Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syövän ominaisuuksia ja mekanismeja mimulone (MML),

C

-geranylflavonoid eristää

keisaripuu

hedelmiä, jotka on aluksi selvitetty tässä tutkimuksessa. MML estänyt soluproliferaatiota annoksesta ja ajasta riippuvat tavalla ja laukaista apoptoosin kautta ulkoinen tie A549 ihmisen keuhko- adenokarsinoomasolua. Lisäksi MML-käsitellyt solut näytetään autophagic ominaisuuksia, kuten muodostumista autophagic Vakuoleissa ensisijainen morfologinen ominaisuus autophagy, ja kertymistä mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevytketjun 3 (LC3) puncta, toinen tyypillinen valmistaja autophagy, määritettynä FITC: hen konjugoidulla immunovärjäyksellä ja monodansylcadaverine (MDC) värjäys, vastaavasti. Ilmentymistasojen LC3-I ja LC3-II, spesifisten autophagy, myös täydennetty MML hoitoon. Autophagy inhibitio 3-metyyliadeniini (3-MA), farmakologinen autophagy estäjä, ja shRNA knockdovvn Beclin-1 vähensi apoptoottisen solukuoleman aiheuttama MML. Autophagic flux ei merkittävästi vaikuttanut MML käsittely ja lysosomaalisen estäjä, klorokiinin (CQ) tukahdutetaan MML aiheuttama autophagy ja apoptoosin. MML aiheuttama autophagy edistettiin laskua p53 ja p-mTOR tasoja ja lisääntyminen p-AMPK. Lisäksi esto p53 transaktivaatiota pifithrin-α (PFT-α) ja knockdown p53 tehostetun induktion autophagy ja lopulta edistää apoptoottista solukuolemaa. Kaiken kaikkiaan tulokset osoittavat, että autophagy edistää sytotoksisuuden MML syöpäsoluissa kätkeminen villityypin p53. Tämä tutkimus viittaa vahvasti siihen, että MML on mahdollinen ehdokas syöpälääke kohdistettu sekä autophagy ja apoptoottisen solukuoleman ihmisen keuhkosyöpä. Lisäksi, co-hoito MML ja p53-estäjä olisi tehokkaampi ihmisen keuhkosyövän hoidossa.

Citation: H-K, Kim K-S, Lee J-W, Park M-H, Moon H-I, Park S-J, et al. (2014) Mimulone aiheuttama Autophagy kautta p53-välitteistä AMPK /mTOR Pathway Lisäykset kaspaasivälitteinen apoptoottista solukuolemaa A549 ihmisen Lung Cancer Cells. PLoS ONE 9 (12): e114607. doi: 10,1371 /journal.pone.0114607

Editor: Ilja Ulasov, Swedish Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. heinäkuuta, 2014; Hyväksytty: 10 marraskuu 2014; Julkaistu: 09 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 An et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Dong-A University Research Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on yleisin pahanlaatuinen kasvain, joka on yksi tärkeimmistä syistä globaalin syöpään liittyvän kuoleman ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kaappaa lähes 85% kaikista keuhkosyövässä [1], [ ,,,0],2]. Huolimatta huomattavasti edistysaskeleet keuhkosyövän hoidossa mukaan lukien leikkaus, sädehoito ja kemoterapia, ennuste potilaille, joilla on keuhkosyöpä on edelleen heikko, alle 15% koko 5 vuoden pysyvyys [1]. Erityisesti kemoterapian avulla platina yhdisteitä tai Platinapohjaisen yhdistelmät on useimmin käytetty keuhkosyöpää hoidon ja pidetään optimaalinen hoito potilailla, joilla on myöhäisvaiheen NSCLC [2], [3]. Kuitenkin tehokkuus kemoterapian potilailla, joilla on edennyt keuhkosyöpä on erittäin vähäistä, koska lääkeresistenssin ja myrkyllisiä sivuvaikutuksia lääkkeiden [2], [3]. Siten on tärkeää kehittää vähemmän myrkyllisiä ja tehokkaampia kemoterapeuttisten aineiden hoitamiseksi kehittynyt keuhkosyöpäpotilaiden.

