Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cancer aloittamista soluja (CIC) tarjoavat ainutlaatuisen solupopulaation olennaisia ​​ylläpitämiseksi ja kasvainten kasvua. Useimmat

in vivo

tutkimuksissa CIC hyödyntää ihmisen tuumoriksenografteja immuunipuutteisilla hiirillä. Nämä mallit tarjoavat rajallisesti tietoa vuorovaikutuksesta CIC isännän immuunijärjestelmää ja ovat rajallinen arvioitaessa hoitoja kohdistaminen CIC, erityisesti immuuni-pohjainen hoitoja. Tämän arvioimiseksi syngeenisellä syöpä Mallia tarvitaan. Olemme tutkineet palloja muodostavan kapasiteetin kolmentoista hiiren keuhkosyöpään solulinjojen ja tunnistettu TC-1 ja metastaattinen alaklooni Lewisin keuhkokarsinooma (HM-LLC), kuten solulinjat, jotka muodostetaan helposti ja säilyy aloilla usean kohtia. TC-1 tumorspheres ei rikastettiin ilmaus CD133 tai CD44, otaksuttu CIC markkereita, eivätkä ne osoittavat Hoechst 33342 puolelle väestöstä värjäystä tai Aldefluor aktiivisuus verrattuna kiinnittynyt TC-1-soluissa. Kuitenkin tumorsphere kulttuuri, nämä solut osoittivat itseuudistumiseen ja pitkäaikainen symmetrinen jako kapasiteettia ja ilmaistu Oct-4 verrattuna tarttuneet solut. HM-LLC pallo peräisin olevia soluja ilmeni kohonneita Oct-4, CD133, ja CD44 ilme, osoitti Hoechst 33342 puoli väestöstä ja Aldefluor aktiivisuus verrattuna tarttuvat solut tai matala metastasoitunut alaklooni LLC (LM-LLC). Hiirissä, HM-LLC pallo peräisin olevat solut tarvitaan vähemmän soluja aloittaa kasvaimien syntyyn verrattuna kiinnittynyt tai LM-LLC soluissa. Samoin TC-1 pallo peräisin olevat solut olivat tuumorigeenisemmiksi kuin tarttuneet solut hiirissä. Sen sijaan, joiden immuunijärjestelmä on heikentynyt hiirissä, on vähemmän kuin 500 pallo tai liittyvät TC-1-soluja ja vähemmän kuin 1000 pallo tai liittyvät LLC-solut aloitettava kasvain. Ehdotamme, että mikään yksittäinen fenotyyppisen markkerin voidaan tunnistaa CIC hiiren keuhkosyövän solulinjat. Tumorsphere kulttuuri voi tarjota vaihtoehtoinen lähestymistapa tunnistaa ja rikastamiseksi hiiren keuhkojen CIC. Lisäksi ehdotamme, että arvioitaessa kasvainten muodostumiseen hiiren keuhkon CIC hiirissä parempia malleja vuorovaikutusta CIC isännän immuunijärjestelmä.

Citation: Morrison BJ, Steel JC, Morris JC (2012) Sphere Culture Hiiren Lung Cancer Cell Lines on rikastunut Cancer Käynnistetään Cells. PLoS ONE 7 (11): e49752. doi: 10,1371 /journal.pone.0049752

Editor: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: 12 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 15 lokakuu 2012; Julkaistu 13 marraskuuta 2012

Copyright: © 2012 Morrison et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Division Hematologia-onkologian, University of Cincinnati. BJM tukivat University of Cincinnati, University Research Council, Postdoctoral Fellow -tutkimusohjelma avustusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on syynä lähes 20% kaikista syöpäkuolemista Yhdysvalloissa [1]. Sen osuus enemmän kuolemia kuin neljä seuraavaa yleisimmistä syövistä yhdistettynä. Huolimatta parannuksista diagnoosin ja hoidon, yleinen 5 vuoden pysyvyys kaikille potilaille, joilla keuhkosyöpä on synkkä 15%, ja tämä laskee alle 2% potilailla etäpesäkkeitä [2]. Siksi keuhkosyöpä on merkittävä kansanterveydellinen ongelma, ja ymmärtää paremmin taudin biologian ja parannuksia hoidossa tarvitaan kipeästi.

