Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ei- pieni- keuhkosyöpä (NSCLC) on yksi johtavista syistä syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Paklitakseli perustuvat yhdistelmähoidot on pitkään käytetty tavallisena käsittely aggressiivinen NSCLCs. Mutta paklitakseli vastus on tullut merkittävä kliininen ongelma torjunnassa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja autophagy on yksi tärkeä mekanismeja tämän ilmiön. Tässä tutkimuksessa käytimme microRNA (miRNA) paneelit seuloa ilmentyvät eri miRNA paklitakselin herkkien keuhkosyövän soluja A549 ja sen paklitakseli-resistenttejä solu- variantti (A549-T24). Havaitsimme miR-17-5p oli yksi voimakkaimmin vaimentua miRNA paklitakselin kestävä keuhkosyöpään solujen verrattuna paklitakseliin herkkä vanhempien soluja. Olemme havainneet, että yli-ilmentyminen miR-17-5p herkistyneet paklitakselin resistenttien keuhkosyöpäsoluissa paklitakselille indusoi apoptoottista solukuolemaa. Lisäksi Tässä raportissa osoitettiin, että miR-17-5p sitoutuu suoraan 3′-UTR beclin 1-geenin, joka on yksi tärkeimmistä autophagy modulaattori. Yli-ilmentymisen miR-17-5p osaksi paklitakselin resistenttien keuhkosyöpäsoluissa pienentää beclin1 ilmaisun ja yhdenmukaisten kuolee solujen autophagy. Havaitsimme myös samankaltaisia ​​tuloksia toisessa paklitakselin kestävä keuhkojen adenosquamous noomasoluja (H596-TXR). Tuloksemme osoittivat, että paklitakselin vastus keuhkosyöpään liittyy downregulation miR-17-5p ilme mikä saattaa aiheuttaa voimistumista BECN1 ilmaisun.

Citation: Chatterjee A, Chattopadhyay D, Chakrabarti G (2014) miR-17 -5p alassäätely edistää paklitakselin Resistance keuhkosyöpään solujen kautta muuttamalla Beclin1 Expression. PLoS ONE 9 (4): e95716. doi: 10,1371 /journal.pone.0095716

Editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Ranska

vastaanotettu: 02 joulukuu 2013; Hyväksytty: 29 maaliskuu 2014; Julkaistu: 22 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Chatterjee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat avustusta Department of Biotechnology, Govt. Intian (nro BT /PR12889 /AGR /36/624/2009) GC. AC tukivat apurahan samasta apurahan, ja tämän jälkeen apurahan alkaen DST- PURSE ohjelmasta, University of Kalkutassa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia ja yksi johtavista syövän syiden liittyvien kuolemien tässä maailmassa. Lähes 85% keuhkosyöpää kuuluvat muille kuin pienille keuhkosyöpä (NSCLC) [1]. Paklitakseli perustuva yhdistelmä solunsalpaajahoitojen nyt pidetty vakiona hoitoja lähes kaikilla potilailla on diagnosoitu NSCLC [2]. Paklitakseli sitoutuu β- alayksikköä α- β tubuliinin heterodimeeri, stabiloi mikrotubulusten, vähentää sen dynaamisuuden vuonna sukkularihmaston, aiheuttaa G

2 /M solusyklin pysähtymiseen ja ajaa syöpäsolujen apoptoottisen kuoleman, aktivoimalla spindle- mitoottisiin check kohta [3]. Valitettavasti kliininen affectivity Paklitakselin on rajallista, koska jotkut kasvaimet vastustuskykyisiä tai tulevat vastustuskykyisiksi sen jälkeen toistuvien Paklitakselin kemoterapian mikä lopulta johtaa taudin uusiutumiseen ja huonoon ennusteeseen. Kaikkein raportoitu mekanismit paklitakselin kestävyys liittyy ylössäätely P-glykoproteiinin ja siihen liittyvät huumeiden effluksipumppujen [4], [5], riittämätön vuorovaikutus kara mikrotubulusten takia posttranslational muuttaminen tai muuttunut ilmentyminen tubuliinin isotyyppien ja mikrotubuluksiin liittyneet proteiinit [6] – [8] tai toiminnallisen muutoksen solun signalointiin ja solujen selviytymisreittien, [9] – [12]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että autophagic induktiota paklitakseli on merkittävä rooli kehityksessä paklitakselin resistenssin kasvainsoluissa [13] – [15].

MikroRNA, erittäin konservoitunut perheen pieniä, ei- koodaavat RNA: t, jotka äskettäin tullut uusi luokka geenin ilmentymisen modulaattorit at posttranskriptionaalisella tasolla [16] – [18]. Tämä tapahtuu kautta täydellinen tai epätäydellinen emäspariutumisessa klo miRNA tunnustamista elementit (MRE) sisällä 3’alue (UTR) kohde- mRNA: iden, jolloin mRNA epävakautta ja translaation tukahduttaminen [16], [19], [20]. Poikkeava miRNA ilmentyminen on usein havaittu erilaisissa ihmisen syövissä, mukaan lukien NSCLC [21], [22]. Viime vuosina on yritetty korreloida dysregulation erityisen miRNA ilmaisutapoja kasvain vastata chemotherapies, kuten paklitakseli [13], [23] – [26].