Viime vuosina kasviperäisiin luonnontuotteet ovat saaneet laajaa huomiota kuin tärkeimmistä uusia lääkkeitä vähentämiseksi kemoterapian liittyviä haittavaikutuksia ja ne saavat aikaan syöpää ehkäisevistä vaikutuksista laukaisemalla apoptoosin ja autophagy [4] – [7]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että useat kasviperäisiä luonnollisia tuotteita, mukaan lukien plumbagin [8], glossogin [9], kurkumiini [10], Celastrol [11], isolinderalactone [12], glycyrrhitsiini [13], polydatin [14], 6- shogaol [15], glykyrretiinihappo [16] ja Embelin [17], apoptoosin kautta luontaisia ​​ja /tai ulkoinen tie ja aktivointi p38 /JNK-reitin ihmisen keuhkosyövän soluja. Lisäksi, 6-shogaol aiheuttaman solukuoleman kautta autophagy induktion inhibition AKT /mTOR reitin ihmisen NSCLC A549-soluja [18] ja paklitakselin ja feroniellin kohdistuu niiden sytotoksisia vaikutuksia aiheuttamalla sekä autophagy ja apoptoosin ihmisen keuhkosyövän A549-soluja [19], [20].

keisaripuu

Steud. (Scrophulariaceae) on lehtipuu jaetaan koko Kiinassa, Koreassa ja Japanissa [21] ja otteet

P

.

tomentosa

on käytetty lievittämään keuhkoputkentulehdus, astmakohtauksia ja limaa perinteisen kiinalaisen lääketieteen [22]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että

C

-geranylated flavonoideja, pääasiassa bioaktiiviset ainesosat

P. tomentosa

, neuroprotektiivisia vaikutuksia, antiradikaalina ja antibakteerisia toimintaa [23] – [26]. Lisäksi

C

-geranylated flavanonit iältään

keisaripuu

hedelmät osoitti vahvaa sytotoksista aktiivisuutta erilaisissa ihmisen syöpäsolulinjoissa [27], [28]. Se on myös ollut viime aikoina raportoitu, että geranylated flavanonia tomentodiplacone B suoraan estää soluproliferaatiota alas-säätely sykliiniriippuvaisen kinaasi 2 aktiivisuus, joka johtaa G1 vaiheeseen kerääntymistä THP-1 ihmisen monosyyttileukemian soluihin [29]. Kuitenkin taustalla olevaa mekanismia vastuussa antituumorivaikutuksen geranylated flavonoideja ei ole hyvin selvitetty.

Olemme hiljattain eristetty kuuluva yhdiste

C

-geranylated flavonoideja, mimulone (MML), alkaen

keisaripuu

hedelmiä. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme ensinnäkin tutkinut syöpää ehkäisevistä vaikutuksista MML ihmisen keuhkosyövän soluja ja myös täsmentänyt vaikutusmekanismi. Osoitamme tässä, että MML laukaisee autophagy edellisen apoptoosin ihmisen NSCLC A549-soluja, ja autophagy esto vähenee apoptoosin MML-käsitellyissä soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Monodansylcadaverine ( MDC), 4 ’, 3-metyyliadeniini (3-MA), klorokiinin (CQ), yhdiste C (yhdiste C) ja 6-diamino-2-fenyyli-dihydrokloridi (DAPI) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO , USA). Z-VAD-FMK (pan-kaspaasi-inhibiittori), Z-DEVD-FMK (kaspaasi-3: n estäjä), Z-IETD-FMK (kaspaasi-8-estäjä) ja Z-LEHD-FMK (kaspaasi-9-estäjä) saatiin Calbiochem (EMD Biosciences, San Diego, CA, USA). 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), DAPI, puromysiini-dihydrokloridi ja klorokiinin (CQ) liuotettiin dH

2O. 3-MA (100 mM), poly-L-lysiiniä (0,1%) ja polybreenin (20 mg /ml) liuotettuna fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS). Pifithrin-α (PFT-α), yhdiste C (yhdiste C) ja MDC liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO). Vasta-aineet ATG7, Beclin-1, LC3, kaspaasi-3, kaspaasi-8, kaspaasi-9, Bid, p-p38, p38, p-AMPK-α, AMPK-α, p-ACC, ACC, p-mTOR, mTOR saatiin Cell Signaling Technology (Tanssijat, Mass, USA); vasta-aineet PARP-1/2 p53 (DO-1), p-ERK ja ERK ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); vasta-aineen p62 /SQSTM1 ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA); vasta-aine, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) saatiin Millipore (Milford, MA, USA); (HRP) konjugoitua sekundaariset vasta-aineet hankittiin Cell signalointi Technology (Tanssijat, Mass, USA) ja Enzo Life Science (Farmingdale, NY, USA), tässä järjestyksessä; Fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta saatiin Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA). Anneksiini V-FITC apoptoosin havaitseminen pakki ja BCA proteiini iinianalyysikitissä hankittiin BD Biosciences (San Jose, CA, USA) ja Thermo (Rockford, IL, USA), tässä järjestyksessä. MML (Fig. 1A) eristettiin

P. tomentosa

hedelmiä valmistettiin, kuten on kuvattu edellisessä raportissa [25], liuotettiin DMSO: hon 40 mM varastossa pitoisuus, ja säilytettiin -20 ° C: ssa.