Lisääntyvä todistusaineisto tukee ajatusta erikoistunut solupopulaation kasvaimiin kutsutaan syöpä aloittamista solujen (CIC), vaihtoehtoisesti ”syöpä kantasolut” tai kasvaimen aloittamista soluihin. Nämä solut uskotaan olevan vastuussa kasvaimen alkuperän, huolto, eteneminen, ja kestävyys hoito. CIC näyttää toiminnalliset ominaisuudet kantasoluja, kuten kyky itseuudistumisen ja kyky aiheuttaa eriytetty jälkeläisiin. Otaksuttu CIC on havaittu myelooista leukemiaa [3], ja kasvaimet aivoissa [5], [6] ja rintojen [7]. Viime aikoina, keuhkojen CIC: t on eristetty ihmisen solulinjoissa ja potilaan näytteet [8] – [15]. Tutkitaan keuhko CIC voi lisätä ymmärrystä alkuperän keuhkosyövän ja saattaa johtaa uusiin hoitomenetelmät kohdistamista näihin soluihin.

CIC on osoitettu muodostavan monisoluisten kolmiulotteisia palloja

in vitro

kasvatettuna in tarttumattomat seerumitonta olosuhteet [6], [16]. Näissä olosuhteissa, useimmat kasvainsolut tehdään anoikis, muoto ohjelmoidun solukuoleman, kun taas harvinainen CIC: t jakavat tuottaa kasvaimen pallosia. Pallo määritys ja ehdotti äskettäin matemaattinen tulkinta mahdollistaa arvioida symmetrisen jako laajeneminen pahanlaatuisten kantasolun kaltaisia ​​soluja, ja arviointi hoidon vaikutuksia on itseuudistumisen ja proliferatiivinen toiminta näiden solujen [17]. Tämä määritys on tehokas keino arvioida toiminnalliset ja fenotyyppiset ominaisuudet liittyvät CIC. Tutkimuksessa, jossa käytettiin potilaan keuhkosyöpä näytteitä, pallo muodostuminen havaittiin seitsemässä 19 kasvainten tutkitaan [10]. Nämä solut havaittiin olevan

in vitro

ja

in vivo

ominaisuuksien CIC lukien itseuudistumisen, proliferatiivisia ja erilaistumista kapasiteetti, ilmaus CD133, rikastus puolelle väestöstä (SP) soluja, lauseke alkion ”stemness” geenit Oct-4 ja Nanog, kemoterapia vastus, ja kasvainten muodostumiseen. Sphere kulttuuri on käytetty rikastamiseksi keuhkosyövän CIC populaatiot [8], [9], [13], [14].

mikrovalokuvia (10x) passage 2 päivää 7 alalla viljelmistä (A) TC -1 aloilla, (B) HM-LLC palloja ja (C) LM-LLC alalla mediakulttuurin. Bar = 100 pm. (D) Yhteensä kertaiseksi laajennus ja (E) symmetrinen jakotaajuuden yli kahdeksan kohtia TC-1 aloilla (punainen) ja HM-LLC palloja (musta), ja kaksi kanavaa varten LM-LLC alalla mediakulttuurin (harmaa) osoittaa merkittäviä eroja; * P 0,001. (F-G) Taita laajeneminen yli seitsemän kohtia TC-1 aloilla (punainen) ja HM-LLC palloja (musta). (H) Passage 2 aloilla viljeltiin ja laskettiin solujen kokonaismäärän päivinä, kuten on esitetty. Kokeilu toistettiin kahdesti, edustavia tuloksia on esitetty. Päivänä 1 kokonaismäärä solujen viljelmässä vähenee. Elossa mitogeeni reagoiva syöpä aloittamista solut ovat vastuussa solujen lisääntymisen ja tuottavan tuore monisoluisten aloilla, jotka voidaan korjata päivänä 7. Bars: ± Standard keskivirhe (SEM).