Tässä tutkimuksessa olimme kiinnostuneita tutkimaan rooli miRNA kehittämisessä paklitakselin resistenssin keuhkosyöpään liittyvien solujen autophagy. Suoritimme miRNA paneelit seulomiseksi ilmentyvät eri miRNA välillä paclitaxel- herkkä (A549) ja paclitaxel- resistenttejä keuhkosyövän soluja (A549-T24). Havaitsimme, että miR-17-5p säädeltiin vähentävästi paklitakselin resistenttien keuhkosyövän soluja (A549-T24 ja H596-TXR) ja sen yli-ilmentymisen edistämiseen paklitakselin aiheuttama sytotoksisuuden ja apoptoosin. Lisäksi meidän tiedot osoittivat, ettei beclin1, yksi tärkeimmistä säätelijöitä solun autophagy, oli välittömänä kohteena miR-17-5p keuhkojen syöpäsoluja.

Yhdessä kaikki nämä löydökset päättelimme, että miR-17 -5p ollut keskeinen rooli kehitettäessä paklitakselin resistenssin säätelemällä solujen autophagy. Tukahduttamista ilmentymisen miR-17-5p liittyi ylössäätelyyn beclin1 ilmaisun ja yhdenmukaisten autophagy jotka häntä cyto-suojaava rooli ja suojasi soluja paklitakselista aiheuttaman apoptoosin ja solukuoleman.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

ravinneseos Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (johon oli lisätty 1 mM L-glutamiinia), naudan sikiön seerumia, penisilliiniä-streptomysiiniä, amfoterisiini B: tä ja 0,25% trypsiini-EDTA: ta GIBCO (Invitrogen) . Paklitakseli ostettiin Sigma, USA. AnneksiiniV-FITC apoptoosin pakki oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). JC-1 ja H2-DCFDA hankittiin Sigmalta, USA. Bradford proteiinin arviointi pakki ostettiin genei, Intia. Kaikki muut kemikaalit ja reagenssit olivat analyysilaatua ja ostettiin Sisco Research Laboratories, Intia.

Cell Line ja Cell Culture

Ihmisen ei-pieni keuhkoepiteelisolujen Adenokarsinoomasolulinja tyypin II, A549, saatiin solusta varasto National Center for Cell Science (NCC), Pune, Intia. Ihmisen keuhkojen adenosquamous karsinoomasolulinja NCI-H596 saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Molemmat solut tyypillistä mt-rDNA sekvensointi lajien tunnistamiseen, lyhyt tandem repeat profilointia ja -isoentsyymi analyysi solulinjaa todennus ja varmistettiin olevan negatiivinen mykoplasmakontaminaation arkiston toimesta. Sekä A549 ja H596-soluja valittiin vastustuskyky paklitakseli (Sigma, USA) vaiheittain oleellisesti, kuten on kuvattu [27], [28]. Lyhyesti, A549-solut alun perin altistettiin 2 nM paklitakselia ja jälleen normaali kasvu saatiin aikaan lääkeaineen annos lisääntyi kahden kerrannaisia, kunnes lopullinen konsentraatio 24 nM paklitakselia (A549-T24) oli saavutettu. NCI-H596-soluissa, jotka olivat hieman suvaitsevainen paklitakselille, oli ensimmäinen altistuvat 5 nM paklitakselia ja pidetään tässä pitoisuus ennen normaalia kasvua saavutettiin. Sen jälkeen lääkeannos on tehostettu kertoimien kolmen kunnes lopullinen annos 15 nM paklitakselin (H596-TXR) saavutettiin. Sekä soluja ylläpidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), johon oli lisätty 1 mM L-glutamiinia, 10% kuolemaan johtavia naudan seerumia, 3,7 g /L NaHCO

3, 100 ug /ml: lla sekä penisilliiniä ja streptomysiiniä ja 2,5 ug /ml amfoterisiini B. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Soluja kasvatettiin Jopa 70-80% konfluenssiin kudosviljelmäpulloissa, niin trypsinoitiin 0,25% trypsiini-EDTA ja jakaa myöhemmin soluviljelylevyille tarpeen.

miRNA Micro Array Expression Analysis

miRNA profilointi A549 ja A549-T24-soluissa tehtiin peräisin Exiqon (Vedbaek, Tanska). Kokonais-RNA lukien miRNA eristettiin A549 ja A549-T24-soluissa käyttäen Qiagen miRNeasy mini kit seuraten valmistajan protokollaa. Kokonais-RNA näytteitä, joilla riittävän laadukkaita analyysiä miRCURY LNA miRNA mikrosirujen alustalla leimattiin käyttäen miRCURY LNA microRNA Hi-Power Labelling Kit, Hy3 /Hy5 ja paria näytettä hybridisoitiin sen miRCURY LNA microRNA Array (kuudes gen – HSA, mmu RNO) ja array luettiin Agilent G2505B Micro array skanneri järjestelmän otsonin ympäristössä. Vain ne miRNA jotka väärin säädellystä ainakin kaksinkertaiseksi (ΔLMR ≥2) otettiin huomioon.