(A) molekyylirakenne mimulone. Erilaisia ​​ihmisen syöpäsoluja, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä A549 (B), rintasyöpä MCF7 (C), paksusuolen syöpä HCT116 (D) ja osteosarkooma U2OS (E) soluja käsiteltiin MML kuten pitoisuuksina (0-80 uM) 12 h tai 24 h, ja sitten solujen elinkyky mitattiin MTT-määrityksellä. Pylväsdiagrammit osoittavat prosenttiosuuden elinkelpoisuuden. (F) A549-soluja käsiteltiin MML eri pitoisuuksina (0-80 uM) 24 tunnin ajan ja elävät solut laskettiin trypan blue -värjäyksellä. Elävien solujen (ei-värjäytyneet solut) laskettiin käyttäen hemosytometria ja pylväsdiagrammi osoittaa elävien solujen prosenttimäärän. Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 ** p 0,01 verrattuna ohjaus.

Soluviljelmät

Ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä A549, ihmisen rinta- adenokarsinooma MCF-7, ihmisen kolorektaalisyövän HCT116 ja ihmisen osteosarkooma U2OS solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; WelGENE Co, Daegu, Korea), joka sisälsi 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% (PSA WelGENE Co, Daegu, Korea) on 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ilmassa.

solujen elinkelpoisuus

analyysi solujen elinkelpoisuuden, MTT-määritys suoritettiin samanlaisella menettelytavalla, joka on kuvattu aiemmin [30]. Lyhyesti, solut ympättiin 24-kuoppalevylle (5 x 10

4 solua /kuoppa) ja kasvatettiin 24 tuntia. Solut käsiteltiin sitten MML eri pitoisuuksina (0-80 uM) 24 tunnin ajan tai käsiteltiin 60 uM MML eri ajanjaksojen (0-24 h). Jälkeen MML hoito, soluja inkuboitiin väliaineen /MTT (0,5 mg /ml) seosta 3 tuntia. DMSO lisättiin liuottamaan vähentää formatsaania kide MTT ja absorbanssi luettiin 540 nm: ssä käyttäen ELISA-levyn lukijaa (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Vahvistaa vaikutuksen MML soluproliferaatioon, elävät solut laskettiin trypan blue -värjäyksellä mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, A549-solut maljattiin 12-kuoppalevylle ja käsiteltiin MML kuten pitoisuuksina 24 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut otettiin talteen käyttämällä trypsiini-EDTA: ta (WelGENE Co, Daegu, Korea) ja värjättiin 0,4% trypan blue-liuoksella (Gibco, Carlsbad, CA). Living solut laskettiin hemosytometrillä. Solujen elinkelpoisuus on esitetty suhteessa kontrolliin.

Proteiinin uutto ja western blot-analyysi

Koko-solu uutteissa A549-soluja valmistettiin käyttämällä RIPA-puskurilla (Pierce, Rockford, IL, USA) joka sisältää proteaasi-inhibiittori-seosta (GE Healthcare, Piscataway, USA) ja fosfataasi-inhibiittorin cocktail (Thermo, Rockford, IL, USA). Proteiinit kokosolulysaateista kvantitoitiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä mukainen pakkaus valmistajan ohjeiden mukaisesti. Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [30]. Enhanced kemiluminesenssin (ECL) havaitsemisjärjestelmä (Amersham Bioscience, NJ, USA) käytettiin havaitsemaan signaalin ja signaalin intensiteettiä havaittujen Proteiinivyöhykkeet mitattiin Scion Image Instrument (Scion Co., Frederick, MD, USA). Equal lastaus arvioitiin GAPDH sisäisinä säätimet Western blottauksella.

Immunosytokemia

immunofluoresenssi suoritettiin samanlaisella menetelmällä kuten aikaisemmin on kuvattu [30]. Lyhyesti, A549-soluja viljeltiin steriilissä peitinlaseille ja käsiteltiin MML 24 tuntia, ja sitten kiinnitettiin 3% paraformaldehydillä (PFA) ja 15 min 37 ° C: ssa. Seuraavaksi läpäiseväksi vaihe suoritettiin jäähdytetyllä metanolilla (100%) 10 minuutin ajan -20 ° C: ssa, ja sitten soluja viljeltiin sen jälkeen in blokkausliuosta, joka sisälsi 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) ja 1% Triton-X 100: ssa 1 h 37 ° C: ssa. Sitten soluja inkuboitiin LC3 vasta-aineen 12 tunnin ajan 4 ° C: ssa ja sen jälkeen FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Tumat värjättiin DAPI (1 ug /ml) 10 min ajan 37 ° C: ssa. Fluoresenssi kuvat siepattiin LSM 700 samapolttopisteisellä laserilla skannaus mikroskooppia (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa).

