Krooninen sairaus

tiivistelmä

peroksisomiproliferaattoriaktivoidun reseptorin β /δ (PPARβ /δ) on tumareseptorin osallistuu säätelyyn lipidi- ja glukoosiaineenvaihdunnan, haavan paranemista ja tulehdusta. PPARβ /δ on liittynyt myös syöpään. Täällä tutkimme ilmaus PPARβ /δ ja komponenttien prostaglandiinin biosynteesitien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Löysimme lisääntyneen ilmentymisen PPARβ /δ, Cox-2, CPLA

2, PGES- ja VEGF ihmisen NSCLC verrattuna normaaliin keuhko. NSCLC solulinjoissa PPARβ /δ aktivaatio lisäsi proliferaatiota ja eloonjäämistä, kun taas PPARβ /ö knock-down vähensi elinkelpoisuus ja lisääntynyttä apoptoosia. PPARβ /δ agonistit indusoi Cox-2 ja VEGF transkriptio, mikä viittaa olemassaolo rehu-eteenpäin silmukoiden solun eloonjäämisen edistämisessä, tulehdusta ja angiogeneesiä. Näitä vaikutuksia havaittiin vain suuren PPARβ /ö ilmentävien solujen, kun taas vähäinen ilmentävät solut olivat vähemmän tai ei vaikuta. Vaikutukset olivat myös poistettiin PPARβ /ö knock-down tai inkuboimalla PPARβ /δ antagonisti. Induktio VEGF johtui sekä sitoutumisen PPARβ /δ VEGF-promoottorin ja PI3K aktivointi kautta ei-genomista mekanismi. Huomasimme, että PPARβ /δ vuorovaikutuksessa PI3K sääntely alayksikköä p85α johtavat PI3K aktivointia ja Akt fosfory-. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että PPARβ /δ voisi olla keskeinen tekijä keuhkojen syövän synnyn ohjaa useita reittejä ja edustavat potentiaalisimmaksi NSCLC hoitoon.

Citation: Genini D, Garcia-Escudero R, Carbone GM, Catapano CV (2012) Transkription ja Non-transkriptiota toiminnot PPARβ /δ in ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 7 (9): e46009. doi: 10,1371 /journal.pone.0046009

Editor: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: toukokuu 11, 2012; Hyväksytty: 23 elokuu 2012; Julkaistu: 25 syyskuu 2012

Copyright: © Genini et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä oli tukee ”Fondazione Ticinese per la ricerca sul cancro.” rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peroksisomiproliferaattoriaktivoidun reseptorit (PPAR: t) ovat nukleaarihormonireseptorit (NHRs) aktivoidaan lipofiilisten ligandit, mukaan lukien pitkäketjuiset rasvahapot ja prostaglandiinien [1]. PPAR muodostavat heterodimeerejä retinoidi-X-reseptori (RXR) ja sitoutuvat konkreettisiin seikkoihin geenien promoottorit. PPAR osallistuvat metabolisia ja kehityshäiriöitä prosesseja. PPARβ /δ on tärkeä rooli lipidien ja sokeriaineenvaihduntaan ja on houkutteleva terapeuttinen kohde aineenvaihdunnan ja rappeutumissairaudet [1]. PPARβ /δ on myös osallisena tulehdusta, haavan paranemista, solujen kasvuun ja erilaistumiseen. PPARβ /δ yli-ilmentyy ihmisen syövissä, ja ne voivat olla tärkeitä tuumorin taudin alkamisen ja etenemisen [1]. Tueksi pro-tuumorigeenistä toiminto, PPARβ /δ ligandeja edistää syövän solujen eloonjäämistä in vitro [2], [3], [4] ja kasvaimen kasvua hiirissä [5], [6], [7]. Sitä vastoin geneettinen knock-out PPARβ /δ paksusuolen syöpäsoluissa laski kasvaimen kasvua hiirissä [8]. Muut tiedot, kuitenkin käyttäen agonistit ja geneettisen knock-out solujen ja hiiren mallit ovat ristiriidassa tämän kasvain mainostaisi [9]. Knock-out of PPARβ /δ paksusuolen syövän mallien ilmoitettiin edistää kasvainten muodostumista hiirillä, kun taas agonistit vähensi solujen lisääntymistä in vitro ja kasvaimen kasvua hiirissä [10], [11], [12]. Erilaiset tekijät voivat vaikuttaa vaste ligandin aktivointi, yli-ilmentyminen ja knock-out PPARβ /δ. Me raportoitu aiemmin, että ilmentyminen ja toiminta PPARβ /δ vaihteli huomattavasti ihmisen NSCLC solulinjoissa ja PPARβ /δ proteiinin taso riippui ligandien kyky suojata proteosomal hajoaminen [13]. Pohjapinta taso reseptorin ja tämän transkription jälkeisen sääntelyn askel voisi selittää osittain muuttujan vastausten PPARβ /δ agonistit erilaisissa koeolosuhteissa [14].