Hiiren keuhkosyöpä ei ole hyvin ominaista läsnäolo ja taajuus CIC. Suurin osa tutkimuksista keuhkojen CIC ovat käyttäneet ihmisen solulinjoja tai primäärikasvain näytteitä, joissa tuumorigeenisuus tutkittava ainoastaan ​​immuunipuutteisilla hiiren malleissa. Tärkeää on, vuorovaikutukset immuunijärjestelmää ja kasvaimen microenvironment on osoitettu olevan merkittävä rooli hoitovastetta. Todellakin, keuhkosyöpä ja monia muita kasvaimia, joita esiintyy immuunipuutteisilla isäntä käyttäytyä aggressiivisemmin, vastaavan huonosti hoitoon, ja huonompi tuloksia [18], [19]. Siksi tarkemmin mallintaa immuunijärjestelmän vuorovaikutusten tarkasteluun perustamiseen kasvainten CIC, tutkimme hiiren keuhkon kasvainsolut rikastettu CIC käytettäessä immunokompetenteilla syngeenisissä eläin. Nykyinen tutkimus raportoi tunnistamiseen ja hiiren keuhkojen CIC käyttäen alalla viljelymenetelmiä ja vertaileva arviointi näiden solujen syngeenisissä ja immuunipuutteisilla hiiri malleja.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

Hiiren TC-1 ja vanhempien Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) solut hankittiin ATCC (Manassas, VA). Korkea metastaattinen (HM-LLC) ja alhainen metastaattinen (LM-LLC) subklooneja LLC [20], [21] olivat lahja tri Zhongyun Dong (University of Cincinnati, Cincinnati, OH), ja viljeltiin adherentteina soluja Dulbeccon modifioitu Eagle media (DMEM) (Mediatech, Inc., Manassas, VA), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja 1% penisilliini G-streptomysiiniä (Invitrogen). Solulinjat 18948, 18955-Tarttuneesta, 18955-Kelluvat (tarttumattoman klooni 18955 soluja), ja 18959 solut ovat

de novo

hiiren pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) solulinjojen ja olivat lahja tohtori . Kathryn Wikenheiser-Brokamp (Cincinnati lastenterveyskeskus, Cincinnati, OH). Nämä solulinjat opiskellut yliopistossa Cincinnati Institutional Animal Care ja Käytä hyväksyntänsä (lisäpöytäkirjan 11-03-21-01). Hiiren keuhkojen kasvainsolulinjoja MLE12 ja MLE15 [22], jotka ovat peräisin siirtogeenisten hiirten kätkeminen apinan virus 40 (SV40), suuri kasvain antigeenin, jonka transkriptiota ohjaa ihmisen pinta-aktiivisen proteiini C: n (SP-C) promoottorin, olivat lahja Dr. Jeffrey Whitsett (Cincinnati lastenterveyskeskus). SCLC-solulinjat ja MLE12 ja MLE15 soluja viljeltiin HITES media [23]. Hiiren adenokarsinooma keuhkosyövän solulinjat 393P, 344P, ja 344SQ [24] peräisin Kras

La1 /+ p53

R172HΔG hiiret olivat lahja Jonathan M. Kurie (The University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston , TX) ja viljeltiin DMEM 10% FCS.

Eläimet ja etiikka lausunto

C57BL /6-hiiriä saatiin Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) ja NOD-SCIDγ (NSG , NOD.Cg-

Prkdc

scid Il2rg

tm1Wjl Twitter /SzJ) hiiriä vakiintunut jalostukseen siirtomaa Cincinnati lastenterveyskeskus. The University of Cincinnati Institutional Animal Care ja käyttö komitea hyväksyneet sen tähän työhön (lisäpöytäkirjan 11-03-21-01). Kaikki menettelyt olivat mukaisesti institutionaalisten eläinten hyvinvointia suuntaviivoja, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Reaaliaikainen PCR kvantitointiin tehtiin Oct-4, geeni liittyy kantasolujen itseuudistumisen mRNA ilme. TC-1 palloja (A) ja HM-LLC aloilla (B), osoittavat kasvanut Oct-4: n ekspression verrattuna täsmäsi tarttuneet solut; * P≤0.001. HM-LLC solut ilmensivät huomattavasti Oct-4 kuin LM-LLC tarttuvien solujen; ** P = 0,005. Tontit edustavat yhdistetyt tiedot 2-4 biologisista rinnakkaista, joissa kussakin on kolme teknistä rinnakkaista. TC-1-soluja (punainen); LM-LLC kiinni (harmaa); HM-LLC-solut (musta). Bars: ± SEM.