MDC värjäys

MDC värjäys tehtiin myös samanlaisella menettelytavalla, joka on kuvattu aiemmin [30 ]. Solut kiinnitettiin 3% PFA: ssa 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa, ja inkuboitiin sitten 50 uM monodansylcadaverine (MDC), joka on autofluo- yhdiste, joka etiketit autophagic onteloita 37 ° C: ssa 10 min. Fluoresoivat Kuvat otettiin vangiksi Olympus BX51 fluoresenssimikroskooppia (Center Valley, PA, USA).

anneksiini V ja PI-värjäys

Soluja käsiteltiin kuten pitoisuudet MML ja /tai estäjien (kaspaasi estäjät, 3-MA, PFT-α) 24 tuntia, ja kerättiin käyttäen trypsiini-EDTA: ta. Värjäyksen jälkeen FITC-konjugoidulla anneksiini V: n ja propidiumjodidin (PI), apoptoottiset solut mitattiin käyttäen Beckman-Coulter Cytomics FC500 virtaussytometrillä (Beckman-Coulter, Miami, FL, USA).

RNA-interferenssi

pLKO.1 lentiviruksen ekspressioplasmidin sisältävien shRNA vastaan ​​Beclin-1 (TRCN0000033552) ja p53 (TRCN0000003753), (Beclin-1, 5′-CCGGCTCAAGTTCATGCTGACGAATCTCGAGATTCGTCAGCATGAACTTGAGTTTTTG-3 ’, p53, 5′-CCGGCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGTTTTT-3’) hankittiin Sigma-Aldrich (Mission shRNA). Viruspartikkelit generoidaan 294T mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut transfektoitiin pLKO.1 shBeclin-1, VSVG ja Gag vektoreita. Viral keitto ruiskutettiin sitten A549-solujen ja inkuboitiin 12 tuntia. Virus-tartunnan A549-solut valitaan Puromysiini-dihydrokloridi hoidon ja valitut solut käytettiin kokeita varten. pLKO.1 shRNA kontrollivektorin (Mission shRNA, SHC002) käytetään kontrollina.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM kolmen erillisen kokeen kussakin ryhmässä. Erot kukin ryhmien arvioitiin Studentin

t

-testin ja * p 0,05 pidettiin osoittamaan tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

vaikutus MML solujen elinkelpoisuudesta eri ihmisen syövän solulinjoissa

vaikutusten arvioimiseksi MML solujen kasvuun erilaisten ihmisen syövän solulinjoissa, ihmisen keuhkosyöpä A549 (Fig. 1 B), ihmisen rintasyöpä MCF-7 (Fig. 1 C), ihmisen paksusuolen syöpä HCT116 (Fig. 1 D) ja ihmisen osteosarkooma U2OS (Fig. 1 E) solut käsiteltiin MML eri pitoisuuksina 12 h tai 24 h ja sitten seuraa MTT määrityksissä. MTT-analyysi Tulokset osoittivat, että MML hoito esti merkitsevästi solujen lisääntymisen annoksesta ja ajasta riippuvaa tavalla näissä syöpäsolun linjat. Edelleen tarkistaa vaikutuksen MML soluproliferaatioon A549-soluja, soluja käsiteltiin MML eri pitoisuuksilla 24 tunnin ajan ja altistettiin sitten trypaanisinisen värjäystä. Tuloksena paljastui merkittävä inhibitio soluproliferaation MML käsittely annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1 F).

