportterigeenin pieneni merkitsevästi ryhmässä, joka oli ko-transfektoitiin pMIR-CK2A2 ja miR-1228 * kontrolliin verrattuna (Fig. 4D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-1228 * vuorovaikutuksessa CK2A2 mRNA 3’UTR.

(A) SGC-7901-miR-1228 * ja SGC-7901-miR-NC transfektoitiin NF-KB-reportteri rakentaa, vastaavasti. 48 tunnin transfektion jälkeen lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Lusiferaasiaktiivisuus normalisoida Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM, n = 3 (B) Kaavamainen kuvaaja oletetun sitoutumiskohta miR-1228 * vuonna CK2A2 ennusti Miranda. (C) Western blot-analyysi paljasti, että proteiini taso CK2A2 in miR-1228 * vakaa yli-ilmentymisen SGC-7901-soluissa merkittävästi vähenikin miR-NC. Taso GAPDH käytettiin latauskontrollina. (D) miR-1228 * vähensi merkittävästi lusiferaasin lukema kun kotransfektoitiin pMIR-CK2A2 3’UTR plasmidiin, mikä osoittaa vuorovaikutuksen miR-1228 * ja CK2A2 3’UTR tällä sivustolla. Lusiferaasiaktiivisuus normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus ilmaistaan ​​PRL-TK. Tiedot ilmaistiin keskiarvoina ± SEM, n = 3.

miR-1228 * Estää EMT

On raportoitu, että NF-KB on keskeinen rooli EMT syövän etenemisessä [30], [31], ja NF-KB: n aktiivisuutta joissain kasvainsolulinjoissa aiheutti käänteinen EMT [32]. Koska miR-1228 * näyttää säätelee negatiivisesti NF-KB: n aktiivisuutta, siksi selvitettävä, jos miR-1228 * voi myös säädellä negatiivisesti EMT mahasyövän. Western blot osoitti, että yli-ilmentyminen miR-1228 * in SGC-7901-solujen alassäädetty mesenkymaaliset markkereita (vimentiinista, β-kateniinin, Snail, Slug, ja ZEB1 /2), kun taas säädelty epiteelin merkki E-kadheriinin (Fig. 5A ). Lisäksi miR-1228 * yliekspressio aiheutti laskua solujen vaeltamiseen (kuvio. 5B-C). Immunohistokemiallinen värjäys käytettiin edelleen vahvistaa EMT-sukuiset proteiinit muutokset miR-1228 * transfektoiduissa SGC-7901 solujen ksenograftimallissa. On osoitettu, että ilmaus vimentiinista vähentynyt ja ilmentyminen E-kadheriinin kasvoi verrattuna, jotka valvonta-soluissa (kuvio. 5D). Samanlainen löydöksiä toisessa mahasyövässä solulinjaa AGS (Fig. S1). Tiedot ovat ensimmäiset todisteet siitä, että miR-1228 * palauttaminen mahasyövän säätelee negatiivisesti EMT.

(A) Western blot-analyysi epiteelin merkki (E-kadheriinin) ja mesenkymaaliset markkereita (vimentiinista, β-kateniinin, Snail , Slug, ja ZEB1 /2) in miR-1228 * vakaa transfektoitu SGC-7901-soluissa ja valvontaa. (B) TranswellTM migraatiokokeessa osoittivat, että SGC-7901-solujen stabiileja transfektoitu miR-1228 * oli alhaisemmat vaeltavia potentiaalia verrata miR-NC (x 100). (C) suhteellinen taso solumigraation esitetään keskiarvona ± SEM, joka perustuu kolmen erillisen kokeen. (D) Expression of EMT liittyviä markkereita vierassiirrekokeissa kasvain. Immunohistokemiallinen värjäys osoitti väheni vimentiinista ja lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen miR-1228 * vierassiirrettä kasvain kontrolliin verrattuna (x 400).