aikana haavan paranemista ja tulehdus PPARβ /δ toiminto on liittyvä induktio syklo-oksigenaasi-2 (COX-2) [1]. Cox-2 muuntaa arakidonihappoa vapautuu fosfolipaasi

2 (CPLA ​​

2) osaksi PGH

2 [15]. PGH

2 muunnetaan sitten prostaglandiinit, kuten prostaglandiini E

2 (PGE

2) ja prostaglandiini I

2 (SMM

2), jolla monimutkaisten biologisia vaikutuksia. Arakidonihapon ja SMM

2 toimivat PPARβ /δ agonistit [2], kun taas PGE

2 tehostaa toimintaa PPARβ /δ ilman suoraan sitoutumista reseptoriin [6]. Steroideihin kuulumattomia tulehduskipulääkkeitä (NSAID) ja COX-2-inhibiittorit vaikuttavat PPARβ /δ estämällä prostaglandiinien [3]. Toisaalta, lisääntyneen ekspression PPARβ /δ on raportoitu suojaamaan syöpäsoluja antiproliferatiivinen ja pro-apoptoottista vaikutusta NSAID-lääkkeiden ja Cox-2-estäjät [3]. Cox-2-yli-ilmentyy pre-pahanlaatuisia ja pahanlaatuisia leesioita, mukaan lukien keuhkosyövässä [16], ja sillä on tärkeä rooli kasvaimeen liittyvä tulehdus ja angiogeneesi [15]. Lisäksi PPARβ /δ ja Cox-2 voi vaikuttaa tuotannon proinflammatoristen ja pro-angiogeenisten tekijöiden kasvaimissa, kuten verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF) [17], [18]. Siten nykyinen näyttö asettaa PPARβ /δ yhdessä Cox-2: n ja prostaglandiini synthases sisällä signaalipolkuja voisi valvoa leviämisen ja selviytymistä syöpäsolujen ja niiden vuorovaikutusta kasvain microenvironment.

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti [19]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) edustaa noin 85% kaikista keuhkosyövässä. NSCLC diagnosoidaan usein edennyt pitkälle ja on erittäin huono ennuste. Parempi ymmärrys tekijöitä alkuperää ja etenemistä NSCLC voi johtaa paranemiseen hoitoon ja ennaltaehkäisyyn. Tässä tutkimuksessa selvitettiin, onko ja miten PPARβ /δ voisivat myötävaikuttaa patogeneesiin NSCLC. Huomasimme, että PPARβ /δ oli usein säädelty vahvistavasti NSCLC verrattuna normaaliin keuhko. PPARβ /δ yli-ilmentyminen liittyy yleensä lisääntynyt ilmentyminen CPLA

2, Cox-2, PGES- ja VEGF. Tutkimme seuraukset PPARβ /δ aktivaatio soluproliferaatioon ja eloonjääminen sekä ilmentymistä Cox-2 ja VEGF NSCLC solulinjoissa. Löysimme todisteita sopusoinnussa pro-tuumorigeenistä rooli PPARβ /δ NSCLC. Lisäksi olemme havainneet, että PPARβ /δ agonistit johti induktion VEGF myös läpi rinnakkain ei-transkription mekanismi liittyy PI3K /Akt aktivointi. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että PPARβ /δ voisi olla keskeinen tekijä keuhkojen syövän synnyn ohjaa useita prosesseja ja reitit ja siten edustaa potentiaalisimmaksi kehittää uusia strategioita keuhkosyövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines

Ihmisen keuhkokarsinooma solulinjat H358, H441, H23 ja A549 hankittiin American Type Culture Collection (LGC Promochem, Molsheim, F) ja pidettiin RPMI: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Soluja kasvatettiin fenolipunaista RPMI, jota oli täydennetty 5% hiilellä erotettua seerumia (HyClone, Logan, UT, USA) ennen inkubointia PPAR-ligandit.

Chemicals

GW501516, LY294002 ja siglitatsonia ostettiin Alexis (Lausanne, Sveitsi). cPGI

2 hankittiin Biomol (Plymouth Meeting, PA). L165041 ja NS398 saatiin Sigma (Buchs, CH). Wortmanniini hankittiin Calbiochem (Merk Biosciences, Nottingham, UK). PPARβ /δ antagonisti GSK0660 toimitti Dr. A. Billin (GlaxoSmithKline, USA). Kaikki yhdisteet liuotettiin DMSO: hon.