(A-B) palstojen osoittaa Aldefluor värjäytymistä (sininen) ja DEAB ohjaus värjäytymistä (punainen) HM-LLC, LM-LLC ja TC-1 tarttuvien solujen verrattuna passage 2, päivänä 1 ja päivänä 7 alalla peräisin olevat solut. Aldefluor korkea ilmentävien solujen (suorakulmainen laatikko) on merkittävästi suurempi (C) tiheys ja (D) keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus (MFI) Aldefluor sisällä HM-LLC aloilla kuin LM-LLC tai HM-LLC kiinnittyneet solut, ja HM-LLC kiinnittynyt solut ilmentävät enemmän Aldefluor kuin LM-LLC tarttuvien solujen; taajuus (C) * P≤0.001; MFI (D) * P≤0.002. Verrattuna DEAB värjäystä, Aldefluor positiivisuus (ei-suorakulmainen laatikko) havaittiin olevan huomattavasti korkeampi TC-1 tarttuvat solut verrattuna palloja (E); * P≤0.004. MFI Aldefluor sisällä TC-1 ryhmissä (F) ei havaittu olevan merkittävästi erilainen. Ei Aldefluor korkea väestön todettiin TC-1 palloja tai kiinnittyneitä soluja. Tontit edustavat yhdistetyt tiedot kahdesta biologisesta mallikertaa kolme teknistä rinnakkaista, joista kussakin. Bars: ± SEM.

edustaja SP lohkoilta (A) LLC-solut ja (B) TC-1-soluissa verrataan täsmäsi tarttuvat solut kulumisesta 2, päivä 1 ja päivä 7 pallo peräisin olevat solut. Hoechst 33342 värjäys vahvistettiin verapamiilin kanssa saarron. (C) SP taajuus oli merkittävästi lisääntynyt HM-LLC aloilla verrattuna tarttuneet solut; * P 0,001; ** P≤0.012. HM-LLC ja LM-LLC kiinnittyneet solut eivät eronneet merkittävästi SP taajuutta. (D) SP ei todettu olevan yliaktiivista alalla johdettuja TC-1-soluissa verrattuna Hyväksytty tarttuneet solut. Päivä 1 pallo peräisin olevia soluja oli huomattavasti alhaisempi taajuus SP-solujen verrattuna kiinnittyneet solut ja päivä 7 alalla peräisin olevat solut; * P = 0,03. Tontit edustavat yhdistetyt tiedot kolmesta biologisista rinnakkaisena kolmen teknisen rinnakkaista, joista kussakin. Bars: ± SEM.

(A) edustaja virtaussytometria tontteja CD133 (Y-akseli) ja CD44 (X-akseli) co-värjäystä. (B ja D) keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus (MFI) CD44 on esitetty korjattu intensiteetti isotyypin värjäytymistä LLC ja TC-1-soluja. (B) HM-LLC aloilla ja tarttuneet solut sekä LLC (ATCC) ilmentävät suurempia määriä CD44 verrattuna LM-LLC soluissa. Sphere peräisin olevien solujen havaittiin olevan pienempi MFI CD44 verrattuna HM-LLC tarttuneet solut. D7 pallo peräisin olevia soluja oli alempi rahalaitos varten CD44 verrattuna D1 soluihin; * P 0,001. (D) Day 1 TC-1 pallo peräisin olevat solut ilmentävät vähemmän CD44 kuin päivä 7 tai kiinnittyneitä soluja; * P≤0.002. (C) CD133 taajuus positiivisten solujen on suurempi HM-LLC aloilla verrattuna LM-LLC tarttuvien solujen; * P≤0.043. CD133 ilme ei ollut merkitsevää eroa HM-LLC tarttuvat solut ja pallojen tai yksi kolmesta eri LLC tarttuneet solut. (E) ei ole merkittävää eroa CD133 ilmentyminen keskuudessa TC-1 viljelyolosuhteissa. Experiment tehdään kolmena kappaleena, edustavia tuloksia on esitetty. Bars: ± SEM.