Pre- miRNA Transfektio

Mirvana miRNA 17 matkivat esiasteita (pre-miR-17-5p ) ja Mirvana miRNA matkivat negatiivinen kontrolli # 1 (pre-miR-negatiivinen kontrolli) hankittiin Ambion. Pre-miRNA transfektoitiin solulinjoissa -50% konfluentteja 100 nM konsentraatio Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) transfektioreagenssia. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, ilmaus miR-17-5p havaittiin reaaliaikaisella PCR: llä ja ilmentyminen BECN1 testattiin qRT-PCR: llä ja /tai Western-blottauksella.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) B

miRNA ilmentymisen analyysi, qRT-PCR tehtiin käyttäen TaqMan microRNA käänteistranskriptio kit (Applied Biosystems) ja TaqMan microRNA määritykset kit (Applied Biosystems) seuraten valmistajan protokollia. U6 snRNA toimi sisäisenä kontrollina.

ekspression analysoimiseksi BECN1, Bax, Bcl-2, LC3-II ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) ja kaspaasi-3 (taulukko 1), cDNA syntetisoitiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä SuperScript Vilo cDNA Synthesis kit (Invitrogen). CDNA sekoitettiin 2 x dynamo ColorFlash SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific) ja eri sarjaa geenin-spesifisiä alukkeita ja sen jälkeen niille qRT-PCR määrän käyttäen StepOne- Plus reaaliaikainen PCR-järjestelmää (Applied Biosystems). Geenien ilmentyminen laskettiin suhteessa GAPDH (ja BECN1, Bcl-2, Bax, LC3-II, kaspaasi-3 jne) tai U6 snRNA (MIR-17-5p) käyttäen vertailevaa syklin aika (Ct) menetelmä (2

-ΔΔCt menetelmä) [29], [30].

Cell Proliferation Inhibitiomääritvs (MTT-määritys) B

A549-T24 ja H596-TXR soluja, joko transfektoitu 100 nM pre-miR-17-5p (T24-miR-17-5p ja TXR-miR-17-5p vastaavasti) tai 100 nM valmiiksi miR-negatiivinen kontrolli-RNA (T24-miR-NC ja TXR-miR-NC vastaavasti) maljattiin 96-kuoppaisille viljelylevyille (1 x 10

4 solua per kuoppa). 24 tunnin inkuboinnin jälkeen väliaine korvattiin tuoreella väliaineella, ja soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla paklitakselin vielä 24 tuntia. MTT (5 mg /ml) liuotettiin PBS: ään ja steriloitiin suodattamalla, ja sitten 20 ui valmistettua liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Tätä inkuboitiin kunnes violetti saostuma oli nähtävissä. Sen jälkeen 100 ui Triton-X100, lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboidaan pimeässä 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Absorbanssi mitattiin ELISA-lukijalla (MultiskanEX, Lab järjestelmät, Helsinki, Suomi), jonka testi aallonpituudella 570 nm ja viite aallonpituudella 650 nm. Tiedot laskettiin inhibitioprosentti seuraavan kaavan mukaan: (1) B

t ja A

s osoitti absorbanssi testiaineiden ja liuotin ohjaus, vastaavasti [31].

trypaanisinieksluusiolla määritys elinkykyyn

trypaanisiniekskluusiolla määritys [32] käytettiin määrittämään lukumäärän elinkelpoisten ja kuolleiden solujen ennalta miR-17-5p transfektio ja myöhemmät paklitakselihoidolla. Lyhyesti, T24-miR-17-5p tai T24-miR-NC-solut maljattiin 6-kuoppaisille viljelylevyille (5 x 10

4 solua per kuoppa). Sitten soluja käsiteltiin 24 nM ja 50 nM paklitakselin vielä 24 tuntia. 24 h kuluttua solut kerättiin läpi trypsinoimalla, pestiin kaksi kertaa 1X PBS: llä ja sitten värjättiin 0,4% trypaanisinisellä PBS: ssä. Sitten soluja valmistettiin analyysiä varten virtaussytometrillä.

rakentaminen Luciferase Reporter konstruktiot ja Luciferase Activity Assay

3′-UTR-lusiferaasireportteri konstrukteja, jotka sisältävät 3′-UTR on BECN1 kanssa tai ilman miR -17-5p sitoutumiskohta amplifioitiin PCR-menetelmällä yhteensä cDNA valmistettiin totaali-RNA saatiin A549-T24-soluissa. PCR-tuotteet kloonattiin

pCI-neo-RL-luc

reportterin vektori (A antelias lahja tri SN Bhattacharyya, IICB, Kolkata, Intia.) Välillä