Potilasnäytteet

Keuhkosyöpä yksilöt (okasolukarsinoomia ja adenokarsinoomista, vaihe IA IIIA) ja viereisen normaalin keuhkokudoksen kudosnäytteitä olivat peräisin Medical University of South Carolina (Charleston, SC, USA) ja saatiin aikaan leikkauksen potilaan suostumus. Kudosnäytteitä snap-jäädytetään ja säilytetään nestemäisessä typessä. RNA eristettiin käyttäen RNA STAT-60. RT-PCR suoritettiin käyttäen 100 ng kokonais-RNA: ta ja 0,4 uM alukkeita, joissa SuperScript One-Step RT-PCR: llä (Invitrogen). PCR-tuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla, visualisoitiin käyttäen AlphaImager (AlphaInnotech) ja kvantifioidaan densitometrinen analyysi käyttäen AlphaImager ohjelmistoa. Tulokset esitettiin suhde kaistan intensiteetti pariksi kasvain ja normaali näytteiden normalisoida referenssiantennin geeni β-aktiini. Pearsonin korrelaatiota analyysi suoritettiin normalisoitu geenin ilmentymisen tasoa. Genominlaajuisten transcriptome aineistoja ihmisen keuhkosyöpä ja normaalin keuhkokudoksen kudosnäytteitä neljästä eri tutkimuksissa (PMID: 18992152, 11707590, 20421987, 18641660) käytettiin tutkimaan korrelaatioita PPARβ /δ ja oletettua kohdegeenien. Normalisoitu geenien ilmentyminen arvot kullekin transkriptio ladattu ja Pearsonin korrelaatiokerrointa ja vastaava p-arvo suhteessa PPARβ /δ laskettiin näytteet kussakin aineisto.

lusiferaasimäärityssysteamiä

PPARβ /δ reagoiva toimittaja (DRE) tarjosi B. Vogelstein [3]. Solut transfektoitiin DRE tai perus pGL3 lusiferaasireportterista yhdessä PRL-SV40 ohjaus plasmidilla käyttäen Lipofectamine. Soluja kasvatettiin RPMI 5% hiilellä erotettua seerumia 24 tunnin ajan. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Kit (Promega), kuten on kuvattu [20].

Cell Proliferation ja elinkelpoisuus

Solut maljattiin 96-kuoppalevyille fenolipunaista RPMI täydennetty 5% hiilellä erotettua seerumia. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin ligandeja tai DMSO: ta (0,1%), 0,1% hiilellä erotettua seerumia. Elävien solujen määrä määritettiin käyttäen MTT: n jälkeen 72 h [20]. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta. Solusyklin analyysi-soluja kasvatettiin 0,1% hiilellä erotettua seerumia ja kerättiin 24 tunnin kuluttua inkubaation ligandeja tai DMSO. Sitten solut värjättiin propidiumjodidilla ja analysoitiin virtaussytometrialla, kuten on kuvattu [20].

RNA Interference

knock-down kokeissa soluja siirrostettiin pienenä pitoisuutena (30-50% konfluenssiin ) ja transfektoitiin 10 nM siRNA (Ambion, Huntingdon, Iso-Britannia) on suunnattu PPARβ /δ (siPPARβ /δ) ja tulikärpäsen lusiferaasi (siGL3) käyttäen Interferin mukaisesti valmistajan ehdottaman protokollan (Polyplus). Transfektio siRNA toistettiin kolmen päivän välein kolme kertaa. Solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT kuluttua 72 h kasvun 0,1% hiilellä erotettua seerumia viimeisestä transfektiosta. Apoptoosi samalla arvioitiin 72 tunnin kuluttua anneksiini V-FITC ja virtaussytometria kuvatulla [20].

RNA: n eristäminen ja RT-PCR

Solut (1 x 10

6 solua) maljattiin 60 mm: n annoksia, kasvanut seerumin ja fenolipunaista RPMI: ssa 24 tuntia, ja sitten inkuboidaan eri yhdisteiden 18 tuntia. RNA eristettiin käyttämällä Trizol (Invitrogen) ja RNeasy MiniKit (Qiagen). RT-PCR suoritettiin ei-kyllästää olosuhteissa käyttäen SuperScript ™ III One-Step RT-PCR System (Invitrogen) ja geeni-spesifisiä alukkeita (taulukko S1) [20]. PCR-tuotteet erotettiin 2% agaroosigeeleillä, värjättiin GelRed (Biotium, Basel, CH) ja niiden määrä käyttämällä AlphaImager kuten edellä on kuvattu.

immunoblottauksella

Solut hajotettiin, kuten on kuvattu [13] . Lysaatit sentrifugoitiin 14000 x g 10 minuutin ajan mahdollisten roskien poistamiseksi ja proteiinipitoisuus määritettiin. Proteiinit ladattiin 10-12% polyakryyliamidigeeleillä ja analysoitiin immunoblottauksella. Prokaspaasi-3 (302), PDK1, PTEN, Akt, ja fosfo-Akt (Ser 473) vasta-aineet ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Cox-2 (E-29) ja PPARβ /δ (H-74), vasta-aineet saatiin St Cruz (Heidelberg, Saksa). Tubuliinia (Ab-1) vasta-aine hankittiin Oncogene (Merk Biosciences, Nottingham, UK).