MML laukaisee kaspaasi-riippuvaista apoptoosia in A549-soluja

Sen määrittämiseksi, MML- aiheuttama sytotoksisuuden A549-solut johtui apoptoosin, kun MML hoidon eri pitoisuuksilla 24 tunnin ajan tai 60 uM MML hoidon eri ajanjaksoilta, apoptoottiset väestö analysoitiin anneksiini V /PI kaksinkertainen värjäystä. Anneksiini V /PI-positiivisia soluja lisääntyy selvästi annoksesta ja ajasta riippuvaa tavalla (Kuva. 2A-C), joka osoittaa apoptoottisen vaikutuksen MML A549-soluissa. Virtaussytometria-analyysi osoitti myös, että MML-hoito lisäsi solujen kerääntymiseen apoptoottisen sub-G1 vaiheen annoksesta riippuvalla tavalla. Solujen määrä on G2 /M-vaiheen lisääntynyt myös annoksesta riippuvalla tavalla (S1 kuva). Edelleen vahvistaa vaikutuksen MML on apoptoosin induktio A549-solut, kaspaasi-3-aktivaation ja poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) pilkkoutumisen tutkittiin immunoblottauksella niiden vasta-aineita. Kaspaasi-3-, keskeinen teloittajana apoptoottisessa kone, pilkkoo monien proteiinien välttämättömiä solujen eloonjäämistä ja aktivoidaan pilkkomalla kahdeksi fragmentiksi (17 kDa ja 19 kDa), kaspaasi-8 ja /tai kaspaasi-9 apoptoosin aikana [31], [32]. Aktivoitu kaspaasi-3: sen jälkeen katkaisee solun proteiinien, mukaan lukien PARP, joka johtaa apoptoottisen solukuoleman. PARP on tärkeä rooli ylläpitämisessä genomista eheys ja on tärkeä proteiinin proteolysoidun kaspaasi-3 apoptoosin aikana [32]. Kuten on esitetty kuviossa. 2D, kaspaasi-3 ja PARP pilkkoutuminen oli selvästi lisääntynyt sen jälkeen, kun 60 uM MML hoitoa 24 h, mikä osoittaa, että MML indusoi apoptoosia kaspaasi-3-aktivaation ja PARP lohkaisu A549-soluja. Kaspaasi-8 ja kaspaasi-9 keskeisessä asemassa ovat apoptoosin kautta syöttämällä reseptorivälitteinen (ulkoinen) ja mitokondrioiden (luontainen) väyliä, vastaavasti [31], [32]. Lohkaisu Bid vaaditaan välistä ylikuulumista ulkoisten ja sisäisten reittien [31], [32]. Purkaa reitti, jonka MML indusoi apoptoosia A549-soluja, proteiinipitoisuus kaspaasi-8 ja kaspaasi-9 analysoitiin immunoblot-analyysillä. Kuten on esitetty kuviossa. 2D, MML-hoito lisäsi katkaistun muotojen (18 kDa ja 43 kDa) ja kaspaasi-8, mutta se ei laukaista kaspaasi-9 ja Bid pilkkoutuminen, mikä osoittaa, että MML indusoi kaspaasi-8: A549-solut. Edelleen vahvistaa, onko MML-indusoitua apoptoosia oli kaspaasiriippuvaisen prosenttiosuus apoptoottisten solujen tarkastettiin anneksiini V-PI kaksinkertainen värjäys jälkeen 24 h hoito eri kaspaasi-inhibiittorit, kuten Z-VAD-FMK (pan-kaspaasiestäjä ), Z-DEVD-FMK (kaspaasi-3: n estäjä), Z-IETD-FMK (kaspaasi-8-estäjä) ja Z-LEHD-FMK (kaspaasi-9-estäjä). Kuten on esitetty kuviossa. 2E, virtaussytometrinen analyysi osoitti, että MML-indusoiman apoptoosin pelastettiin pan-kaspaasi-inhibiittori, kaspaasi-3, ja kaspaasi-8-estäjien verrattuna MML hoito yksinään, mutta ei kaspaasi-9-inhibiittori. Samanlainen tulos saatiin myös MTT-määrityksellä (Fig. 2F). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että MML-indusoitua apoptoosia ohjaa pääasiassa ulkoinen tie sijaan sisäisen reaktiotien.

(A) A549-soluja käsiteltiin MML kuten pitoisuuksina (0-60 uM) 24 tunnin ajan ja sitten värjättiin FITC- konjugoidulla anneksiini V ja PI. Apoptoottisia soluja mitattiin virtaussytometrillä. (B) A549-soluja käsiteltiin 60 uM MML jonkin aikaa riippuvaisella tavalla. Apoptoottiset solut värjättiin anneksiini V: n ja PI: n ja havaittiin käyttämällä virtaussytometriä. (C) Pylväsdiagrammi osoittaa prosenttiosuuden apoptoottisten solujen (annoksesta riippuvalla tavalla, top, aika-riippuvaisella tavalla, alhaalla). Apoptotic väestö arvioitiin anneksiini V positiivinen, PI negatiivinen (AV + /PI-, valkoinen bar) ja anneksiini V ja PI kaksinkertainen positiivinen (AV + /PI +, musta palkki) apoptoottisia soluja. (D) Soluja käsiteltiin MML kuten pitoisuuksina (0-60 uM) 24 tunnin ajan, ja Western blot -analyysi suoritettiin tarkistaa apoptoosin markkeri, kaspaasi-3, -8, -9, Bid ja PARP-puoli, vastaavasti. GAPDH käytettiin lastaus valvonta Western blot-analyysi. (E) Soluja esikäsiteltiin tai ilman kunkin kaspaasiestäjä, Z-VAD-FMK (30 uM), Z-DEVD-FMK (30 uM), Z-IETD-FMK (30 uM) ja Z-LEHD-FMK (30 uM) 1 tunti ja sitten käsiteltiin MML (60 uM) 24 tunnin ajan. Apoptoottisia soluja värjättiin anneksiini V: n ja PI: n ja sitten populaatiot havaittiin virtaussytometrillä. (F) Soluja käsiteltiin kaspaasi-inhibiittorit ja MML samoissa olosuhteissa kuin virtaussytometrianalyysin ja solujen elinkyky mitattiin MTT-määrityksellä. Pylväsdiagrammit tarkoittavat prosentuaalista solujen elinkelpoisuuden (ylhäällä) ja prosenttiosuus apoptoottisten solujen (ala), tässä järjestyksessä. Apoptotic väestö arvioitiin anneksiini V positiivinen, PI negatiivinen (AV + /PI-, valkoinen bar) ja anneksiini V ja PI kaksinkertainen positiivinen (AV + /PI +, musta palkki) apoptoottisia soluja. Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 ** p 0,01 verrattuna valvonta;