Keskustelu

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin pahanlaatuinen kasvain maailmanlaajuisesti ja tällä hetkellä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvää kuolleisuutta [33], [34]. Vaikka nykyinen käytäntö, jossa yhdistyvät kemoterapiaa tai sädehoitoa kirurginen resektio on huomattavasti lisääntynyt eloonjäämisaste mahasyöpäpotilaista, yleinen 5 vuoden pysyvyys on edelleen alhainen. Mahasyövän pidetään monitekijäinen ja monivaiheinen prosessi, johon liittyy aktivointi onkogeenien ja inaktivointi tuumorisuppressorigeeneille [35].

miRNA ovat endogeenisiä ei-proteiinia koodaavan lyhyen RNA: iden tärkeä rooli solun fysiologia, kehitys, ja sairauksia negatiivisesti geenin ilmentymisen säätelemiseksi. Analyysit miRNA ekspressioprofiileja ovat osoittaneet, että monet miRNA ovat poikkeavasti ilmaistaan ​​ja korreloivat kasvaimen kehittymisen, etenemisen ja ennusteen erilaisten hematologisten ja kiinteitä kasvaimia kuten mahasyövän [36]. Määrittelemään ja selventämään biologisten toimintojen miRNA vapauttamisen mahalaukun syöpä voi auttaa meitä ymmärtämään paremmin patogeneesin tätä tappavaa tautia ja aikaansaa uusia mahdollisuuksia kehittää miRNA-pohjainen hoitoja. Esimerkiksi, miR-221 ja miR-222 on osoitettu positiivisesti säännellä mahasyövän solujen lisääntymistä ja invaasiota, viittaa siihen, että valitsemalla inhibitio näiden miRNA olla hyötyä mahalaukun syövän hoitojen [37]. miRNA osansa etiologia ja patogeneesi eri syöpiä kohdentamalla useiden onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla geenejä. miR-21 yli-ilmennetään helikobakteeri-infektio mahalaukun limakalvon ja mahalaukun syövän kudoksissa. Pakotettu ilmentymä miR-21 lisää invasiivisuus mahalaukun syövän solujen, RECK on välittömänä kohteena miR-21 [38]. miR-218 estää hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden mahasyövän kohdistamalla ROBO1 reseptori [39]. Ueda ym [40] tunnistettiin 22 säädelty ja 13 alassäädetty miRNA mahasyövän vs. ei-kasvain limakalvolla, alhainen ilmentyminen let-7g ja miR-433 ja korkea ilmentyminen miR-214 liittyi epäsuotuisa lopputulos kokonaispituudeltaan selviytyminen riippumaton kliinisten covariates, mukaan lukien syvyys invaasio, imusolmukkeiden etäpesäke, ja vaihe. miR-375 on usein alassäädetty mahasyövän ja toiminta tuumorisuppressorina säädellä mahalaukun syövän solujen lisääntymistä mahdollisesti kohdistamalla JAK2 onkogeeni [10]. Meidän toinen tutkimus osoitti miR-1228 * oli yksi epiteelin syöpään liittyvien miRNA (julkaisematon). Kuitenkin vain harvat tutkimukset on miR-1228 * on raportoitu. Guled ym [41] osoitti, että miR-1228 * oli hyvin ilmaistu pahanlaatuinen mesoteliooma näytteissä verrattuna normaaliin näytteitä. Mutta biologinen tehtävä tämän miRNA ei ole vielä arvioitu. Tässä tutkimuksessa, tunnistimme että miR-1228 * oli alassäädetty yli 70% mahasyövän näytteistä verrattuna niiden nontumor kollegansa ja säätää kokeellista näyttöä, että se voi toimia tuumorisuppressorina kautta negatiivisesti säätelevä EMT ja estämällä NF -κB toimintaa.