Kromatiini Immunosaostaminen (chip)

Solut kasvatettiin yhtenäisiksi 75-cm

2 pullot, nälässä ja inkuboitiin GW501516 tai ajoneuvon 18 tuntia. ChIP suoritettiin, kuten on kuvattu [21] 4 ug anti-PPARβ /δ-vasta-aineen tai anti-IgG negatiivisena kontrollina. PCR tehtiin alukkeilla, jotka kattavat alueita -527–298 ja -1338–1123 VEGF-promoottorin läsnä ollessa Betaiini ja DMSO käyttämällä AmpliTaq Gold (Applied Biosystem, Foster City, CA). Densitometrinen analyysi suoritettiin käyttäen AlphaImager ohjelmistoa.

His-merkitty PPARβ /δ Pull-down ja immunosaostus

His-PPARβ /δ ekspressiovektori kuvattu aiemmin [13]. His-merkitty N- ja C-terminaalisten katkaistu konstruktit PPARβ /δ luotiin kohdennetulla mutageneesillä. Solut transfektoitiin Lipofectamine, kasvatettiin konfluenssiin ja inkuboitiin ilman PPARβ /δ ligandeja. Solut lyysattiin RIPA-puskurissa 30 minuuttia jäissä ja jollei avattavan His-valitse nikkeli affmiteettigeeliin (Sigma). Proteiinit eluoitiin Laemmlin puskuria. Vastaavat eriä lysaatit, läpivirtaus- ja eluaatit ladattiin geelit ja analysoitiin immunoblottauksella. Immunosaostuksella (IP) suoritettiin käyttäen anti-p85α seerumia (lahja M. Thelen, IRB, Bellinzona, CH) ja A /G-Sepharose-helmiä (Thermo Scientifics). His-PPARβ /δ havaittiin anti-His-vasta-ainetta (Sigma).

Tulokset

ilmentäminen PPARβ /δ in ei-pienisoluinen keuhkosyöpä

arvioitiin taso PPARβ /δ yhdessä PPAR, CPLA

2, Cox-2, PGES- ja SMM in NSCLC solulinjoissa. Näiden geenien ilmentymistä vaihteli huomattavasti eri solulinjoissa (Fig. 1A). H441-soluissa oli korkea PPARβ /δ, Cox-2, CPLA

2, PGES- ja PPARy. H358 ja H23 soluista oli väliportaan PPARβ /δ ja matala /kohtalainen ilmentyminen Cox-2, PGES-, CPLA

2 ja PPARy. Mielenkiintoista, A549-solut, joita on käytetty monissa tutkimuksissa testata vaikutusta PPARβ /δ agonistit, oli alhaisin PPARβ /δ ja PGES-, vaikka oli suhteellisen korkea ilmentymä PPARy ja Cox-2. Ero PPARβ /δ tason välillä H441 ja A549-soluja varmistettiin käyttämällä valikoivaa PPARβ /δ reagoiva lusiferaasireportterista [3] (Fig. 1 B) ja oli yhdenmukainen aiempien tietojen ryhmämme proteiinien tasolla ja vastauksena ligandia aktivaatio kaksi solulinjaa [13]. Kiinnostavaa kyllä, suurin osa ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat eivät ilmaisseet SMM, lukuun ottamatta H23-solujen, joissa on alhainen SMM mRNA: ta havaittiin. Tämä viittasi siihen, että SMM

2 ei todennäköisesti tuotetaan endogeenisesti useimmissa NSCLC soluissa.

(A) RNA eristettiin ilmoitetusta solulinjoista monistettiin RT-PCR: llä tason arvioimiseksi PPARβ /δ, PPARy, CPLA

2, Cox-2, SMM, ja PGES- RNA. GAPDH: ta käytettiin viite-geenin. (B) H441 ja A549-soluja transfektoitiin PPARβ /δ reagoiva lusiferaasireportterigeenin (DRE) tai emäksinen pGL3 lusiferaasireportterigeenin (Basic). Lusiferaasiaktiivisuudeksi arvioitiin 24 tunnin kuluttua. * P 0,01. (C) RNA: ta eristettiin keuhkokasvaimia ja viereisen normaalin keuhkokudoksen analysoitiin RT-PCR: llä alukkeilla, jotka ovat spesifisiä PPARβ /δ ja β-aktiini.

Seuraavaksi tarkasteltiin ilmentymisen samat geenit normaalissa keuhkojen ja kasvainten kudosnäytteitä potilasta NSCLC (kuva S1). Löysimme lisääntynyt PPARβ /δ mRNA monissa kasvaimissa verrattuna pariksi normaalin keuhkojen näytteitä (Fig. 1 C). Vertailla ilmentymiskuvio Koko näytteen sarja, mRNA-tasolla kunkin geenin määritettiin densitometrinen analyysi, normalisoidaan p-aktiini ja esitetty suhde taso kunkin parin kasvain /normaali täsmäsi näytettä (Fig. 2). PPARβ /δ mRNA oli selvästi sääteli (T /N-suhde ≥4) noin 50% kasvaimista. Tämä on linjassa aiempien raporttien yli-ilmentyminen tämän NHR monissa ihmisen syövissä, mukaan lukien NSCLC [1], [22]. Cox-2, CPLA