Xba

I ja

Ei

I restriktiokohdat, heti alavirtaan Renilla lusiferaasigeenin. Kaikki lusiferaasi konstruktit sekvenssi varmistettiin. Solut ohimenevästi yhteisrahoitettuja transfektoitu Renilla lusiferaasireportterista plasmideja (

pCI-neo-RL-Bec-3

’

UTR-wt

tai

pCI-neo-RL-Bec-3

”

UTR-mut

), tulikärpäsen lusiferaasi-plasmidia (

pGL3-FF

) ja pre-miR-17-5p edeltäjä ja /tai anti-miR-17-5p tai pre -miR-negatiivinen kontrolli esiaste-RNA Iipofectamine2000 transfektioreagenssia seuraavat valmistajan protokollaa. 48 tunnin kuluttua transfektion jälkeen solut otettiin talteen ja hajotettiin passiivisia hajotuspuskuria (Promega). Lusiferaasiaktiivisuudet solu-uutteet määritettiin käyttäen Promega dual lusiferaasireportterista iinianalyysikitissä on VICTOR X3 Plate Reader järjestelmä (PerkinElmer). Suhteellinen Lusiferaasiaktiivisuudet laskettu suhde Renilla luc /Firefly luc aktiivisuutta ja normalisoitu ohjaus- solujen ja taita tukahduttamisen laskettiin. pGL3-FF vektoria käytettiin sisäisen valvonnan.

Detection of Happamat vesikulääristä soluelimiin (Avós) B

tarkkailla väheneminen Avós muodostumiseen, T24-miR-17-5p ja T24-miR -NC solut ympättiin peitinlaseja. 48 tunnin kuluttua transfektion jälkeen solut värjättiin akridiinioranssilla (AO) (1 ug /ml) 37 ° C: ssa pimeässä 15 minuutin ajan, pestiin sitten kahdesti PBS: llä. Kuvia AO värjäystä visualisoitiin heti käyttäen fluoresenssimikroskooppia (OLYMPUS IX70, Japani). Sytoplasmassa ja tumassa värjättyjen solujen fluoresoi kirkkaan vihreä, kun taas hapan autophagic onteloita fluoresoi kirkkaan punainen. Samanlaisia ​​kokeita suoritettiin myös A549-solut.

määrällisesti muutoksen määrän happamia rakkulat (Avos) A549-, T24-miR-NC ja T24-miR-17-5p soluja, ne värjättiin AO (1 ug /ml) PBS: ssä 37 ° C: ssa 15 min, solut kerättiin, pestiin kahdesti PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan PBS: ää ja analysoitiin sitten välittömästi virtaussytometrialla määrityksessä. Virtaussytometrianalyysissä Aineisto analysoitiin CellQuest analyysin ohjelmisto (Becton Dickinson) [33].

merkintä Autophagic Vakuolien kanssa Monodansylcadaverine

A549-T24-soluja transfektoitiin joko ennalta miR-17- 5p (100 nM) tai ennalta asennuspalveli- negatiivinen kontrolli-RNA (100 nM), kylvetään coverslip ja pidettiin toiset 48 tuntia. Soluja inkuboitiin 50 uM monodansylcadaverine 10 min ajan 37 ° C: ssa PBS: ssä, ja kuvat on otettu mukaan fluoresenssimikroskooppia (OLYMPUS IX70, Japani). Lisäksi kvantitatiivista analyysia autophagosome muodostumisen samat näytteet trypsinoitiin ja analysoitiin virtaussytometrillä määritys [34].

virtaussytometrianalyysin varten apoptoottiset solut

T24-miR-NC ja T24-asennuspalveli- 17-5p soluja käsiteltiin 24 nM ja 50 nM paklitakselin 24 tuntia. Noin 1 x 10

5-solut värjättiin sitten 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä FITC-konjugoidulla anneksiiniV (1 ug /ml) ja propidiumjodidia (PI) (0,5 ug /ml) Ca

2 + suhteen väkevöityä sidospuskuri ja analysoitiin kahden värin virtaussytometria-analyysiä. AnneksiiniV ja PI päästöjen havaittiin FL1 ja FL2 kanavien FACSCalibur-virtaussytometrillä (Becton-Dickinson, USA), vastaavasti [31]. Aineisto analysoitiin käyttämällä CellQuest- ohjelma Becton-Dickinson.

määritys mitokondrion kalvon Potential (ΔΨ) B

arvioimiseksi mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨ), 5,5 ’, 6,6 ”-tetrakloori-1,1 ’, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodidi (JC-1), joka on herkkä fluoresoiva koetin ΔΨ käytettiin [35]. T24-miR-NC ja T24-miR-17-5p solut käsiteltiin 24 nM ja 50 nM paklitakselia 24 tuntia. Sitten solut otettiin talteen, pestiin kahdesti PBS: llä, värjättiin 5 uM JC-1 30 min ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Solut huuhdeltiin PBS: lla kahdesti, resuspendoitiin 500 ui PBS: ää ja heti arvioitiin punaisen fluoresenssin (JC-1), jossa FACSCalibur-virtaussytometrillä (Becton-Dickinson, USA).