tulokset osoittivat downregulation miR-1228 * mahasyövän kudoksissa ja mahasyövän solulinjoissa. Erilaiset molekyylitason mekanismit johtavat miRNA dysregulation, kuten geneettinen mutaatio, epigeneettiset poikkeavuus ja vapautuneilla transkriptioaktiviteettia [42]. TF: t voivat säädellä miRNA ilmentymistä sitoutumalla promoottorin alueille, joko fysiologinen tai patologinen yhteyksissä [43]. Tutkimaan, miten miR-1228 * vapautettiin mahasyövän, olemme analysoineet 2-kb promoottorialueen ylävirtaan miR-1228 * ja löysi kolmen oletetun c-Rel sitovia alueita. Vaikka NF-KB tunnetaan parhaiten sen transkription aktivoinnin toiminto, viimeaikainen työ p65, RelB ja c-Rel osoittivat, että NF-KB voi alas-säädellä geenit [17], [44], [45]. Käyttämällä miR-1228 * promoottori-reportteri-konstrukti, joka sisälsi 2 kb: n fragmentteja miR-1228 * promoottori, olemme huomanneet, että NF-KB-reitin aktivaattori TNF-α laski miR-1228 * promoottorin aktiivisuutta. Ja NF-KB estäjä PDTC huomattavan antagonisoivat TNF-α-välitteisen miR-1228 * promoottorin alhainen aktiivisuus. Tuloksemme osoittivat myös, että c-Rel pystyi sitoutuu suoraan miR-1228 * promoottori ja säätelemään negatiivisesti sen ilme. Koska c-Rel alayksikkö on jäsenenä NF-KB-perheen, NF-KB phenocopied vaikutuksia c-Rel säätelyssä miR-1228 * ilmaisua, mikä viittaa siihen, että NF-KB-reitin negatiivisesti mukana downregulation Mir-1228 * mahasyövän. Lisäksi miR-1228 * yliekspressio johti myös downregulation NF-KB: n aktiivisuutta. Siksi meidän data hahmotella kaksinkertainen negatiivinen kierre välillä NF-KB ja miR-1228 *. Tarkkaa mekanismia, miten tämä negatiivinen palaute tapahtuu joudutaan vielä tutkia.

CK2A2 on yksi alayksikkö proteiinikinaasi CK2, joka on erittäin konservoitunut ja kaikkialla läsnä proteiini seriini /treoniini-kinaasi. Yliekspressio CK2 on havaittu useita syöpiä, mukaan lukien rintarauhanen, eturauhanen, munuaisten, keuhkojen, pään ja kaulan ja vatsan [27], [46]. Yliekspressio CK2 maitorauhasten Siirtogeenisten hiirten aiheuttaa liikakasvua ja dysplasia, jotka lopulta johtavat adenokarsinooman [47]. CK2 olivat yli-ilmennetään pään ja kaulan okasolusyöpä linjat ja kudoksissa. Knockdovvn CK2 alayksiköiden differentiaalisesti estyy IκBα hajoamista, NF-KB ydinvoiman lokalisointi, fosforylaatio, DNA: ta sitova, ja toimittaja toimintaa [25]. CK2 on tärkeä rooli in Her-2 /neu signalointi, edistää IKB hajoamista ja NF-KB: n aktivaation [26]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että miR-1228 * vähensi ilmentymistä CK2A2 proteiinitasolla. Lusiferaasimääritystä kanssa reportteri, joka sisältää miR-1228 * sitova sekvenssi 3’UTR CK2A2 mRNA ehdotti, että miR-1228 * suoraan kohdistuu 3’UTR CK2A2. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että tukahduttaminen NF-KB: n aktiivisuuden miR-1228 * voi olla kohdistamalla CK2A2 ilme. EMT on nyt kaikki tiedetään esiintyvän erilaisia ​​sairauksia, mukaan lukien etenemistä syöpä. On tunnustettu, että EMT on tärkeä prosessi muodostaa hajanainen histologian ja aloittaa etäpesäke tehostamalla liikkuvuutta syöpäsoluja [48]. EMT säätelevät eri onkogeeninen signalointireitteihin kuten AKT: n ja NF-KB [49], [50]. Erityisesti, NF-KB: n on osoitettu edistävän EMT, kun NF-KB: n aktiivisuuden mesenkyymisolun aiheuttaa käänteinen EMT [30]. Menetys E-kadheriinin ilmentymisen ja voitto vimentiinista ilmaisun pidetään tärkeimpänä molekyylimarkkereiden EMT [51].