2 ja PGES- myös säädellään ylöspäin useimmissa kasvain näytteissä (kuvio. 2). Ylössäätöä näistä geeneistä oli erityisen selvää kasvaimissa PPARβ /δ yli-ilmentyminen. Erityisesti, SMM havaittiin normaalin keuhkokudoksen ja muuttunut vain hieman pieni osa tapauksista. PPARy kohtalaisesti lisääntynyt joissakin kasvaimissa mutta useammin alassäädetty, sopusoinnussa otaksuttu tuumorisuppressori rooli johtua tästä NHR. VEGF, joka on otaksuttu tavoite PPARβ /δ ja Cox-2, oli myös säädelty monissa kasvaimissa PPARβ /δ yliekspressio (Kuva.). Erityisesti taso PPARβ /δ korreloi merkitsevästi ilmaus Cox-2 (Pearson vesi jakaantumiskerr. 0,76; p-arvo, 2.91E-05), CPLA

2 (Pearson vesi jakaantumiskerr. 0,69; p-arvo 2.72E- 04) ja VEGF (Pearson vesi jakaantumiskerr. 0,54; p-arvo 0,018). Antamaan lisätukea välinen yhteys PPARβ /δ, VEGF ja Cox-2 tutkimme taso näiden geenien julkisesti saatavilla geeniekspression aineistoja normaalista ja keuhkosyöpään kudosnäytteistä. Löysimme merkittäviä korrelaatioita PPARβ /δ VEGF ja Cox-2 mRNA: n ekspression useita aineistoja (taulukko S2). Yhdessä nämä tulokset osoittavat usein ja samanaikainen säätely ylöspäin PPARβ /δ, VEGF ja komponentit Cox-2 /prostaglandiini synteettinen polku osajoukko NSCLC ja tukea oletusta, että aktivointi näistä reiteistä voi olla merkitystä keuhko syövän synty.

RNA uutettiin kasvaimia ja viereisen normaali keuhkokudosanalyysin joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja tutkittiin RT-PCR: llä. Tulokset edustavat suhde geeniekspression kasvainten suhteen pariksi normaalia kudosta, joka perustuu densitometrisen analyysin ja normalisoitiin p-aktiini käytetään viitteenä geenin. Mustat palkit merkitse kasvaimien korkein ilmentymä PPARβ /δ (T /N-suhde ≥4).

PPARβ /δ Edistää leviämisen ja Survival of ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Cells

vapautettiin ilmaus PPARβ /δ voi suosia lisääntymistä ja selviytymistä syöpäsoluja. Kuitenkin tutkimukset tehdään erilaisissa solun malleja, kuten keuhkosyövän solulinjat eivät toimittaneet yhdenmukaisia ​​tuloksia [9], [23]. Tiedot edellä kuvattu viittaavat siihen yhteydessä, jossa jotkin tutkimukset tehtiin oli varsin heterogeeninen ja voi vaikuttaa erilaisia ​​soluvasteita PPARβ /δ aktivaatio. Huomasimme, että PPARβ /δ agonistit lisääntynyt lisääntymistä ja edistää selviytymistä NSCLC soluja. Aktivointi PPARβ /δ mukaan cPGI

2 alhaisen seerumiväliaineessa lisääntynyt solujen elinkelpoisuutta ja lisääntymistä (Fig. 3A). Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin toisella PPARβ /δ agonisti, L165041 (Fig. 3B). Johdonmukaisesti, solusyklin analyysi osoitti kasvua S-vaiheessa olevien solujen hoidon jälkeen cPGI

2 alhaisen seerumiväliaineessa kun G1 vaiheessa olevien solujen vähentynyt (Fig. 3C). Erityisesti kaikki nämä vaikutukset näkyivät solujen korkea ilmentyminen PPARβ /δ (esim H441 ja H358), kun taas ei ollut mitään tai vain vähäinen vaikutus kasvuun ja solusyklin A549 solujen alhainen reseptorin (Fig. 3A- C). Nämä pro-kasvun ja eloonjäämisen vaikutukset olivat spesifisiä PPARβ /δ agonistit kuten inkubaation PPARy-agonistin siglitatsonia inhiboi solun kasvua (kuva S2). Lisäksi korkea ilmentyminen PPARβ /δ liittyi alentunut herkkyys tulehduskipulääkkeiden ja COX-2-estäjät, kuten sulindaakkisulfidi, sulindaakkisulfonin ja NS398, vuonna H441-soluissa verrattuna A549-soluja, joilla on alhainen PPARβ /δ lauseke (kuva S2). Tueksi pro-selviytymisen toiminto, knock-alas PPARβ /ö käyttäen Sirna (siRNA) vaikuttaa solujen elinkykyä (Fig. 3d). PPARβ /A knock-down kasvoi myös määrä anneksiini V, positiivinen apoptoottisia soluja (kuvio. 3E) ja indusoi kaspaasi-3-aktivaation, joka on tunnettu merkkiaine apoptoottisen solukuoleman (Fig. 3F). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että aktivointi PPARβ /δ edistää selviytymistä ja proliferaatiota NSCLC-soluja, jotka ilmentävät korkeita reseptorin.