luottamusväli juoni rajoittavan laimennuksen analyysi on esitetty y-akselilla näytetään arvioitu taajuus syövän aloittamista solujen (CIC). (A) rajoittava laimennus TC-1-soluja (120000, 80000, 40000, 10000, 5000, ja 1000) injektoitiin subkutaanisti syngeenisiin C57BL /6-hiiriä (n = 4-8). Sphere peräisin olevien solujen havaittiin olevan tuumorigeenisemmiksi kuin tarttuneet solut; * P≤0.001; ** P 0,02. Päivä 1 pallo peräisin olevat solut olivat tuumorigeenisemmiksi kuin 7. päivänä; *** P = 0,04. Rajoittava laimennus- (10000, 1000, ja 500-solut) (n = 6-8) ja samat kolme ryhmää injisoitiin NSG hiirillä ja CIC taajuus havaittiin olevan alle 1/500 kaikille ryhmille. (B) analyysi LLC rajoittavan laimennuksen kasvain kokeilu syngeenisille (80000, 40000, 20000 ja 10000 solua) ja immuunipuutteisilla (NSG) hiiriä (80000, 40000, 10000 ja 1000 solua) (n = 4-9). Mitään merkittäviä eroja huomata; kuitenkin, pallo peräisin olevat solut tiettyjä kehityssuuntia kohti on tuumorigeenisemmiksi kuin HM tai LM kiinnittyneitä soluja C57BL /6-hiirissä. Matalammat numerot istutettujen solujen tarvittiin aloittaa kasvaimia immuunipuutteisilla eläimiä kuin syngeenisissä eläimiä, joilla on arvioitu CIC taajuus alle 1/1000 kaikille LLC ryhmille.

Tumorsphere Analyysit

Soluja viljeltiin, kuten tumorspheres DMEM /F12 (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT), joka sisälsi 20 ng /ml rhEGF (R 1 usean kohtia (kuvio 1 D). Sphere viljelmät TC-1 ja HM-LLC ollut positiivinen syöpä kantasolun /CIC symmetrinen jako taajuus, kun taas LM-LLC-solut eivät (kuvio 1 E). Tämä osoittaa, että alalla mediakulttuurin olosuhteet voivat tunnistaa otaksuttu CIC näiden kahden solulinjoista. FE oli suhteellisen vakaa jakolukuun TC-1 (kuvio 1 F) ja HM-LLC (kuvio 1G) aloilla. 24 tunnin kuluessa passage noin 30% (HM-LLC) tai 54% (TC-1) solua tehdään anoikis /solukuoleman (kuva 1 H). Loput mitogeeni-reagoivaa solujen D1 lähti muodostaa palloiksi D7. Oletimme, että D1-solut rikastettiin CIC verrattuna D7 soluihin, kuten D7 solut todennäköisemmin koostuu noin CIC: t ja suurempi määrä eriytetty kasvainsoluissa.

Oct-4-mRNA: n ekspressio on tehostettu in Sphere -johdannainen solut

Expression of Oct-4, geeni osallistuu kantasolujen itseuudistumiseen ja avainsäätelijä pluripotenttisuuden jotka voivat yksin ohjelmoida soluja pluripotenssia [28], arvioitiin Hyväksytty tarttuu ja passage 2, D1 ja D7 pallo solujen TC-1 ja HM-LLC, ja tarttuu LM-LLC soluissa. Data normalisoitiin ilmentymisen β-aktiini ja standardoitu ilmentymistasoihin joko TC-1 (kuvio 2A) tai HM-LLC kiinnittyneitä soluja (kuvio 2B). Sphere johdetut solut ilmensivät merkitsevästi enemmän Oct-4 mRNA kuin sovitetun tarttuneet solut; P≤0.001. TC-1 pallo viljeltyjä soluja joko D1 tai D7 ilmaistuna noin 6-kertaisesti enemmän Oct-4 verrattuna tarttuneet solut. HM-LLC pallojen joko D1 tai D7 ilmaistuna yli 1,7 kertaa enemmän Oct-4 kuin tarttuvien solujen. LM-LLC kiinnittyneet solut ilmensivät Oct-4 noin 60% tasolle tarttuneiden HM-LLC soluissa. Expression of Sox2 ja Nanog, jotka liittyvät itseuudistumiseen ja stemness, ei todettu olevan huomattavasti eri ilmaisseet välillä pallojen ja kiinnittyneitä soluja (tuloksia ei esitetä).