mittaus reaktiivisia happiradikaaleja (ROS)

ROS-tasot määritettiin käyttämällä fluoresoivan markkerin 2 ’, 7’- dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (DCFH-DA) [36]. Lyhyesti, T24-miR-NC ja T24-miR-17-5p solut käsiteltiin 24 nM ja 50 nM paklitakselia 24 tuntia. Solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 10 mM DCFH-DA 30 minuuttia pimeässä huoneenlämmössä ja siirtyminen vihreä fluoresenssin intensiteettiä, kuten havaitaan FL1-kanava, seurasi FACSCalibur -virtaussytometrissä (Becton-Dickinson, USA) ja tiedot analysoitiin CellQuest analyysin ohjelmisto (Becton-Dickinson, USA).

tilastollinen analyysi

qRT-PCR-reaktiot suoritettiin kolminkertaisina kunkin näytteen ja toistetaan vähintään 3 kertaa ja tiedot analysoitiin tilastollisesti Studentin ”t-testiä tai Wilcoxonin summa testi. IC

50 dataa MTT-määritystä analysoitiin Wilcoxonin summa testi. Kaikki tiedot näytettiin keinona ± S.E. (Standard error). Kaksi mittausta olivat tilastollisesti merkitseviä, jos vastaava p-arvo oli 0,05.

Tulokset

Profiilit miRNA vuonna Paclitaxel- herkkä ja kestävä Lung Cancer Cells

valmis paclitaxel- kestävä keuhkojen ei-pieni syöpäsolu (A549-T24) paklitakselista herkkien solujen jatkuva altistuminen A549-solut paklitakselille (Fig. S1A). Etsimään kriittisen miRNA mukana kehittämässä paklitakselin resistenssin, kokonais-RNA, uutettu keuhkosyövän soluista (A549) ja niiden paklitakseli variantin (A549-T24), lähetettiin Exiqon, Tanskan miRNA array profilointia. Vuodesta array Tuloksista havaittiin, että 23 miRNA oli differentiaalisesti ilmaistut A549-T24-soluissa kuin A549-solut (Fig. 1).

miRNA joukko profiilit paklitakselin herkkien (C1 ja C2) ja resistenttejä (Tx1 ja Tx2 ) keuhkosyövän solulinjat osoitettiin. Ohjattu hierarkkinen klusterointi solulinjojen perustuu niiden ero miRNA ilmaisun kanssa ΔLMR≥2 näiden kahden ryhmän välillä oli näytteillä. Jokainen pylväs edustaa solulinjassa ja kukin rivi koetin asetettu. Lämpö kartta osoittaa korkea (punainen) tai matala (sininen) ilmentymistaso suhteessa keskiarvoon kohti asteikon kuvassa.

Tunnistaa kohdegeenien näiden differentiaalisesti ilmaisi miRNA, me etsinyt miRNA tavoite ennustus tietokantoja miRBase, microRNA.org ja TargetScanHuman 6.2 ja tunnistimme miR-17-5p voisi ehkä olla rooli autophagy kohdentamalla autophagy liittyvä proteiini beclin 1 (BECN1) sitoutumalla suoraan sen 3 ’UTR alue välillä asemassa 135 on 141. on jo todettu, että induktio autophagy mukaan paklitakselihoidolla on merkittävä rooli kehityksessä paklitakselin resistenssin tuumorisoluissa säätelyä BECN1 [13] – [15]. Havaitsimme tehostettuun autophagy kuten osoitetaan säätelyä BECN1 ja lisääntynyt LC3-I LC3-II muuntaminen ja downregulation p62 ilmentymistä A549-T24-soluissa verrattuna A549-solut (Fig. 2A). Olemme myös mitattuna suhteessa mRNA tasoilla BECN1 ja LC3-II (Fig. 2B ja 2C) ja löysivät nämä mRNA: t olivat yläreguloituja A549-T24-soluissa verrattuna A549-soluja. Laajentaa havainto valmistimme toinen paklitakselia kestävä keuhkosyövän solulinjaa H596-TXR paklitakselista herkkien NCI- H596-solujen

in vitro

(Fig. S1B) ja tutkittiin tilan BECN1 ja LC3 tässä resistenttejä keuhkosyöpäsolua line (H596-TXR). Löysimme samanlainen säätelyä BECN1 ja lisääntynyt LC3-I LC3-II muuntaminen paklitakselin resistenttejä H596-solut (H596-TXR) verrattuna vanhempien H596-soluissa (kuvio. S2A). Lisäksi analyysi suhteellisten mRNA tasojen BECN1 ja LC3-II (Fig. S2B ja Fig. S2C) vahvisti merkittävien säätelyä solujen autophagy in H596-TXR solujen verrattuna H596 soluihin.