(A) H441, H358 ja A549-soluja inkuboitiin cPGI

2 seerumittomassa väliaineessa, ja solujen elinkyky arvioitiin 72 tunnin kuluttua MTT-määrityksellä. * P 0,01 kontrolliin verrattuna soluihin. (B) Soluja inkuboitiin L165041 kuten edellä. * P 0,01 kontrolliin verrattuna soluihin. (C) Soluja inkuboitiin cPGI

2 (10 uM) 24 tunnin ajan ja analysoitiin virtaussytometrialla.

Päällyslevy

, edustaja virtaussytometristen profiilia H358 soluja inkuboitiin ja ilman cPGI

2.

Pohjalevy

, solusyklin jakelu soluissa 24 tunnin kuluttua inkubaation ja ilman cPGI

2. Kasvu S-vaiheessa olevien solujen sisään H441 ja H358-soluissa määritettiin kolmena kappaleena kokeissa oli tilastollisesti merkitsevä (P 0,01). (D) H441-soluja transfektoitiin siRNA for PPARβ /δ ja GL3 ja solujen elinkelpoisuus määritettiin 72 tunnin kuluttua MTT. * P 0,01 kontrolliin verrattuna soluihin. (E) H358-soluja, jotka on transfektoitu PPARβ /δ siRNA ja GL3 värjättiin anneksiini-V: n ja propidiumjodidilla ja analysoitiin virtaussytometrialla. Prosenttiosuus anneksiini V-positiivisten solujen (apoptoottisia soluja) on merkitty kuhunkin paneeliin. P 0,05. (F) H358-solut transfektoitiin siRNA: lla ja PPARβ /δ ja GL3, hajotettiin ja analysoitiin immunoblottauksella kaspaasi-3-vasta-aine. * P 0,01.

PPARβ /δ aktivointi indusoi Cox-2: n ja VEGF Expression

Cox-2 ja PPARβ /δ voidaan toiminnallisesti vuorovaikutuksessa ja vastavuoroisesti säätelevät toisiaan. Samanaikainen säätely ylöspäin PPARβ /δ ja komponentit Cox-2 /prostaglandiini Synteesireittiin NSCLC kudoksissa ja solulinjoissa edelleen tukea tätä linkkiä ja aiheuttama voimme testata, onko PPARβ /δ voivat vaikuttaa Cox-2: n ilmentymisen in NSCLC soluissa. Havaitsimme kasvua Cox-2-mRNA: n, kun hoito NSCLC-solujen kanssa PPARβ /δ ligandi GW501516 (Fig. 4A). Varsinkin Cox-2: n mRNA ei kasvanut A549-soluja viittaa siihen, että vaikutus riippui endogeenisen PPARβ /δ. GW501516 indusoi myös transkription rasvakudoksen erilaistumisen liittyvä proteiini (ADRP) geeni, joka on tunnettu tavoite PPARβ /δ, on H358 ja H441-soluja, ja vain vähäisessä määrin A549-solut (Fig. 4A). Päinvastoin, PDK, joka on PPARβ /δ kohdegeenin raportoitu muissa tutkimuksissa [24], ei ollut vaikutusta (kuvio. 4A). Aika-tietenkin analyysi osoitti, että muutokset Cox-2 ja ADRP mRNA-tasolla olivat selviä 4-8 h lisäämällä ligandin ja kasvoi edelleen 24 h (Fig. 4B).

(A ) H358, H441 ja A549-soluja kasvatettiin konfluenssiin, ravinnotta 24 tuntia ja sitten käsiteltiin GW501516 (5 uM) 18 tuntia. Kokonais-RNA eristettiin ja tutkittiin RT-PCR: llä. (B) H358-soluja inkuboitiin GW501516 varten ilmoitettu kertaa ennen RNA ja analyysi.

PPARβ /δ ja Cox-2 voisi olla myötäkytkentärakenne sääntely loop yllä solujen eloonjäämistä ja proliferaatiota. Lisäksi PPARβ /δ tunnistettiin keskeinen osa angiogeenisen kytkimen aikana syövän etenemistä [25] ja VEGF, joka on merkittävä välittäjäaine angiogeneesin, tunnistettiin tavoitteeksi PPARβ /δ [18]. Analyysi VEGF ilmentymisen NSCLC ja normaali keuhkojen näytteet osoittivat lisääntyneen ilmentymisen VEGF ja vahvasti yhteydessä PPARβ /δ in keuhkosyövässä (Fig. 2 ja taulukko S2), sopusoinnussa ajatus, että PPARβ /δ voisi säädellä VEGF ilme. Testaamiseksi vaikutuksen PPARβ /δ VEGF ilmaisun, käsittelimme NSCLC solut GW501516. VEGF-mRNA: n lisääntynyt H358 ja H441-soluja inkuboitiin GW501516, mutta ei muutu A549-solut (Fig. 4A). Kuten Cox-2 ja ADRP, VEGF-mRNA: n lisääntynyt 4-8 tuntia ja kasvatettiin edelleen 24 tunnin kuluttua (kuvio. 4B). Yllätykseksemme ilmaus VEGF-reseptorien VEGFR1 ja VEGFR2 väheni käsittelemällä GW501516 (Fig. 4A-B).