# p 0,05 verrattuna MML-hoidetussa ryhmässä.

MML laukaisee autophagy A549-soluissa

Kasviperäiset luonnon yhdisteiden tiedetään aiheuttavan niiden syöpää ehkäisevistä vaikutuksista indusoimalla autophagy ihmisen syöpäsoluissa [7]. Autophagy on catabolic prosessin muodostavan kaksinkertaisen kalvovesikkeleiden, kutsutaan autophagosomes [33]. Sen tutkimiseksi, MML laukaisee autophagy A549-soluissa, morfologiset muutokset jälkeen MML hoidon tarkastettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, laaja sytoplasma vakuolisaatiota ja kokoonpanojen autophagosome kaltaisten vacuoles in MML-käsiteltyjen A549-solujen havaittiin alle faasikontrastimikroskopiaa. Vahvista autophagy induktion MML, MDC värjäys ja mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevytketjun 3 (LC3) immunovärjäyksessä fluoresoivalla vasta-aineita LC3 tehtiin. MDC ja LC3 tunnetaan spesifisten autophagic ontelot ja autophagosomes, vastaavasti, ja puncta muodostuminen LC3 osaksi autophagosome voidaan havaita konfokaalimikroskopialla, jota käytetään laajalti luotettava menetelmä, joka kykenee havaitsemaan autophagy [33]. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, MML-käsittelemätön kontrolli soluissa osoitti hajottama MDC-värjäys, kun taas MML-käsiteltyjen A549-solut johti kasvua fluoresenssin intensiteetin viittaa laajaan MDC-positiivisia autophagic vacuoles. Lisäksi lisääntynyt solunosasijaintia pistemäisiä LC3 havaittiin myös MML-käsiteltyjen A549-soluja verrattuna käsittelemättömään kontrolliin solujen ja LC3 puncta muodostuminen lisääntyi ajasta riippuva tavalla (Fig. 3B). Edelleen selvittämiseksi autophagosome muodostumista MML-käsitellyissä soluissa, muutoksia kolmen suuren autophagy liittyviä markkereita, LC3-II, Beclin-1 ja ATG7, analysoitiin immunoblottauksella. ATG7 ja LC3-II-proteiinin tasot olivat merkittävästi lisääntynyt annosriippuvaisesti tavalla MML hoitoon, mutta Beclin-1 taso hieman laajennettu (Fig. 3C). Yhdessä nämä tiedot varmasti osoittavat, että MML indusoi autophagosome muodostumista A549-solut.

(A) A549-soluja käsiteltiin 60 uM MML 24 tuntia ja sitten morfologiset kuvat siepattiin vaihekontrastimikroskoopilla (400 x, PC). Nuolet osoittavat endogeenisen autophagosome kaltainen vacuoles (vasemmalla) ja pylväsdiagrammi osoittaa, kuinka monta vakuolien solua kohti. Soluja käsiteltiin MML (60 uM, 24 h), ja sitten solut värjättiin MDC ja LC3 vasta-aine, vastaavasti. MDC (kirkas väri, keskimmäinen) Kuvat otettiin vangiksi fluoresenssimikroskooppia ja LC3 (vihreä, oikea) loisteputki kuvia havaittiin -konfokaalimikroskoopilla (bar; 10 pm). Pylväsgrafiikka osoittaa fluoresoiva intensiteetti LC3 FITC. (B) Soluja käsiteltiin MML (60 uM) eri ajanjaksoja (0-24 h) ja LC3 immunofluoresenssivärjäyksen suoritettiin havaita autophagosomes. Tumat värjättiin DAPI. Kuvat otettiin käyttäen -konfokaalimikroskoopilla (bar; 10 pm). (C) A549-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla MML (0-60 uM) 24 tuntia. Western blot-analyysi suoritettiin sen jälkeen vasta-aineita ATG7, Beclin-1 ja LC3, vastaavasti. GAPDH käytettiin latauskontrollina. Pylväsdiagrammi osoittaa densitometria analyysi LC3-II /GAPDH-suhde. A549-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla MML (0-60 uM) 24 tunnin ajan (D) tai 60 uM MML eri ajan funktiona (E) ja sen jälkeen immunoblot-analyysi suoritettiin käyttäen vasta-aineita p62 ja LC3, vastaavasti. GAPDH käytettiin latauskontrollina. (F) A549-soluja esi-inkuboitiin klorikiinin (CQ, 25 uM) 1 tunti, sitten sitä käsiteltiin MML (60 uM) 24 tunnin ajan. Western blot-analyysi suoritettiin käyttäen vasta-aineita, kuten edellä on esitetty. GAPDH käytettiin lastaus valvonta Western blottauksella. Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 ** p 0,01 verrattuna ohjaus.