(A) Expression tila tiettyjen autophagic markkeriproteiinien BECN1, MAP-LC3, P62 ja GAPDH (latauskontrollina) mitattiin Western-blottauksella. (B-C) Suhteellinen BECN1 ja LC3-II-mRNA: n ekspressiotasot kvantifioitiin qRT-PCR-analyysi A549 ja A549-T24-soluja,

baareja

edustavat keskiarvoa ± S.E. (

*

p 0,03 vs kontrolli, jossa n = 3) (D) alassäätely miR-17-5p ilmentymistä paklitakselin resistenttien keuhkosyövän soluja (A549-T24), kun A549-soluihin. Taqman qRT-PCR suoritettiin havaitsemaan suhteellisten tasojen miR-17-5p A549 ja A549-T24-soluissa. Tulokset normalisoitiin snU6 ekspressiotason ja esitetty keskiarvona ± keskivirhe kolmesta itsenäisestä rinnakkaista.

(** p 0,001

vs kontrolli, n = 3).

miRNA-17-5p on vaimentua in Paclitaxel- Kestää keuhkosyöpäsoluissa

edelleen validoitu array tiedot miR-17-5p by Taqman qRT-PCR. Käyttämällä Taqman probe- perustuu qRT- PCR vertasimme ilmentymistason miR-17-5p paklitakselin herkkiä tai resistenttejä A549-soluja. Kuva. 2D esittää ~7.2 kertaiseksi downregulation suhteellisen miR-17-5p ekspressiotaso A549-T24-soluissa verrattuna A549-soluja, validointi mikro-array tuloksia. Olemme myös arvioitu ilmentymistason miR-17-5p in H596-TXR solujen ja sitä verrattiin että H596-soluja. Olemme havainneet, että H596-TXR solut osoittivat lähes ~2.62 kertainen downregulation suhteellisen miR-17-5p ilmentymisen verrattuna paklitakseli herkkien H596-solut (Fig. S2D), joka osoittaa assosiaatio miR-17-5p ja paklitakselin vastus ei ole solulinjassa erityisiä .

Herkkyys paklitakseli moduloidaan yliekspressio miR-17-5p

in vitro

sen tutkimiseksi, miR-17-5p yli-ilmentymisen herkistyneet A549-T24-soluissa paklitakseliin meidän transfektoidut A549-T24-soluissa 100 nM valmiiksi miR-17-5p (T24-miR-17-5p) tai 100 nM ennalta asennuspalveli- negatiivinen kontrolli-RNA (T24-miR-NC) ja 24 h transfektion solut käsiteltiin eri annoksilla paklitakselin (0-200 nM). Havaittiin, että verrattuna negatiiviseen kontrolliin (T24-miR-NC), yliekspressio miR-17-5p merkittävästi herkisti A549- T24 soluja paklitakselille (Fig. 3A,

p 0,05

ja

p 0,03

). Esimerkiksi, T24-miR-17-5p soluissa osoitti lähes 86%, 51%, 31% ja 6% solujen elinkyky, kun soluja käsiteltiin 12 nM, 50 nM, 100 nM ja 200 nM paklitakselin 24 tuntia vastaavasti. Samanlaisissa olosuhteissa T24-miR-NC-solut osoittivat lähes 99%, 89%, 78% ja 58% elinkelpoisuus. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun overexpresed 100 nM pre-miR-17-5p osaksi H596-TXR soluja (TXR-miR-17-5p) ja käsiteltiin soluja, joilla on samankaltaisia ​​paklitakseliannoksilla (0-200 nM) 24 tuntia. Havaittiin, että verrattuna negatiiviseen kontrolliin (TXR-miR-NC), TXR-miR-17-5p solut osoittivat paljon pienempi solujen elinkyky, kun niitä käsitellään kasvavilla pitoisuuksilla paklitakseli. Täydelliset annos-vaste-käyrät esitetään kuviossa. S3A.

(A) A549-T24-soluja joko transfektoitu 100 nM valmiiksi miR-negatiivinen kontrolli (T24-miR-NC) tai pre-miR-17-5p (T24-miR-17-5p ) prekursori-RNA, ja ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 1 x 10

4 solua kuoppaa kohti. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin 0, 12, 24, 50, 100, 200 nM paklitakseli vielä 24 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. Tulokset on esitetty% solun elinkykyisyyden mitattu soluissa, joita käsiteltiin paklitakselia.