Aldefluor Aktiivisuus paranee HM-LLC muttei TC-1 Spheres

ALDH1 ilme ja toiminta on korreloinut CIC aktiivisuus ja lisääntynyt aggressiivisuus keuhkotuumoreiden [12]. Tutkimme ALDH1 toimintaa Hyväksytty tarttuu ja pallo kulttuureissa. Palstojen on esitetty tarttuva HM-LLC: n ja LM-LLC verrattuna P2, D1 ja D7 alalla viljeltyjä soluja (kuvio 3A) ja tarttuva TC-1-soluja verrattuna P2, D1 ja D7 alalla viljeltyjä soluja (kuvio 3B). HM-LLC aloilla, osajoukko korkean Aldefluor ilmentävien solujen havaittiin olevan merkittävästi lisääntynyt alalla viljellyissä soluissa verrattuna HM-LLC tai LM-LLC kiinnittyneitä soluja (kuvio 3A); P≤0.001 taajuuden, ja P≤0.002 Keskimääräisen fluoresenssin voimakkuus (MFI) (kuvio 3C ja 3D). TC-1 pysyvä ja pallo-johdetut solut ilmensivät alhaisia ​​Aldefluor aktiivisuutta (kuvio 3B). Adherentteja TC-1-soluja osoitti enemmän Aldefluor-positiivisia soluja verrattuna alalla peräisin olevia soluja (kuvio 3E); P≤0.004. Nämä tasot eivät olleet merkittävästi erilaiset, kun analysoitiin rahalaitosten (kuvio 3F).

SP paranee HM-LLC muttei TC-1 Spheres

tarkastelimme Hyväksytty kiinnittyneet solut, ja P2, D1 ja D7 pallo kulttuureja Hoechst 33342 SP. Kontrollina, verapamiili käytettiin häiritä toimintaa Hoechst 33342 transporter. SP määriteltiin vähentynyt solujen populaatio, kun läsnä on verapamiili. Esimerkkejä profiileja LLC-solut (kuvio 4A) ja TC-1-soluja (kuvio 4B) on esitetty. SP taajuus havaittiin lisääntynyt aloilla HM-LLC verrattuna kiinnittyneet solut joko HM-LLC tai LM-LLC; P≤0.012 D1- palloja ja P 0,001 D7 palloja (kuvio 4C). Keskimääräinen osa SP solujen kanssa kolmen biologisen toistojen HM-LLC P2, D1 aloilla oli 1 ± 0,5%, P2, D7 pallojen 2 ± 0,7%, HM-LLC tarttuvien solujen 0,4 ± 0,4% ja LM-LLC kiinnittynyt soluja 0,4 ± 0,3%. TC-1 tarttuu alustaansa ja pallo-kulttuureissa ilmaistaan ​​matalat taajuudet SP soluja. SP taajuutta ei todettu parannettu alalla viljellyt verrattuna kiinnittynyt TC-1 (kuvio 4D). Päivä 1 pallo johdettujen solujen havaittiin olevan harvenevat SP-solujen verrattuna kiinnittyneet solut tai D7 alalla peräisin olevat solut; P = 0,03.

CD133 ilmentyminen lisääntyy in HM-LLC Kuulat ja CD44 Expression paranee HM-LLC solut verrattuna LM-LLC Cells