Tiedetään, että autophagosomes myös kertyä, kun autophagic vuon osoittaa koko prosessin autophagy on tehotonta [35], [46]. Sen arvioimiseksi, MML vaikuttaa autophagic vuon A549-soluja, taso p62-proteiini, jota käytetään valvomaan autophagic flux [35], [46] tarkistettiin immunoblottauksella sen vasta-aine. Kuten on esitetty kuviossa. 3D ja 3E p62 taso oli merkittävästi vähentynyt MML hoito annoksesta ja ajasta riippuvaa tavalla. Lisäksi vaikutusten arvioimiseksi MML on autophagic rakkula liikevaihdon, proteiini tasot P62 ja LC3 II tarkastettiin immunoblottauksella jälkeen 24 h hoidon klorokiinin (CQ) tunnetaan lysosomaalisen hajoamisen estäjä. Kuten on esitetty kuviossa. 3F, esikäsittely ja SA merkittävästi nostivat P62 ja LC3 II verrattuna MML hoito yksinään. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että MML hoito ei häiritse autophagic rakkula liikevaihdon. Yhdessä nämä tulokset varmasti osoittavat, että MML aiheuttama autophagy ilman heikentyvän autophagic vuon A549-solut.

esto autophagy mukaan autophagy estäjä tai knockdovvn Beclin-1 estää MML välittämä apoptoottisen solukuoleman

se on äskettäin todistettu, että autophagy inhibitio tietyn autophagy inhibiittoria, kuten 3-metyyliadeniini (3-MA), voidaan edistää apoptoosia ihmisen syöpäsoluja [35] – [38]. Näin ollen tutkimme vaikutus 3-MA muodostumista LC3 puncta ja autophagic vacuoles in MML-käsiteltyjen A549-solut. Pistemäinen LC3 jakelua ja muodostumista MDC-positiivisten autophagosomes in MML aiheuttama solut huomattavasti tukahdutti 3-MA hoitoa (Fig. 4A). Lisäksi yhteistyössä hoidon MML ja 3-MA esti merkittävästi paitsi LC3-II kertymistä mutta myös kaspaasi 3 ja PARP cleavages (Fig. 4B). Sitten tarkastetaan vaikutusta 3-MA on apoptoosin avulla anneksiini V /PI kaksinkertainen värjäystä. Anneksiini V /PI-positiivisten solujen laskivat tuntuvasti soluissa yhteistyössä käsitelty MML ja 3-MA, verrattuna hoidettiin MML yksinään (Fig. 4C). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin samanaikainen hoito MML ja SA (Fig. 4D). Nämä tulokset ilmeisesti osoittavat, että autophagy inhibitio 3-MA ja CQ voisi estää MML-indusoitua apoptoosia in A549-solut.

(A) A549-soluja esi-inkuboitiin kanssa tai ilman 3-MA (10 mM) 3 h ja sitten inkuboitiin MML (60 uM) 24 tunnin ajan. Solut värjättiin MDC (kirkkaat värit) LC3 (vihreä) vasta-aine, tässä järjestyksessä. Tumat värjättiin DAPI (sininen). Fluoresenssikuvia saatiin käyttämällä -konfokaalimikroskoopilla (bar; 10 pm). (B) Soluja esikäsiteltiin kanssa tai ilman 3-MA: ssa 3 h ennen käsittelyä MML (60 uM) 24 tunnin ajan. Western blot -analyysi suoritettiin vasta-aineilla LC3, PARP-1/2 ja kaspaasi-3, vastaavasti. GAPDH käytettiin latauskontrollina. Pylväsdiagrammit osoittavat suhde katkaistun kaspaasi-3 /GAPDH ja LC3-II /GAPDH, vastaavasti. (C) A549-soluja esikäsiteltiin 3 h kanssa tai ilman 3-MA ja käsiteltiin MML (60 uM) 24 tunnin ajan ja solut värjättiin FITC-konjugoidulla anneksiini V /PI ja sitten mitattiin FACS: llä. Pylväsdiagrammi, osoittaa prosenttiosuuden apoptoottisten solujen. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen arvioitiin anneksiini V positiivinen ja PI negatiivinen (AV + /PI-, valkoinen bar) ja anneksiini V ja PI kaksinkertainen positiivinen (AV + /PI +, musta palkki) apoptoottisia soluja. (D) Soluja esikäsiteltiin tai ilman SA: ssa 1 tunti ja sitten inkuboitiin MML 24 tuntia. Immunoblottaus analyysi suoritettiin käyttäen vasta-aineita, kuten aiemmin on osoitettu. Soluja käsiteltiin SA ja MML samoissa olosuhteissa kuin edellä mainittiin ja sitten solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT: llä (alhaalla). Pylväsdiagrammi, osoittaa prosenttiosuuden solujen elinkykyä. Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 ** p 0,01 verrattuna valvonta;