Sarakkeet

, tarkoittaa kolmen riippumattoman kokeen;

baareja

, keskiarvo ± S.E. (* P 0,05 vs negatiivinen kontrolli, p 0,03 vs A549-ohjaus, jossa n = 4). (B-C) Soluja (T24-miR-NC ja T24-miR-17-5p) käsiteltiin seuraavaksi 24 nM ja 50 nM paklitakselin 24 tuntia ja tehdään FACS-analyysi sen jälkeen, kun on värjätty trypaanisini. Histogrammi edustaa Red fluoresenssin intensiteetti (FL3-H) vs. laskee juoni jossa annosriippuvaisen kasvua solukuoleman tapahtuu. Tulokset edustavat parasta kerättyjen tietojen kolmen kokeen tulokset olivat samanlaiset.

Tämä menetys solujen elinkelpoisuuden miR-17-5p yli-ilmentymisen ja sen jälkeen Paklitakselihoidon tutkittiin lisäksi trypaanisinivärin syrjäytymisen määrityksessä, jossa käytettiin -virtaussytometrissä (Fig. 3B ja 3C,

p 0,01

) A549-T24-soluissa. Elävät solut hallussaan ehjät solukalvojen poissulkevia trypaanisinistä kuitenkaan kuolleet solut eivät ja lopulta viedä trypansininen. Kuva. 3B ja 3C esittää, että miR-17-5p yli-ilmentymisen ja sen jälkeen paklitakselihoidolla (24 ja 50 nM) 24 h, jäljellä solujen elinkelpoisuus T24-miR-17-5p solujen vähentynyt verrattuna vastaaviin negatiivisiin kontrolleihin. Esimerkiksi, kun taas miR-17-5p yli-ilmentymisen ja seuraava käsittely 24 nM ja 50 nM paklitakselin 24 tuntia aiheutti lähes 25% ja 46% solukuolema, joka vastaa negatiivisia kontrolleja osoitti vain 4% ja 6% solukuoleman, vastaavasti. Nämä tulokset osoittivat, että miR-17-5p yliekspressio on avainasemassa herkistettäessä paklitakseli kestävä A549-T24-soluissa paklitakselille.

Beclin 1 on välittömänä kohteena miR-17-5p in Lung Cancer Cells

sen määrittämiseksi, onko miR-17-5p sitoutuu suoraan 3′-UTR-alueen BECN1 mRNA, rakensimme 3′-UTR toimittajille ja BECN1 sisältävät otaksutun miR-17-5p sitoutumiskohdan ja vastaavat mutantti konstrukti, josta puuttuu asennuspalveli- 17-5p sitoutumiskohdan, alavirtaan lusiferaasireportterigeenin (Fig. 4A). Kotransfektion ennalta miR-17-5p kanssa BECN1 villityypin reportterikonstruktio A549-T24-soluissa merkittävästi tukahdutettu Renilla lusiferaasiaktiivisuutta (Fig. 4B), kun taas kotransfektion mutantti reportterikonstruktio ei ollut merkittävää muutosta suhteellisessa lusiferaasiaktiivisuuteen kanssa, ohjaus (Fig. 4B). Lisäksi, kun A549-T24-soluja samanaikaisesti transfektoitiin anti-miR-17-5p (100 nM) ja 3′-UTR-toimittajille ja BECN1, kanssa tai ilman oletetun miR-17-5p sitoutumiskohdan, ei merkittävä lasku suhteessa lusiferaasiaktiivisuuden havaittiin (Fig. 4B). Nämä tulokset yhdessä vahvistivat, että BECN1 oli välittömänä kohteena miR-17-5p keuhkojen syöpäsoluja.

(A) Kaavamainen esitys 3′-UTR ihmisen BECN1 transkriptin. Ennakoitu miR-17-5p sitoutumiskohta kuvattiin. Numerot (+ 135-141) edustivat nukleotidit, jotka ennustettiin emäsparin kanssa miR-17-5p siemen järjestyksessä. (B) miR-17-5p sitoutuu suoraan 3 ’UTR: BECN1 geenin A549-T24-soluissa. A549-T24-soluja yhteisrahoitettuja transfektoitu Renilla lusiferaasireportterista plasmideja (

pCI-neo-RL-Bec-3

’

UTR-wt

tai

pCI-neo-RL-Bec -3

”

UTR-mut

), tulikärpäsen lusiferaasi plasmidit (pGL3-FF) ja pre-miR-17-5p esiaste tai anti-miR-17-5p tai ennalta miR-negatiivinen kontrolli esiaste RNA: sta käyttäen Iipofectamine2000 transfektioreagenssia. 48 tunnin kuluttua solut kerättiin ja lyysattiin passiivista hajotuspuskuria. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttäen Promega dual lusiferaasireportterigeenin määritys kit. Tulokset olivat edustettuina suhteellinen kertaiseksi tukahduttamisen (Renillaa luc /Firefly luc aktiivisuutta) verrattuna hallita soluihin. (* P 0,05, ** p 0,03 vs. kontrolli, n = 4).