PPARβ /δ osallistuu suoraan asetukseen VEGF transkriptio

induktio VEGF: n ilmentymisen PPARβ /δ voi edustaa tärkeää reseptorin toiminta. Jotta saadaan näyttöä osallistumisesta PPARβ /δ induktioon VEGF koputimme se alas käyttäen RNA-interferenssi. Tehokkuutta siRNA-välitteisen knock-down varmistettiin RT-PCR: llä (Fig. 5A). PPARβ /A knock-down vähensi perustason VEGF-mRNA: n ja kyky GW501516 indusoivan VEGF mRNA verrattuna ohjata transfektoiduissa soluissa (kuvio. 5A). Vaikutus PPARβ /δ ehtyminen oli selvempää H358 kuin H441-soluissa, luultavasti siksi, että alemman lähtötaso reseptorin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin suoraan PPARβ /δ kohde ADRP. Basal ADRP ilmaisun ja vastaus GW501516 oli alhaisempi PPARβ /δ köyhdytettyä soluja verrattuna ohjata transfektoiduissa soluissa (kuvio. 5A). Mielenkiintoista, knock-alas PPARβ /ö hieman vähennetty pohjapinta taso VEGFR1 ja VEGFR2 ja parannettu sijaan antagonisoivat vaikutus GW501516 (Fig. 5A). Siten ehtyminen PPARβ /δ oli päinvastainen vaikutus VEGF ja VEGFRs, sopusoinnussa ajatus, että PPAR voivat vaikuttaa geenin ilmentymisen selvä mekanismien [26].

(A) H358 ja H441-solut transfektoitiin PPARβ /δ siRNA ja valvonta GL3 ja käsiteltiin sitten GW501516 (5 uM) 18 tuntia. Gene-tasot määritettiin RT-PCR: llä. (B) Soluja inkuboitiin 2 h GSK0660 (10 uM) ja sitten GW501516 (5 uM) 18 h ennen analyysin RT-PCR: llä. (C) H358-soluja käsiteltiin GW501516 18 tuntia ja käsitellään kromatiinin immunosaostus käyttäen anti-PPARβ /δ ja anti-IgG-vasta-aineita. Alueella VEGF-promoottorin sisältävä pPre (-527 /-298) ja ei-kohdealueen (-1338 /-1123) amplifioitiin PCR. PPre sisältävät alue ADRP promoottori monistettiin positiivisena kontrollina.

Päällyslevy

, edustaja geeli skannaus.

Pohjalevy

, densitometristä määrällisesti kolmen erillisen kokeen in H441-soluissa. * P 0,01.

Lisäksi siRNA-välitteisen knock-down, testasimme PPARβ /δ antagonisti GSK0660 [27]. Soluja inkuboitiin 2 h GSK0660 (10 uM) ennen käsittelyä GW501516. Tämä annos GSK0660 ei vaikuttanut solujen elävyyden mutta tehokkaasti estetty PPARβ /δ aktiivisuutta. GSK0660 oli pieni vaikutus perustason VEGF mRNA, mutta esti induktion VEGF GW501516 (Kuva. 5A). GSK0660 oli samanlainen vaikutus ADRP mRNA sekä perus kunnossa ja ligandin aktivaation. GSK0660 vähensi myös tason VEGFR1 ja VEGFR2 mRNA kontrollisoluihin verrattuna sekä pohjapinta olosuhteissa ja kun läsnä on GW501516 (Fig. 5B). Siten sekä siRNA välittämä knock-alas ja PPARβ /δ antagonisti tukossa VEGF transkriptio, sopusoinnussa hypoteesin, että PPARβ /δ oli suoraan mukana prosessissa ja toiminut transkriptioaktivaattorina.

Voit selvittää PPARβ /δ säädellä VEGF-ilmentymisen suora sitoutuminen VEGF-promoottori, teimme kromatiinin immunosaostuksella ja arvioitiin sitoutuminen PPARβ /δ alueelle VEGF-promoottori (-527 /-298), joka sisältää pPre [28]. Ylävirran alue VEGF-promoottorin (-1338 /-1123), josta puuttuu PPREs käytettiin negatiivisena kontrollina. Ligandin aktivointi, sitoutuminen PPARβ /δ havaittiin, että pPre sisältävät päällä kun taas mitään sitoutumista ei havaittu distaalinen alue (Fig. 5C). Densitometrinen analyysi Tulokset vahvistivat sitoutuminen PPARβ /δ VEGF promoottori ligandin aktivaation, kun ei ollut sitova ilman ligandia ja IgG kontrollinäytteiden (Fig. 5C). Lisäksi laajuus PPARβ /A sitoutumisen VEGF-promoottori oli verrattavissa että ADRP promoottorin, joka on tunnettu ja PPARβ /δ kohde (Fig. 5C).