arvioinnin lisäksi toiminnallisia ominaisuuksia CIC tällaisten kuten ALDH1 aktiivisuus ja Hoechst 33342 väriainetta ulosvirtausta, myös pyrittiin luonnehtimaan TC-1 ja LLC-solujen ilmentymisen CD44 ja CD133, oletetun CIC solunpintamarkkereiden. Palstojen varten CD44 ja CD133 esitetään (kuvio 5A). Niistä TC-1 ja LLC-solut, kaikki solut ilmaistu CD44. CD44 lauseke HM-LLC aloilla verrattuna HM-LLC tarttuvien solujen osoitti laskua varten pallojen ilmaisee yleisesti (kuviot 5A ja 5B). CD44: n ilmentyminen oli vaihteleva yksi LLC-solulinjoja ja viljelyolosuhteet (kuviot 5A ja 5B). Adherentteja solulinjat näkyy tasaisempi ilmaus CD44, kun taas pallo-viljeltyjen solujen osoitti enemmän heterogeeninen ilmaus joidenkin soluihin, jotka ilmentävät laski määriä CD44 taas useimmat pysyi CD44 kirkas. CD44 rahalaitos ilmentyminen havaittiin vähenevän välillä D1 ja D7 soluja; P 0,001 (kuvio 5B). LM-LLC soluilla vähiten voimakas värjäytymisen CD44 verrattuna kaikkiin muihin LLC solutyyppejä ja viljelyolosuhteet; P 0,001 (kuvio 5A). Eroa ei havaittu ilmentämiseen CD133 keskuudessa HM-LLC kiinnittyneet solut ja P2, D1 ja D7 alalla viljelmäsoluja; oli kuitenkin merkittävä kasvu taajuus CD133 positiivisuus keskuudessa HM-LLC aloilla, sekä D1 ja D7 viljeltyjä soluja verrattuna LM-LLC-solut (kuvio 5C).

CD44-ilmentyminen väheni P2, D1 pallo peräisin olevien solujen TC-1-soluissa verrattuna kiinnittyneet solut ja P2, D7 soluja (kuvio 5D). Eroa CD44 ilmentyminen oli havaittavissa P2, D7 TC-1-soluissa verrattuna kiinnittynyt TC-1-soluissa. Mitään merkittäviä eroja ei havaittu ilmentymiseen CD133 keskuudessa TC-1 soluviljelmässä olosuhteissa (kuvio 5E).

Sphere johdettuja soluilla Suurempi kasvainten muodostumiseen hiirissä verrattuna tarttuvat solut

arvioitiin tuumorigeenisyyden D1 ja D7 aloilla verrattuna tarttuneet solut. Tutkimme myös tuumorigeenisyyteen näiden solujen immunokompetenteilla hiirissä verrattuna immuunipuutteisilla NSG hiiriä, jotta voidaan paremmin käsitellä CIC mallin näissä kahdessa eri hiiren ympäristöissä [29]. Käyttämällä rajoittavan laimennuksen analyysi, TC-1 aloilla havaittiin olevan huomattavasti tuumorigeenisemmiksi hiirissä verrattuna TC-1 tarttuneet solut; P≤0.001 P2, D1-solut ja P = 0,0158 ja P2, D7-soluihin (kuvio 6A). D1 TC-1 aloilla olivat tuumorigeenisemmiksi kuin D7 aloilla; P = 0,04. TC-1 P2, D1 palloja arvioitiin olevan CIC taajuus 1 solun kohti 9533 solua. P2, D7 pallot olivat seuraavaksi tuumorigeenisen oli arviolta CIC taajuus 1 solun kohden 21918 solut, ja kiinnittyneet solut havaittiin olevan vähiten tuumorigeenisen, jonka arvioitu taajuus 1 solun kohden 62129 soluja. LLC-soluja istutettiin hiirissä, oli suuntaus alempi CIC taajuuden joukossa aloilla (D1-solut, 1 per 29694-solujen ja D7 solun 1 per 35949 solua) verrattuna kiinnittyneitä soluja (HM-LLC 1 per 46989-solujen ja LM-LLC 1 per 49686 solua), mutta tämä suuntaus ei saavuttanut merkitsevyyttä (kuvio 6B). Vuonna NSG hiirillä kaikki laimennukset kustakin solulinjasta ja viljelyolosuhteissa testattu kykeni muodostamaan kasvaimia 100% hiiristä. Kun testataan, alle 500 solua TC-1 ja pienempi kuin 1000 solua varten LLC-soluja riitä osoittamaan kasvaimen NSG hiirissä (kuvio 6A ja 6B).