yli-ilmentyminen miR-17-5p in Paclitaxel Kestää keuhkosyöpäsoluissa Johtaa Beclin 1 alassäätely

kokeellisesti vahvistaa tavoite ennustus, arvioimme proteiinin tasot BECN1 seuraavista miR-17-5p yliekspressio molempiin A549-T24 ja H596-TXR soluissa. Kuva. 5A osoittaa, yliekspressio miR-17-5p laski merkittävästi BECN1 ilmentymistä verrattuna negatiiviseen kontrolliin (T24-luki- NC). Tämä vahvistettiin lisäksi arvioinnissa mRNA tasojen BECN1 by qRT-PCR. Löysimme, miR-17-5p yliekspressio alennettu BECN1 mRNA tasolla ~5.6 kertaiseksi (

p 0,01

) A549-T24-soluissa verrattuna negatiiviseen kontrolliin. Testasimme ekspressiotasot kahden muun autophagic markkereita, LC3-II ja p62, jotka ovat alavirtaan BECN1 Western-blottauksella. Yli-ilmentymisen miR-17-5p A549-T24-soluissa vähensi konversio LC3-I LC3-II (Fig. 5A, toinen blot ja Fig. 5C) ja kohonnut taso p62 (Fig. 5A, kolmas blot). Siinä tapauksessa, että H596-TXR soluissa, olemme myös havainneet, että yli-ilmentyminen miR-17-5p johti yhtäpitävät downregulation of BECN1 ja LC3-II H596-TXR solut (Fig. S3B-D). Kaikki nämä tiedot yhdessä osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-17-5p osaksi paklitakselin resistenttien keuhkosyöpään solujen aiheuttama väheneminen solujen autophagy suoraan kohdentamalla autophagy liittyvää proteiinia BECN1.

(A) A549-T24-soluja transfektoitiin joko 100 nM valmiiksi miR-negatiivinen kontrolli (T24-miR-NC) tai pre-miR-17-5p (T24-miR-17-5p) esiaste-RNA. 24 tunnin kuluttua, solujen lysaatit valmistettiin Western-blottauksella vasta-ainetta vastaan ​​BECN1, MAP-LC3, p62 ja GAPDH: ta käytettiin loading ohjaus. (B-C) Suhteellinen BECN1 ja LC3-II-mRNA: n ekspressiotasot kvantifioitiin qRT-PCR-analyysi in T24-miR-NC ja T24-miR-17-5p soluja,

baareja

edustavat keskiarvoa ± S.E. kolmesta itsenäisestä kokeesta (** p 0,01 vs. kontrolli, jossa n = 3).

yli-ilmentyminen miR-17-5p Estää Autophagy in Paklitakseli Kestää A549-T24 Cells

paklitakseli indusoi autophagy syöpäsoluissa [13] – [15]. Syöpäsolut käyttävät tätä cytoprotective autophagy puolustuksena alkaen apoptoottista solukuolemaa mikä puolestaan ​​edistää kehitystä paklitakselin resistenssin. Aikana authophagy, autophagosomes fuusioituvat lysosomeihin muodostamiseksi autophagolysosomes, jotka ovat happamia onteloita (AVO), jotka sitoutuvat akridiini-oranssia antaa punaisen fluoresenssin ja voidaan helposti arvioida fluoresenssimikroskopialla ja virtaussytometria. Kuva. 6A-B osoitti, kun paklitakselia herkällä A549-solut osoittivat lähes mitään punaista rakkulat (Fig. 6A), suuri määrä punaisia ​​fluoresoivia rakkulat havaittiin sytoplasmassa T24-miR-NC-solut (Fig. 6B). Kuitenkin, kun A549-T24-solut transfektoitiin miR-17-5p (T24-miR-17-5p solut), ulkonäkö punainen AVO: n vähentynyt huomattavasti (Fig. 6C). Nämä tulokset vahvistivat virtaussytometrianalyysillä (Fig. 6D-G). Havaitsimme, että T24-miR-NC-solut osoittivat korkeampaa autophagic vuon verrattuna A549-solut (Fig. 6D verrattuna kuvioon. 6E). Kuitenkin, kun A549-T24-soluja yli-ilmentynyt kanssa miR-17-5p, muodostuminen AVO n vähensi merkittävästi verrattuna T24-miR-NC-soluissa (kuvio. 6F verrattuna kuvioon. 6E). Kuva. 6G esitetään määrällinen esitys Avós soluissa laskettiin virtaussytometrillä tuloksista.

T24-miR-NC ja T24-miR-17-5p solut värjättiin AO AVO havainnon alla fluoresenssimikroskoopissa (B ja C ). AO värjäys A549 toimi kontrollina (A). (D-F) kvantitoimiseksi muutos% soluista kehittää AVO seuraavat miR-17-5p yli-ilmentymisen A549-T24-soluissa virtaustekniset sytometrinen arvio Avós tehtiin A549, T24-miR-NC ja T24-miR-17- 5p-soluissa. (G) kvantitointi keskimääräisen AVO positiivisten solujen kaikissa kolmessa solulinjoissa. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± keskivirhe Kuva. Kuten on esitetty kuviossa. Kuva. Kuva. Kuten on esitetty kuviossa.