# p 0,05 verrattuna MML-hoidetussa ryhmässä.

Tarkemmat estämällä autophagy reitin voidaan saavuttaa tyrmäyksellä tai knockdovvn autophagy liittyvien (

ATG

) geenejä ja

Beclin-1

geeni. Edelleen vahvistaa, onko autophagy voi säädellä apoptoosia, Beclin-1, kriittinen säätelijä autophagy, joka pudotettiin käyttäen pientä hiusneula-RNA (shRNA) ja sitten muutokset omien autophagosomes tarkastettiin LC3 immunovärjäyksellä. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, endogeeninen LC3 jakelu on merkittävästi vähentynyt MML saaneilla Beclin-1 taintumisen soluja (shBeclin-1) verrattuna MML-käsiteltyjen shControl soluissa. Lisäksi, kuten on esitetty kuviossa. 5B, knockdovvn

Beclin-1

geenin selvästi tukahdutettu Beclin-1-proteiinin ilmentymisen ja kertymistä LC3-II verrattuna shControl. Yhdenmukainen tuloksia käyttämällä 3-MA ja CQ, kaspaasi-3 ja PARP cleavages myös merkitsevästi inhiboi tukahduttamisen autophagy kautta knockdovvn

Beclin-1

geeni. MTT-määritys tulos osoitti myös, että sytotoksinen vaikutus MML merkittävästi vähentää pudotus on

Beclin-1

geenin (Fig. 5C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat selvästi, että autophagy esto 3-MA ja CQ tai Beclin-1 Knockdown esti MML aiheuttamaa apoptoosia A549- soluissa.

(A) Ohjaus ja Beclin-1 Knockdown soluja käsiteltiin MML (60 uM) 24 tunnin ajan ja sitten LC3 immunofluoresenssivärjäyksen suoritettiin havaitsemiseksi autophagosomes. Tumat värjättiin DAPI. Kuvat otettiin vangiksi -konfokaalimikroskoopilla (bar; 10 pm). (B) pudotus-soluja (shControl, shBeclin-1) käsiteltiin MML (60 uM) 24 tunnin ajan. Western blot -analyysi suoritettiin vasta-aineilla Beclin-1, LC3, PARP-1/2 ja kaspaasi-3, vastaavasti. GAPDH käytettiin latauskontrollina. Pylväsdiagrammit osoittavat suhde LC3-II /GAPDH ja pilkottiin kaspaasi-3 /GAPDH, vastaavasti. (C) Ohjaus ja Beclin-1 pudotus soluja käsiteltiin MML (60 uM) 24 tunnin ajan, ja sitten solujen elinkyky mitattiin MTT-määrityksellä. Pylväsdiagrammi, edustaa prosentteina solujen elinkykyä. Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 ** p 0,01 verrattuna valvonta;

# p 0,05 verrattuna MML-hoidetussa ryhmässä.

MML indusoi autophagy kautta lasku p53 tasoilla

Äskettäin on raportoitu, että p53 on keskeinen rooli sääntely autophagy [39] – [41]. Sen tutkimiseksi, onko p53 on osallisena MML-välitteisen autophagy siten, tasot p53 ja LC3-II-proteiinia tutkittiin immunoblottauksella. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, MML hoito vähensi huomattavasti p53 tasoilla verrattuna käsittelemättömään kontrolliin soluja, mutta kasvoi LC3-II-tasoja. Lisäksi kaspaasi-3 ja PARP cleavages nostettiin MML hoitoa. Lisäksi LC3-II-tasoja ja halkaistut kaspaasi-3 ja PARP tasot olivat huomattavasti soluissa yhteistyössä käsitelty MML ja pifithrin-α (PFT-α), farmakologinen p53-estäjän, verrattuna hoidettiin MML tai PFT-α yksin . Nämä tulokset osoittavat selvästi, että vähennys p53 tasoilla MML voitaisiin lisätä induktio autophagy ja apoptoosin A549-soluja kätkeminen villityyppisen p53. Edelleen vahvistaa roolia p53 MML-indusoidun autophagy, autophagosomes tutkittiin LC3 immunovärjäyksellä. Kuten on esitetty kuviossa. 6B, merkittävä kerääntyminen LC3 puncta soluissa havaittiin yhdessä käsiteltiin MML ja PFT-α, osoittaa augment on autophagy induktion p53 menetys. Lisäksi prosenttiosuus anneksiini V /PI-positiivisia soluja oli noin 10% korkeampi soluissa yhdessä käsiteltiin MML ja PFT-α kuin niillä, joita hoidettiin MML yksinään (Fig. 6C). Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.