Keskustelu

Suurin osa tutkimukset CIC on käytetty potilaasta peräisin materiaalista tai vahvistettu ihmisen kasvaimen solulinjojen ympättiin heikentynyt immuunivaste hiiriin. Vaikka nämä ksenografti tutkimukset antavat mahdollisuuden selvittää osa-solupopulaatio pystyy kerrata kasvain immuunipuolustuksen hiiri, ne eivät voi esittää tarkkaa kuvaa ominaisuuksien todellisen CIC. Jotta muodostaa kasvain ihmisessä, potentiaalinen CIC on vuorovaikutuksessa immuunijärjestelmän estää kasvaimen tunnustamista ja poistamiseen. Todisteeksi tästä, osoitimme että syngeeninen immunokompetenteilla hiirillä vaativat huomattavasti enemmän soluja aloittamaan kasvain kuin immuunipuutteisilla hiirillä. Tästä voidaan oletettuun, että on olemassa suurempi solupopulaation kykenevät kasvamaan kasvaimia immuunipuutteisilla hiirillä, jotka eivät voi aloittaa kasvaimia niiden syngeenisissä kollegansa, ja että todellinen CIC: t voivat edustaa paljon harvinaisempi väestöön kuin määritetty xenograph malleissa.

soveltaminen alalla kulttuurin havaitsemiseksi otaksuttu CIC on käytetty erilaisten kasvainten [10], [16], [17], [30]. Tietääksemme tämä on ensimmäinen kerta, kun paneeli hiiren keuhkosyövän solulinjat on systemaattisesti tutkittu pallo muodostavat kapasiteetti ja rikastaminen CIC (taulukko 1). Erityisesti TC-1 ja HM-LLC aloilla kykenivät kestävää kasvua viljelmässä. Tällä passage, huomattava määrä soluja kuolee ensimmäisen 24 tunnin aikana. Tämä osoittaa, että sisällä pallo kulttuureissa on olemassa väestöryhmästä soluista, jotka kykenevät uudistamaan itsensä ja leviämisen, otaksuttu CIC. Kuitenkin kaikki solulinjat kykenivät kestävää kasvua aloilla. Seitsemän yhdeksästä solulinjoja muodostettiin palloja ja testattiin pitkän aikavälin kulttuurin kapasiteetti oli FE alla tai sisällä keskihajonta 1 (taulukko 1). Fe alle 1 viittaa siihen, että muut solut rajoitetun leviämisen kapasiteetti lisäksi totta CIC voisivat muodostaa palloja, tai että todellinen CIC voisi epäsymmetrisesti jakaa ajan myötä erilaistuneita soluja ei kykene kulttuurin alalla olosuhteissa. Siten pallo muodostumista yhden tai kaksi kanavaa ei ole niin helppoa etsiä CIC kuten pitkittynyt alalla kulttuurin useiden kohtien ja soveltamalla matemaattista mallia arvioidaan CIC symmetrinen jako taajuus [17].

Vastakohtana vanhempien LLC ja LM-LLC-solut, HM-LLC-solut pystyvät muodostamaan aloilla, jotka voidaan siirrostaa yli kahdeksan kertaa, ja osoitti vankan kertainen laajeneminen ja symmetrinen jako taajuus. Lisäksi pallo muodostuminen todettiin, että metastaattisen hiiren keuhkon adenokarsinooma linjat 344P ja 344SQ, mutta ei ei-metastasoitunut solulinjassa 393P. Nämä kolme solulinjat on aiemmin raportoitu muodostaen kolmiulotteisia pallojen matrigeeliä kulttuurin ja etäpesäkkeiden-altis linjat on luonnehdittu jossa tapahtuu epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) [24]. On esitetty, että voi olla suora yhteys EMT solujen ja hankinta kantasolun kaltainen /CIC fenotyyppi [31]. Tuloksemme viittaavat siihen, että metastaattinen soluilla on rikastettu kyky kulttuuriin tarttumattomia palloset, ja että metastaattinen solut rikastetaan CIC. Tulevaisuuden tutkimuksia tarvitaan puuttua tähän.

osoitettu, että taajuus CIC muuttuu ajan kuluessa käytävän hiiren keuhkosyöpään tumorspheres.