PI3K Aktivointi osallistuu VEGF: n indusointi PPARβ /δ

selvittäneet muita väyliä, jotka on liitetty sen PPARβ /δ voisi edistää sääntelyn VEGF vastauksena PPARβ /δ agonistit. PI3K /Akt -systeemi aktivoituu monien syöpien ja on sekaantunut kasvainangiogeneesissä [29]. ILK ja PDK, kaksi myötävirtaan kohde kinaasien Akt, osoitettiin säänneltävä PPARβ /δ [24] ja aktivointi PPARβ /δ lisääntynyt fosforyloidun Akt (Pakt) endoteelisolujen esisolut [30] ja NSCLC-solujen [31]. Siksi tutkimme onko PI3K /Akt-reitin oli mukana VEGF induktion PPARβ /δ agonistit NSCLC soluissa. Soluja esikäsiteltiin 2 h PI3K estäjän LY294002 seuraa GW501516. Pre-inkubointi LY294002 annoksilla, joiden tiedetään estävän Akt phopshorylation vähensi VEGF: n ilmentymistä, ja esti induktion VEGF vastauksena PPARβ /δ ligandi (Fig. 6A). LY294002 oli samanlainen vaikutus ADRP. Kuitenkin PI3K estäjä ei estä alas-säätely VEGFR1 ja VEGFR2 aiheuttama GW501516. Wortmanniini, toinen voimakas PI3K-estäjä, oli samanlaisia ​​vaikutuksia VEGF, ADRP ja VEGFRs (Fig. 6A).

(A) H358-soluja kasvatettiin konfluenssiin, paastolla 24 tuntia ja sitten inkuboitiin 2 h LY294002 (25 uM) tai wortmanniini (200 nM), jota seurasi GW501516 (5 uM) 18 tuntia. RNA uutettiin ja analysoitiin RT-PCR: llä. (B) H358 ja H441-soluja inkuboitiin ja ilman GW501516 varten osoitetun ajan. Solulysaatit tutkittiin immunoblottaus vasta-aineita koko ja fosforyloidun Akt, PTEN ja p85α. (C) H358-solut transfektoitiin His-PPARβ /δ tai tyhjä pcDNA3.1-vektori, ja niitä inkuboitiin ilman GW501516 18 tuntia. Solut hajotettiin RIPA puskuriin ja His-PPARβ /δ purettiin Hänen-valitse nikkeli affmiteettigeeliin. Immunoblotit kehitettiin vasta-aineiden PPARβ /δ ja p85α. (D) H358-solut transfektoitiin pcDNA3.1, täyspitkä His-PPARβ /δ (PPARβ /δ 1-441), tai katkaistun PPARβ /ö säilyttää N-terminaalisen osan (PPARβ /δ 1-168) ja C- terminaalista osaa (PPARβ /δ 168-441), hajotettiin RIPA puskuria ja jollei immunosaostus anti-p85α vasta-aine. Immunobloteissa kokosolulysaateista ja immunosaostumien (

keskeltä ja pohjapaneelin

, vastaavasti) suoritettiin suunnattuja vasta-aineita p85α, tubuliinia ja His-tag. Nuolet osoittavat täyspitkä ja typistetyn PPARβ /ö havaittu immunobloteilla kokosolulysaateista ja immunopresipitaatit.

Päällyslevy

kaaviokuvaus PPARβ /δ rakenne ja verkkotunnuksen organisaatio.

Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että PI3K vaikuttivat PPARβ /δ välittämä induktio VEGF. Fosfataasia ja tensin homologin poistetaan kromosomissa 10 (PTEN) on tärkeä säätelijä PI3K [29]. Modulaatio PI3K /Akt-reitin vastauksena aktivointiin PPAR syyksi on muutoksia PTEN tasolla. PPARy-agonistit lisääntynyt PTEN on seurauksena esto PI3K [32]. Toisaalta, aktivointi PPARβ /A alennetaan PTEN mikä lisää Pakt [22], [31]. Kun kuitenkin käsitellään H441 ja H358-solujen kanssa GW501516 emme noudata mitään johdonmukaista muutosta PTEN tasolla (Fig. 6B). Lisäksi olemme havainneet, että GW501516 indusoi Pakt hyvin varhaisessa ajan. Lisääntynyt Pakt nähtiin 1-2 tunnin hoidon ja säilyi vähintään 4 h (Fig. 6B). Yhteensä Akt, PTEN ja p85α eivät olleet tai minimaalisen vaikuta tällä hetkellä, mikä viittaa siihen, että tason muutokset näiden proteiinien olivat todennäköisesti selittää induktion Pakt jonka PPARβ /δ agonisti.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet että PI3K voidaan aktivoida fyysinen vuorovaikutus PI3K-säätelyalayksikkö p85α kanssa NHRs.